Summary
Acyl-RAC(アシル-レジンアシストキャプチャ)は、様々な生物学的サンプル中のシステイン残基の可逆的脂質修飾(S-acylation)を検出する方法を非常に敏感で、信頼性が高く、実行しやすいです。
Abstract
プロテインS-アシル化は、S-パルミトイル化とも呼ばれ、陰茎チオエステル結合を介して長鎖脂肪酸を有するシステイン残基の可逆的な翻訳後修飾である。広範囲にわたる調節機構として出現するS-acylationは、複雑な形成からタンパク質の密売およびタンパク質安定性に至る、タンパク質の生物学的活性のほぼすべての側面を調節することができる。タンパク質S-アシル化の生物学的機能の理解の最近の進歩は、様々な生物学的サンプルにおけるタンパク質S-acylationの堅牢かつ敏感な検出を可能にする新しい生化学的ツールの開発によって大きく達成された。ここでは、チオール反応性セファロースビーズによる内因性S-acylatedタンパク質の選択的捕捉に基づく最近開発された方法であるアシル樹脂支援捕捉(Acyl-RAC)について述べている。既存のアプローチと比較して、Acyl-RACは、より少ないステップを必要とし、新しいS-アシル化ターゲットの同定のための質量分析と結合された場合、より信頼性の高い結果を得ることができます。この技術の主な制限は、同じチオスター結合を介してシステインに結合した脂肪酸種を区別する能力の欠如である。
Introduction
S-アシル化は、陰唇チオエステル結合1を介して標的タンパク質上のシステイン残基に脂肪アシル鎖を付加することを含む可逆的な翻訳後修飾である。それはパルミテ酸塩、飽和16-炭素脂肪酸2を有するタンパク質の修飾として最初に報告された、したがって、この修飾は、しばしばS-パルミトイル化と呼ばれる。パルミチン酸に加えて、タンパク質は、様々な長く短い飽和(ミリステイトおよびステアレート)、一価不飽和(オレ酸塩)および多価不飽和(アラキドキおよびエイコサペンタノエート)脂肪酸33、4、5、6、74,5,6,7によって可逆的に修飾することができる。真核細胞において、S-アシル化はDHHCタンパク質アシルトランスセラーゼとして知られる酵素ファミリーによって触媒され、システイン脱アシル化の逆反応はタンパク質チオエステラーゼによって触媒され、そのほとんどは依然として謎8のままである。
チオスター結合の可射性により、この脂質修飾を可逆的にし、タンパク質のクラスタリング、細胞質膜局在、細胞内の密売、タンパク質相互作用およびタンパク質安定性99,1010を動的に調節することを可能にする。その結果、S-アシル化は、ハンチントン病、アルツハイマー病およびいくつかのタイプの癌(前立腺癌、胃、膀胱、肺、大腸)を含むいくつかの障害に関連しており、この翻訳後タンパク質改変11を検出するための信頼できる方法の開発を必要とする。
パルミテは、放射性([3H]、14C)または3[125I])を用いた代謝標識は、タンパク質S-アシル化12、13、14,13,をアッセイするために開発された最初のアプローチの1つである。14しかしながら、放射線標識ベースの方法は健康上の懸念を提示し、非常に敏感ではなく、時間がかかり、そして非常に豊富なタンパク質15の脂質を検出するだけである。放射性標識に対するより速く非放射性の代替は、生体直交脂肪酸プローブによる代謝標識であり、これはタンパク質S-アシル化16の測定ダイナミクスをアッセイするために日常的に使用される。この方法では、化学レポーターを有する脂肪酸(アルキンまたはアジ化基)を、アシルトランスファーーゼタンパク質によってS-acylatedタンパク質に組み込む。アジドアルキン・ウイスゲン・シクロ付加反応(クリック化学)は、フッ素酸またはビオチンなどの官能性基を、S-acylateタンパク質17、18、19,18,19の検出を可能にする集積脂肪酸に付着させるために使用することができる。
アシルビオチン交換(ABE)は、組織サンプル15に不適当な代謝標識の欠点のいくつかをバイパスするS-acylatedタンパク質の捕捉および同定に広く用いられている生化学的方法の1つである。この方法は、組織および凍結細胞試料20,21,21を含む多様な生物学的サンプルにおけるS-アシル化の分析に適用することができる。この方法は、中性ヒドロキシルアミンによるアシル基とシステイン残基との間のチオエステル結合の選択的切断に基づく。遊離チオール基は、次いでチオール反応性ビオチン誘導体で捕捉される。生成されたビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンアガロースを使用して親和性精製され、免疫ブロッティングによって分析されます。
アシル樹脂アシスト捕捉(Acyl-RAC)と呼ばれた代替アプローチは、後に、シオール反応性樹脂22,23,23による遊離システインの直接結合と共にビオチン化ステップを置き換えるために導入された。この方法は、ABEと比較して少ないステップを有し、同様に、サンプル1の広い範囲でタンパク質S-アシル化を検出するために使用することができる。
Acyl-RACは4つの主要なステップ(図1)で構成されています。
1. 無料チオール群のブロック;
2. システイン-アシルチオエステル結合の選択的切断中性ヒドロキシルアミン (HAM) システインチオール基を露出する;
3. チオール反応性樹脂を用いた脂質化されたシステインの捕獲;
4. 還元バッファーと溶出後の S-acylated タンパク質の選択的濃縮.
次いで、捕捉したタンパク質を免疫ブロッティングにより分析するか、または質量分析(MS)ベースのプロテオミクスを行い、S-acylatedプロテオームを様々な種および組織22、24、2524,25の範囲で評価することができる。22個々のS-アシル化部位は、捕捉されたタンパク質のトリプシン消化およびLC-MS/MS22による得られたペプチドの分析によっても同定することができる。ここでは、細胞株と組織サンプルの両方で、複数のタンパク質のS-アシル化を同時に検出するためにacyl-RACを使用する方法を示す。
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Protocol
このプロトコルで使用されたマウスは、NIHガイドラインに従って安楽死させた。ヒューストンのテキサス大学保健科学センターの動物福祉委員会は、すべての動物の仕事を承認しました。
1. 細胞ライセートの調製
- 表1に記載されているように、リシスバッファを準備する。PBSを10mLに、0.1gのn-ドデシルβ-D-マルトシド洗剤(DDM)を加え、溶解させて回転させます。100 μL のホスファターゼ阻害剤カクテル 2、ML211(10 μM)、PMSF (10 mM)、プロテアーゼ阻害剤カクテル (1x) を加え、使用前に氷上でバッファーを冷やします。
- 培養器から細胞を含む必要な培地を、350 x gで15mLまたは50 mLの円錐形チューブおよびスピン細胞に移し、細胞の破片を取り除くために吸気します。
注:我々は実行される各アシル-RAC反応のために1 x 107細胞を使用しました。 - ペレットをPBS 5 mL に再懸濁し、350 x gで 5 分間回転させて洗浄します。
注:PBSの拡張インキュベーションによる細胞溶菌を避けるために、ステップ1.3を迅速に実行してください。 - ステップ1.1で調製した600μLのリシスバッファーをペレットに加え、4°Cで30分間サーマルシェーカーで1500rpmで振って溶地します。
- 透明溶解液は、ペレット洗剤不溶性材料に30分間4°Cで20,000 x gで遠心分離によって。予め冷却された1.5 mLマイクロフュージチューブでクリアしたライセートを収集し、氷の上に保管してください。
- ブラッドフォード/BCAアッセイを実行してタンパク質濃度を推定します。実験を行う前に、異なるサンプル間で同量のタンパク質を確保することが重要です。1回の反応で500μg以上のタンパク質を使用することを推奨します。
注:記載の実験では、マウス組織から培養された(Jurkat)細胞と初代脾細胞を使用しました。上記のライシス法は、他の細胞タイプにも採用することができる。上記の細胞タイプに対して得られる平均タンパク質濃度は、1×107細胞当たり7約500μgである。ジュルカット細胞は、2 mM L-グルタミン、10 mM HEPES、1 mMピルビン酸ナトリウム、4,500mg/Lグルコース、および1,500mg/L炭酸ナトリウムを5%CO2で37°Cで10%FBSを添加して含むRPMI-1640培地で維持した。我々は、反応ごとに1 x 107ジュルカット細胞を使用した。初代脾細胞は、26に記載したマウス脾臓組織から単離した。簡単に言えば、脾臓組織を氷上で浸食し、続いて低張性溶液中の赤血球の溶解と遠心分離によるリンパ球からの分離を行った。反応ごとに1 x 107の一次細胞を使用しました。
2. アシル-RAC: フリーチオール群の遮断
注: 以降の手順はすべて室温(RT)で実行できます。
- リセートを新鮮な1.5 mLマイクロフュージチューブに移し、以下に説明するクロロホルムメタノール(CM)沈殿を行う。
- メタノール(MeOH)とクロロホルム(CHCl3)3を、リセートの最終比でリセートに加え、MeOH:CHCl3 of 2:2:1を、均質な懸濁液を作り出すために激しく振る。
- 水相と有機相の間の相でペレット(「パンケーキ」)を形成するために5分間10,000 x gで回転します。
- 針またはゲルローディングチップを使用して、チューブを傾け、できるだけ多くの溶媒を吸引します。
- プロテインペレットを数分間空気乾燥し、600 μLのMeOHを加えて穏やかに洗浄し、ペレットを分解しないように穏やかに混合します。
- 残りのMeOHを慎重に取り除き、ベンチトップのプロテインペレットを約5分間乾燥させます。
- (オプション)MeOH洗浄後に壊れたペレットをスピンダウンして、試料の損失を避けるために、追加の遠心分離ステップを実行します。
注: CM の降水ステップの後で実験を停止できます。ペレットが得られたら、500 μL の MeOH で-20 °Cで 1 週間まで保存できます。- 2SHBバッファーの200 μLにタンパク質ペレットを溶解し、42°C/1500 rpmでペレットが溶解するまでサーマルシェーカーでボルテックスします。
- (オプション)ペレットを溶解するために超音波式水浴で追加の5〜10分間インキュベート。
注:超音波処理の長さは、材料の溶解度によって異なります。しかし、長時間の超音波処理はタンパク質分解を引き起こす可能性があります。
- 2SHBバッファーの998 μLに2 μL MMTSを加えて、2SHBで0.2%メチルメタンチオスルホン酸塩(v/v)を2SHBで調製します。
メモ:実験ごとに、作りたての0.2%MMTSを使用してください。 - 2SHBに0.2%MMTSの200 μLを加えて、各チューブに0.1%MMTSの最終濃度を加えます。サーマルシェーカーで1500rpmで振るとともに42°Cで15分間インキュベートします。
3. アシルRAC:ヒドロキシルアミン(HAM)の切断とS-アシル化タンパク質の捕獲
- MMTSを除去するために、上記のように3〜4倍のCM沈殿を繰り返します。MMTSの除去は、MMTSの独特の臭気の欠如によって推定することができる。沈殿後、ペレットを溶解するまでサーマルシェーカーで42°C/1500rpmでボルテックスすることにより2SHBバッファーの100μLにペレットを溶解し、次いで300μLのバッファーAで希釈する。
- 最終沈殿後、上記の2SHBバッファの200μLにサンプルを溶解し、240 μLのバッファAで希釈します。
- いくつかの処置条件に応じてS-acylationの変化を比較する場合、再びタンパク質濃度を測定し、各条件に対して同量のタンパク質を使用して進めます。
- 各サンプルから40μLを入力コントロールとして保持します。
- サンプルを200 μLの2つの等しい部分に分割し、チューブを「+HAM」と「-HAM」としてマークします。50 μLの新たに調製したニュートラル 2 M HAM (pH 7.0-7.5) をチューブの 1 つに 400 mM の最終濃度 (+ HAM) に加え、2番目のチューブ (- HAM) に 50 μL を加え、負のコントロールとして使用します。チオプロピル・セファローズ(TS)ビーズの添加に進みます。
注: CM の降水ステップの後で実験を停止できます。ペレットが得られたら、500 μL の MeOH で-20 °Cで 1 週間まで保存できます。2 M HAM の中性 pH は、アシルシステインチオエステル結合の選択性を保証し、慎重に調整する必要があります。過度の発泡によるサンプルの損失を避けるために、2SHBバッファでサンプルを取り扱う際には注意が必要です。以下のすべてのステップは、HAM および + HAM サンプルと同じです。 - 各チューブに30 μLのTSビーズスラリーを加え、RTで1~2時間回転させます。
- TSビーズをバッファAに1%SDSで4倍洗い、残ったHAMを取り除きます。
- マイクロフュージを使用して1分間、すべてのビーズサンプルをそっとスピンダウンし、上清を慎重に吸引します。
- バッファー A のビーズを 500 μL の 1% SDS で再中断します。
- ステップ 3.7.1 ~ 3.7.2 を繰り返します。
注:活性化チオプロピルセファローズ(TS)は、カップリングする前に中性pHで洗い流さなければならない添加剤の存在下で凍結乾燥供給される。蒸留水は、膨潤や洗浄におすすめです。0.1gのビーズの重量を量り、蒸留水1mLで再懸濁し、RTで30分間回転しながら膨らまじ、緩衝液Aでビーズ1xを洗浄し、50%のゲル化培地から50%のバッファーの比率でスラリーを調製します。腫れたTSは、4°Cで1週間まで20%エタノールの存在下で中性pHで保存され得る。アジドイオンは2-ピリジルジスルフィド基と反応するため、静電剤としてアジドナトリウムを使用しないでください。より高い効率のために、新鮮なビーズを準備します。ビーズを取り扱いながら、P200ピペットチップの先端を少し切って、損傷を防ぐことができます。
注:CMの降水後の任意の段階で実験を停止することができます。ペレットは、MeOHの500 μLで-20°Cで1週間まで保存することができます。
4. S-アシル化タンパク質の溶出と検出
- 最後の洗浄後、上記のようにビーズを軽く回転させ、ビーズを邪魔することなくできるだけ多くの上澄み物を吸い込みます。
- DTTを使用して4倍のSDSサンプルバッファーを使用してビーズからタンパク質を回収します。
- ビーズに50 μLの4倍のSDSサンプルバッファーを加え、80°Cでインキュベートし、サーマルシェーカーで15分間1500rpmでインキュベートします。チューブを冷まします。
- 5,000 x gでビーズを 3 分間遠心分離し、ビーズを完全にペレットし、ゲルローディングチップを使用して溶出したタンパク質を新鮮な 1.5 mL チューブに移します。
- SDS-PAGEを実行し、ウェスタンブロッティングによって目的のタンパク質のS-アシル化を分析します。
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Representative Results
上述したプロトコルに従って、我々は最初に、T細胞白血病患者27の末梢血に由来する不死化T細胞株であるJurkat細胞における複数のタンパク質のS-アシル化を同時に検出するために、acyl-RACを用いた。この方法の有用性を実証するために、以前にS-acylated9,289,28,2929と同定された調節性T細胞タンパク質が選択された。図2Aに示すように、チロシンキナーゼLckは、システイン残基と脂肪酸部分(+HAMレーン)との間のチオエステル結合を切断するために中性2Mヒドロキシラミンで処理されたライセートで検出することができる。2M NaCl(-HAMレーン)で処理した試料は重要な陰性対照を表し、チオエステル結合の検出に対するアッセイの選択性を示す。入力レーンは、シグナルの特異性をさらに確認し、目的のタンパク質がS-acylatedでない場合は陽性制御として機能することができる。次いで、膜を剥ぎ取り、タンパク質に対する抗体を再検出し、FynとLATを用いて、アシルRACアッセイを用いて複数のタンパク質のS-アシル化を同時に分析できることを実証した(図2A)。
この方法を用いた組織試料中のプロテインS-アシル化を検出する有用性を実証するために、マウス脾臓にアシルRACプロトコルを適用した。図2Bに示すように、Lck、FynおよびLATのS-アシル化は、この修飾が2種間で保存されていることを示す一次マウス脾細胞において容易に検出され得る。
図 1.アシル-RACの模式的表現。この方法は、4つの主要なステップからなる:(1)メチルメタンチオスルホン酸(MMTS)を有する遊離チオール基を遮断し、(2)システインアシルチオスター結合の選択的切断、システインチオール基を露出させる中性ヒドロキシルアミン(HAM)、 (3)新たに露出したシステインチオールを用いたタンパク質の捕捉を、チオール反応性樹脂と直接結合し、(4)還元溶出緩衝液を用いて捕捉したタンパク質を回収し、続いて免疫ブロッティングまたはMS分析を行う。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.S-アシル化タンパク質の検出アシルRACアッセイを用いて、Jurkat T細胞(A)およびマウス脾臓組織(B)におけるT細胞シグナル伝達タンパク質のS-アシル化を検出した。Lck-、Fyn-およびLAT特異的抗体を用いた免疫ブロットは、ヒドロキシルアミン処理試料中のこれらのタンパク質のS-アシル化を示す(+HAMレーン)。塩化ナトリウム(-HAMレーン)で処理されたサンプルは、陰性対照として機能する。未処理のライセートは入力レーンに示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| バッファー | 組成 | ノート |
| リシスバッファー (LB) | DPBS で 1% DDM;10 μM ML211;ホスファターゼ阻害剤カクテル 2 (1:100);プロテアーゼ阻害剤カクテル(1X)、PMSF(10mM) | 新鮮な準備をし、使用前に4°Cで冷やします。 |
| SDS バッファ(2SHB) | 2% SDS;5 mM EDTA;100 mMヘペス;pH 7.4 | |
| バッファ A | 5 mM EDTA;100 mMヘペス;pH 7.4 | |
| ヒドロキシルアミン (ハム) | 2 M ストック溶液を蒸留した H20 | 新鮮な準備をします。最初に溶解したとき、HAMは非常に低いpHを有する。pHを7-7.5に5 M NaOHを使用してください。 |
| 4X SDS サンプルバッファー | 200 mM Tris-Cl (pH 6.8), 8% SDS (ドデシル硫酸ナトリウム) 0.01% ブロモフェノールブルー, 10% グリセロール | 使用直前に5 mM DTTで補足します。 |
表 1: プロトコルで必要とされる一般的に使用されるバッファーのバッファー構成。2SHBバッファとバッファAは事前に用意できますが、pHは定期的にチェックする必要があります。ライシスバッファーとHAMは実験の日を準備する必要があります。
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Discussion
ここで、マウス組織由来の培養ヒト細胞および一次細胞の両方で選択したタンパク質のS-アシル化を検出するために、アシル-RACアッセイを利用することに成功しました。この方法は、単純で敏感であり、標準的な生化学技術を使用して最小限の装置要件で簡単に行うことができます。この方法は、タンパク質転写系のβサブユニット(Sec61b)、リボソームタンパク質S11(Rps11)、およびミクロソームグルタチオン-S-トランストランスファーゼ3(MGST3)22のような新規S-acylate化タンパク質22を同定することに成功することが示されている。アシルRACの感度と適応性は、様々な生物学的サンプル中のタンパク質S-アシル化を研究するのに適しています。
S-acylatedタンパク質のかなりの割合は、脂質いかだとしても知られている原形質膜のグリコスフィンゴ脂質濃縮部分と関連付けることができます。したがって、トリトンX-100、NP-40またはBrij58のような中性洗剤がリシス30に使用される場合、一部のS-acylatedタンパク質は完全に抽出されない可能性がある。アニオン性洗剤(SDSなど)またはマルトシド系非イオン性洗剤(n-ドデシルβ-D-マルトシド(DDM)など)を用いて、脂質いかだの解離や目的タンパク質の完全な回復を確実に行うことができる30、31、32。3230,31このプロトコルでは、膜タンパク質抽出に有効であることが実証された軽度の脂質様非イオン性洗剤であるDDMを用いて、長期間にわたって安定な天然状態を維持する33を用いた。
サンプルのリシス中の無秩序なチオエステラーゼ活性は、TSプルダウンステップ後にタンパク質収率を低下させ、S-acylatedタンパク質の検出に影響を与える可能性があります。チオエステラーゼ阻害剤は、ML211、アシルタンパク質チオエステラーゼ1(APT1、LYPLA1)およびアシルプロテインチオエステラーゼ2(APT2、LYPLA2)の二重阻害剤を添加して、ライセート34,35,35中のタンパク質の無差別脱アシル化を防ぐことができます。
システイン残基の不完全な遮断はTSに非アシル化されたタンパク質の結合を引き起こし、従って–HAMサンプルの高いシグナルによって明らかに高い背景をもたらす。このバックグラウンド結合は、周ららによる修飾ABEプロトコルに記載されているチオール架橋剤-2,2'-ジチオディピリジンとの追加インキュベーションによって実質的に減少させることができる。
代謝標識とは対照的に、アシルRACは生きた細胞に限定されず、新たに単離または凍結した組織サンプル中のタンパク質S-アシル化を検出するために行うことができる。acyl-RACプロトコルは免疫沈降工程を回避するので、同じアッセイで関心のある複数のタンパク質の脂質を同時に検出し、単一の実験で必要な生物学的材料の量を減らす可能性があります。しかし、代謝標識ベースのアッセイは、デノボS-アシル化を特異的に検出したり、目的のタンパク質上の脂肪酸回転率を測定することを目的とした実験に適しています。acyl-RACのもう一つの重要な制限は、この技術が同じチオ,エステル結合3、4、5、6、74,5を介してシステイン残基に共有結合することができる異3なる脂肪酸を区別することができないということである。6,7
アシルRACおよびABEアッセイはいずれも、システイン残基と脂肪酸との間のチオエステル結合の選択的切断に基づいて、遊離チオール基を明らかにする。acyl-RACはチオール反応性樹脂によるS-アシル化タンパク質の直接プルダウンを使用するため、ABEと比較して必要なステップは少なくなります。類似しているが、プロテオーム全体のS-acylationの研究は、これらの2つの方法を用いて検出されたタンパク質の変動を示し、技術的な違いが原因である可能性が最も高い。例えば、ラット脳ホモジネートにおいて、ABEベースの分析は241個のS-acylatedタンパク質を同定し、アシルRACベースの分析は14425を同定した。ラット脳プロテオーム中の61個のタンパク質は、タンパク質のS-アシル化状態を確認するための複数の技術の使用の必要性を強調する両方の方法によって一般的に検出された。
アシルRACおよびABE法のもう一つの潜在的な欠点は、S-アシル化のストイチオメトリーを確実に評価し、脂質化されたシステインの数を決定できないことである。これらの技術の修飾は、アシルPEG交換またはPEGシフトアッセイと呼ばれ、これらの制限37、38,38に対処するために開発された。この方法では、ヒドロキシルアミン切断後のプルダウンステップは、PEG-マレイミド質量タグでインキュベーションによって置換される。得られた遊離システイン残基のPEGylationは、SDS-PAGEにより質量シフトとして観察され得る。
結論として、acyl-RACは、多種多様な生物学的サンプルにおける生理学的および病的生理学的条件下でのタンパク質S-アシル化のダイナミクスに関する貴重な洞察を提供できる、迅速で敏感で信頼性の高い方法です。上記で議論した方法の限界を考慮すると、アシル-RACと他の技術の組み合わせが、目的のタンパク質のS-アシル化を完全に特徴付けることを推奨する。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所の助成金5R01GM115446と1R01GM130840によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
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