Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Påvisning af Protein S-Acylation ved hjælp af Acyl-Resin Assisted Capture

doi: 10.3791/61016 Published: April 10, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) er en meget følsom, pålidelig og nem at udføre metode til at opdage reversibel lipid ændring af cysteinrester (S-acylation) i en række biologiske prøver.

Abstract

Protein S-acylation, også kaldet S-palmitoyrlation, er en reversibel posttranslationel ændring af cysteinrester med langkædede fedtsyrer via en labile thioester-binding. S-acylation, der er ved at opstå som en udbredt reguleringsmekanisme, kan modulere næsten alle aspekter af proteiners biologiske aktivitet, fra kompleks dannelse til proteinhandel og proteinstabilitet. De seneste fremskridt med hensyn til forståelse af protein S-acylations biologiske funktion blev opnået i vid udstrækning på grund af udviklingen af nye biokemiske værktøjer, der muliggør robust og følsom påvisning af protein S-acylation i en række biologiske prøver. Her beskriver vi acyl harpiks-assisteret fangst (Acyl-RAC), en nyligt udviklet metode baseret på selektiv indfangning af endogent S-acylated proteiner ved thiol-reaktiv sepharose perler. Sammenlignet med eksisterende tilgange kræver Acyl-RAC færre trin og kan give mere pålidelige resultater, når det kombineres med massespektrometri til identifikation af nye S-acylationsmål. En væsentlig begrænsning i denne teknik er den manglende evne til at skelne mellem fedtsyrearter knyttet til cysteiner via samme thioester obligation.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

S-acylation er en reversibel posttranslationel modifikation, der indebærer tilsætning af en fedtacylkæde til en intern cysteinrest på et målprotein via en labile thioester-binding1. Det blev først rapporteret som en ændring af proteiner med palmitat, en mættet 16-carbon fedtsyrer2, og derfor denne ændring er ofte omtalt som S-palmitoyrlation. Ud over palmitat kan proteiner ændres reversibelt ved en række længere og kortere mættede fedtsyrer (myristat og stearate), enkeltumættede (oleate) og flerumættede fedtsyrer (arachidonate og eicosapentanoate) fedtsyrer3,4,5,6,7. I eukaryote celler katalyseres S-acylation af en familie af enzymer kendt som DHHC protein acyltransferases, og den omvendte reaktion af cysteindeacylation katalyseres af proteinthioesterases, hvoraf de fleste stadig er gådefulde8.

Labiliteten af thioester binding gør denne lipid modifikation reversibel, gør det muligt at dynamisk regulere protein klyngedannelse, plasma membran lokalisering, intracellulær handel, protein-protein interaktioner og protein stabilitet9,10. Derfor har S-acylation været forbundet med flere lidelser, herunder Huntingtons Sygdom, Alzheimers sygdom og flere former for kræft (prostata, gastrisk, blære, lunge, kolorektal), hvilket kræver udvikling af pålidelige metoder til at opdage denne post-translationelle protein modifikation11.

Metabolisk mærkning med radioaktivt ([3H], [14C] eller [125I]) palmitat var en af de første metoder udviklet til analyseprotein S-acylation12,13,14. Men, radiomærkning-baserede metoder udgør sundhedsmæssige bekymringer, er ikke meget følsomme, tidskrævende, og kun opdage lipidation af meget rigelige proteiner15. Et hurtigere og ikke-radioaktivt alternativ til radioaktiv mærkning er metabolisk mærkning med bioortogonale fedtsyresonder, som rutinemæssigt anvendes til analysedynamik af protein S-acylation16. I denne metode, en fedtsyre med en kemisk reporter (alkyne eller azide gruppe) er indarbejdet i S-acylated protein ved et protein acyltransferase. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaktion (klik kemi) kan derefter bruges til at knytte en funktionaliseret gruppe, såsom en fluorophore eller biotin, til den integrerede fedtsyre giver mulighed for påvisning af S-acylated protein17,18,19.

Acyl-biotin udveksling (ABE) er en af de udbredte biokemiske metoder til indfangning og identifikation af S-acylated proteiner, der omgår nogle af manglerne ved metabolisk mærkning såsom uegnet til vævsprøver15. Denne metode kan anvendes til analyse af S-acylation i en bred vifte af biologiske prøver, herunder væv og frosne celleprøver20,21. Denne metode er baseret på selektiv spaltning af thioesterbindingen mellem acylgruppen og cysteinrester ved neutral hydroxylamin. De befriede thiol grupper er derefter fanget med en thiol-reaktiv biotin derivat. De genererede biotinylated proteiner er derefter affinitet-renset ved hjælp af streptavidin agarose og analyseret ved immunblotting.

En alternativ tilgang, der kaldes acyl-harpiks assisteret fangst (Acyl-RAC), blev senere indført for at erstatte biotinylation-trinnet med direkte konjugering af frie cysteiner med en thiolreaktiv harpiks22,23. Denne metode har færre trin sammenlignet med ABE og kan ligeledes bruges til at detektere protein S-acylation i en lang række prøver1.

Acyl-RAC består af 4 hovedtrin (figur 1),
1. Blokering af frie thiol grupper;
2. Selektiv spaltning af cystein-acyl thioester obligation med neutral hydroxylamin (HAM) for at afsløre cystein thiol grupper;
3. Indfangning af lipidatiserede cysteiner med en thiol-reaktiv harpiks;
4. Selektiv berigelse af S-acylaterede proteiner efter eluering med reducerende buffer.

De tilfangetagne proteiner kan derefter analyseres ved immunblotting eller udsat for massespektrometri (MS) baseret proteomics at vurdere S-acylated proteom e i en varieret vifte af arter og væv22,24,25. Individuelle S-acylation steder kan også identificeres ved trypsin fordøjelse af de tilfangetagne proteiner og analyse af de resulterende peptider ved LC-MS/MS22. Her demonstrerer vi, hvordan acyl-RAC kan bruges til samtidig påvisning af S-acylation af flere proteiner i både en cellelinje og en vævsprøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mus, der anvendes i denne protokol blev aflivet i henhold til NIH retningslinjer. Animal Welfare Committee ved University of Texas Health Science Center i Houston godkendte alt dyrearbejde.

1. Fremstilling af cellelysater

  1. Klargør lysisbufferen som beskrevet i tabel 1. Til 10 ml PBS tilsættes 0,1 g n-dodecyl β-D-maltoside vaskemiddel (DDM) og roteres for at opløse. Der tilsættes 100 μL fosfatasehæmmercocktail 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) og proteasehæmmercocktail (1x), og bufferen på is ender før brug.
  2. Overfør krævede medier, der indeholder celler fra inkubatoren, til 15 ml eller 50 ml koniske rør og spinceller ved 350 x g i 5 min og aspirerer for at slippe af med cellerester.
    BEMÆRK: Vi brugte 1 x 107 celler til hver acyl-RAC reaktion, der skal udføres.
  3. Pillerne vaskes ved at suspendere den igen i 5 ml PBS og dreje ved 350 x g i 5 min.
    BEMÆRK: Udfør trin 1.3 hurtigt for at undgå cellelysis på grund af forlænget inkubation i PBS.
  4. Der tilsættes 600 μL lysisbuffer, der er fremstillet i trin 1.1, til pelletsen, og den omrystes ved 1500 omdrejninger i en termisk shaker i 30 min. ved 4 °C.
  5. Ryd lysater ved centrifugering ved 20.000 x g ved 4 °C i 30 min til pellet vaskemiddel-uopløselige materialer. Saml ryddet lysat i forkølet 1,5 ml microfuge rør og holde dem på is.
  6. Udfør en Bradford/BCA-analyse for at estimere proteinkoncentrationen. Det er afgørende at sikre den samme mængde protein på tværs af forskellige prøver, før forsøget udføres. Vi anbefaler, at du bruger mindst 500 μg protein pr. reaktion.
    BEMÆRK: I de beskrevne forsøg brugte vi dyrkede (Jurkat) celler og primære milnocytter fra musvæv. Lysismetoden, der er beskrevet ovenfor, kan også anvendes til andre celletyper. Den gennemsnitlige proteinkoncentration, der opnås for ovennævnte celletyper, er ca. 500 μg pr. 1 x 107 celler. Jurkat celler blev opretholdt i RPMI-1640 medium modificeret til at indeholde 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat, 4.500 mg / l glukose, og 1.500 mg / l natriumbikarbonat suppleret med 10% FBS ved 37 °C med 5% CO2. Vi brugte 1 x 107 Jurkat celler pr reaktion. Primære miltytter blev isoleret fra musemiltvæv som beskrevet26. Kort, milt væv blev udblødt på is, efterfulgt af lysis af erythrocytter i hypotonisk opløsning og adskillelse fra lymfocytter ved centrifugering. Vi brugte 1 x 107 primære celler pr. reaktion.

2. Acyl-RAC: Blokering af frie thiol grupper

BEMÆRK: Alle efterfølgende trin kan udføres ved stuetemperatur (RT).

  1. Lysat overføres til et frisk 1,5 ml mikrofugerør, og chloroform-methanol (CM) udfældning som beskrevet nedenfor overføres.
    1. Der tilsættes methanol (MeOH) og chloroform (CHCl3) til lysatet ved et endeligt lysat: MeOH: CHCl3 på 2:2:1 og ryst kraftigt for at skabe en homogen suspension.
    2. Spin ved 10.000 x g i 5 min for at danne en pellet ("pandekage") i den indbyrdes fase mellem vandige og organiske faser.
    3. Vip røret og aspirer så meget opløsningsmiddel som muligt ved hjælp af en nål eller en gel lastning spids.
    4. Lufttørre proteinpellet i et par minutter og vask det forsigtigt ved at tilsætte 600 μL MeOH og blande forsigtigt for at undgå at bryde op pellet
    5. Fjern forsigtigt den resterende MeOH og tør proteinpelletpå en bordplade i ca. 5 min.
    6. (Valgfrit) Udfør et ekstra centrifugeringstrin for at spinde ned ad enhver knækket pellet efter MeOH-vasken for at undgå tab af prøve.
      BEMÆRK: Forsøget kan stoppes efter CM-udfældningstrinnet. Når pellet er opnået, kan den opbevares i 500 μL MeOH i -20 °C op til en uge.
      1. Proteinpelleten opløses i 200 μL 2SHB buffer ved vortexing ved 42 °C/1500 rpm i en termisk shaker, indtil pellet er opløst.
    7. (Valgfrit) Inkuber i yderligere 5-10 min i et sonikerende vandbad for at opløse pelleten.
      BEMÆRK: Sonikerings længde varierer afhængigt af materialets opløselighed. Men langvarig sonikering kan forårsage protein nedbrydning.
  2. Der fremstilles 0,2% methylmetantopiulfonat (MMTS) (v/v) i 2SHB ved tilsætning af 2 μL MMTS til 998 μL 2SHB buffer.
    BEMÆRK: Brug frisklavet 0,2% MMTS til hvert eksperiment.
  3. Der tilsættes 200 μL 0,2% MMTS i 2SHB til hvert rør til en endelig koncentration på 0,1 mmts. Inkuber i 15 minutter ved 42 °C ved omrystning ved 1500 omdrejninger i en termisk shaker.

3. Acyl-RAC: Hydroxylamin (HAM) spaltning og indfangning af S-acylated proteiner

  1. Gentag 3-4x CM udfældninger som beskrevet ovenfor for at fjerne MMTS. Fjernelse af MMTS kan anslås ved manglen på særskilt lugt af MMTS. Efter hver nedbør opløses pelleten i 100 μL 2SHB buffer ved vortexing ved 42 °C/1500 omdr./min. i en termisk shaker, indtil pellet ender, og derefter fortyndes med 300 μL buffer A.
  2. Efter den endelige udfældning opløses prøverne i 200 μL 2SHB-buffer som beskrevet ovenfor og fortyndes med 240 μL buffer A.
  3. I tilfælde af sammenligning af ændringer i S-acylation som reaktion på flere behandlingsbetingelser måles proteinkoncentrationen igen, og fortsæt med lige meget protein for hver betingelse.
  4. Der opbevares 40 μL fra hver prøve som inputkontrol.
  5. Prøverne opdeles i to lige store dele af 200 μL og mærkerør som "+ HAM" og "- HAM". 50 μL friskfremstillet neutral 2 M HAM (pH 7.0-7.5) tilsættes 50 μL friskfremstillet neutral 2 M HAM (pH 7.0-7.5) til en endelig koncentration på 400 mM til et af rørene (+ HAM) og 50 μL neutral 2 M NaCl til det andet rør (- HAM), som vil blive anvendt som negativ kontrol. Fortsæt til tilsætning af thiopropyl-Sepharose (TS) perler.
    BEMÆRK: Forsøget kan stoppes efter nogen af CM nedbør trin. Når pellet er opnået, kan den opbevares i 500 μL MeOH i -20 °C op til en uge. Neutral pH på 2 M HAM sikrer sin selektivitet for acyl-cysteinthioesterbindingen og skal justeres omhyggeligt. Der skal udvises forsigtighed ved håndtering af prøver i 2SHB-buffer for at undgå tab af prøve på grund af overdreven skumdannelse. Alle følgende trin er identiske for - HAM og + HAM prøver.
  6. Der tilsættes 30 μL TS perleslam til hvert rør, og rørene roteres i 1-2 timer ved RT.
  7. Vask TS perler4x med 1% SDS i buffer A for at fjerne resterende HAM.
    1. Forsigtigt spin ned alle perle prøver ved hjælp af en microfuge i 1 min og omhyggeligt aspirere supernatant.
    2. Resuspender perlerne i 500 μL 1% SDS i buffer A.
    3. Gentag trin 3.7.1-3.7.2 tre gange.
      BEMÆRK: Aktiveret thiopropyl-sepharose (TS) leveres frysetørret ved tilstedeværelse af tilsætningsstoffer, der skal vaskes væk ved neutral pH før kobling. Destilleret vand anbefales til hævelse og vask. Der vejes 0,1 g perler og resuspenderes i 1 ml destilleret vand og lad den svulme op, mens den roterer i 30 min-1 timer ved RT. Vask perler ne 1x med buffer A og forbered en gylle med buffer A i et forhold på 50% afklaret medium til 50% buffer. Opsvulmet TS kan opbevares ved neutral pH-værdien ved tilstedeværelse af 20 % ethanol ved 4 °C op til en uge. Brug ikke natriumazid som bakteriostatisk middel, da azitidioner reagerer med 2-pyridyldisulfidgrupperne. For højere effektivitet, forberede friske perler. Under håndtering af perlerne kan spidsen af en P200 pipettespids skæres en smule for at undgå skader.
      BEMÆRK: Forsøget kan stoppes på ethvert tidspunkt efter CM-udfældning. Pelletkan opbevares i 500 μL MeOH i -20 °C op til en uge.

4. Eluering og påvisning af S-acylaterede proteiner

  1. Efter den sidste vask, forsigtigt spin ned perlerne som beskrevet ovenfor og aspirat så meget supernatant som muligt uden at forstyrre perlerne.
  2. Gendan proteinerne fra perler med 4x SDS prøvebuffer med DTT.
    1. Der tilsættes 50 μL 4x SDS-prøvebuffer til perlerne og inkuberes ved 80 °C, 1500 omdrejninger i 15 minutter i en termisk shaker. Lad rørene køle af.
    2. Perlerne centrifugeres ved 5.000 x g i 3 min for helt at pelletere perlerne og overføre de eluerede proteiner til et frisk 1,5 ml rør ved hjælp af en gelladespids.
  3. Kør SDS-PAGE og analysere S-acylation af protein (r) af interesse ved vestlige blotting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Efter den protokol, der er beskrevet ovenfor, vi første gang brugt acyl-RAC til samtidig at opdage S-acylation af flere proteiner i Jurkat celler, en udødeliggjort T-celle linje oprindeligt stammer fra det perifere blod af en T-celle leukæmi patient27. Regulatoriske T-celleproteiner, der tidligere var identificeret som S-acylateret9,28,29, blev valgt for at påvise nytten af denne metode., Som vist i figur 2Akan tyrosinkinase Lck påvises i lysater behandlet med neutral 2 M hydroxylamin for at kløve thioesterbindingen mellem cysteinrester og en fedtsyremoiety (+ HAM-bane). Den prøve, der er behandlet med 2 M NaCl (- HAM-bane), repræsenterer en vigtig negativ kontrol, der angiver analysens selektivitet til påvisning af thioesterbindingsbindingerne. Indgangsbanen bekræfter yderligere signalets specificitet og kan fungere som en positiv kontrol, hvis det protein af interesse ikke er S-acylated. Membranen blev derefter strippet og omprobed med antistoffer mod proteiner Fyn og LAT at påvise, at acyl-RAC assay kan bruges til at analysere S-acylation af flere proteiner på samme tid (Figur 2A).

For at demonstrere nytten af denne metode til at detektere protein S-acylation i vævsprøver, anvendte vi acyl-RAC-protokollen på musemilten. Som vist i figur 2Bkan S-acylation af Lck, Fyn og LAT let påvises i primære musemilnocytter, hvilket indikerer, at denne ændring er bevaret mellem to arter.

Figure 1
Figur 1. Skematisk repræsentation af ACYl-RAC. Metoden består af 4 hovedtrin: 1) blokering af frie thiolgrupper med methylmetanthiosulfonat (MMTS), 2) selektiv spaltning af cystein-acylthioesterbindingen med neutral hydroxylamin (HAM) for at eksponere cysteinthiolgrupper (3) indfangning af proteiner med nyligt eksponeret cysteinthiol ved direkte konjugering med thiolreaktiv harpiks og (4) genvinding af tilfangetagne proteiner ved hjælp af en reducerende elueringsbuffer efterfulgt af immunblotting eller MS-analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Påvisning af S-acylaterede proteiner. En acyl-RAC-analyse blev anvendt til at detektere S-acylation af T-cellesignaleringsproteiner i Jurkat T-celler (A) og murinemiltvæv (B). Immunblotting med Lck-, Fynske og LAT-specifikke antistoffer viser S-acylation af disse proteiner i hydroxylaminbehandlet prøve (+ HAM lane). En prøve behandlet med natriumchlorid (- HAM lane) fungerer som negativ kontrol. Ubehandlede lysater vises i indgangsbanen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Buffer Sammensætning Noter
Lysis buffer (LB) 1% DDM i DPBS; 10 μM ML211 Fosfatasehæmmer Cocktail 2 (1:100); Protease hæmmer Cocktail (1X), PMSF (10 mM) Der tilberedes frisk, afkøles ved 4 °C før brug.
SDS-buffer (2SHB) 2% SDS; 5 mM EDTA; 100 mM HEPES; pH 7,4
Buffer A 5 mM EDTA; 100 mM HEPES; pH 7,4
Hydroxylamin (HAM) 2 M stamopløsning i destilleret H20 Forbered dig frisk. Når først opløst, HAM har en meget lav pH. Brug 5 M NaOH til pH til 7-7,5.
4X SDS-eksempelbuffer 200 mM Tris-Cl (pH 6.8), 8% SDS (natriumdodesulfat) 0,01% Bromophenol blå, 10% glycerol Supplere med 5 mM DTT lige før brug.

Tabel 1: Buffersammensætning af almindeligt anvendte buffere , der kræves i protokollen. 2SHB buffer og buffer A kan tilberedes på forhånd, men deres pH-visning skal kontrolleres regelmæssigt. Lysis buffer og HAM skal forberedes dagen for forsøget.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her har vi med succes udnyttet acyl-RAC-analysen til at detektere S-acylation af udvalgte proteiner i både dyrkede humane celler og primære celler afledt af musevæv. Denne metode er enkel, følsom og kan nemt udføres med minimale udstyrskrav ved hjælp af standardbiokemiteknikker. Denne metode har vist sig at kunne identificere nye S-acylaterede proteiner såsom β-subenheden i proteintranslokaliseringssystemet (Sec61b), ribosomprotein S11 (Rps11) og mikrosomal glutathion-S-transferase 3 (MGST3)22. Acyl-RAC's følsomhed og tilpasningsevne gør det velegnet til at studere protein S-acylation i en række biologiske prøver.

En betydelig fraktion af S-acylated proteiner kan være forbundet med glycosphingolipid-berigede dele af plasmamembranen, også kendt som lipid flåder. Således kan nogle S-acylated proteiner ikke fuldt udekstraheret, hvis milde rengøringsmidler, såsom Triton X-100, NP-40 eller Brij58, anvendes til lysis30. Anioniske vaske- og rengøringsmidler (såsom SDS) eller maltosidebaserede ikke-ioniske vaske- og rengøringsmidler (såsom n-dodecyl β-D-maltoside (DDM)) kan anvendes til at sikre dissociation af lipidflåder og fuld genvinding af de proteiner af interesse30,31,32. I denne protokol brugte vi DDM, et mildt, lipidlignende ikke-ionisk vaskemiddel, der har vist sig at være effektivt til at opnå proteinudvinding i membranen og opretholde deres stabile tilstand over længere perioder33.

Den uregulerede thioesteraseaktivitet under lysis af prøven kan potentielt resultere i reduceret proteinudbytte efter TS-nedstræktrinnet og dermed påvirke påvisning af S-acylaterede proteiner. En thioesterasehæmmer, såsom ML211, en dobbelt hæmmer for Acyl-Protein Thioesterase 1 (APT1, LYPLA1) og Acyl-Protein Thioesterase 2 (APT2, LYPLA2) kan tilsættes for at forhindre vilkårlig deacylation af proteiner i lysatet34,35.

En ufuldstændig blokade af cysteinrester kan forårsage binding af ikke-acylated proteiner til TS, hvilket resulterer i en høj baggrund tydeligt ved højt signal i -HAM prøver. Baggrundsbindingen kan reduceres væsentligt ved en yderligere inkubation med et thiol-crosslinking-middel-2,2'-dithiodipyridin som beskrevet i en modificeret ABE-protokol af Zhou et al.36.

I modsætning til metabolisk mærkning er acyl-RAC ikke begrænset til levende celler og kan udføres for at detektere protein S-acylation i friskisolerede eller frosne vævsprøver. Da acyl-RAC-protokollen undgår et immunudfældningstrin, kan den bruges til samtidig at opdage lipidering af flere proteiner af interesse i samme analyse, hvilket potentielt kan reducere mængden af biologisk materiale, der kræves i et enkelt eksperiment. Metaboliske mærkningsbaserede analyser er imidlertid mere velegnede til forsøg, der specifikt har til formål at påvise de novo S-acylation eller måle omsætningen af fedtsyrer på et protein af interesse. En anden vigtig begrænsning af ACYl-RAC er , at denne teknik ikke er i stand til at skelne mellem forskellige fedtsyrer , der kan bindes kovalent til cysteinresterne via samme thioester-binding3,4,5,6,7.

Både acyl-RAC og ABE-analyser er baseret på selektiv spaltning af thioesterbindingen mellem cysteinresterne og en fedtsyre for at afsløre en fri thiolgruppe. Da acyl-RAC bruger direkte pull-down af S-acylated proteiner ved en thiol-reaktiv harpiks, denne metode kræver færre trin i forhold til ABE. Selv om lignende, proteom-dækkende undersøgelser af S-acylation viser en vis variation i proteiner opdaget ved hjælp af disse to metoder, sandsynligvis på grund af de tekniske forskelle. For eksempel, i rotte hjerne homogenat, ABE-baseret analyse identificeret 241 S-acylated proteiner mens acyl-RAC-baseret analyse identificeret 14425. 61 proteiner i rottehjernenproteom blev almindeligt påvist ved begge metoder, der understregede behovet for brug af flere teknikker til at fastslå et proteins S-acylationstatus.

En anden potentiel ulempe ved acyl-RAC og ABE metoder er den manglende evne til pålideligt at evaluere stoichiometri af S-acylation og bestemme antallet af lipiderede cysteiner. Der blev udviklet en ændring af disse teknikker, som kaldes acyl-PEG-udveksling eller PEG-shift-analyse, for at afhjælpe disse begrænsninger37,38. Ved denne metode erstattes pull-down-trin efter hydroxylaminspaltning med inkubation med et PEG-maleimidmassemærke. Deraf følgende PEGylation af de eksponerede frie cysteinrester kan observeres som masseskift ved SDS-PAGE.

Afslutningsvis er acyl-RAC en hurtig, følsom og pålidelig metode, der kan give værdifuld indsigt i dynamikken i protein S-acylation under både fysiologiske og patofysiologiske forhold i en lang række biologiske prøver. I betragtning af begrænsninger ne ved den ovenfor diskuterede metode anbefales en kombination af acyl-RAC med andre teknikker for fuldt ud at karakterisere S-acylation af et protein af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter anmeldt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud 5R01GM115446 og 1R01GM130840.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets Sigma 11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424 Eppendorf 22620444
Hydroxylamine (HAM) Sigma 159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS) Sigma 64306
Mini tube rotator LabForce
ML211 Cayman 17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake Benchmark Scientific H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) Sigma D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) Sigma T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator L & R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26, (1-2), 93-103 (2009).
  2. Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4, (5), 1137-1144 (1985).
  3. Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268, (15), 11394-11400 (1993).
  4. DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272, (50), 31362-31368 (1997).
  5. Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289, (49), 33850-33861 (2014).
  6. Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268, (24), 18243-18248 (1993).
  7. Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269, (7), 4713-4716 (1994).
  8. Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 1206 (2008).
  9. Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275, (1), 261-270 (2000).
  10. Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
  11. Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4, (0), 1-23 (2015).
  12. O'Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259, (8), 5054-5057 (1984).
  13. Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
  14. Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40, (2), 191-197 (2006).
  15. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36, (2), 276-285 (2004).
  16. Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
  17. Rami, N., Hannoush, N. A. -R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4, (7), 581-587 (2009).
  18. Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22, (3), 721-732 (2008).
  19. Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131, (13), 4967-4975 (2009).
  20. Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
  21. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456, (7224), 904-909 (2008).
  22. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52, (2), 393-398 (2011).
  23. Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9, (1), 64-75 (2014).
  24. Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53, (4), 420-451 (2018).
  25. Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7, (1), 1-13 (2017).
  26. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
  27. Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
  28. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26, (1), 93-103 (2009).
  29. Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183, (3), 1685-1694 (2009).
  30. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
  31. Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191, (9), 1591-1604 (2000).
  32. Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (38), 11876-11880 (2015).
  33. Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7, (7), (2017).
  34. Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
  35. Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
  36. Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91, (15), 9858-9866 (2019).
  37. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (49), 17534-17539 (2014).
  38. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (16), 4302-4307 (2016).
Påvisning af Protein S-Acylation ved hjælp af Acyl-Resin Assisted Capture
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tewari, R., West, S. J., Shayahati, B., Akimzhanov, A. M. Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture. J. Vis. Exp. (158), e61016, doi:10.3791/61016 (2020).More

Tewari, R., West, S. J., Shayahati, B., Akimzhanov, A. M. Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture. J. Vis. Exp. (158), e61016, doi:10.3791/61016 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter