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Biochemistry

Acyl-राल सहायता प्राप्त कब्जा का उपयोग कर प्रोटीन एस-Acylation का पता लगाने

Published: April 10, 2020 doi: 10.3791/61016
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, McGovern Medical School at UT Health, 2MD Anderson UT Health Graduate School
* These authors contributed equally

Summary

Acyl-आरएसी (Acyl-Resin असिस्टेड कैप्चर) विभिन्न प्रकार के जैविक नमूनों में साइस्टीन अवशेषों (एस-एसिलेशन) के रिवर्सिबल लिपिड संशोधन का पता लगाने के लिए विधि करने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील, विश्वसनीय और आसान है।

Abstract

प्रोटीन एस-एसिलेशन, जिसे एस-पामिटोइलेशन भी कहा जाता है, एक लेबिल थिओस्टर बॉन्ड के माध्यम से लंबी श्रृंखला फैटी एसिड के साथ साइस्टीन अवशेषों का एक रिवर्सिबल पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है। एस-acylation, जो एक व्यापक नियामक तंत्र के रूप में उभर रहा है, प्रोटीन की जैविक गतिविधि के लगभग सभी पहलुओं को मिलाना कर सकते हैं, जटिल गठन से प्रोटीन तस्करी और प्रोटीन स्थिरता के लिए । प्रोटीन एस-एसिलेशन के जैविक कार्य की समझ में हाल की प्रगति मुख्यतः उपन्यास जैव रासायनिक उपकरणों के विकास के कारण हासिल की गई थी, जिससे विभिन्न प्रकार के जैविक नमूनों में प्रोटीन एस-एसिलेशन का मजबूत और संवेदनशील पता लगाया जा सकता है। यहां, हम एसिल रेसिन-असिस्टेड कैप्चर (Acyl-आरएसी) का वर्णन करते हैं, जो हाल ही में विकसित विधि है जो थिओल-प्रतिक्रियाशील सेफलोस मोतियों द्वारा एंडोजेन्सी एस-एसाइटेड प्रोटीन के चयनात्मक कैप्चर पर आधारित है। मौजूदा दृष्टिकोणों की तुलना में, Acyl-RAC कम कदम की आवश्यकता है और अधिक विश्वसनीय परिणाम उपज जब उपन्यास एस-acylation लक्ष्यों की पहचान के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर कर सकते हैं । इस तकनीक में एक प्रमुख सीमा एक ही thioester बांड के माध्यम से cysteines से जुड़ी फैटी एसिड प्रजातियों के बीच भेदभाव करने की क्षमता की कमी है ।

Introduction

एस-एसिलेशन एक रिवर्सिबल पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जिसमें एक लेबिल थिओस्टर बॉन्ड1के माध्यम से एक लक्ष्य प्रोटीन पर एक आंतरिक साइस्टीन अवशेषों में फैटी एसिल श्रृंखला को जोड़ना शामिल है। यह पहली बार palmitate, एक संतृप्त 16 कार्बन फैटी एसिड2के साथ प्रोटीन के संशोधन के रूप में सूचित किया गया था, और इसलिए इस संशोधन अक्सर एस-palmitoylation के रूप में संदर्भित किया जाता है । पाजिटेट के अलावा, प्रोटीन को विभिन्न प्रकार के लंबे और छोटे संतृप्त (माइरिस्टेट और स्टीरेट), मोनोअनसैचुरेटेड (ओलेट) और पॉलीअनसैचुरेटेड (अराचिदान और आइकोसैपेंटानोएट) फैटी एसिड3,,4,,55,6,,7द्वारा प्रतिवर्तित रूप से संशोधित किया जा सकता है। यूकेरियोटिक कोशिकाओं में, एस-एसिलेशन को डीएचसी प्रोटीन एसिलट्रांसफरेस के नाम से जाने जाने वाले एंजाइमों के परिवार द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है और साइस्टीन डीसिलेशन की रिवर्स प्रतिक्रिया प्रोटीन थिओस्टेरेनेस द्वारा उत्प्रेरित होती है, जिनमें से अधिकांश अभी भी रहस्यपूर्ण8रहते हैं।

थिओएस्टर बॉन्ड की लेबिलिटी इस लिपिड संशोधन को उलटा बनाती है, जिससे यह प्रोटीन क्लस्टरिंग, प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण, इंट्रासेलर ट्रैफिकिंग, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और प्रोटीन स्थिरता9,,10को गतिशील रूप से विनियमित कर सकता है । नतीजतन, एस-acylation हंटिंगटन रोग, अल्जाइमर रोग और कैंसर के कई प्रकार (प्रोस्टेट, गैस्ट्रिक, मूत्राशय, फेफड़ों, कोलोरेक्टल) सहित कई विकारों से जोड़ा गया है, जो विश्वसनीय तरीकों के विकास के लिए इस के बाद अनुवाद प्रोटीन संशोधन11का पता लगाने की आवश्यकता है ।

रेडियोधर्मी([3एच],[14सी] या[125I]) के साथ मेटाबोलिक लेबलिंग प्रोटीन एस-एसिलेशन12,,13,,14परख के लिए विकसित पहले दृष्टिकोणों में से एक थी। हालांकि, रेडियोलेबलिंग आधारित तरीके स्वास्थ्य चिंताओं को पेश करते हैं, बहुत संवेदनशील नहीं हैं, समय लेने वाली हैं, और केवल अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन15के लिपिडेशन का पता लगाते हैं। रेडियोलेबलिंग के लिए एक तेज और गैर रेडियोधर्मी विकल्प बायोऑर्थोगोनल फैटी एसिड जांच के साथ मेटाबोलिक लेबलिंग है, जिसका उपयोग नियमित रूप से प्रोटीन एस-एसिलेशन16की गतिशीलता को परख करने के लिए किया जाता है। इस विधि में, एक रासायनिक रिपोर्टर (एल्किन या अजाइड समूह) के साथ एक फैटी एसिड को प्रोटीन एसिलट्रांसफरेज द्वारा एस-एसाइटेड प्रोटीन में शामिल किया जाता है। अजाइड-अल्किन ह्यूज़न साइक्लोएडिक्शन रिएक्शन (क्लिक केमिस्ट्री) का उपयोग एक कार्यात्मक समूह को संलग्न करने के लिए किया जा सकता है, जैसे फ्लोरोफोर या बायोटिन, एकीकृत फैटी एसिड में, जो एस-एसाइटेड प्रोटीन17,,18,,19का पता लगाने की अनुमति देता है।

Acyl-biotin एक्सचेंज (ABE) एस-acylated प्रोटीन की कैप्चर और पहचान के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग किए जाने वाले जैव रासायनिक तरीकों में से एक है जो ऊतक नमूनों के लिए अनुपयुक्तता जैसे मेटाबोलिक लेबलिंग की कुछ कमियों को दरकिनार करता है15। इस विधि को विभिन्न जैव नमूनों में एस-एसिलेशन के विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें ऊतक और जमे हुए सेल नमूने शामिल हैं,जिनमें 20,,21 शामिलहैं। यह विधि एसिल समूह और तटस्थ हाइड्रोक्सिलमाइन द्वारा साइस्टीन अवशेषों के बीच थिओस्टर बांड के चयनात्मक दरार पर आधारित है। इसके बाद मुक्त थिओल समूहों को थिओल-रिएक्टिव बायोटिन डेरिवेटिव के साथ कैप्चर किया जाता है । उत्पन्न बायोटिनी प्रोटीन तब स्ट्रेप्टाविडिन अगारोज का उपयोग करके आत्मीयता-शुद्ध होते हैं और इम्यूनोलोटिंग द्वारा विश्लेषण किया जाता है।

बाद में एक वैकल्पिक दृष्टिकोण को एक थिओल-रिएक्टिव रिसिन22,,23द्वारा मुफ्त साइस्टीन के प्रत्यक्ष संयोजन के साथ बायोटिनीलेशन कदम को बदलने के लिए शुरू किया गया था । इस विधि में आबे की तुलना में कम कदम हैं और इसी तरह नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रोटीन एस-एसिलेशन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है1।

Acyl-आरएसी 4 मुख्य चरणों के होते हैं(चित्रा 1),
1. मुक्त थिओल समूहों को अवरुद्ध करना;
2. साइस्टीन थिओल माइन (एचएच) के साथ साइस्टीन-एसिल थिओस्टर बॉन्ड का चयनात्मक दरार साइस्टीन थिओल समूहों को बेनकाब करने के लिए;
3. थिओल-रिएक्टिव रिसिज़न के साथ लिपिडाय साइस्टीन ्स पर कब्जा;
4. बफर को कम करने के साथ एल्यूशन के बाद एस-एसाइटेड प्रोटीन का चयनात्मक संवर्धन।

इसके बाद पकड़े गए प्रोटीन का विश्लेषण इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा किया जा सकता है या बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित प्रोटेओमिक्स के अधीन किया जा सकता है ताकि विभिन्न प्रजातियों और ऊतकों में एस-एसाइटेटेड प्रोटेम का आकलन किया जा सके22,24,25। व्यक्तिगत एस-एसिलेशन साइटों को कैप्चर किए गए प्रोटीन के ट्राइप्सिन पाचन और एलसी-एमएस/एमएस22द्वारा परिणामी पेप्टाइड्स के विश्लेषण द्वारा भी पहचाना जा सकता है। यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि कोशिका रेखा और ऊतक नमूने दोनों में कई प्रोटीन के एस-acyation का एक साथ पता लगाने के लिए acyl-RAC का उपयोग कैसे किया जा सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल चूहों NIH दिशा निर्देशों के अनुसार इच्छामृत्यु थे । ह्यूस्टन में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र विश्वविद्यालय में पशु कल्याण समिति सभी पशु काम को मंजूरी दे दी ।

1. सेल लाइसेट की तैयारी

  1. टेबल 1में वर्णित लिसिस बफर तैयार करें। पीबीएस के 10 एमएल के लिए, एन-डोडकिल के 0.1 ग्राम को जोड़ें-डी-माल्टोसाइड डिटर्जेंट (डीडीएम) और भंग करने के लिए घुमाएं। फॉस्फेटेज अवरोधक कॉकटेल 2, एमएल211 (10 माइक्रोन), पीएमएसएफ (10 एमएम) और प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल (1x) के 100 माइक्रोन जोड़ें और उपयोग से पहले बर्फ पर बफर को ठंडा करें।
  2. किसी भी सेल मलबे से छुटकारा पाने के लिए 5 मिन और एस्पिरेट के लिए 350 x ग्राम पर इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को 15 मिलीएल या 50 मिलीग्राम शंकुट्यूब और स्पिन कोशिकाओं में स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक मीडिया।
    नोट: हमने प्रत्येक एसिल-आरएसी प्रतिक्रिया के लिए 1 x 107 कोशिकाओं का उपयोग किया।
  3. पीबीएस के 5 mL में इसे फिर से निलंबित करके और 5 मिन के लिए 350 x ग्राम पर कताई द्वारा गोली धोएं।
    नोट: पीबीएस में विस्तारित ऊष्मायन के कारण सेल लिसिस से बचने के लिए जल्दी से कदम 1.3 करें।
  4. चरण 1.1 में तैयार किए गए लिसिस बफर के 600 माइक्रोन को 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मीटर के लिए थर्मल शेकर में 1500 आरपीएम पर हिलाकर ले जाना चाहिए।
  5. पैलेट डिटर्जेंट-अघुलनशील सामग्री के लिए 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20,000 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा स्पष्ट रूप से स्पष्ट रूप से स्पष्ट है। प्री-कूल्ड 1.5 मिलीस माइक्रोफ्यूज ट्यूब में साफ लेज़ लीजिए और उन्हें बर्फ पर रखें।
  6. प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए ब्रैडफोर्ड/बीसीए परख करें । प्रयोग करने से पहले विभिन्न नमूनों में प्रोटीन की एक ही मात्रा सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। हम प्रति प्रतिक्रिया कम से कम 500 माइक्रोन प्रोटीन का उपयोग करने की सलाह देते हैं।
    नोट: वर्णित प्रयोगों में, हमने चूहों के ऊतकों से सुसंस्कृत (जुरकैट) कोशिकाओं और प्राथमिक प्लंप्लेट का उपयोग किया। ऊपर वर्णित लिसिस विधि को अन्य सेल प्रकारों में भी अपनाया जा सकता है। उपरोक्त सेल प्रकारों के लिए प्राप्त औसत प्रोटीन एकाग्रता लगभग 500 μg प्रति 1 x 107 कोशिकाओं है। आरपीएमआई-1640 मीडियम में ज्यूरीट कोशिकाओं को रखा गया था 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 10 एमएम हेप्स, 1 एमएम सोडियम पायरुवेट, 4,500 मिलीग्राम/एल ग्लूकोज, और 1,500 मिलीग्राम/एल सोडियम बाइकार्बोनेट को 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% एफबीएस के साथ पूरक किया गया था। हमने प्रति प्रतिक्रिया 1 x 107 जुरकैट कोशिकाओं का उपयोग किया। प्राथमिक प्लोनोसाइट्स माउस तिल्ली ऊतक से अलग थे जैसा कि26वर्णित है। संक्षेप में, तिल्ली ऊतक बर्फ पर मैकेरेटेड किया गया था, इसके बाद हाइपोटोनिक समाधान में एरिथ्रोसाइट्स का लाइसिस और सेंट्रलाइफुगम द्वारा लिम्फोसाइट्स से अलग किया गया था। हमने प्रति प्रतिक्रिया 1 x 107 प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग किया।

2. Acyl-आरएसी: मुक्त थिओल समूहों के अवरुद्ध

नोट: बाद के सभी चरणों को कमरे के तापमान (आरटी) पर किया जा सकता है।

  1. एक ताजा 1.5 mL माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और नीचे वर्णित क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल (सेमी) वर्षा करें।
    1. मिह: 2:2:1 के सीएचसीएल 3 और सजातीय निलंबन बनाने के लिए सख्ती से हिलाएं: मेयोह: 2:2:1 के सीसीएल3 में मेथनॉल (MeOH) और क्लोरोफॉर्म (सीसीएल3)जोड़ें।
    2. जलीय और कार्बनिक चरणों के बीच इंटरचरण में एक गोली ("पैनकेक") बनाने के लिए 5 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर स्पिन करें।
    3. सुई या जेल लोडिंग टिप का उपयोग करके ट्यूब और एस्पिरेट को जितना संभव हो उतना सॉल्वेंट झुकाएं।
    4. हवा कुछ मिनट के लिए प्रोटीन गोली सूखी और धीरे से MeOH के ६०० μL जोड़कर इसे धोने और धीरे मिश्रण करने के लिए गोली तोड़ने से बचने के लिए
    5. ध्यान से शेष MeOH निकालें और लगभग 5 मिनट के लिए एक बेंचटॉप पर प्रोटीन गोली सूखी।
    6. (वैकल्पिक) नमूने के नुकसान से बचने के लिए मेओएच वॉश के बाद किसी भी टूटी हुई गोली को स्पिन करने के लिए एक अतिरिक्त केंद्रीकरण कदम उठाएं।
      नोट- सीएम वर्षा के कदम के बाद प्रयोग रोका जा सकता है। एक बार गोली प्राप्त हो जाने के बाद, इसे एक सप्ताह तक -20 डिग्री सेल्सियस में मेओएच के 500 माइक्रोन में संग्रहित किया जा सकता है।
      1. एक थर्मल शेकर में 42 डिग्री सेल्सियस/1500 आरपीएम पर भंवर द्वारा 2SHB बफर के 200 माइक्रोन में प्रोटीन पैलेट भंग जब तक गोली भंग हो जाती है।
    7. (वैकल्पिक) पैलेट को भंग करने के लिए एक ध्वनिक पानी स्नान में एक अतिरिक्त 5-10 min के लिए इनक्यूबेट।
      नोट: सामग्री की घुलनशीलता के आधार पर सोनिकेशन की लंबाई भिन्न होती है। हालांकि, लंबे समय तक सोनिकेशन प्रोटीन क्षरण का कारण बन सकता है।
  2. 2एसएचबी में एमएमटी के 2 माइक्रोन को जोड़कर 2एसएचबी में 02% मिथाइल मीथेनथिओसल्फोनेट (एमएमटीएस) (v/v) तैयार करें।
    नोट: प्रत्येक प्रयोग के लिए हौसले से तैयार 0.2% एमएमटी का उपयोग करें।
  3. 0.1% एमएमटीएस की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक ट्यूब में 2SHB में 0.2% एमएमटी के 200 माइक्रोन जोड़ें। थर्मल शेकर में 1500 आरपीएम पर मिलाते हुए 42 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए इनक्यूबेट।

3. Acyl-आरएसी: हाइड्रोक्सीलामाइन (हैम) दरार और एस-acylated प्रोटीन का कब्जा

  1. एमएमटीएस को हटाने के लिए ऊपर वर्णित 3-4x सेमी वर्षा दोहराएं। एमएमटीएस को हटाने का अनुमान एमएमटीएस की अलग गंध की कमी से लगाया जा सकता है। प्रत्येक वर्षा के बाद, एक थर्मल शेकर में 42 डिग्री सेल्सियस/1500 आरपीएम पर भंवर द्वारा 2SHB बफर के 100 माइक्रोन में गोली भंग जब तक गोली घुल नहीं जाता है, और फिर बफर ए के 300 माइक्रोन के साथ पतला।
  2. अंतिम वर्षा के बाद, 2SHB बफर के 200 माइक्रोन में नमूनों को भंग करें, जैसा कि ऊपर वर्णित है और बफर ए के 240 माइक्रोन के साथ पतला हो।
  3. कई उपचार स्थितियों के जवाब में एस-acylation में परिवर्तन की तुलना करने के मामले में, प्रोटीन एकाग्रता को फिर से मापने और प्रत्येक स्थिति के लिए प्रोटीन की समान मात्रा के साथ आगे बढ़ना ।
  4. इनपुट कंट्रोल के रूप में प्रत्येक नमूने से 40 माइक्रोन बनाए रखें।
  5. नमूनों को 200 माइक्रोन के दो बराबर भागों में विभाजित करें और "+ हैम" और "-हैम" के रूप में ट्यूबों को चिह्नित करें। एक ट्यूब (+ हैम) में से एक में 400 मीटर की अंतिम एकाग्रता में ताजा तैयार तटस्थ 2 एम हैम (पीएच 7.0-7.5) के 50 माइक्रोन जोड़ें, जिसका उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाएगा। थियोप्रोपिल-सेफेरोज (टीएस) मोतियों को जोड़कर आगे बढ़ें।
    नोट: प्रयोग सीएम वर्षा के किसी भी कदम के बाद रोका जा सकता है । एक बार गोली प्राप्त हो जाने के बाद, इसे एक सप्ताह तक -20 डिग्री सेल्सियस में मेओएच के 500 माइक्रोन में संग्रहित किया जा सकता है। 2 एम हैम के तटस्थ पीएच acyl-cysteine thioester बांड के लिए अपनी चयनात्मकता सुनिश्चित करता है और ध्यान से समायोजित किया जाना चाहिए । अत्यधिक फोमिंग के कारण नमूने के नुकसान से बचने के लिए 2SHB बफर में नमूनों को संभालते समय देखभाल की जानी चाहिए। सभी निम्नलिखित चरण ों के लिए समान हैं - हैम और + हैम नमूने।
  6. प्रत्येक ट्यूब में टीएस बीड-घोल के 30 माइक्रोन जोड़ें और आरटी में 1-2 घंटे के लिए ट्यूबों को घुमाएं।
  7. अवशिष्ट हैम को हटाने के लिए बफर ए में 1% एसडीएस के साथ टीएस मोतियों 4x धोएं।
    1. धीरे से 1 मिनट के लिए एक माइक्रोफ्यूज का उपयोग कर सभी माड नमूनों नीचे स्पिन और ध्यान से supernatant aspirate ।
    2. बफर ए में 1% एसडीएस के 500 माइक्रोन में मोतियों को फिर से निलंबित करें।
    3. दोहराएं चरण 3.7.1-3.7.2 तीन बार।
      नोट: सक्रिय thiopropyl-Sepharose (टीएस) को एडिटिव्स की उपस्थिति में फ्रीज-सूखे की आपूर्ति की जाती है जिसे युग्मन से पहले तटस्थ पीएच में धोया जाना चाहिए। सूजन और धोने के लिए आसुत पानी की सिफारिश की जाती है। मोतियों के 0.1 ग्राम वजन और आसुत पानी के 1 mL में फिर से निलंबित और यह प्रफुल्लित करने के लिए, जबकि आरटी में 30 min-1 घंटे के लिए घूर्णन करने की अनुमति । बफर ए के साथ मोती 1x धोएं और बफर ए के साथ एक घोल तैयार करें, ५०% बसे माध्यम से ५०% बफर के अनुपात में । सूजन टीएस को एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 20% इथेनॉल की उपस्थिति में तटस्थ पीएच पर संग्रहीत किया जा सकता है। एक बैक्टीरियोस्टैटिक एजेंट के रूप में सोडियम अजाइड का उपयोग न करें क्योंकि अजाइड आयन 2-पाइरिडिल डिसल्फाइड समूहों के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। उच्च दक्षता के लिए, ताजा मोती तैयार करें। मोतियों को संभालते समय, पी 200 पिपेट टिप की नोक को थोड़ा काटा जा सकता है ताकि किसी भी नुकसान को रोका जा सके।
      नोट: प्रयोग सीएम वर्षा के बाद किसी भी स्तर पर रोका जा सकता है । गोली एक सप्ताह तक -20 डिग्री सेल्सियस में MeOH के 500 μL में स्टोर किया जा सकता है।

4. एल्यूशन और एस-एसाइटेड प्रोटीन का पता लगाना

  1. अंतिम धोने के बाद, मोतियों को धीरे-धीरे ऊपर वर्णित किया गया है और मोतियों को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना अधिवस्ण के रूप में कम करें।
  2. डीटीटी के साथ 4x एसडीएस नमूना बफर के साथ मोतियों से प्रोटीन को ठीक करें।
    1. मोतियों में 4x एसडीएस सैंपल बफर के 50 माइक्रोन जोड़ें और 80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, थर्मल शेकर में 15 मिन के लिए 1500 आरपीएम। ट्यूबों को ठंडा होने दें।
    2. मोतियों को पूरी तरह से पैलेट करने और जेल लोडिंग टिप का उपयोग करके एक ताजा 1.5 मिलीग्राम ट्यूब में चमकित प्रोटीन को स्थानांतरित करने के लिए 3 मिन के लिए 5,000 x ग्राम पर मोतियों को केंद्रित करें।
  3. एसडी-पेज चलाएं और पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा प्रोटीन (एस) ब्याज के एस-एसिलेशन का विश्लेषण करें।

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, हमने पहले न्यायक कोशिकाओं में कई प्रोटीनों के एस-acylation का पता लगाने के लिए acyl-RAC का उपयोग किया, जो मूल रूप से टी सेल ल्यूकेमिया रोगी27के परिधीय रक्त से प्राप्त एक अमर टी सेल लाइन है। नियामक टी सेल प्रोटीन पहले एस-acylated9,,28,,29 के रूप में पहचान की इस विधि की उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए चुना गया था । जैसा कि चित्रा 2Aमें दिखाया गया है, टायरोसिन किनेस एलके को न्यूट्रल 2 एम हाइड्रोक्सीलैमाइन के साथ इलाज किए जाने वाले लिसेट्स में साइस्टीन अवशेषों और फैटी एसिड मोईटी (+ हैम लेन) के बीच थिओएस्टर बांड को क्लीव करने के लिए पाया जा सकता है। 2 एम NaCl (-HAM लेन) के साथ इलाज नमूना एक महत्वपूर्ण नकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है, thioester बांड का पता लगाने के लिए परख की चयनात्मकता का संकेत है । इनपुट लेन आगे संकेत की विशिष्टता की पुष्टि करता है और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते है अगर ब्याज का प्रोटीन एस acylated नहीं है । झिल्ली तो छीन लिया और प्रोटीन Fyn और LAT के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ फिर से जांच के लिए प्रदर्शित करता है कि acyl-आरएसी परख एक ही समय में कई प्रोटीन के एस-acylation का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है(चित्रा 2A)।

ऊतक के नमूनों में प्रोटीन एस-acylation का पता लगाने के लिए इस विधि की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, हमने माउस तिल्ली में acyl-आरएसी प्रोटोकॉल लागू किया। जैसा कि चित्रा 2 बीमें दिखाया गया है, एलसी, फिन और लैट के एस-एसिलेशन का प्राथमिक माउस स्प्लेनोसाइट्स में आसानी से पता लगाया जा सकता है जो यह दर्शाता है कि यह संशोधन दो प्रजातियों के बीच संरक्षित है।

Figure 1
चित्रा 1. acyl-आरएसी का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। विधि में 4 मुख्य चरण होते हैं: (1) मिथाइल मीथेनथिओसल्फोनेट (एमएमटीएस) के साथ मुक्त थिओल समूहों को अवरुद्ध करना, (2) साइस्टीन-एसिल थिओस्टर बॉन्ड के चुनिंदा क्लीवेज के साथ तटस्थ हाइड्रोक्सीलामाइन (एचएच) साइस्टीन थिओल समूहों को बेनकाब करने के लिए, (3) एक थिओल-प्रतिक्रियाशील प्रतिक्रियाशील प्रतिक्रियाऔर (4) एक कम करने elution बफर का उपयोग कर पर कब्जा कर लिया प्रोटीन की वसूली के साथ प्रत्यक्ष संयोजन द्वारा नए उजागर cysteine thiol के साथ प्रोटीन का कब्जा, इम्यूनोब्लॉटिंग या एमएस विश्लेषण के बाद । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2. एस-ससायमित प्रोटीन का पता लगाना। एक acyl-आरएसी परख का उपयोग करने के लिए टी सेल के एस-acylation का पता लगाने के लिए किया गया था Jurkat टी कोशिकाओं(ए)और murine तिल्ली ऊतक(बी)में प्रोटीन संकेत । एलसी-, फिन-और लैट-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोलॉटिंग हाइड्रोक्सिलामाइन उपचारित नमूना (+ हैम लेन) में इन प्रोटीनों के एस-एसिलेशन को दर्शाता है। सोडियम क्लोराइड (-हैम लेन) के साथ इलाज किया गया एक नमूना नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। इनपुट लेन में अनुपचारित लाइसेट्स दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

बफ़र संरचना नोट्स
लिसिस बफर (एलबी) डीपीबीएस में 1% डीडीएम; 10 μM ML211; फॉस्फेटेज़ अवरोधक कॉकटेल 2 (1:100); प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल (1X), पीएमएसएफ (10 एमएम) उपयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर ताजा, ठंडा तैयार करें।
एसडीएस बफर (2एसएचबी) 2% एसडीएस; 5 मीटर EDTA; 100 mM HEPES; पीएच 7.4
बफर ए 5 मीटर EDTA; 100 mM HEPES; पीएच 7.4
हाइड्रोक्सीलामाइन (हैम) 2 एम स्टॉक समाधान आसुत एच20 में नए सिरे से तैयारी करें। जब पहली बार भंग, हैम एक बहुत कम पीएच है । पीएच से 7-7.5 तक 5 एम नाओएच का उपयोग करें।
4X एसडीएस नमूना बफर 200 एमएम ट्रिस-सीएल (पीएच 6.8), 8% एसडीएस (सोडियम डोडेसिल सल्फेट) 0.01% ब्रोमोफेनॉल ब्लू, 10% ग्लाइसेरोल उपयोग से ठीक पहले 5 एमएम डीटीटी के साथ पूरक करें।

तालिका 1: प्रोटोकॉल में आवश्यक आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स की बफर संरचना। 2SHB बफर और बफर ए पहले से तैयार किया जा सकता है लेकिन उनके पीएच को नियमित रूप से जांचा जाना चाहिए। Lysis बफर और हैम प्रयोग के दिन तैयार किया जाना चाहिए ।

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Discussion

यहां, हमने माउस ऊतक से प्राप्त सुसंस्कृत मानव कोशिकाओं और प्राथमिक कोशिकाओं दोनों में चयनित प्रोटीन के एस-acylation का पता लगाने के लिए acyl-RAC परख का सफलतापूर्वक उपयोग किया। यह विधि सरल, संवेदनशील है, और मानक जैव रसायन तकनीकों का उपयोग करके न्यूनतम उपकरण आवश्यकताओं के साथ आसानी से किया जा सकता है। इस विधि को उपन्यास एस-एसाइटेड प्रोटीन जैसे प्रोटीन ट्रांसवेलिंग सिस्टम (Sec61b), राइबोसोमल प्रोटीन S11 (Rps11), और माइक्रोसोमल ग्लूटाथिएक-एस-ट्रांसफराज 3 (MGST3)22की पहचान करने के लिए दिखाया गया है ।S एसिल-आरएसी की संवेदनशीलता और अनुकूलनशीलता विभिन्न प्रकार के जैविक नमूनों में प्रोटीन एस-एसिलेशन का अध्ययन करना उपयुक्त बनाती है।

एस-एसाइटेड प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण अंश प्लाज्मा झिल्ली के ग्लाइकोस्फिनोलिपिड-समृद्ध हिस्सों से जुड़ा हो सकता है, जिसे लिपिड राफ्ट के रूप में भी जाना जाता है। इस प्रकार, कुछ एस-एसाइलेटेड प्रोटीन पूरी तरह से निकाले नहीं जा सकते हैं, यदि ट्राइटन एक्स-100, एनपी-40 या बृज58 जैसे हल्के डिटर्जेंट का उपयोग लाइसिस30के लिए किया जाता है। एनिनिक डिटर्जेंट (जैसे एसडीएस) या माल्टोसाइड आधारित गैर-आयनिक डिटर्जेंट (जैसे एन-डोडेसिल-डी-माल्टोसाइड (डीडीएम)) का उपयोग लिपिड राफ्ट के विसोशन और ब्याज30,,31,,32के प्रोटीन की पूर्ण वसूली सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने डीडीएम का उपयोग किया, एक हल्के, लिपिड की तरह गैर-आयनिक डिटर्जेंट जिसे झिल्ली प्रोटीन निष्कर्षण में प्रभावी होने और लंबे समय तक33तक अपने स्थिर मूल राज्य को बनाए रखने के लिए प्रदर्शित किया गया है।

नमूने के लिसिस के दौरान अनियमित थिओस्टेरेज़ गतिविधि संभावित रूप से टीएस पुल-डाउन कदम के बाद प्रोटीन उपज में कम हो सकती है और इस प्रकार एस-एसाइटेड प्रोटीन का पता लगाने को प्रभावित करती है। ML211 जैसे एक थिओस्टेरेटेस अवरोधक, Acyl-प्रोटीन Thioesterase 1 (APT1, LYPLA1) और Acyl-प्रोटीन Thioesterase 2 (APT2, LYPLA2) के लिए एक दोहरी अवरोधक lysate३४,,३५में प्रोटीन के अंधाधुंध deacylation को रोकने के लिए जोड़ा जा सकता है ।

साइस्टीन अवशेषों की एक अधूरी नाकाबंदी टीएस के लिए गैर-acylated प्रोटीन की बाध्यकारी पैदा कर सकती है, इस प्रकार -हैम नमूनों में उच्च संकेत द्वारा स्पष्ट उच्च पृष्ठभूमि होती है। पृष्ठभूमि बाध्यकारी काफी हद तक एक थिओल-क्रॉसलिंकिंग एजेंट के साथ एक अतिरिक्त ऊष्मायन से कम किया जा सकता है-2,2'-dithiodipyridine के रूप में झोउ एट अलद्वाराएक संशोधित ABE प्रोटोकॉल में वर्णित है ।

मेटाबोलिक लेबलिंग के विपरीत, acyl-आरएसी जीवित कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं है और हौसले से अलग या जमे हुए ऊतक नमूनों में प्रोटीन एस-acylation का पता लगाने के लिए किया जा सकता है । चूंकि acyl-आरएसी प्रोटोकॉल एक इम्यूनोप्रिसिप्रिशन कदम से बचा जाता है, यह एक साथ एक ही परख में ब्याज की कई प्रोटीन के लिपिडेशन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रकार संभवतः एक ही प्रयोग में आवश्यक जैविक सामग्री की मात्रा को कम करने । हालांकि, मेटाबोलिक लेबलिंग आधारित परख विशेष रूप से डी नोवो एस-acylation का पता लगाने या ब्याज के प्रोटीन पर फैटी एसिड कारोबार दरों को मापने के उद्देश्य से प्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त हैं । एक्ल-आरएसी की एक अन्य महत्वपूर्ण सीमा यह है कि यह तकनीक विभिन्न फैटी एसिड के बीच अंतर करने में असमर्थ है जिसे एक ही थियोस्टर बॉन्ड3,4,,5,6,7के माध्यम से साइस्टीन अवशेषों के लिए सहसंयोजकीय रूप से बाध्य किया जा सकता है ।

दोनों acyl-आरएसी और ABE परख साइटीन अवशेषों और एक फैटी एसिड के बीच thioester बांड के चयनात्मक दरार पर आधारित है एक मुक्त thiol समूह प्रकट करते हैं । चूंकि acyl-आरएसी एक थिओल-प्रतिक्रियाशील प्रतिक्रियाशील द्वारा एस-acylated प्रोटीन के प्रत्यक्ष पुल-डाउन का उपयोग करता है, इस विधि के लिए अबे की तुलना में कम कदम की आवश्यकता होती है । हालांकि इसी तरह, एस-acylation के प्रोटेम-वाइड अध्ययन इन दो तरीकों का उपयोग करके पाए गए प्रोटीन में कुछ भिन्नता दिखाते हैं, तकनीकी मतभेदों के कारण सबसे अधिक संभावना है। उदाहरण के लिए, चूहे के मस्तिष्क में होमोगेनेट, ABE आधारित विश्लेषण ने 241 एस-एसाइटेड प्रोटीन की पहचान की जबकि एसिल-आरएसी आधारित विश्लेषण ने 14425की पहचान की। चूहे के मस्तिष्क प्रोटेम में 61 प्रोटीन आमतौर पर प्रोटीन की एस-एसिलेशन स्थिति का पता लगाने के लिए कई तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता को रेखांकित करने वाले दोनों तरीकों से पता लगाया जाता था।

Acyl-आरएसी और ABE तरीकों की एक और संभावित खामी एस-acylation के stoichiometry का मज़बूती से मूल्यांकन करने और लिपिड साइस्टीन की संख्या निर्धारित करने में असमर्थता है । इन तकनीकों का एक संशोधन, जिसका नाम acyl-खूंटी एक्सचेंज या खूंटी-शिफ्ट परख कहा जाता है, इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए विकसित किया गया था37,,38। इस विधि में, हाइड्रोक्सीलामाइन दरार के बाद पुल-डाउन कदम को खूंटी-मैलियामिड मास-टैग के साथ ऊष्मायन द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। जिसके परिणामस्वरूप उजागर मुक्त सायस्टीन अवशेषों के PEGylation SDS-PAGE द्वारा बड़े पैमाने पर बदलाव के रूप में मनाया जा सकता है ।

अंत में, acyl-आरएसी एक तेज, संवेदनशील और विश्वसनीय विधि है जो जैविक नमूनों की एक महान विविधता में शारीरिक और रोगविज्ञानी दोनों स्थितियों के तहत प्रोटीन एस-एसिलेशन की गतिशीलता में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है। ऊपर चर्चा की विधि की सीमाओं को ध्यान में रखते हुए, अन्य तकनीकों के साथ acyl-आरएसी का एक संयोजन पूरी तरह से ब्याज की एक प्रोटीन के एस-acylation की विशेषता की सिफारिश की है ।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं ।

Acknowledgments

इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान 5R01GM115446 और 1R01GM130840 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets Sigma 11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424 Eppendorf 22620444
Hydroxylamine (HAM) Sigma 159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS) Sigma 64306
Mini tube rotator LabForce
ML211 Cayman 17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake Benchmark Scientific H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) Sigma D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) Sigma T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator L & R

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Tewari, R., West, S. J., Shayahati, B., Akimzhanov, A. M. Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture. J. Vis. Exp. (158), e61016, doi:10.3791/61016 (2020).

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