Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

זיהוי חלבון S-אכלציה באמצעות לכידת הסיוע Acylation-שרף

Published: April 10, 2020 doi: 10.3791/61016
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, McGovern Medical School at UT Health, 2MD Anderson UT Health Graduate School
* These authors contributed equally

Summary

Acyl-מירוץ (acyl-שרף בסיוע לכידת) הוא רגיש מאוד, אמין וקל לבצע שיטה לזיהוי שינוי השומנים הפיך של שאריות ציסטאין (S-acyl) במגוון של דגימות ביולוגיות.

Abstract

חלבון s-אכלציה, המכונה גם S-palmitoylation, הוא שינוי הפיך לאחר ההעברה של שאריות ציסטאין עם חומצות שומן ארוכות בשרשרת באמצעות בונד לבנה thioester. S-אכלציה, המתעוררים כמנגנון הרגולציה הנרחב, יכול לווסת כמעט את כל ההיבטים של הפעילות הביולוגית של חלבונים, מפני היווצרות מורכבים לסחר בחלבונים ויציבות חלבונים. ההתקדמות האחרונה להבנת התפקוד הביולוגי של חלבון S-אכלציה הושגה בעיקר בשל התפתחות הכלים הביוכימיים החדשניים המאפשרים גילוי חזק ורגיש של חלבון S-אכלציה במגוון דגימות ביולוגיות. כאן, אנו מתארים לכידה בסיוע של acyl שרף (Acyl-מירוץ), שיטה שפותחה לאחרונה מבוסס על לכידת סלקטיבי של חלבונים S-acylated על ידי החרוזים הספרדית thiol-תגובתי. לעומת הגישות הקיימות, Acyl-מירוץ דורש פחות שלבים והוא יכול להניב תוצאות אמינות יותר כאשר ביחד עם ספקטרומטר המסה לזיהוי מטרות הרומן S-אכלציה. מגבלה מרכזית בטכניקה זו היא חוסר יכולת להפלות בין מינים של חומצת שומן המחוברים לציסטרינס באמצעות אותו קשר.

Introduction

S-אכלציה הוא שינוי הפיך לאחר ההעברה מעורבים תוספת של שרשרת acylation שומן לשאריות ציסטאין פנימי על חלבון היעד באמצעות בונד לבנה thioester1. הוא דווח לראשונה כשינוי של חלבונים עם palmitate, חומצה שומן רווי 16 פחמן2, ולכן שינוי זה מכונה לעתים קרובות S-palmitoyלציה. בנוסף palmitate, חלבונים יכולים להיות שונה למדי על ידי מגוון רחב יותר וקצר יותר רווי (myristate ו stearate), חד (oleate) ו רב בלתי רווי (ארכאידיט ו eאיסאופנטאנואט) חומצות שומן3,4,5,6,7. בתאי איקריוטית, S-אכלציה הוא מזרז על ידי משפחה של אנזימים המכונה acyltransferחלבונים החלבון ואת התגובה הפוכה של ציסטאין דאכלציה הוא מזרז על ידי חלבון החלבונים, שרובם עדיין להישאר המסתורית8.

היכולת של הקשר thioester עושה את זה שינוי השומנים הפיך, המאפשר לו להסדיר באופן דינאמי באשכולות חלבון, פלזמה ממברנה לוקליזציה, סחר תאיים, אינטראקציות חלבונים חלבון ויציבות חלבון9,10. כתוצאה מכך, S-אכלציה נקשר להפרעות מספר כולל מחלת הנטינגטון, מחלת אלצהיימר ומספר סוגים של סרטן (ערמונית, קיבה, שלפוחית השתן, ריאות, המעי הגס), אשר מחייב פיתוח של שיטות אמינות לזהות את שינוי החלבון הפוסט-טרנסלסטי11.

מטבולית תיוג עם רדיואקטיבי ([3H],[14ג] או [125אני]) palmitate היתה אחת הגישות הראשונות שפותחו כדי לשנות את החלבון S-אכלציה12,13,14. עם זאת, שיטות מבוססות רדיואולבלינג מציגים חששות בריאותיים, הם לא רגישים מאוד, זמן רב, ורק לגלות lipidation של חלבונים שופע מאוד15. חלופה מהירה ולא רדיואקטיבית radiolabeling היא תיוג מטבולית עם בדיקה חומצות שומן bioorthogonal, אשר משמש באופן שגרתי כדי שיטת הדינמיקה של חלבון S-אכלציה16. בשיטה זו, חומצת שומן עם כתב כימי (הקבוצה האלבית או עזידה) משולבים בחלבון S-acylated על ידי חלבון acyltransferase. התגובה של עזידה-אלקין (לחץ על כימיה) יכולה לשמש לחיבור קבוצה פונקציונליזציה, כגון fluorophore או biotin, לחומצת השומן המשולבת המאפשרת זיהוי של חלבון ה-S-acylated17,18,19.

Acyl-ביוטין החליפין (אייב) היא אחת השיטות הביוכימי בשימוש נרחב לכידה וזיהוי של חלבונים S-acylated העוקף כמה חסרונות של תיוג מטבולית כגון חוסר התאמה לדגימות רקמות15. ניתן ליישם שיטה זו לניתוח S-acylation במגוון מגוון של דגימות ביולוגיות, כולל רקמות ודגימות תאים קפואים20,21. שיטה זו מבוססת על מחשוף סלקטיבי של הקשר בין הקבוצה acyl ושאריות ציסטאין על ידי הידרוקסילאמין נייטרלי. הקבוצות המשוחררות שוחררו לאחר מכן באמצעות הנגזרת הביוטין התגובתית. חלבונים biotinylated שנוצר לאחר מכן מטוהרים אהדה באמצעות streptavidin agarose ונותחו על ידי החיסונית.

גישה חלופית הנקראת acyl שרף בסיוע לכידת (acyl מירוץ) הוצגה מאוחר יותר להחליף את הצעד biotinylation עם בניינים ישירים של cysteines חינם על ידי שרף thiol-תגובתי22,23. שיטה זו יש פחות צעדים לעומת אייב ובאופן דומה ניתן להשתמש כדי לזהות חלבון S-אכלציה במגוון רחב של דגימות1.

Acyl-מירוץ מורכב 4 צעדים עיקריים (איור 1),
1. חסימת קבוצות תיול חינם;
2. מחשוף סלקטיבי של בונד של ציסטאין thioester עם הידרוקסילין נייטרלי (HAM) לחשוף את הקבוצות ציסטאין.
3. לכידת cysteines הליפינס עם שרף מגיב thiol;
4. העשרה סלקטיבית של חלבוני S-acylated לאחר הימנעות עם הפחתת מאגר.

את החלבונים שנתפסו ניתן לנתח על ידי חיסוני או נתון המסה ספקטרומטריה (MS) מבוסס פרוטאומניקס להעריך את S-acylated פרוטדום במגוון מגוון של מינים ורקמות22,24,25. אתרים בודדים S-אכלציה ניתן גם לזהות על ידי טריפסין העיכול של חלבונים שנתפסו ניתוח של פפטידים הנובעים על ידי LC-MS/MS22. כאן, אנו מדגימים כיצד acyl מירוץ יכול לשמש זיהוי סימולטני של S-האכלציה של חלבונים מרובים הן בקו התא וגם דגימת רקמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עכברים המשמשים בפרוטוקול זה הורדמים על פי הנחיות NIH. הוועדה לרווחת בעלי חיים באוניברסיטת טקסס מדעי הבריאות המרכז ביוסטון אישר את כל העבודה בעלי חיים.

1. הכנת ליקוטים סלולריים

  1. הכן את מאגר הליזה כמתואר בטבלה 1. כדי 10 mL של PBS, להוסיף 0.1 g של n-dodecyl β-D-מלטוסייד אבקת כביסה (DDM) ולסובב להתמוסס. הוסף 100 μL של קוקטייל פוספאטאז מעכבי 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 מ"מ) ו מעכב פרוטאז קוקטייל (1x) ולצנן את המאגר על הקרח לפני השימוש.
  2. העברת מדיה נדרש המכיל תאים מהאינקובטור לתוך 15 מ"ל או 50 mL מצינורות ותאי ספין ב 350 x g עבור 5 דקות ו-מדלל כדי להיפטר כל פסולת תא.
    הערה: השתמשנו 1 x 107 תאים עבור כל תגובה מירוץ acyl להתבצע.
  3. לשטוף את הגלולה על ידי השעיית מחדש ב 5 מ ל של PBS ו ספינינג ב 350 x g עבור 5 דקות.
    הערה: בצע את השלב 1.3 במהירות כדי להימנע מפירוק תאים עקב הדגירה המורחבת ב-PBS.
  4. הוסף 600 μL של מאגר הליזה שהוכן בשלב 1.1 לגלולה ו lyse אותו על ידי טלטול ב 1500 rpm ב שייקר תרמית עבור 30 דקות ב 4 ° c.
  5. ברור lysates על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g ב 4 ° צ' עבור 30 דקות כדי כדור ניקוי-חומרים לא מסיסים. לאסוף נקי ליפוסט בקירור טרום מקורר 1.5 מ"ל microfuge mL ולשמור אותם על קרח.
  6. בצע ברדפורד/BCA שיטת הערכת ריכוז החלבון. זה קריטי להבטיח את אותה כמות של חלבון על פני דגימות שונות לפני ביצוע הניסוי. אנו ממליצים להשתמש לפחות 500 μg של חלבון לכל תגובה.
    הערה: בניסויים המתוארים, השתמשנו בתאי השימוש בתרבית (ג'ורקאט) והטחול הראשוני מרקמת העכברים. שיטת הליזה שתוארה לעיל יכולה להיות מאומצת גם לסוגי תאים אחרים. ריכוז החלבון הממוצע המתקבל עבור סוגי תאים הנ ל הוא כ 500 μg לכל 1 x 107 תאים. תאים ג'ורקאט היו שמרו ב-RPMI-1640 בינוני שונה להכיל 2 מ"מ L-גלוטמין, 10 מ"מ HEPES, 1 mM נתרן פירובט, 4,500 mg/L גלוקוז, ו 1,500 mg/L נתרן ביקרבונט יושלם עם 10% FBS ב 37 ° צ' עם 5% CO2. השתמשנו ב-1 x 107 . בתאי ג'ורקאט לכל תגובה הטחול הראשי מבודדים מרקמת הטחול של העכבר כמתואר26. בקצרה, רקמת הטחול היה מיצה על קרח, ואחריו הליזה של אריתרופוציטים בפתרון היפוטון והפרדה מ לימפוציטים על ידי צנטריפוגה. השתמשנו 1 x 107 תאים ראשוניים לכל תגובה.

2. acyl מירוץ: חסימת של הקבוצות תיול חינם

הערה: ניתן לבצע את כל השלבים הבאים בטמפרטורת החדר (RT).

  1. העברת ליפוסט לתוך שפופרת טריים 1.5 mL microfuge ולבצע כלורופורם-מתנול (CM) משקעים כמתואר להלן.
    1. הוסף מתנול (MeOH) ו כלורופורם (CHCl3) אל הליפוסט ביחס הסופי של Lysate: Meoh: chcl3 של 2:2:1 ולנער במרץ כדי ליצור השעיה הומוגנית.
    2. ספין ב 10,000 x g עבור 5 דקות כדי ליצור גלולה ("פנקייק") בשלב בין שלבים מימית ואורגני.
    3. להטות את הצינור ומכה ממיסים ככל האפשר באמצעות מחט או טיפ טעינת ג'ל.
    4. האוויר יבש את הגלולה חלבון במשך כמה דקות בעדינות לשטוף אותו על ידי הוספת 600 μL של MeOH ו ערבוב בעדינות כדי להימנע מפירוק הגלולה
    5. הסר בזהירות את הנותרים MeOH ויבש את הגלולה חלבון על הספסל במשך כ 5 דקות.
    6. אופציונלי לבצע צעד צנטריפוגה נוסף כדי לסובב את כל הגלולה שבורה לאחר שטיפת MeOH כדי למנוע אובדן של דגימת.
      הערה: ניתן לעצור את הניסוי לאחר משקעים של CM. לאחר הגלולה מושגת, זה יכול להיות מאוחסן ב 500 μL של MeOH ב-20 ° c עד שבוע.
      1. מפזר את החלבון גלולה ב 200 μL של מאגר 2SHB על ידי vortexing ב 42 ° צ'/1500 סל ד ב שייקר תרמית עד התחתית התפרקה.
    7. אופציונלי דגירה של 5 – 10 דקות באמבט מים sonicating כדי לפזר את הגלולה.
      הערה: אורך הsonication משתנה בהתאם לסיסות החומר. עם זאת, sonication ממושכת עלולה לגרום לירידה בחלבון.
  2. הכינו 0.2%% מתיל מתיונין (v/v) ב-2SHB על-ידי הוספת 2 μL של MMTS ל 998 μL של מאגר 2SHB.
    הערה: השימוש הטרי 0.2% MMTS עבור כל ניסוי.
  3. הוסף 200 μL של 0.2% MMTS ב 2SHB לכל צינור לריכוז סופי של 0.1% MTS. מודטה עבור 15 דקות ב 42 ° c עם טלטול ב 1500 סל ד ב שייקר תרמית.

3. מירוץ מפוספס: הידרוקסילמין (בשר חזיר) מחשוף ולכידת חלבונים של S-acylated

  1. חזור על הקפיצות של 4 x ס"מ כמתואר לעיל כדי להסיר MMTS. הסרת MMTS יכול להיות מוערך על ידי חוסר ריח ברור של MMTS. אחרי כל משקעים, לפזר את הגלולה ב 100 μL של מאגר 2SHB ידי vortexing ב 42 ° צ'/1500 סל ד ב שייקר תרמית עד הגלולה מתמוסס, ולאחר מכן לדלל עם 300 μL של מאגר A.
  2. לאחר משקעים סופיים, התמוססות דגימות ב-200 μL של מאגר 2SHB כמתואר לעיל ולדלל עם 240 μL של מאגר A.
  3. במקרה של השוואת שינויים ב-S-acylation בתגובה לתנאי טיפול מספר, למדוד ריכוז חלבון שוב ולהמשיך עם כמות שווה של חלבון עבור כל תנאי.
  4. שמור על 40 μL מכל אחת מהדוגמאות כבקרת קלט.
  5. פיצול דגימות לשני חלקים שווים של 200 μL ו לסמן צינורות כמו "+ HAM" ו "-HAM". הוסף 50 μL של מוכן טרי 2 עם נקניק (pH 7.0-7.5) לריכוז הסופי של 400 מ"מ לאחד הצינורות (+ HAM) ו 50 μL של נייטרלי 2 M הנאל השני (-HAM), אשר ישמש כפקד שלילי. המשך לתוספת חרוזי thiopropyl-ספרד (TS).
    הערה: ניתן לעצור את הניסוי לאחר כל אחד מצעדי המשקעים של ס מ. לאחר הגלולה מושגת, זה יכול להיות מאוחסן ב 500 μL של MeOH ב-20 ° c עד שבוע. החומציות הנייטרלית של 2 M HAM מבטיחה את הסלקטיביות שלה לקשר של האקאיל-cysteine, ויש להתאימו בקפידה. יש לנקוט טיפול בעת טיפול בדגימות במאגר 2SHB כדי למנוע אובדן של מדגם עקב קצף מוגזם. כל השלבים הבאים הם זהים עבור-HAM ו + HAM דגימות.
  6. הוסף 30 μL של TS חרוז-ליטר כל צינור לסובב את הצינורות עבור 1-2 h ב RT.
  7. שוטפים את החרוזים 4x עם 1% SDS במאגר A כדי להסיר שיורית HAM.
    1. בעדינות לסובב את כל דגימות חרוז באמצעות microfuge עבור 1 דקות ובזהירות מזהם את supernatant.
    2. השהה מחדש את החרוזים ב-500 μL של 1% SDS במאגר A.
    3. חזור על שלב 3.7.1 – 3.7.2 שלוש פעמים.
      הערה: מופעל thiopropyl-ספרד (TS) מסופק להקפיא מיובש בנוכחות תוספים שיש לשטוף בתוך pH נייטרלי לפני צימוד. מים מזוקקים מומלץ לנפיחות ולכביסה. שוקלים 0.1 גרם של חרוזים ולהשעות מחדש 1 מ ל של מים מזוקקים ולאפשר לו להתנפח תוך כדי סיבוב עבור 30 דקות-1 h ב RT. לשטוף חרוזים 1x עם מאגר A ולהכין משקה עם מאגר A, ביחס של 50% בינונית התיישבו על 50% מאגר. TS נפוחות ניתן לאחסן ב-pH נייטרלי בנוכחות של 20% אתנול ב 4 ° c עד שבוע. אין להשתמש בנתרן עזידה כסוכן בקטאוסטטי, מאחר שאזידה יונים מגיבים עם הקבוצות הדיסולטיות בשתי הפירידיל. ליעילות גבוהה יותר, הכינו חרוזים טריים. בזמן הטיפול החרוזים, קצה של טיפ P200 tte ניתן לגזור מעט כדי למנוע נזק כלשהו.
      הערה: ניתן לעצור את הניסוי בכל שלב לאחר משקעים בעלי ס מ. הגלולה עשויה להיות חנות ב-500 μL של MeOH ב-20 ° c עד שבוע.

4. הימנעות מגילוי חלבונים של S-acylated

  1. לאחר השטיפה האחרונה, בעדינות לסובב את החרוזים כפי שמתואר לעיל ומכה את הסופר supernatant ככל האפשר מבלי להפריע את החרוזים.
  2. לשחזר את החלבונים מחרוזים עם 4 x SDS מאגר לדוגמה עם DTT.
    1. הוסף 50 μL של 4 x SDS מאגר לדוגמה חרוזים ו-הדגירה ב 80 ° צ', 1500 rpm עבור 15 דקות ב שייקר תרמית. . תן לחצוצרות להתקרר
    2. צנטריפוגה את החרוזים ב 5,000 x g עבור 3 דקות כדי לחלוטין הגלולה החרוזים ולהעביר את החלבונים משחרל שפופרת טריים 1.5 mL באמצעות עצה טעינת ג'ל.
  3. הפעל SDS-עמוד ולנתח S-אכלציה של החלבון (של) של העניין על ידי בלוק המערבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, השתמשנו הראשון acyl-מירוץ כדי לזהות בו S-אכלציה של כמה חלבונים בתאים ורנל, קו תא T הונצח במקור נגזר דם היקפי של חולה לוקמיה של תא T27. החלבונים של תא T הרגולציה שזוהו בעבר כ-S-acylated9,28,29 נבחרו כדי להדגים את כלי השירות של שיטה זו. כפי שמוצג באיור 2a, טירולך קינאז lck ניתן להבחין ב lysates שטופלו עם נייטרלי 2 M הידרוקסילין כדי לדבוק את הקשר thioester בין שאריות ציסטאין ו moiety חומצת שומן (+ HAM ליין). המדגם שטופל עם 2 מטרים (מסלול) מייצג שליטה שלילית חשובה, המציינת את הסלקטיביות של האפשרות לגילוי איגרות החוב. נתיב הקלט מאשר עוד את הפירוט של האות והוא יכול לשמש כפקד חיובי אם החלבון של הריבית אינו-S-acylated. הקרום היה אז התפשט ונחקר עם נוגדנים נגד חלבונים Fyn ו-LAT כדי להדגים את השימוש acyl מירוץ ניתן להשתמש כדי לנתח S-אכלציה של חלבונים מרובים באותו זמן (איור 2A).

כדי להדגים את השירות של שיטה זו כדי לזהות חלבון S-אכלציה בדגימות רקמות, החלתי את הפרוטוקול acylation מירוץ לטחול העכבר. כפי שמוצג באיור 2B, S-אכלציה של Lck, fyn ו-LAT ניתן לזהות בקלות הטחול הראשי של העכבר המציין כי שינוי זה שימור בין שני מינים.

Figure 1
איור 1. ייצוג סכימטי של. השיטה מורכבת מ 4 השלבים העיקריים: (1) חסימת קבוצות תיול חינם עם מתיל מתיונין (mmts), (2) מחשוף סלקטיבי של הקשר של ציסטאין-acyl האג עם הידרוקסילין נייטרלי (HAM) כדי לחשוף את הקבוצות ציסטאין תיול, (3) לכידת חלבונים עם החדש ציסטאין תיול חשוף על ידי הקוניוגציה ישירה עם שרף תיול-תגובתי ו (4) התאוששות של חלבונים שנתפסו באמצעות מאגר להפחתת הפחתת, ואחריו בניתוח חיסוני או טרשת נפוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. זיהוי חלבונים של S-acylated. מירוץ acyl-מרקא שימש כדי לזהות את S-האכרחון של תאי T איתות חלבונים בתוךכורקאטT תאים (א) ו רקמת הטחול Murine (ב). מבחינה חיסונית עם Lck-, Fyn-ונוגדנים ספציפיים ללאט מראה S-אכרחון של חלבונים אלה במדגם טיפול הידרוקסילין (+ HAM ליין). מדגם שטופל באמצעות נתרן כלוריד (מסלול "HAM") משמש כשליטה שלילית. ליקוטים לא מטופלות מוצגים בנתיב הקלט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

אגר רכב ערות
מאגר לליזה (LB) 1% DDM ב-DPBS; 10 μM ML211; מעכב פוספספטאז קוקטייל 2 (1:100); מעכב פרוטאז קוקטייל (1X), PMSF (10 מ"מ) היכונו רעננים, מקררים ב -4 ° c לפני השימוש.
מאגר SDS (2SHB) 2% SDS; 5 מילימטר EDTA; 100 מ"מ הופס; 7.4 pH
מאגר A 5 מילימטר EDTA; 100 מ"מ הופס; 7.4 pH
הידרוקסיללין (בשר חזיר) 2 מניות M פתרון מזוקק H20 . היכון רענן כאשר התפרקה לראשונה, האם יש pH נמוך מאוד. השימוש 5 M NaOH כדי pH כדי 7-7.5.
מאגר לדוגמה 4X SDS 200 mM טריס-Cl (pH 6.8), 8% SDS (נתרן dodecyl סולפט) 0.01% ברומרופנול כחול, 10% גליצרול תוספת עם 5 מ"מ DTT בדיוק לפני השימוש.

טבלה 1: הרכב מאגר של מאגרים נפוצים הדרושים בפרוטוקול. מאגר 2SHB ומאגר A יכול להיות מוכן מראש אבל ה-pH שלהם חייב להיבדק באופן קבוע. מאגר לליזה והאם יש להכין את יום הניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מנוצל בהצלחה את הבחינה מירוץ acyl כדי לזהות S-אכלציה של חלבונים שנבחרו בתאי האדם התרבותי הן התאים הראשוניים הנגזרים מרקמת העכבר. שיטה זו היא פשוטה, רגישה, ניתן לבצע בקלות עם דרישות ציוד מינימלי באמצעות טכניקות ביוכימיה סטנדרטית. שיטה זו הוצגה בהצלחה לזהות חלבונים S-acylated הרומן כגון β-subunit של המערכת חלבון האיתור (Sec61b), חלבון הריבוזומS11 (Rps11), ו מיקרוזומיום הגלוטתיון-S-transferase 3 (MGST3)22. רגישות והסתגלות של מירוץ acyl הופך אותו מתאים ללמוד חלבון S-אכלציה במגוון של דגימות ביולוגיות.

שבריר משמעותית של חלבונים S-acylated יכול להיות משויך עם גלינגספיוליפיד-חלקים מועשר של קרום הפלזמה, המכונה גם רפסודות ליפיד. לכן, חלבונים מסוימים של S-acylated לא להיות מופק באופן מלא אם חומרי ניקוי מתון, כגון טריטון X-100, NP-40 או Brij58, משמשים לפירוק30. חומרי ניקוי אנייוני (כגון sds) או מלטוסייד מבוסס על שימוש לא יוני (כגון n-dodecyl β-D-maltoside (ddm)) ניתן להשתמש כדי להבטיח את הדיסוציאציה של רפסודות השומנים והתאוששות מלאה של חלבונים של ריבית30,31,32. בפרוטוקול זה, השתמשנו DDM, עדין, שומנים כמו סבון שאינו יונית, כי הוכח להיות יעיל בחילוץ חלבון ממברנה ושמירה על מצב מקורי יציבה שלהם על תקופות ממושכות33.

הפעילות במהלך הפירוק של המדגם יכולה לגרום לתשואה חלבון מופחתת לאחר הצעד המשיכה TS למטה ובכך להשפיע על גילוי של חלבונים S-acylated. מעכב thioesterase, כגון ML211, מעכב כפול עבור החלבון acyl-חלבונים 1 (APT1, LYPLA1) ו acyl-חלבון thioesterase 2 (APT2, LYPLA2) ניתן להוסיף כדי למנוע deacylation הבחנה של חלבונים ב lysate34,35.

המצור הלא מושלם על שאריות ציסטאין יכול לגרום להקפאות חלבונים לא-מיוטים ל-TS, ולכן כתוצאה מכך ברור ברקע גבוה בדגימות הבשר-חזיר. כריכת הרקע יכולה להיות מופחתת באופן משמעותי על ידי דגירה נוספת עם thiol-crosslinking קישור סוכן-2, 2 '-dithiodipyridine כפי שמתואר פרוטוקול אייב שונה על ידי ג'ואו et al.36.

בניגוד תיוג מטבולית, acyl-מירוץ לא מוגבל כדי לחיות תאים וניתן לבצע כדי לזהות את ה-חלבון S-אכלציה בדגימות רקמה מבודדים או קפואים. מאז הפרוטוקול acyl-מירוץ נמנע צעד immunoprecipitation, זה יכול לשמש בו זמנית לזהות לידה של חלבונים מרובים של עניין באותו הסדר, ובכך להפחית את כמות החומר הביולוגי הנדרש בניסוי אחד. עם זאת, מטבולית תיוג מבוסס בחני מתאים יותר עבור ניסויים שנועדו במיוחד לזהות דה נובו S-אכלציה או למדוד חומצות שומן מחזור שיעורי על חלבון של ריבית. מגבלה חשובה נוספת של מירוץ acyl הוא כי טכניקה זו אינה מסוגלת להבחין בין חומצות שומן שונות שיכול להיות מאוגד כרוך בפני שאריות ציסטאין באמצעות אותו הקשר thioester3,4,5,6,7.

הן acyl-מירוץ ו אייב בחני מבוססים על מחשוף סלקטיבי של קשר thioester בין שאריות ציסטאין וחומצת שומן כדי לחשוף את הקבוצה החופשית תיול. מאז acyl-מירוץ משתמש ישירה למשוך למטה של חלבונים S-acylated ידי שרף thiol-תגובתי, שיטה זו דורשת פחות צעדים בהשוואה ל-ABE. למרות דומה, מחקרים פרוטדום של S-אכלציה להראות כמה וריאציה של חלבונים שזוהו באמצעות שתי שיטות אלה, סביר להניח בשל ההבדלים הטכניים. לדוגמה, במוח חולדה הומוגון, ניתוח מבוסס אייב זיהה 241 S-acylated חלבונים ואילו ניתוח מבוסס acyl-מירוץ מזוהה 14425. 61 חלבונים במוח עכברוש פרוטדום היו בדרך כלל זוהו על ידי שתי השיטות הבקיע את הצורך להשתמש בטכניקות מרובות כדי לוודא את מצב S-acylation של חלבון.

עוד חיסרון פוטנציאלי של שיטות מירוץ acyl ו-ABE הוא חוסר היכולת להעריך באופן מהימן סטויכמטריה של S-אכלציה ולקבוע את מספר הליפינים cysteines. שינוי של טכניקות אלה, הנקרא acyl-יתד exchange או משמרת יתד, פותחה כדי לטפל במגבלות אלה37,38. בשיטה זו, צעד למטה לאחר המחשוף הידרוקסילין מוחלף על ידי הדגירה עם תג המסה של יתד-maleimide. התוצאה המתקבלת של שאריות הציסטטין החשופים, ניתן להבחין כמשמרת המונית על ידי SDS-PAGE.

לסיכום, acyl-מירוץ היא שיטה מהירה, רגיש ואמין שיכול לספק תובנות יקרות לדינמיקה של חלבון S-אכלציה תחת שני התנאים פיסיולוגיים ופתופיזילוגיים במגוון גדול של דגימות ביולוגיות. בהתחשב מגבלות של השיטה שנדונה לעיל, שילוב של acyl מירוץ עם טכניקות אחרות מומלץ לאפיין במלואו S-אכלציה של חלבון של עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין קונפליקטים של עניין מוצהר.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות 5R01GM115446 ו-1R01GM130840.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets Sigma 11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424 Eppendorf 22620444
Hydroxylamine (HAM) Sigma 159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS) Sigma 64306
Mini tube rotator LabForce
ML211 Cayman 17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake Benchmark Scientific H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) Sigma D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) Sigma T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator L & R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
  2. Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).
  3. Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).
  4. DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).
  5. Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).
  6. Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).
  7. Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
  8. Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).
  9. Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).
  10. Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
  11. Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).
  12. O'Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
  13. Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
  14. Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40 (2), 191-197 (2006).
  15. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
  16. Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
  17. Rami, N., Hannoush, N. A. -R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).
  18. Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
  19. Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
  20. Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
  21. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).
  22. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  23. Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
  24. Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).
  25. Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  26. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
  27. Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
  28. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).
  29. Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).
  30. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
  31. Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).
  32. Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).
  33. Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), (2017).
  34. Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
  35. Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
  36. Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).
  37. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).
  38. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).

Tags

ביוכימיה סוגיה 158 ביוכימיה אימונולוגיה ביולוגיה של התא S-אכלציה מפלאולציה שינוי לאחר ההעברה Acylation-מירוץ הטחול לימפוציטים
זיהוי חלבון S-אכלציה באמצעות לכידת הסיוע Acylation-שרף
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tewari, R., West, S. J., Shayahati,… More

Tewari, R., West, S. J., Shayahati, B., Akimzhanov, A. M. Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture. J. Vis. Exp. (158), e61016, doi:10.3791/61016 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter