Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Detecção de Proteína S-Acilação usando captura assistida de acila-resina

Published: April 10, 2020 doi: 10.3791/61016
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, McGovern Medical School at UT Health, 2MD Anderson UT Health Graduate School
* These authors contributed equally

Summary

A Cil-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) é um método altamente sensível, confiável e fácil de executar para detectar modificações lipídicas reversíveis de resíduos de cisteína (S-acilação) em uma variedade de amostras biológicas.

Abstract

A proteína S-acilação, também referida como S-palmitoylation, é uma modificação pós-translacional reversível de resíduos de cisteína com ácidos graxos de cadeia longa através de uma ligação de tiéster labile. A acilação s, que está emergindo como um mecanismo regulatório generalizado, pode modular quase todos os aspectos da atividade biológica das proteínas, desde a formação complexa até o tráfico de proteínas e a estabilidade proteica. O recente progresso na compreensão da função biológica da proteína S-acilação foi alcançado em grande parte devido ao desenvolvimento de novas ferramentas bioquímicas permitindo a detecção robusta e sensível da proteína S-acilação em uma variedade de amostras biológicas. Aqui, descrevemos a captura assistida por acilina (Acyl-RAC), um método recentemente desenvolvido baseado na captura seletiva de proteínas endógenas S-acylated por contas de Sefarrose reativas de tiol. Em comparação com as abordagens existentes, a Acyl-RAC requer menos passos e pode produzir resultados mais confiáveis quando associada à espectrometria de massa para identificação de novos alvos de acilação S. Uma grande limitação nesta técnica é a falta de capacidade de discriminação entre espécies de ácidos graxos ligadas a cisteínas através da mesma ligação thioester.

Introduction

A s-acilação é uma modificação pós-translacional reversível que envolve a adição de uma cadeia de acila gordurosa a um resíduo de cisteína interna em uma proteína alvo através de uma ligação de thioester labile1. Foi relatado pela primeira vez como uma modificação de proteínas com palmitato, um ácido graxo saturado de 16carbonos 2, e, portanto, esta modificação é frequentemente referida como S-palmitoylation. Além do palmitato, as proteínas podem ser reversivelmente modificadas por uma variedade de ácidos graxos mais longos e curtos saturados (myristate e esteato), monoinsaturados (oleato) e poliinsaturados (aracidonate e eicosapentanoato) ácidos graxos3,4,5,6,7. Em células eucarióticas, a s-acilação é catalisada por uma família de enzimas conhecidas como aciltransferases de proteína DHHC e a reação reversa da deacinada cisteína é catalisada por thioesterases protéicas, a maioria das quais ainda permanecem enigmáticas8.

A labilidade da ligação tioester torna reversível essa modificação lipídica, permitindo-lhe regular dinamicamente o agrupamento de proteínas, a localização da membrana plasmática, o tráfico intracelular, as interações proteína-proteína e a estabilidade proteica9,10. Consequentemente, a s-acilação tem sido associada a vários distúrbios, incluindo a doença de Huntington, doença de Alzheimer e vários tipos de câncer (próstata, gástrico, bexiga, pulmão, colorretal), o que requer o desenvolvimento de métodos confiáveis para detectar essa modificação proteica pós-translacional11.

A rotulagem metabólica com palmitato radioativo([3H], [14C] ou [125I]) foi uma das primeiras abordagens desenvolvidas para ensaio de proteína S-acilação12,13,14. No entanto, os métodos baseados em rotulagem por radiorotulagem apresentam preocupações de saúde, não são muito sensíveis, demorados e detectam apenas lipidação de proteínas altamente abundantes15. Uma alternativa mais rápida e não radioativa à rotulagem radioativa é a rotulagem metabólica com sondas de ácidos graxos bioortogonais, que é usada rotineiramente para ensaio dinâmico da proteína S-acilação16. Neste método, um ácido graxo com um repórter químico (grupo alquina ou azida) é incorporado na proteína S-acylated por uma proteína aciltransferase. A reação de cicloadição de Azide-alquino Huisgen (química do clique) pode então ser usada para anexar um grupo funcionalizado, como um floróforo ou biotina, ao ácido graxo integrado que permite a detecção da proteína S-acylated17,18,19.

A troca de acilina (ABE) é um dos métodos bioquímicos amplamente utilizados para captura e identificação de proteínas S-acyladas que ignora algumas das deficiências da rotulagem metabólica, como a inadequação para amostras de tecido15. Este método pode ser aplicado para análise da s-acilação em uma variedade diversificada de amostras biológicas, incluindo tecidos e amostras de células congeladas20,21. Este método baseia-se no decote seletivo da ligação tioester entre o grupo acile e o resíduo de cisteína por hidroxilamina neutra. Os grupos thiol liberados são então capturados com um derivado de biotina tiol-reativo. As proteínas biotinyladas geradas são então purificadas por afinidade usando agarose de streptavidin e analisadas por imunoblotting.

Uma abordagem alternativa denominada captura assistida de acilina (Acyl-RAC) foi posteriormente introduzida para substituir a etapa de biotinylation por conjugação direta de cisteínas livres por uma resina tiol-reativa22,23. Este método tem menos passos em comparação com a ABE e da mesma forma pode ser usado para detectar aciação de proteína S em uma ampla gama de amostras1.

A Cil-RAC consiste em 4 passos principais (Figura 1),
1. Bloqueio de grupos de tiol livres;
2. Decote seletivo da ligação cisteine-acila thioester com hidroxilamina neutra (HAM) para expor grupos de cisteína thiol;
3. Captura das cisteínas lipidados com resina tiol-reativa;
4. Enriquecimento seletivo das proteínas S-acylated após elução com a redução do tampão.

As proteínas capturadas podem então ser analisadas por imunoblotting ou submetidas à espectrometria de massa (MS) para avaliar o proteoma s-acylado em uma variedade variada de espécies e tecidos22,24,25. Os locais individuais de s-acilação também podem ser identificados pela digestão da tripsina das proteínas capturadas e análise dos peptídeos resultantes por LC-MS/MS22. Aqui, demonstramos como a acil-RAC pode ser usada para detecção simultânea de s-acilação de múltiplas proteínas em uma linha celular e uma amostra de tecido.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Os camundongos utilizados neste protocolo foram eutanizados de acordo com as diretrizes do NIH. O Comitê de Bem-Estar Animal do Centro de Ciência da Saúde da Universidade do Texas, em Houston, aprovou todo o trabalho animal.

1. Preparação de lysates celulares

  1. Prepare o buffer de lysis conforme descrito na Tabela 1. A 10 mL de PBS, adicione 0,1 g de n-dodecil β-D-maltoside detergente (DDM) e gire para dissolver. Adicione 100 μL de coquetel inibidor de fosfatase 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) e coquetel inibidor de protease (1x) e esfrie o tampão no gelo antes do uso.
  2. Transferir a mídia necessária contendo células da incubadora para tubos cônicos de 15 mL ou 50 mL e células giratórias a 350 x g por 5 min e aspirar para se livrar de quaisquer detritos celulares.
    NOTA: Utilizou 1 x 107 células para cada reação acil-RAC a ser realizada.
  3. Lave a pelota resuspendendo-a em 5 mL de PBS e girando a 350 x g por 5 min.
    NOTA: Execute rapidamente a etapa 1.3 para evitar a lse celular devido à incubação prolongada na PBS.
  4. Adicione 600 μL de tampão de lysis preparado na etapa 1.1 para a pelota e lyse-lo agitando a 1500 rpm em um shaker térmico por 30 min a 4 °C.
  5. Limpe as lidas por centrifugação a 20.000 x g a 4 °C por 30 min para pellet detergente-insolúvel. Colete lysate limpo em tubos de microfusão pré-resfriados de 1,5 mL e mantenha-os no gelo.
  6. Realize um ensaio bradford/bca para estimar a concentração de proteínas. É fundamental garantir a mesma quantidade de proteína em diferentes amostras antes de realizar o experimento. Recomendamos o uso de pelo menos 500 μg de proteína por reação.
    NOTA: Nos experimentos descritos, utilizou-se células cultivadas (Jurkat) e esplenocites primários a partir do tecido de camundongos. O método de lyse descrito acima também pode ser adotado para outros tipos de células. A concentração média de proteína obtida para os tipos de células acima mencionadas é de aproximadamente 500 μg por 1 x 107 células. As células de Jurkat foram mantidas no meio RPMI-1640 modificado para conter 2 mM L-glutamina, 10 mM HEPES, 1 mM de piruvato de sódio, 4.500 mg/L de glicose e 1.500 mg/L de bicarbonato de sódio suplementado com 10% de FBS a 37 °C com 5% de CO2. Usamos 1 x 107 células Jurkat por reação. Os esplenocites primários foram isolados do tecido do baço do camundongo como descrito26. Resumidamente, o tecido do baço foi macerado no gelo, seguido de lyse de eritrócitos em solução hipotônica e separação dos linfócitos por centrifugação. Usamos 1 x107 células primárias por reação.

2. Acill-RAC: Bloqueio de grupos de tiol gratuitos

NOTA: Todas as etapas subseqüentes podem ser executadas à temperatura ambiente (RT).

  1. Transfira o lysate para um tubo de microfusão fresco de 1,5 mL e realize precipitação de clorofórmio-metanol (CM), conforme descrito abaixo.
    1. Adicione metanol (MeOH) e clorofórmio (CHCl3) ao lysato em uma razão final de lysate: MeOH: CHCl3 de 2:2:1 e agite vigorosamente para criar uma suspensão homogênea.
    2. Gire a 10.000 x g por 5 min para formar uma pelota ("panqueca") na interfase entre as fases aquosas e orgânicas.
    3. Incline o tubo e aspirar o máximo de solvente possível usando uma agulha ou uma ponta de carregamento de gel.
    4. Seque o ar da pelota de proteína por alguns minutos e lave-a delicadamente adicionando 600 μL de MeOH e misturando suavemente para evitar quebrar a pelota
    5. Retire cuidadosamente o MeOH restante e seque a pelota de proteína em uma bancada por aproximadamente 5 minutos.
    6. (Opcional) Realize um passo adicional de centrifugação para girar qualquer pelota quebrada após a lavagem MeOH para evitar a perda da amostra.
      NOTA: O experimento pode ser interrompido após a etapa de precipitação de CM. Uma vez obtida a pelota, pode ser armazenada em 500 μL de MeOH em -20 °C até uma semana.
      1. Dissolva a pelota de proteína em 200 μL de tampão 2SHB, vórticando a 42 °C/1500 rpm em um agitador térmico até que a pelota seja dissolvida.
    7. (Opcional) Incubar por mais 5-10 min em um banho de água sônica para dissolver a pelota.
      NOTA: O comprimento da sonagem varia dependendo da solubilidade do material. No entanto, a sonoração prolongada pode causar degradação proteica.
  2. Prepare 0,2% de metanosulfonato de metila (MMTS) (v/v) em 2SHB adicionando 2 μL de MMTS a 998 μL de tampão 2SHB.
    NOTA: Use mms de 0,2% recém-preparados para cada experimento.
  3. Adicione 200 μL de 0,2% de MMTS em 2SHB a cada tubo a uma concentração final de 0,1% MMTS. Incubar por 15 min a 42 °C com agitação a 1500 rpm em um agitador térmico.

3. Acila-RAC: Decote de hidroxilamina (HAM) e captura de proteínas S-aciadas

  1. Repita precipitações de 3-4x CM conforme descrito acima para remover mmts. A remoção do MMTS pode ser estimada pela falta de odor distinto de MMTS. Após cada precipitação, dissolva a pelota em 100 μL de tampão 2SHB, vórticando a 42 °C/1500 rpm em um agitador térmico até que a pelota se dissolva e, em seguida, diluir com 300 μL de Tampão A.
  2. Após a precipitação final, dissolva amostras em 200 μL de tampão 2SHB conforme descrito acima e diluir com 240 μL de Buffer A.
  3. No caso de comparar as alterações na acilação s em resposta a várias condições de tratamento, meça novamente a concentração de proteínas e prossiga com a mesma quantidade de proteína para cada condição.
  4. Retenha 40 μL de cada amostra como um controle de entrada.
  5. Divida as amostras em duas partes iguais de 200 μL e marque tubos como "+ HAM" e "- HAM". Adicione 50 μL de 2 M HAM neutro recém-preparado (pH 7.0-7.5) a uma concentração final de 400 mM a um dos tubos (+ HAM) e 50 μL de 2 M neutros para o segundo tubo (- HAM), que será usado como um controle negativo. Proceder à adição de contas de thiopropyl-Sepharose (TS).
    NOTA: O experimento pode ser interrompido após qualquer uma das etapas de precipitação do CM. Uma vez obtida a pelota, pode ser armazenada em 500 μL de MeOH em -20 °C até uma semana. O pH neutro de 2 M HAM garante sua seletividade para a ligação de thioester acile-cisteína e deve ser cuidadosamente ajustado. Deve-se tomar cuidado ao manusear amostras no tampão 2SHB para evitar a perda da amostra devido à espuma excessiva. Todas as etapas seguintes são idênticas para amostras de HAM e + HAM.
  6. Adicione 30 μL de pasta-de-bico-ts a cada tubo e gire os tubos por 1-2 h em RT.
  7. Lave as contas TS 4x com 1% de SDS no Buffer A para remover o HAM residual.
    1. Gire suavemente todas as amostras de contas usando um microfuge por 1 min e apiratee cuidadosamente o sobrenadante.
    2. Ressuspensão das contas em 500 μL de 1% de SDS no Buffer A.
    3. Repita o passo 3.7.1-3.7.2 três vezes.
      NOTA: O thiopropyl-Sepharose ativado (TS) é fornecido congelado na presença de aditivos que devem ser lavados em pH neutro antes do acoplamento. A água destilada é recomendada para inchaço e lavagem. Pesar 0,1 g de contas e resuspender em 1 mL de água destilada e deixá-la inchar enquanto gira por 30 min-1 h em RT. Lave as contas 1x com tampão A e prepare um chorume com tampão A, em uma razão de 50% de médio assentado a 50% tampão. TS inchado pode ser armazenado em pH neutro na presença de 20% de etanol a 4 °C até uma semana. Não use azida de sódio como agente bacteriostático, uma vez que os íons de azida reagem com os grupos de dissulfeto de 2-piridinas. Para maior eficiência, prepare contas novas. Ao manusear as contas, a ponta de uma pipeta P200 pode ser cortada ligeiramente de modo a evitar qualquer dano.
      NOTA: O experimento pode ser interrompido em qualquer estágio após a precipitação de CM. A pelota pode ser guardada em 500 μL de MeOH em -20 °C até uma semana.

4. Elução e detecção de proteínas S-aciadas

  1. Após a última lavagem, gire suavemente para baixo as contas como descrito acima e aspirar o máximo de sobrenatantes possível sem perturbar as contas.
  2. Recupere as proteínas das contas com tampão amostral de 4x SDS com DTT.
    1. Adicione 50 μL de tampão de amostra SDS 4x às contas e incubar a 80 °C, 1500 rpm por 15 min em um shaker térmico. Deixe os tubos esfriarem.
    2. Centrifugar as contas a 5.000 x g por 3 min para pellet completamente as contas e transferir as proteínas eluidas para um tubo fresco de 1,5 mL usando uma ponta de carregamento de gel.
  3. Execute o SDS-PAGE e analise a s-acilação das proteínas de interesse pela mancha ocidental.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Seguindo o protocolo descrito acima, primeiro usamos acil-RAC para detectar simultaneamente a acilação de S de várias proteínas em células de Jurkat, uma linha de células T imortalizada originalmente derivada do sangue periférico de um paciente com leucemia de células T27. As proteínas de células T regulatórias previamente identificadas como S-acylated9,28,29 foram escolhidas para demonstrar a utilidade deste método. Como mostrado na Figura 2A,a tyrosine quinase Lck pode ser detectada em lisatos tratados com hidroxilamina neutra de 2 M para cortar a ligação de thioester entre resíduos de cisteína e um moiety ácido graxo (+ pista HAM). A amostra tratada com 2 M NaCl (- faixa HAM) representa um importante controle negativo, indicando a seletividade do ensaio para detecção das ligações de thioester. A faixa de entrada confirma ainda mais a especificidade do sinal e pode servir como um controle positivo se a proteína de interesse não for S-acylated. A membrana foi então despojada e rescada com anticorpos contra proteínas Fyn e LAT para demonstrar que o ensaio acil-RAC pode ser usado para analisar a acilação S de múltiplas proteínas ao mesmo tempo(Figura 2A).

Para demonstrar a utilidade deste método para detectar a cianação de proteínas em amostras de tecido, aplicamos o protocolo acil-RAC ao baço do camundongo. Como mostrado na Figura 2B,a acilação s de Lck, Fyn e LAT pode ser prontamente detectada em esplenocós de camundongos primários indicando que esta modificação é conservada entre duas espécies.

Figure 1
Figura 1. Representação esquemática de acil-RAC. O método consiste em 4 passos principais: (1) bloquear grupos de tiol livres com metatornossulfonato metil (MMTS), (2) decote seletivo da ligação cisteína-acila thioester com hidroxilamina neutra (HAM) para expor grupos de cisteína thiol, (3) captura de proteínas com cisteína thiol recém-exposta por conjugação direta com uma resina tiol-reativa e (4) recuperação de proteínas capturadas utilizando um tampão de elução redutor, seguido de imunoblotação ou análise de Esm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Detecção de proteínas S-acyladas. Um ensaio acilo-RAC foi usado para detectar s-acilação de proteínas de sinalização de células T em células Jurkat T(A) e tecido de baço murina(B). A imunoblotação com anticorpos específicos de Lck, Fyn e LAT mostra a acilação s dessas proteínas na amostra tratada com hidroxilamina (+ pista HAM). Uma amostra tratada com cloreto de sódio (- pista de HAM) serve como controle negativo. Lysates não tratados são mostrados na faixa de entrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Buffer Composição Notas
Tampão de lysis (LB) 1% DDM em DPBS; 10 μM ML211; Coquetel inibidor de phosphatase 2 (1:100); Coquetel inibidor de protease (1X), PMSF (10 mM) Prepare fresco, esfrie a 4 °C antes de usar.
Buffer sds (2SHB) 2% SDS; 5 mM EDTA; 100 mM HEPES; pH 7.4
Tampão A 5 mM EDTA; 100 mM HEPES; pH 7.4
Hidroxilamina (HAM) 2 M solução de estoque em dinamizado H20 Prepare-se fresco. Quando dissolvido pela primeira vez, HAM tem um pH muito baixo. Use 5 M NaOH para pH para 7-7.5.
Buffer de amostra 4X SDS 200 mM Tris-Cl (pH 6.8), 8% SDS (sulfato de dodílico de sódio) 0,01% Azul bromofenol, 10% glicerol Suplemento com DTT de 5 mM pouco antes do uso.

Tabela 1: Composição tampão de buffers comumente utilizados exigidos no protocolo. 2SHB buffer e Buffer A podem ser preparados com antecedência, mas seu pH deve ser verificado regularmente. Lysis buffer e HAM devem estar preparados no dia da experiência.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aqui, utilizamos com sucesso o ensaio acil-RAC para detectar a ciação S de proteínas selecionadas em células humanas cultivadas e células primárias derivadas do tecido do camundongo. Este método é simples, sensível e pode ser facilmente realizado com requisitos mínimos de equipamento usando técnicas padrão de bioquímica. Este método tem sido demonstrado para identificar com sucesso novas proteínas S-acylated, como a β-subunidade do sistema de translocação de proteínas (Sec61b), proteína ribossômica S11 (Rps11) e glutationa microssômica-S-transferase 3 (MGST3)22. A sensibilidade e adaptabilidade da acil-RAC torna-o adequado para estudar a acilação de proteínas em uma variedade de amostras biológicas.

Uma fração significativa de proteínas S-acyladas pode ser associada com partes enriquecidas com glicosphingolipide da membrana plasmática, também conhecidas como balsas lipídicas. Assim, algumas proteínas S-acylated podem não ser totalmente extraídas se detergentes leves, como Triton X-100, NP-40 ou Brij58, forem usados para a lse30. Detergentes aniônicos (como SDS) ou detergentes não iônicos maltoside (como n-dodecil β-D-maltoside (DDM)) podem ser usados para garantir a dissociação de balsas lipídicas e a recuperação total das proteínas de interesse30,31,32. Neste protocolo, utilizou-se dDM, um detergente não iônico leve, semelhante a lipídios, que tem sido demonstrado ser eficaz na extração de proteínas de membrana e manutenção de seu estado nativo estável durante períodos prolongados33.

A atividade não regulada de thioesterase durante a lyse da amostra pode potencialmente resultar em redução do rendimento da proteína após a retirada do TS e, assim, afetar a detecção de proteínas S-acylado. Um inibidor de thioesterase, como ml211, um inibidor duplo para a cia-proteína thioesterase 1 (APT1, LYPLA1) e Acyl-Protein Thioesterase 2 (APT2, LYPLA2) pode ser adicionado para prevenir a dessetilação indiscriminada de proteínas no lysato34,35.

Um bloqueio incompleto de resíduos de cisteína pode causar a ligação de proteínas não acinadas à TS, resultando em um alto fundo evidente pelo alto sinal nas amostras de HAM. A ligação de fundo pode ser substancialmente reduzida por uma incubação adicional com um agente de crosslinking-thiol-2,2'-dithiodipyridine como descrito em um protocolo ABE modificado por Zhou et al.36.

Em contraste com a rotulagem metabólica, o acil-RAC não se limita às células vivas e pode ser realizado para detectar a citilação de proteínas s em amostras de tecido recém-isolados ou congelados. Uma vez que o protocolo acilo-RAC evita um passo de imunoprecipitação, ele pode ser usado para detectar simultaneamente lipidação de múltiplas proteínas de interesse no mesmo ensaio, reduzindo potencialmente a quantidade de material biológico necessária em um único experimento. No entanto, ensaios baseados em rotulagem metabólica são mais adequados para experimentos que visam detectar especificamente a nova acilação de S-acilação ou medir taxas de rotatividade de ácidos graxos em uma proteína de interesse. Outra limitação importante da acil-RAC é que esta técnica é incapaz de distinguir entre diferentes ácidos graxos que podem ser covalentemente ligados aos resíduos de cisteína através da mesma ligação de thioester3,4,5,6,7.

Ambos os ensaios acil-RAC e ABE baseiam-se no decote seletivo da ligação thioester entre o resíduo de cisteína e um ácido graxo para revelar um grupo de tiol livre. Uma vez que a acil-RAC usa a retirada direta de proteínas S-acylated por uma resina tiol-reativa, este método requer menos passos em comparação com a ABE. Embora semelhantes, estudos de s-acilação de proteome mostram alguma variação nas proteínas detectadas usando esses dois métodos, provavelmente devido às diferenças técnicas. Por exemplo, na homogeneidade cerebral de ratos, a análise baseada em ABE identificou 241 proteínas S-acylated, enquanto a análise baseada em acila-RAC identificou 14425. 61 proteínas no proteome cerebral de ratos foram comumente detectadas por ambos os métodos ressaltando a necessidade de uso de múltiplas técnicas para verificar o estado de s-acilação de uma proteína.

Outra desvantagem potencial dos métodos acil-RAC e ABE é a incapacidade de avaliar de forma confiável a estequiometria da sacilação e determinar o número de cisteínas lipidados. Uma modificação dessas técnicas, denominada troca acil-PEG ou ensaio peg-shift, foi desenvolvida para abordar essas limitações37,38. Neste método, o passo de puxar para baixo após o decote hidroxilamina é substituído por incubação por uma etiqueta de massa PEG-maleimida. A PEGylation resultante dos resíduos de cisteína livre expostos pode ser observada como deslocamento em massa pela SDS-PAGE.

Em conclusão, a acil-RAC é um método rápido, sensível e confiável que pode fornecer insights valiosos sobre a dinâmica da proteína S-acilação sob condições fisiológicas e fisiopatológicas em uma grande variedade de amostras biológicas. Considerando as limitações do método discutido acima, recomenda-se uma combinação de acil-RAC com outras técnicas para caracterizar totalmente a acilação de S de uma proteína de interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nenhum conflito de interesse declarado.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde 5R01GM115446 e 1R01GM130840.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets Sigma 11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424 Eppendorf 22620444
Hydroxylamine (HAM) Sigma 159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS) Sigma 64306
Mini tube rotator LabForce
ML211 Cayman 17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake Benchmark Scientific H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) Sigma D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) Sigma T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator L & R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
  2. Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).
  3. Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).
  4. DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).
  5. Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).
  6. Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).
  7. Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
  8. Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).
  9. Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).
  10. Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
  11. Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).
  12. O'Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
  13. Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
  14. Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40 (2), 191-197 (2006).
  15. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
  16. Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
  17. Rami, N., Hannoush, N. A. -R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).
  18. Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
  19. Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
  20. Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
  21. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).
  22. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  23. Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
  24. Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).
  25. Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  26. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
  27. Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
  28. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).
  29. Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).
  30. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
  31. Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).
  32. Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).
  33. Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), (2017).
  34. Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
  35. Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
  36. Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).
  37. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).
  38. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).

Tags

Bioquímica Edição 158 Bioquímica Imunologia Biologia Celular S-acilação palmitoilação modificação pós-translacional Acil-RAC esplenocitos linfócitos
Detecção de Proteína S-Acilação usando captura assistida de acila-resina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tewari, R., West, S. J., Shayahati,… More

Tewari, R., West, S. J., Shayahati, B., Akimzhanov, A. M. Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture. J. Vis. Exp. (158), e61016, doi:10.3791/61016 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter