Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الكشف عن البروتين S-Acylation باستخدام Acyl-الراتنج بمساعدة التقاط

Published: April 10, 2020 doi: 10.3791/61016
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, McGovern Medical School at UT Health, 2MD Anderson UT Health Graduate School
* These authors contributed equally

Summary

Acyl-RAC (Acyl-Resin المساعدة على التقاط) هو حساس للغاية وموثوق بها وسهلة لأداء طريقة للكشف عن تعديل الدهون عكسها من مخلفات السيستين (S-acylation) في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية.

Abstract

البروتين S-acylation، ويشار إليها أيضا باسم S-palmitoylation، هو تعديل عكسها بعد الترجمة من مخلفات السيستين مع الأحماض الدهنية طويلة السلسلة عن طريق السندات ثيويستر labile. ويمكن لـ S-acylation، الذي يظهر كآلية تنظيمية واسعة النطاق، أن تعدل تقريبا جميع جوانب النشاط البيولوجي للبروتينات، من التكوين المعقد إلى الاتجار بالبروتين واستقرار البروتين. وقد تحقق التقدم المحرز مؤخرا في فهم الوظيفة البيولوجية للبروتين S-acylation إلى حد كبير بسبب تطوير أدوات كيميائية حيوية جديدة تسمح بالكشف القوي والحساس للبروتين S-acylation في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية. هنا، ونحن نصف acyl الراتنج بمساعدة القبض (Acyl-RAC)، وهي طريقة وضعت مؤخرا على أساس التقاط انتقائي من البروتينات S-acylated الذاتي ة من قبل الخرز سيفوريد رد الفعل ثيول. بالمقارنة مع النهج القائمة ، يتطلب Acyl-RAC خطوات أقل ويمكن أن تسفر عن نتائج أكثر موثوقية عندما يقترن بقياس الطيف الكتلي لتحديد أهداف S-acylation الجديدة. أحد القيود الرئيسية في هذه التقنية هو عدم القدرة على التمييز بين أنواع الأحماض الدهنية المرتبطة السيستينعبر نفس رابطة ثيويستر.

Introduction

S-acylation هو تعديل عكسها بعد الترجمة التي تنطوي على إضافة سلسلة أسيل الدهنية إلى بقايا السيستين الداخلية على البروتين المستهدف عن طريق السندات ثيويستر labile1. تم الإبلاغ لأول مرة عن تعديل البروتينات مع البالميتات ، وهو حمض دهني مشبع بـ 16 كربونًا2، وبالتالي غالبًا ما يشار إلى هذا التعديل باسم S-palmitoylation. بالإضافة إلى البالميتات ، يمكن تعديل البروتينات بشكل عكسي من خلال مجموعة متنوعة من التشبع الأطول والأقصر (myristate و stearate) ، غير المشبعة (الأوليات) ومتعددة غير المشبعة (الأراكيدونات والإسيكوسابينتانات) الأحماض الدهنية3،4،5،6،7. في الخلايا eukaryotic، هو تحفيز S-acylzation من قبل عائلة من الإنزيمات المعروفة باسم acyltransferases البروتين DHHC ورد الفعل العكسي من السيستين deacylation هو تحفيز من قبل thioesterases البروتين، ومعظمها لا تزال غامضة8.

قابلية رابطة ثيويستر يجعل هذا التعديل الدهون عكسها، مما يسمح لها لتنظيم حيوي تجمع البروتين، وتوطين غشاء البلازما، والاتجار داخل الخلايا، والتفاعلات البروتين البروتين واستقرار البروتين9،10. وبالتالي، تم ربط S-acylation إلى العديد من الاضطرابات بما في ذلك مرض هنتنغتون، ومرض الزهايمر وعدة أنواع من السرطان (البروستاتا، المعدة، المثانة، الرئة، القولون والمستقيم)، مما يتطلب تطوير طرق موثوق بها للكشف عن هذا التعديل البروتين بعد الترجمة11.

العلامات الأيضية مع المشعة([3H]، [14C] أو[125I]) palmitate كان واحدا من النهج الأولى المتقدمة لأساية البروتين S-acylation12،13،14. ومع ذلك، الأساليب القائمة على العلامات الإشعاعية الحالية المخاوف الصحية، ليست حساسة جدا، وتستغرق وقتا طويلا، والكشف فقط عن الدهون من البروتينات وفيرة للغاية15. بديل أسرع وغير مشع لوضع العلامات الإشعاعية هو وضع العلامات الأيضية مع تحقيقات الأحماض الدهنية الحيوية، والتي تستخدم بشكل روتيني لتقويم ديناميات البروتين S-acylation16. في هذه الطريقة ، يتم دمج الأحماض الدهنية مع مراسل كيميائي (مجموعة الألكيين أو الأزيد) في البروتين S-acylated بواسطة acyltransferase البروتين. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition التفاعل (انقر الكيمياء) يمكن استخدامها بعد ذلك لإرفاق مجموعة وظيفية، مثل الفلوروفور أو البيوتين، إلى الأحماض الدهنية المتكاملة مما يسمح للكشف عن البروتين S-acylated17،18،19.

Acyl-biotin التبادل (ABE) هي واحدة من الطرق الكيميائية الحيوية المستخدمة على نطاق واسع لالتقاط وتحديد البروتينات S-acylated التي تتجاوز بعض أوجه القصور في وضع العلامات الأيضية مثل عدم ملاءمة لعينات الأنسجة15. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لتحليل S-acylation في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية، بما في ذلك الأنسجة وعينات الخلايا المجمدة20،21. ويستند هذا الأسلوب على الانقسام الانتقائي من السندات ثيويستر بين مجموعة acyl وبقايا السيستين من الهيدروكسيلامين محايدة. ثم يتم التقاط مجموعات ثيول المحررة مع مشتق البيوتين القائم على التفاعل مع ثيول. ثم يتم تنقية البروتينات الحيوية المتولدة باستخدام العقديات وتحليلها بواسطة المناعي.

تم تقديم نهج بديل يسمى acyl-resin بمساعدة القبض (Acyl-RAC) في وقت لاحق لاستبدال خطوة biotinylation مع اقتران مباشر من السيستينات الحرة من قبل راتنج ثيول التفاعلي22،23. هذه الطريقة لديها خطوات أقل بالمقارنة مع ABE وبالمثل يمكن استخدامها للكشف عن البروتين S-acylation في مجموعة واسعة من العينات1.

Acyl-RAC يتكون من 4 خطوات رئيسية(الشكل 1)،
1. حظر مجموعات ثيول الحرة؛
2. الانقسام الانتقائي من السندات ثيويستر السيستين- أسيل مع الهيدروكسيلامين محايدة (HAM) لفضح مجموعات السيستين ثيول;
3. التقاط السيستينات الدهنية مع الراتنج ثيول التفاعلي؛
4. الإثراء الانتقائي للبروتينات S-acylated بعد elution مع الحد من العازلة.

ويمكن بعد ذلك أن يتم تحليل البروتينات التي تم التقاطها عن طريق التنبولين المناعي أو إخضاعها لـ البروتيوميكس القائم على الكتلة (MS) لتقييم البروتيوم S-acylated في مجموعة متنوعة من الأنواع والأنسجة22،24،25. يمكن أيضًا تحديد مواقع S-acylation الفردية عن طريق هضم التربسين للبروتينات الملتقطة وتحليل الببتيدات الناتجة بواسطة LC-MS/MS22. هنا، نوضح كيف يمكن استخدام acyl-RAC للكشف المتزامن عن S-acylation من بروتينات متعددة في كل من خط الخلية وعينة الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول تم القتل الرحيم وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد القومية للصحة. وافقت لجنة رعاية الحيوان في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في هيوستن على جميع الأعمال الحيوانية.

1. إعداد الخلايا الليكلسات

  1. إعداد المخزن المؤقت lysis كما هو موضح في الجدول 1. إلى 10 مل من PBS، أضف 0.1 غرام من منظفات n-dodecyl α-D-maltoside (DDM) وقم بتدويرها للذوبان. أضف 100 ميكرولتر من كوكتيل مثبط الفوسيفاتي2 وML211 (10 ميكرومتر) وPMSF (10 mM) وكوكتيل مثبط البروتياز (1x) وتبريد الحاجز على الجليد قبل الاستخدام.
  2. نقل وسائل الإعلام المطلوبة التي تحتوي على خلايا من الحاضنة إلى 15 مل أو 50 مل أنابيب مخروطية وخلايا تدور في 350 × ز لمدة 5 دقيقة وينتشق للتخلص من أي حطام الخلية.
    ملاحظة: استخدمنا 1 × 107 خلايا لكل رد فعل acyl-RAC ليتم تنفيذها.
  3. اغسل البيليه عن طريق إعادة تعليقه في 5 مل من PBS والغزل في 350 × ز لمدة 5 دقيقة.
    ملاحظة: تنفيذ الخطوة 1.3 بسرعة لتجنب الانزل الخلوي بسبب الحضانة الموسعة في برنامج تلفزيوني.
  4. إضافة 600 ميكرولتر من العازلة التحلل أعدت في الخطوة 1.1 إلى بيليه وlyse ذلك عن طريق اهتزاز في 1500 دورة في الدقيقة في شاكر الحرارية لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  5. الانحلال الواضح عن طريق الطرد المركزي عند 20000 × ز عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لمواد المنظفات بيليه غير القابلة للذوبان. جمع مسح lysate في أنابيب microfuge 1.5 مل تبريد مسبق والاحتفاظ بها على الجليد.
  6. إجراء برادفورد / BCA القول لتقدير تركيز البروتين. من الضروري ضمان نفس الكمية من البروتين عبر عينات مختلفة قبل إجراء التجربة. نوصي باستخدام ما لا يقل عن 500 ميكروغرام من البروتين لكل رد فعل.
    ملاحظة: في التجارب الموصوفة، استخدمنا الخلايا المستزرعة (Jurkat) والخلايا الأيضية الأولية من أنسجة الفئران. يمكن اعتماد طريقة التليس المذكورة أعلاه لأنواع الخلايا الأخرى أيضًا. متوسط تركيز البروتين الذي تم الحصول عليه لأنواع الخلايا المذكورة أعلاه هو حوالي 500 ميكروغرام لكل 1 × 107 خلايا. تم الحفاظ على خلايا بيركات في RPMI-1640 متوسطة المعدلة لتحتوي على 2 mM L-الجلوتامين، 10 mM HEPES، 1 mm الصوديوم بيروفات، 4500 ملغ / لتر الجلوكوز، و 1500 ملغ / لتر بيكربونات الصوديوم تكملها 10٪ FBS في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. استخدمنا 1 × 107 خلايا جوركات لكل رد فعل. تم عزل الخلايا الالطحالبية الأولية من أنسجة طحال الماوس كما هو موضح26. لفترة وجيزة ، تم macerated أنسجة الطحال على الجليد ، تليها حل الخلايا الحمراء في محلول نقص التوتر والانفصال عن الخلايا الليمفاوية عن طريق الطرد المركزي. استخدمنا 1 × 107 خلايا أساسية لكل رد فعل.

2. Acyl-RAC: حظر مجموعات ثيول الحرة

ملاحظة: يمكن تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في درجة حرارة الغرفة (RT).

  1. نقل lysate إلى أنبوب ميكروفوغ 1.5 مل جديدة وإجراء هطول الأمطار الكلوروفورم والميثانول (CM) على النحو المبين أدناه.
    1. إضافة الميثانول (MeOH) والكلوروفورم (CHCl3)إلى lysate في نسبة نهائية من lysate: MeOH: CHCl3 من 2:2:1 ويهز بقوة لخلق تعليق متجانس.
    2. تدور عند 10,000 × ز لمدة 5 دقيقة لتشكيل بيليه ("فطيرة") في المرحلة البينية بين المرحلتين المائية والعضوية.
    3. إمالة الأنبوب وتستنشق أكبر قدر ممكن من المذيبات باستخدام إبرة أو تلميح تحميل هلام.
    4. الهواء تجفيف بيليه البروتين لبضع دقائق ويغسل بلطف عن طريق إضافة 600 ميكرولتر من MeOH وخلط بلطف لتجنب كسر بيليه
    5. إزالة بعناية MeOH المتبقية وتجفيف بيليه البروتين على مقاعد البدلاء لمدة 5 دقائق تقريبا.
    6. (اختياري) تنفيذ خطوة إضافية الطرد المركزي لتدور أسفل أي بيليه مكسورة بعد غسل MeOH لتجنب فقدان العينة.
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة بعد خطوة هطول الأمطار CM. بمجرد الحصول على بيليه، يمكن تخزينها في 500 ميكرولتر من MeOH في -20 درجة مئوية تصل إلى أسبوع.
      1. حل بيليه البروتين في 200 ميكرولتر من العازلة 2SHB عن طريق الدوامة في 42 درجة مئوية / 1500 دورة في الدقيقة في شاكر الحرارية حتى يذوب بيليه.
    7. (اختياري) احتضان لمدة 5-10 دقيقة إضافية في حمام مائي صوتي لإذابة بيليه.
      ملاحظة: يختلف طول صوتنة اعتمادا على ذوبان المواد. ومع ذلك، سونيكيشن لفترات طويلة يمكن أن يسبب تدهور البروتين.
  2. إعداد 0.2٪ ميثيل ميثثيوسولفونات (V/v) في 2SHB بإضافة 2 ميكرولتر من MMTS إلى 998 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2SHB.
    ملاحظة: استخدم 0.2% MMTS معدة حديثًا لكل تجربة.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من 0.2٪ MMTS في 2SHB إلى كل أنبوب إلى تركيز نهائي من 0.1٪ MMTS. احتضان لمدة 15 دقيقة في 42 درجة مئوية مع اهتزاز في 1500 دورة في الدقيقة في شاكر الحرارية.

3. Acyl-RAC: الهيدروكسيلامين (HAM) الانقسام والتقاط البروتينات S-acylated

  1. كرر هطول الأمطار 3-4x CM كما هو موضح أعلاه لإزالة MMTS. يمكن تقدير إزالة MMTS من خلال عدم وجود رائحة متميزة من MMTS. بعد كل هطول للأمطار، حل بيليه في 100 ميكرولتر من العازلة 2SHB عن طريق دوامة في 42 درجة مئوية/ 1500 دورة في الدقيقة في شاكر الحرارية حتى يذوب الكريات، ثم تمييع مع 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت A.
  2. بعد هطول الأمطار النهائي، تذوب العينات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2SHB كما هو موضح أعلاه وتمييع مع 240 ميكرولتر من المخزن المؤقت A.
  3. في حالة مقارنة التغيرات في S-acylation استجابة لعدة ظروف العلاج، وقياس تركيز البروتين مرة أخرى والمضي قدما مع كمية متساوية من البروتين لكل حالة.
  4. الاحتفاظ بـ 40 ميكرولتر من كل عينة كتحكم في الإدخال.
  5. تقسيم العينات إلى جزأين متساويين من 200 ميكرولتر ووضع علامة على أنابيب "+ HAM" و "- HAM". أضف 50 ميكرولتر من محايدة أعدت حديثا 2 M HAM (درجة الحموضة 7.0-7.5) إلى تركيز نهائي من 400 mM إلى واحد من الأنابيب (+ HAM) و 50 ميكرولتر محايدة 2 M NaCl إلى الأنبوب الثاني (- HAM)، والتي سيتم استخدامها كتحكم سلبي. المضي قدما في إضافة من الخرز ثيوبروبيل سيفوروز (TS).
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة بعد أي من خطوات هطول الأمطار CM. بمجرد الحصول على بيليه، يمكن تخزينها في 500 ميكرولتر من MeOH في -20 درجة مئوية تصل إلى أسبوع. درجة الحموضة محايدة من 2 M HAM يضمن انتقائيته لسندات ثيويستر acyl-cysteine وينبغي تعديلها بعناية. وينبغي توخي الحذر عند التعامل مع العينات في المخزن المؤقت 2SHB لتجنب فقدان العينة بسبب الرغوة المفرطة. جميع الخطوات التالية متطابقة ل - HAM و + عينات HAM.
  6. أضف 30 ميكرولتر من طلاط طُلح TS إلى كل أنبوب وقم بتدوير الأنابيب لمدة 1-2 ساعة في RT.
  7. غسل حبات TS 4x مع 1٪ SDS في المخزن المؤقت A لإزالة لحم الخنزير المتبقية.
    1. تدور بلطف أسفل جميع عينات من السّغة باستخدام ميكروفوج لمدة 1 دقيقة وتستنشق بعناية supernatant.
    2. إعادة تعليق الخرز في 500 ميكرولتر من 1٪ SDS في المخزن المؤقت A.
    3. كرر الخطوة 3.7.1-3.7.2 ثلاث مرات.
      ملاحظة: يتم توفير تنشيط ثيوبروبيل-سيفورخ (TS) تجميد المجففة في وجود المواد المضافة التي يجب غسلها بعيدا في درجة الحموضة محايدة قبل اقتران. يوصى بالمياه المقطرة للتورم والغسيل. وزن 0.1 غرام من الخرز وإعادة تعليق في 1 مل من الماء المقطر والسماح لها بتضخم أثناء الدوران لمدة 30 دقيقة-1 ساعة في RT. غسل الخرز 1x مع المخزن المؤقت A وإعداد الطين مع المخزن المؤقت A، في نسبة 50٪ استقرت المتوسطة إلى 50٪ المخزن المؤقت. يمكن تخزين TS منتفخة في درجة الحموضة محايدة في وجود الإيثانول 20٪ في 4 درجة مئوية تصل إلى أسبوع. لا تستخدم أزيد الصوديوم كعامل بكتريوستاتيكي لأن أيون الأزيد تتفاعل مع مجموعات ثنائي الكبريتيد 2-pyridyl. لكفاءة أعلى، وإعداد الخرز الطازج. أثناء التعامل مع الخرز ، يمكن قطع طرف P200 pipette قليلاً لمنع أي ضرر.
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة في أي مرحلة بعد هطول الأمطار CM. قد يتم تخزين بيليه في 500 ميكرولتر من MeOH في -20 درجة مئوية تصل إلى أسبوع.

4. Elution والكشف عن البروتينات S-acylated

  1. بعد غسل الماضي، تدور بلطف أسفل الخرز كما هو موضح أعلاه وتستنشق أكبر قدر ممكن من supernatant دون إزعاج الخرز.
  2. استعادة البروتينات من الخرز مع 4x SDS العازلة عينة مع DTT.
    1. إضافة 50 ميكرولتر من 4x SDS العازلة عينة إلى الخرز واحتضان في 80 درجة مئوية، 1500 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في شاكر الحرارية. دع الأنابيب تبرد.
    2. طرد يحبات في 5000 x ز لمدة 3 دقيقة لبيليه تماما الخرز ونقل البروتينات eluted إلى أنبوب 1.5 مل جديدة باستخدام تلميح تحميل هلام.
  3. تشغيل SDS-PAGE وتحليل S-acylation من البروتين (ق) من الفائدة من قبل النشاف الغربي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد البروتوكول المذكور أعلاه، استخدمنا لأول مرة acyl-RAC للكشف في وقت واحد S-acylation من العديد من البروتينات في خلايا جوركات، وهو خط خلية تال خالدة المستمدة أصلا من الدم المحيطي من مريض سرطان الدم خلية تي27. تم اختيار بروتينات الخلايا T التنظيمية التي تم تحديدها سابقًا باسم S-acylated9،28،29 لإظهار فائدة هذه الطريقة. كما هو مبين في الشكل 2A، يمكن الكشف عن التيروسين كيناز ليك في تحلل تعامل مع محايدة 2 M هيدروكسيلامين لشكيس السندات الثيويستر بين مخلفات السيستين وحمض دهني moiety (+ حارة هام). العينة المعالجة بـ 2 M NaCl (- حارة HAM) تمثل عنصر تحكم سلبي مهم ، مما يشير إلى انتقائية التبرير للكشف عن روابط الثيويستر. يؤكد ممر الإدخال كذلك خصوصية الإشارة ويمكن أن يكون بمثابة عنصر تحكم إيجابي إذا لم يكن بروتين الفائدة S-acylated. ثم تم تجريد الغشاء وإعادة التحقيق مع الأجسام المضادة ضد البروتينات Fyn و LAT لإثبات أن أسيل RAC يمكن استخدامها لتحليل S-acylation من البروتينات المتعددة في نفس الوقت(الشكل 2A).

لإثبات فائدة هذه الطريقة للكشف عن البروتين S-acylation في عينات الأنسجة، طبقنا بروتوكول acyl-RAC على طحال الماوس. كما هو مبين في الشكل 2B، يمكن اكتشاف S-acylation من Lck و Fyn و LAT بسهولة في الخلايا الجنبية الأولية للفأرة مما يشير إلى أن يتم الحفاظ على هذا التعديل بين نوعين.

Figure 1
الشكل 1 - ما إذا كانت هناك نسبة التمثيل التخطيطي لـ acyl-RAC. وتتألف الطريقة من 4 خطوات رئيسية: (1) منع مجموعات الثيول الحرة مع ميثيل ميثيوسولفونات (MMTS)، (2) انشقاق انتقائي من السندات ثيويستر السيستين-acyl مع الهيدروكسيلامين محايدة (HAM) لفضح مجموعات السشتاين ثيول، (3) التقاط البروتينات مع ثيول السيستين المكشوفة حديثا عن طريق الاقتران المباشر مع الراتنج ثيول التفاعلي و (4) استعادة البروتينات التي تم التقاطها باستخدام العازلة الإلوطية الحد، تليها المناعي أو تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. الكشف عن البروتينات S-acylated. تم استخدام أساية acyl-RAC للكشف عن S-acylation من بروتينات إشارات الخلايا T في خلايا Jurkat T(A)وأنسجة الطحال المورين(B). المناعي مع Lck-, Fyn- و LAT الأجسام المضادة محددة يظهر S-acylation من هذه البروتينات في عينة المعالجة هيدروكسيلامين (+ حارة هام). العينة المعالجة بكلوريد الصوديوم (- حارة هام) بمثابة تحكم سلبي. وتظهر الانزلات غير المعالجة في حارة الإدخال. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المخزن المؤقت تكوين تلاحظ
الليسيس المخزن المؤقت (LB) 1% DDM في DPBS; 10 ميكرومتر مل211؛ فوسفاتاز مثبط كوكتيل 2 (1:100); كوكتيل مثبط بروتياز (1X)، PMSF (10 mM) إعداد الطازجة، والبرد في 4 درجة مئوية قبل الاستخدام.
المخزن المؤقت SDS (2SHB) 2% SDS; 5 mM EDTA؛ 100 mM HEPES; درجة الحموضة 7.4
المخزن المؤقت أ 5 mM EDTA؛ 100 mM HEPES; درجة الحموضة 7.4
هيدروكسيلامين (هام) 2 م محلول المخزون في المقطر H20 تحضير الطازجة. عند حلها لأول مرة، HAM لديه درجة الحموضة منخفضة جدا. استخدام 5 M NaOH إلى درجة الحموضة إلى 7-7.5.
4X SDS عينة المخزن المؤقت 200 mM تريس-كل (درجة الحموضة 6.8), 8% SDS (كبريتات دوديسي الصوديوم) 0.01% أزرق بروموفينول, 10% الجلسرين الملحق مع 5 mM DTT قبل الاستخدام.

الجدول 1: تكوين المخزن المؤقت للمخازن المؤقتة الشائعة الاستخدام المطلوبة في البروتوكول. 2SHB العازلة والمخزن المؤقت A يمكن إعدادها مقدما ولكن يجب التحقق من درجة الحموضة الخاصة بهم بانتظام. يجب إعداد الليسيس المؤقت وHAM في يوم التجربة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، نجحنا في استخدام فحص acyl-RAC للكشف عن S-acylation من البروتينات المختارة في كل من الخلايا البشرية المستزرعة والخلايا الأولية المستمدة من أنسجة الماوس. هذه الطريقة بسيطة وحساسة ، ويمكن تنفيذها بسهولة مع الحد الأدنى من متطلبات المعدات باستخدام تقنيات الكيمياء الحيوية القياسية. وقد ثبت أن هذه الطريقة لتحديد بنجاح رواية S-acylated البروتينات مثل وحدة فرعية من نظام نقل تحديد المواقع البروتين (Sec61b), البروتين riبوم S11 (Rps11), وglutathione ميكروسومي- S-transferase 3 (MGST3)22.S حساسية وقابلية التكيف من acyl-RAC يجعلها مناسبة لدراسة البروتين S-acylation في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية.

يمكن أن يرتبط جزء كبير من البروتينات S-acylated مع أجزاء غنية بالدهون من غشاء البلازما، والمعروف أيضا باسم الطوافات الدهنية. وهكذا، قد لا يتم استخراج بعض البروتينات S-acylated بالكامل إذا تم استخدام المنظفات خفيفة، مثل تريتون X-100، NP-40 أو Brij58، لليليس30. يمكن استخدام المنظفات الأنيونية (مثل SDS) أو المنظفات غير الأيونية القائمة على المالوسيد (مثل n-dodecyl α-D-maltoside (DDM)) لضمان انفصام طوافات الدهون والاستعادة الكاملة للبروتينات ذات الفائدة30،31،32. في هذا البروتوكول، استخدمنا DDM، وهو خفيف، مثل الدهون المنظفات غير الأيونية التي ثبت أن تكون فعالة في استخراج البروتين غشاء والحفاظ على حالتها الأصلية مستقرة على مدى فترات طويلة33.

يمكن أن يؤدي نشاط ثيويستراز غير المنظم أثناء تحليل العينة إلى انخفاض غلة البروتين بعد خطوة سحب TS إلى الأسفل وبالتالي التأثير على الكشف عن البروتينات S-acylated. يمكن إضافة مثبط ثيوستراز ، مثل ML211 ، وهو مثبط مزدوج لـ Acyl-Protein Thioesterase 1 (APT1 ، LYPLA1) وAcyl-Protein Thioesterase 2 (APT2 ، LYPLA2) لمنع إزالة البروتينالعشوائي في التحلل34،35.

يمكن أن يؤدي الحصار غير الكامل لمخلفات السيستين إلى ربط البروتينات غير المنقوصة بـ TS ، مما يؤدي إلى خلفية عالية واضحة من خلال الإشارة العالية في عينات -HAM. يمكن تقليل ربط الخلفية بشكل كبير من خلال حضانة إضافية مع عامل ثيول crosslinking-2,2'-dithiodipyridine كما هو موضح في بروتوكول ABE المعدلمن قبل Zhou et al.36.

على النقيض من وضع العلامات الأيضية، لا يقتصر acyl-RAC على الخلايا الحية ويمكن إجراؤها للكشف عن البروتين S-acylation في عينات الأنسجة المعزولة حديثا أو المجمدة. وبما أن بروتوكول acyl-RAC يتجنب خطوة الترسيب المناعي ، يمكن استخدامه في وقت واحد للكشف عن الدهون من البروتينات المتعددة ذات الأهمية في نفس الفحص ، وبالتالي يمكن تقليل كمية المواد البيولوجية المطلوبة في تجربة واحدة. ومع ذلك، الأيض القائم على وضع العلامات المقالات هي أكثر ملاءمة للتجارب التي تهدف إلى الكشف على وجه التحديد دي نوفو S-acylation أو قياس معدلات دوران الأحماض الدهنية على بروتين الفائدة. آخر الحد المهم من acyl-RAC هو أن هذه التقنية غير قادرة على التمييز بين الأحماض الدهنية المختلفة التي يمكن أن تكون ملزمة covalently إلى بقايا السيستين عبر نفس السندات ثيويستر3,4,5,6,7.

ويستند كل من acyl-RAC وABE المقالات على الانقسام الانتقائي للسندات ثيويستر بين بقايا السيستين والأحماض الدهنية للكشف عن مجموعة ثيول الحرة. منذ acyl-RAC يستخدم السحب المباشر إلى أسفل من البروتينات S-acylated بواسطة الراتنج ثيول التفاعلي, هذه الطريقة تتطلب خطوات أقل بالمقارنة مع ABE. على الرغم من أن مماثلة, دراسات على نطاق بروتيم من S-acylation تظهر بعض الاختلاف في البروتينات التي تم الكشف عنها باستخدام هاتين الطريقتين, على الأرجح بسبب الاختلافات التقنية. على سبيل المثال ، في تجانس دماغ الفئران ، حدد التحليل المستند إلى ABE 241 بروتينًا S-acylated في حين حدد التحليل المستند إلى acyl-RAC 14425. تم اكتشاف 61 بروتينًا في بروتيم دماغ الفئران عادة ً من خلال كلتا الطريقتين مما يؤكد الحاجة إلى استخدام تقنيات متعددة للتأكد من حالة S-acylation للبروتين.

عيب آخر محتمل من أساليب acyl-RAC وABE هو عدم القدرة على تقييم موثوق قياس s-acylation s-acylation وتحديد عدد السيستينات الدهنية. تم تطوير تعديل هذه التقنيات ، التي تسمى acyl-PEG تبادل أو قول التحول PEG ، لمعالجة هذه القيود37،38. في هذه الطريقة، يتم استبدال خطوة السحب إلى أسفل بعد انشقاق هيدروكسيلامين بالحضانة مع PEG-maleimide العلامة الشامل. يمكن ملاحظة PEGylation الناتجة من مخلفات السيستين الحرة المكشوفة كتحول جماعي من قبل SDS-PAGE.

في الختام، acyl-RAC هو طريقة سريعة وحساسة وموثوق بها التي يمكن أن توفر رؤى قيمة في ديناميات البروتين S-acylation تحت كل من الظروف الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية في مجموعة كبيرة ومتنوعة من العينات البيولوجية. بالنظر إلى القيود المفروضة على الطريقة التي نوقشت أعلاه، ينصح مزيج من acyl-RAC مع تقنيات أخرى لتوصيف تماما S-acylation من بروتين الفائدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة المنح 5R01GM115446 و 1R01GM130840.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets Sigma 11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424 Eppendorf 22620444
Hydroxylamine (HAM) Sigma 159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS) Sigma 64306
Mini tube rotator LabForce
ML211 Cayman 17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake Benchmark Scientific H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) Sigma D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) Sigma T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator L & R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
  2. Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).
  3. Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).
  4. DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).
  5. Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).
  6. Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).
  7. Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
  8. Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).
  9. Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).
  10. Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
  11. Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).
  12. O'Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
  13. Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
  14. Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40 (2), 191-197 (2006).
  15. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
  16. Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
  17. Rami, N., Hannoush, N. A. -R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).
  18. Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
  19. Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
  20. Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
  21. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).
  22. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  23. Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
  24. Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).
  25. Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  26. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
  27. Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
  28. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).
  29. Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).
  30. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
  31. Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).
  32. Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).
  33. Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), (2017).
  34. Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
  35. Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
  36. Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).
  37. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).
  38. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 158، الكيمياء الحيوية، علم المناعة، بيولوجيا الخلايا، S-acylation، palmitoylation، تعديل ما بعد الترجمة، Acyl-RAC، الخلايا الجنبية، الخلايا الليمفاوية
الكشف عن البروتين S-Acylation باستخدام Acyl-الراتنج بمساعدة التقاط
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tewari, R., West, S. J., Shayahati,… More

Tewari, R., West, S. J., Shayahati, B., Akimzhanov, A. M. Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture. J. Vis. Exp. (158), e61016, doi:10.3791/61016 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter