Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Detektion av Protein S-Acylation med Acyl-Harts Assisted Capture

doi: 10.3791/61016 Published: April 10, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) är en mycket känslig, tillförlitlig och lätt att utföra metod för att upptäcka reversibel lipidmodifiering av cysteinrester (S-acylation) i en mängd olika biologiska prover.

Abstract

Protein S-acylation, även kallad S-palmitoylering, är en reversibel post-translationell modifiering av cysteinrester med långkedjiga fettsyror via en labile tiooter bindning. S-acylation, som håller på att växa fram som en utbredd regleringsmekanism, kan modulera nästan alla aspekter av proteinernas biologiska aktivitet, från komplex bildning till proteinhandel och proteinstabilitet. Den senaste tidens framsteg i förståelsen av proteinets biologiska funktion S-acylation uppnåddes till stor del på grund av utvecklingen av nya biokemiska verktyg som möjliggör robust och känslig detektion av protein S-acylation i en mängd olika biologiska prover. Här beskriver vi acyl harts-assisted capture (Acyl-RAC), en nyligen utvecklad metod baserad på selektiv fångst av endogent S-acylated proteiner av tiool-reaktiva Sepharose pärlor. Jämfört med befintliga metoder kräver Acyl-RAC färre steg och kan ge mer tillförlitliga resultat i kombination med masspektrometri för identifiering av nya S-acylation mål. En stor begränsning i denna teknik är bristen på förmåga att diskriminera mellan fettsyra arter knutna till cysteiner via samma tiode bond.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

S-acylation är en reversibel post-translationell modifiering som innebär tillsats av en fet acylkedja till en intern cystein rester på ett målprotein via en labile tiooter bindning1. Det rapporterades först som en ändring av proteiner med palmitat, en mättad 16-kolfettsyra2, och därför denna ändring kallas ofta S-palmitoylation. Förutom palmitat kan proteiner vördas av en mängd längre och kortare mättade (myristate och stearate), enkelomättade (oleat) och fleromättade (arachidonate och eicosapentanoate) fettsyror3,,4,,5,,6,7. I eukaryota celler, S-acylation katalyseras av en familj av enzymer som kallas DHHC protein acyltransferases och den omvända reaktionen av cystein deacylation är katalyserad av protein tioesteraser, varav de flesta fortfarande gåtfulla8.

Labiliteten hos tioesterbindningen gör denna lipidmodifiering reversibel, vilket gör det möjligt att dynamiskt reglera proteinkluster, plasmamembranlokalisering, intracellulär handel, protein-proteininteraktioner och proteinstabilitet9,10. Följaktligen har S-acylation kopplats till flera sjukdomar inklusive Huntingtons sjukdom, Alzheimers sjukdom och flera typer av cancer (prostata, mag, urinblåsa, lunga, kolorektal), vilket kräver utveckling av tillförlitliga metoder för att upptäcka denna post-translationella protein modifiering11.

Metabolisk märkning med radioaktiv ([3H], [14C] eller [125I]) palmitat var en av de första metoder som utvecklats för att analysera proteinet S-acylation12,13,14. Men radiolabeling-baserade metoder presentera hälsoproblem, är inte särskilt känsliga, tidskrävande, och bara upptäcka lipidering av mycket rikliga proteiner15. Ett snabbare och icke-radioaktivt alternativ till radiomärkning är metabolisk märkning med bioorthogonala fettsyror sonder, som används rutinmässigt för att analysera dynamiken i proteinet S-acylation16. I denna metod, en fettsyra med en kemisk reporter (alkyne eller azide grupp) ingår i S-acylaterade proteinet av ett protein acyltransferase. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaktion (klicka kemi) kan sedan användas för att fästa en funktionaliserad grupp, såsom en fluorofore eller biotin, till den integrerade fettsyran möjliggör detektion av S-acylated protein17,18,19.

Acyl-biotin utbyte (ABE) är en av de omfattande använda biokemiska metoder för avskiljning och identifiering av S-acylaterade proteiner som kringgår några av bristerna i metabolisk märkning såsom olämplighet för vävnadsprover15. Denna metod kan användas för analys av S-acylation i ett varierat antal biologiska prover, inklusive vävnader och frysta cellprover20,21. Denna metod är baserad på selektiv klyvning av tioesterbindningen mellan acylgruppen och cysteinresterna genom neutral hydroxylamin. De befriade tioolgrupperna fångas sedan med ett tioolreaktivt biotinderivat. De genererade biotinylerade proteinerna renas sedan med hjälp av streptavidin agarose och analyseras genom immunoblotting.

En alternativ metod som kallas acyl-harts assisterad fångst (Acyl-RAC) infördes senare för att ersätta biotinylation steg med direkt konjugering av fria cysteiner med en tiool-reaktiv harts22,23. Denna metod har färre steg jämfört med ABE och på samma sätt kan användas för att upptäcka protein S-acylation i ett brett spektrum av prover1.

Acyl-RAC består av 4 huvudsteg (figur 1),
1. Blockering av fria tioolgrupper.
2. Selektiv klyvning av cystein-acyl tioesterbindning med neutral hydroxylamin (HAM) för att exponera cysteintiosgrupper.
3. Fånga av lipiderade cysteiner med en tioolreaktiv harts;
4. Selektiv anrikning av S-acylaterade proteiner efter eluering med reducerande buffert.

De fångade proteinerna kan sedan analyseras genom immunblottning eller utsättas för masspektrometri (MS) baserade proteomik för att bedöma S-acylaterad proteom i ett varierat antal arter och vävnader22,24,25. Enskilda S-acylation platser kan också identifieras genom trypsin matsmältningen av de fångade proteinerna och analys av de resulterande peptiderna av LC-MS/MS22. Här visar vi hur acyl-RAC kan användas för samtidig detektion av S-acylation av flera proteiner i både en cellinje och ett vävnadsprov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Möss som används i detta protokoll avlivades enligt NIH riktlinjer. Djurskyddskommittén vid University of Texas Health Science Center i Houston godkände allt djurarbete.

1. Beredning av cell lysates

  1. Förbered lysbuffert enligt beskrivningen i tabell 1. Till 10 ml PBS, tillsätt 0,1 g n-dodecyl β-D-maltoside tvättmedel (DDM) och rotera för att lösa upp. Tillsätt 100 μl fosfatashämmare cocktail 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) och proteashämmare cocktail (1x) och kyla bufferten på is före användning.
  2. Överför erforderligt medium som innehåller celler från inkubatorn till 15 ml eller 50 ml koniska rör och spinnceller vid 350 x g i 5 min och aspirera för att bli av med cellskräp.
    OBS: Vi använde 1 x 107 celler för varje acyl-RAC reaktion som skall utföras.
  3. Tvätta pelleten genom att återanvända den i 5 ml PBS och snurra i 350 x g i 5 min.
    OBS: Utför steg 1.3 snabbt för att undvika celllys på grund av förlängd inkubation i PBS.
  4. Tillsätt 600 μl lysbuffert som beretts i steg 1.1 till pelleten och lyse den genom att skaka vid 1500 rpm i en termisk skakapparat i 30 min vid 4 °C.
  5. Rensa lysertes genom centrifugering vid 20.000 x g vid 4 °C i 30 min till pelleten tvättmedel-olösliga material. Samla rensade lysate i förkylda 1,5 ml mikrobränslerör och förvara dem på is.
  6. Utför en Bradford/ BCA-analys för att uppskatta proteinkoncentrationen. Det är viktigt att säkerställa samma mängd protein över olika prover innan du utför experimentet. Vi rekommenderar att du använder minst 500 μg protein per reaktion.
    OBS: I de experiment som beskrivs använde vi odlade (Jurkat) celler och primära splenocyter från möss vävnad. Den lysmetod som beskrivs ovan kan också användas för andra celltyper. Den genomsnittliga proteinkoncentration som erhålls för ovannämnda celltyper är cirka 500 μg per 1 x 107 celler. Jurkat celler bibehölls i RPMI-1640 medium modifierad för att innehålla 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat, 4,500 mg/L glukos, och 1,500 mg/L natriumbikarbonat kompletteras med 10% FBS vid 37 °C med 5% CO2. Vi använde 1 x 107 Jurkat celler per reaktion. Primära splenocytes isolerades från mus mjälte vävnad som beskrivs26. Kortfattat var mjälte vävnad macerated på is, följt av lysis av erytrocyter i hypotoniska lösning och separation från lymfocyter genom centrifugering. Vi använde 1 x 107 primära celler per reaktion.

2. Acyl-RAC: Blockering av fria tioolgrupper

Alla efterföljande steg kan utföras vid rumstemperatur (RT).

  1. Överför 1,5 ml mikrobränslerör och utför utfällning av kloroform-metanol (CM) enligt beskrivningen nedan.
    1. Tillsätt metanol (MeOH) och kloroform (CHCl3) till lysate vid ett slutligt förhållande av lysate: MeOH: CHCl3 av 2:2:1 och skaka kraftigt för att skapa en homogen fjädring.
    2. Snurra i 10 000 x g i 5 min för att bilda en pellet ("pannkaka") vid interfasen mellan vattenhaltiga och organiska faser.
    3. Luta röret och sug upp så mycket lösningsmedel som möjligt med hjälp av en nål eller en gellastningsspets.
    4. Lufttorka proteinpellet i några minuter och tvätta den försiktigt genom att tillsätta 600 μL MeOH och blanda försiktigt för att undvika att bryta upp pelleten
    5. Ta försiktigt bort resterande MeOH och torka proteinpelleten på en bänkskiva i ca 5 min.
    6. (Valfritt) Utför ytterligare ett centrifugeringssteg för att snurra ner eventuella trasiga pellets efter MeOH-tvätten för att undvika att provet tappas.
      OBS: Experimentet kan stoppas efter CM-nederbördssteget. När pelleten har erhållits kan den förvaras i 500 μL MeOH i -20 °C upp till en vecka.
      1. Lös upp proteinpelleten i 200 μL 2SHB-buffert genom att virvla vid 42 °C/1500 rpm i en termisk skakapparat tills pelleten är upplöst.
    7. (Valfritt) Inkubera i ytterligare 5–10 min i ett ultraljudsvattenbad för att lösa upp pelleten.
      OBS: Längden på ultraljudsbehandling varierar beroende på löslighet av materialet. Emellertid, långvarig ultraljudsbehandling kan orsaka proteinnedbrytning.
  2. Förbered 0,2 % metylmetanthiosulfonat (MMTS) (v/v) i 2SHB genom att tillsätta 2 μl MMTS till 998 μl 2SHB-buffert.
    OBS: Använd nyberedd 0,2 % MMTS för varje experiment.
  3. Tillsätt 200 μl 0,2 % MMTS i 2SHB till varje rör i en slutlig koncentration på 0,1 % MMTS. Inkubera i 15 min vid 42 °C med skakning vid 1500 varv/min i en termisk skakapparat.

3. Acyl-RAC: Hydroxylamin (HAM) klyvning och fångst av S-acylaterade proteiner

  1. Upprepa 3-4x CM nederbörd enligt beskrivningen ovan för att ta bort MMTS. Avlägsnande av MMTS kan uppskattas av bristen på distinkt lukt av MMTS. Lös upp pelleten i 100 μL 2SHB-bufferten efter varje utfällning vid 42 °C/1500 rpm i en termisk skakapparat tills pelleten löses upp och späd sedan med 300 μl buffert A.
  2. Lös upp proverna i 200 μL buffert med 2SHB enligt beskrivningen ovan efter den slutliga utfällningen enligt beskrivningen ovan och späd med 240 μl buffert A.
  3. Vid jämförelse av förändringar i S-acylation som svar på flera behandlingstillstånd, mät proteinkoncentrationen igen och fortsätt med lika mycket protein för varje tillstånd.
  4. Behåll 40 μl från varje prov som inmatningskontroll.
  5. Dela upp proverna i två lika stora delar av 200 μL och markera rör som "+ HAM" och "- HAM". Tillsätt 50 μl nyberedd neutral 2 M HAM (pH 7.0-7.5) till en slutlig koncentration på 400 mM till ett av rören (+ HAM) och 50 μL neutral 2 M NaCl till det andra röret (- HAM), som kommer att användas som en negativ kontroll. Fortsätt till tillsats av tiopropyl-sepharose (TS) pärlor.
    OBS: Experimentet kan stoppas efter någon av CM nederbörd steg. När pelleten har erhållits kan den förvaras i 500 μL MeOH i -20 °C upp till en vecka. Neutralt pH på 2 M HAM säkerställer dess selektivitet för acyl-cysteinthesterbindningen och bör justeras noggrant. Försiktighet bör iakttas vid hantering av prover i 2SHB-buffert för att undvika förlust av prov på grund av överdriven skumbildning. Alla följande steg är identiska för - HAM och + HAM-prover.
  6. Tillsätt 30 μl TS-pärl-slam till varje rör och rotera rören i 1-2 h vid RT.
  7. Tvätta TS-pärlorna 4x med 1% SDS i buffert A för att avlägsna kvarvarande HAM.
    1. Snurra försiktigt ner alla pärlprover med hjälp av en mikrofuge i 1 min och aspirera försiktigt supernatanten.
    2. Resuspend pärlorna i 500 μL av 1% SDS i buffert A.
    3. Upprepa steg 3.7.1–3.7.2 tre gånger.
      OBS: Aktiverad tiopropyl-sepharose (TS) levereras frystorkad i närvaro av tillsatser som måste tvättas bort vid neutralt pH före koppling. Destillerat vatten rekommenderas för svullnad och tvättning. Väg 0,1 g pärlor och resuspend i 1 ml destillerat vatten och låt den svälla medan den roterar i 30 min-1 h vid RT. Tvätta pärlorna 1x med buffert A och förbered en slurry med buffert A, i ett förhållande av 50% fast medium till 50% buffert. Svullen TS kan förvaras vid neutralt pH i närvaro av 20% etanol vid 4 °C upp till en vecka. Använd inte natriumazid som bakteriostatiskt medel eftersom azimidjoner reagerar med 2-pyridyldisulfidgrupperna. För högre effektivitet, förbereda färska pärlor. Vid hantering av pärlorna kan spetsen på en P200 pipettspets skäras något för att förhindra skador.
      OBS: Experimentet kan stoppas när som helst efter CM nederbörd. Pelleten kan förvaras i 500 μL MeOH i -20 °C upp till en vecka.

4. Elution och detektion av S-acylaterade proteiner

  1. Efter den sista tvätten, snurra försiktigt ner pärlorna enligt beskrivningen ovan och aspirera så mycket supernatant som möjligt utan att störa pärlorna.
  2. Återvinn proteinerna från pärlor med 4x SDS provbuffert med DTT.
    1. Tillsätt 50 μL 4x SDS provbuffert till pärlorna och inkubera vid 80 °C, 1500 rpm i 15 min i en termisk shaker. Låt rören svalna.
    2. Centrifugera pärlorna på 5000 x g i 3 min för att helt pelleta pärlorna och överföra eluerade proteiner till en färsk 1,5 ml rör med hjälp av en gel lastning spets.
  3. Kör SDS-PAGE och analysera S-acylation av de proteiner av intresse genom västra blotting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Efter protokollet som beskrivs ovan använde vi först acyl-RAC för att samtidigt upptäcka S-acylation av flera proteiner i Jurkat-celler, en förevigad T-cellinje som ursprungligen härrör från perifert blod hos en T-cellsleukemipatient27. Regulatory T cell proteiner som tidigare identifierats som S-acylated9,28,29 valdes för att visa nyttan av denna metod. Som visas i figur 2Akan tyrosinkinas Lck detekteras i lysates som behandlats med neutral 2 M hydroxylamin för att klyva tioesterbindningen mellan cysteinrester och en fettsyramoiety (+ HAM lane). Provet som behandlas med 2 M NaCl (- HAM lane) representerar en viktig negativ kontroll, vilket indikerar selektiviteten hos analysen för detektion av tioesterbindningarna. Inmatningsfilen bekräftar ytterligare signalens specificitet och kan fungera som en positiv kontroll om det protein som är av intresse inte är S-acylated. Membranet avlägsnades sedan och förebråtlades med antikroppar mot proteiner Fyn och LAT för att visa att acyl-RAC-analysen kan användas för att analysera S-acylation av flera proteiner samtidigt (figur 2A).

För att visa nyttan av denna metod för att upptäcka protein S-acylation i vävnadsprover, tillämpade vi acyl-RAC protokollet till musen mjälte. Som visas i figur 2Bkan S-acylation av Lck, Fyn och LAT lätt detekteras i primära muspratocyter som indikerar att denna ändring bevaras mellan två arter.

Figure 1
Bild 1. Schematisk representation av acyl-RAC. Metoden består av 4 huvudsteg: (1) som blockerar fria tioolgrupper med metylmetathiosulfonat (MMTS), (2) selektiv klyvning av cystein-acylthjutsbindningen med neutral hydroxylamin (HAM) för att exponera cysteintiolgrupper. (3) avskiljning av proteiner med nyligen exponerad cysteintion genom direkt konjugering med tioolreaktiv harts och (4) återvinning av fångade proteiner med hjälp av en reducerande elueringsbuffert, följt av immunblotting eller MS-analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Detektion av S-acylaterade proteiner. En acyl-RAC-analys användes för att detektera S-acylation av T-cellssignaleringsproteiner i Jurkat T-celler (A) och murine mjältevävnad (B). Immunoblotting med Lck-, Fyn- och LAT-specifika antikroppar visar S-acylation av dessa proteiner i det hydroxylaminbehandlade provet (+ HAM lane). Ett prov som behandlats med natriumklorid (- HAM lane) fungerar som negativ kontroll. Obehandlade lysates visas i inmatningsfilen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Buffert Sammansättning Anteckningar
Lysbuffert (LB) 1% DDM i DPBS; 10 μM ML211; Fosfatashämmare Cocktail 2 (1:100); Proteashämmare Cocktail (1X), PMSF (10 mM) Förbered färsk, kyla vid 4 °C före användning.
SDS-buffert (2SHB) 2% SDS; 5 mM EDTA; 100 mM HEPES; pH 7,4
Buffert A 5 mM EDTA; 100 mM HEPES; pH 7,4
Hydroxylamin (HAM) 2 M stamlösning i destillerad H20 Förbered dig på det här. Vid första upplöstes har HAM ett mycket lågt pH-kol. Använd 5 M NaOH till pH till 7-7,5.
4X SDS-provbuffert 200 mM Tris-Cl (pH 6.8), 8% SDS (natrium dodecyl sulfat) 0,01% Bromofenol blå, 10% glycerol Komplettera med 5 mM DTT strax före användning.

Tabell 1: Buffertsammansättning av vanliga buffertar som krävs i protokollet. 2SHB buffert och buffert A kan beredas i förväg, men deras pH måste kontrolleras regelbundet. Lysbuffert och HAM måste beredas på experimentdagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här har vi framgångsrikt utnyttjat acyl-RAC-analysen för att upptäcka S-acylation av utvalda proteiner i både odlade mänskliga celler och primära celler som härrör från musvävnad. Denna metod är enkel, känslig och kan enkelt utföras med minimala utrustningskrav med hjälp av standardbiokemitekniker. Denna metod har visat sig framgångsrikt identifiera nya S-acylaterade proteiner såsom β-underenheten i proteinflyttningssystemet (Sec61b), ribosomalt protein S11 (Rps11) och microsomal glutation-S-transferase 3 (MGST3)22. Känsligheten och anpassningsförmågan hos acyl-RAC gör det lämpligt att studera protein S-acylation i en mängd olika biologiska prover.

En betydande del av S-acylaterade proteiner kan associeras med glykosfino-berikade delar av plasmamembranet, även känd som lipidflottar. Således, vissa S-acylated proteiner kanske inte helt extraheras om milda rengöringsmedel, såsom Triton X-100, NP-40 eller Brij58, används för lysis30. Anjoniska rengöringsmedel (t.ex. SDS) eller maltosidebaserade icke-joniska rengöringsmedel (t.ex. n-dodecyl β-D-maltoside (DDM)) kan användas för att säkerställa dissociation av lipidflottar och fullständig återvinning av proteiner av intresse30,,31,32. I detta protokoll använde vi DDM, en mild, lipidliknande icke-joniskt rengöringsmedel som har visat sig vara effektivt i membranproteinutvinning och bibehålla deras stabila inhemska tillstånd under längre perioder33.

Den oreglerade tioesterasaktiviteten under provets lys kan potentiellt leda till minskad proteinavkastning efter TS-pull-down-steget och därmed påverka detektionen av S-acylaterade proteiner. En tioesterashämmare, såsom ML211, en dubbel hämmare för Acyl-Protein Thioesterase 1 (APT1, LYPLA1) och Acyl-Protein Thioesterase 2 (APT2, LYPLA2) kan läggas till för att förhindra urskillningslös deacylation av proteiner i lysate34,,35.

En ofullständig blockad av cysteinrester kan orsaka bindning av icke-acylaterade proteiner till TS, vilket resulterar i en hög bakgrund som framgår av hög signal i -HAM-proverna. Bakgrundsbindningen kan minskas avsevärt genom en ytterligare inkubation med ett tiool-tvärmedel-2,2'-dithiodipyridin som beskrivs i ett modifierat ABE-protokoll av Zhou m.fl.36.

I motsats till metabolisk märkning är acyl-RAC inte begränsad till levande celler och kan utföras för att upptäcka protein S-acylation i nyligen isolerade eller frysta vävnadsprover. Eftersom acyl-RAC-protokollet undviker ett immunoprecipitationsteg kan det användas för att samtidigt upptäcka lipidering av flera proteiner av intresse i samma analys, vilket potentiellt minskar mängden biologiskt material som krävs i ett enda experiment. Emellertid, metabolisk märkning-baserade analyser är mer lämpade för experiment som syftar till att specifikt upptäcka de novo S-acylation eller mäta fettsyra omsättningshastigheter på ett protein av intresse. En annan viktig begränsning av acyl-RAC är att denna teknik inte kan skilja mellan olika fettsyror som kan kovalent bundna till cysteinrester via samma derasbindning3,,4,,5,6,7.

Både acyl-RAC och ABE analyser är baserade på selektiv klyvning av tioesterbindning mellan cysteinrester och en fettsyra för att avslöja en fri tioolgrupp. Eftersom acyl-RAC använder direkt pull-down av S-acylated proteiner genom en tiool-reaktiv harts, denna metod kräver färre steg i jämförelse med ABE. Även om liknande, proteome-omfattande studier av S-acylation visar viss variation i de proteiner som upptäcks med hjälp av dessa två metoder, troligen på grund av de tekniska skillnaderna. Till exempel, i råtta hjärnan homogenat, ABE-baserad analys identifierade 241 S-acylaterade proteiner medan acyl-RAC-baserad analys identifierade 14425. 61 proteiner i råttahjärnhjärnproteomen upptäcktes vanligen av båda metoderna som understryker behovet av användning av flera tekniker för att fastställa S-acylation status för ett protein.

En annan potentiell nackdel med acyl-RAC och ABE metoder är oförmågan att tillförlitligt utvärdera stökiometri av S-acylation och bestämma antalet lipiderade cysteiner. En ändring av dessa tekniker, så kallade acyl-PEG-utbyte eller PEG-shift-analys, utvecklades för att ta itu med dessa begränsningar37,,38. I denna metod ersätts pull-down-steg efter hydroxylaminklyvning genom inkubation med en PEG-maleimide masstagg. Resulterande PEGylation av exponerade fria cysteinrester kan observeras som massförskjutning av SDS-PAGE.

Sammanfattningsvis är acyl-RAC en snabb, känslig och tillförlitlig metod som kan ge värdefulla insikter i dynamiken i proteinet S-acylation under både fysiologiska och patofysiologiska förhållanden i en mängd olika biologiska prover. Med tanke på begränsningar av den metod som diskuteras ovan, rekommenderas en kombination av acyl-RAC med andra tekniker för att fullt ut karakterisera S-acylation av ett protein av intresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health grants 5R01GM115446 och 1R01GM130840.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets Sigma 11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424 Eppendorf 22620444
Hydroxylamine (HAM) Sigma 159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS) Sigma 64306
Mini tube rotator LabForce
ML211 Cayman 17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake Benchmark Scientific H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) Sigma D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) Sigma T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator L & R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26, (1-2), 93-103 (2009).
  2. Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4, (5), 1137-1144 (1985).
  3. Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268, (15), 11394-11400 (1993).
  4. DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272, (50), 31362-31368 (1997).
  5. Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289, (49), 33850-33861 (2014).
  6. Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268, (24), 18243-18248 (1993).
  7. Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269, (7), 4713-4716 (1994).
  8. Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 1206 (2008).
  9. Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275, (1), 261-270 (2000).
  10. Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
  11. Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4, (0), 1-23 (2015).
  12. O'Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259, (8), 5054-5057 (1984).
  13. Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
  14. Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40, (2), 191-197 (2006).
  15. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36, (2), 276-285 (2004).
  16. Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
  17. Rami, N., Hannoush, N. A. -R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4, (7), 581-587 (2009).
  18. Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22, (3), 721-732 (2008).
  19. Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131, (13), 4967-4975 (2009).
  20. Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
  21. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456, (7224), 904-909 (2008).
  22. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52, (2), 393-398 (2011).
  23. Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9, (1), 64-75 (2014).
  24. Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53, (4), 420-451 (2018).
  25. Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7, (1), 1-13 (2017).
  26. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
  27. Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
  28. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26, (1), 93-103 (2009).
  29. Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183, (3), 1685-1694 (2009).
  30. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
  31. Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191, (9), 1591-1604 (2000).
  32. Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (38), 11876-11880 (2015).
  33. Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7, (7), (2017).
  34. Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
  35. Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
  36. Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91, (15), 9858-9866 (2019).
  37. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17534-17539 (2014).
  38. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (16), 4302-4307 (2016).
Detektion av Protein S-Acylation med Acyl-Harts Assisted Capture
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tewari, R., West, S. J., Shayahati, B., Akimzhanov, A. M. Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture. J. Vis. Exp. (158), e61016, doi:10.3791/61016 (2020).More

Tewari, R., West, S. J., Shayahati, B., Akimzhanov, A. M. Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture. J. Vis. Exp. (158), e61016, doi:10.3791/61016 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter