Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Påvisning av protein s-acylasjon ved hjelp av Acyl-harpiks assistert fangst

Published: April 10, 2020 doi: 10.3791/61016
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, McGovern Medical School at UT Health, 2MD Anderson UT Health Graduate School
* These authors contributed equally

Summary

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) er en svært følsom, pålitelig og enkel å utføre metode for å oppdage reversibel lipidmodifikasjon av cysteinrester (S-acylation) i en rekke biologiske prøver.

Abstract

Protein S-acylation, også referert til som S-palmitoylering, er en reversibel post-translasjonell modifikasjon av cysteinrester med lange kjedefettsyrer via en labile tioester binding. S-acylation, som fremstår som en utbredt regulatorisk mekanisme, kan modulere nesten alle aspekter av den biologiske aktiviteten til proteiner, fra kompleks dannelse til proteinhandel og proteinstabilitet. Den nylige fremgangen i forståelsen av den biologiske funksjonen til protein S-acylation ble oppnådd i stor grad på grunn av utviklingen av nye biokjemiske verktøy som tillater robust og sensitiv påvisning av protein S-acylation i en rekke biologiske prøver. Her beskriver vi acyl harpiksassistert fangst (Acyl-RAC), en nylig utviklet metode basert på selektiv fangst av endogene S-acylated proteiner av tiol-reaktive sepharose perler. Sammenlignet med eksisterende tilnærminger, acyl-RAC krever færre trinn og kan gi mer pålitelige resultater når kombinert med massespektrometri for identifisering av nye S-acylation mål. En stor begrensning i denne teknikken er mangelen på evne til å diskriminere mellom fettsyrearter knyttet til cystein via samme tioester binding.

Introduction

S-acylation er en reversibel post-translasjonell modifikasjon som involverer tilsetning av en fet acylkjede til en intern cysteinrester på et målprotein via en labile tioester bond1. Det ble først rapportert som en modifikasjon av proteiner med palmitat, en mettet 16-karbon fettsyre2, og derfor er denne endringen ofte referert til som S-palmitoylering. I tillegg til palmitat, proteiner kan være synlig modifisert av en rekke lengre og kortere mettet (myristate og stearat), enumettet (oleate) og flerumettet (arachidonate og eicosapentanoat) fettsyrer3,4,5,6,7. I eukaryyotiske celler katasieres S-acylasjon av en familie av enzymer kjent som DHHC protein acyltransferases og omvendt reaksjon av cystein deacylering er katalysert av protein tioesterases, hvorav de fleste fortsatt forblir gåtefulle8.

Labiliteten til tioesterbindingen gjør denne lipidmodifikasjonen reversibel, slik at den dynamisk kan regulere proteinklynger, plasmamembranlokalisering, intracellulær handel, proteinproteininteraksjoner og proteinstabilitet9,10. Følgelig har S-acylation vært knyttet til flere lidelser, inkludert Huntington sykdom, Alzheimers sykdom og flere typer kreft (prostata, mage, blære, lunge, kolorektal), som nødvendiggjør utvikling av pålitelige metoder for å oppdage denne post-translasjonelle protein modifikasjon11.

Metabolsk merking med radioaktivt ([3H], [14C] eller [125I]) palmitat var en av de første tilnærmingene utviklet for å analyse protein S-acylation12,13,14. Radiomerkingsbaserte metoder presenterer imidlertid helsemessige bekymringer, er ikke veldig følsomme, tidkrevende, og oppdager bare lipidering av svært rikelig proteiner15. Et raskere og ikke-radioaktivt alternativ til radiomerking er metabolsk merking med bioortogonale fettsyresonder, som brukes rutinemessig til å analysedynamikken i protein S-acylation16. I denne metoden er en fettsyre med en kjemisk reporter (alkyne eller azidegruppe) innlemmet i S-acylated protein av et proteinacyltransferase. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaksjon (klikk kjemi) kan deretter brukes til å feste en funksjonalisert gruppe, for eksempel en fluoroforeller eller biotin, til integrert fettsyre som tillater påvisning av S-acylated protein17,18,19.

Acyl-biotin utveksling (ABE) er en av de omfattende brukte biokjemiske metoder for fangst og identifisering av S-acylated proteiner som omgår noen av manglene ved metabolsk merking som uegnethet for vevsprøver15. Denne metoden kan brukes til analyse av S-acylation i et variert utvalg av biologiske prøver, inkludert vev og frosne celleprøver20,,21. Denne metoden er basert på selektiv spalting av tioesterbindingen mellom acylgruppen og cysteinrester av nøytral hydroksylamin. De frigjorte tiolgruppene fanges deretter opp med et tiol-reaktivt biotinderivat. De genererte biotinylated proteiner blir deretter affinitet-renset ved hjelp av streptavidin agarose og analysert av immunblotting.

En alternativ tilnærming kalt acyl-harpiks assistert fangst (Acyl-RAC) ble senere introdusert for å erstatte biotinylation trinn med direkte bøyning av frie cystein av en tiol-reaktiv harpiks22,23. Denne metoden har færre trinn sammenlignet med ABE og kan på samme måte brukes til å oppdage protein S-acylation i et bredt spekter av prøver1.

Acyl-RAC består av 4 hovedtrinn (Figur 1)
1. Blokkering av gratis tiolgrupper;
2. Selektiv spalting av cystein-acyl tioester bånd med nøytral hydroksylamin (HAM) for å avsløre cystein tiol grupper;
3. Fangst av lipiderte cysteinmed en tiol-reaktiv harpiks;
4. Selektiv berikelse av S-acylated proteiner etter elution med reduserende buffer.

De fangede proteinene kan deretter analyseres ved immunblotting eller utsatt for massespektrometri (MS) basert proteomics for å vurdere S-acylated proteome i et variert utvalg av arter og vev22,24,25. Individuelle S-acylation nettsteder kan også identifiseres ved trypsin fordøyelse n av fanget proteiner og analyse av de resulterende peptider av LC-MS/MS22. Her viser vi hvordan acyl-RAC kan brukes til samtidig påvisning av S-acylation av flere proteiner i både en cellelinje og en vevsprøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mus som brukes i denne protokollen ble euthanized i henhold til NIH retningslinjer. Dyrevelferdskomiteen ved University of Texas Health Science Center i Houston godkjente alt dyrearbeid.

1. Utarbeidelse av celle lysates

  1. Forbered lysisbufferen som beskrevet i tabell 1. Til 10 ml PBS, tilsett 0,1 g n-dodecyl β-D-maltoside vaskemiddel (DDM) og roter for å oppløse. Tilsett 100 μL fosfatasehemmer cocktail 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) og proteasehemmercocktail (1x) og kjøl bufferen på is før bruk.
  2. Overfør nødvendige medier som inneholder celler fra inkubatoren til 15 ml eller 50 ml koniske rør og spinnceller på 350 x g i 5 min og aspirer for å kvitte seg med cellerester.
    MERK: Vi brukte 1 x 107 celler for hver acyl-RAC-reaksjon som skal utføres.
  3. Vask pelleten ved å resuspendere den i 5 ml PBS og spinne på 350 x g i 5 min.
    MERK: Utfør trinn 1.3 raskt for å unngå cellelyse på grunn av utvidet inkubasjon i PBS.
  4. Tilsett 600 μL lysisbuffer klargjort i trinn 1.1 til pelleten og lyse den ved å riste ved 1500 rpm i en termisk shaker i 30 min ved 4 °C.
  5. Klart lysates ved sentrifugering på 20.000 x g ved 4 °C i 30 min til pellet vaskemiddel-uoppløselige materialer. Samle ryddet lysate i forhåndskjølte 1,5 ml mikrofugerør og hold dem på is.
  6. Utfør en Bradford/BCA-analyse for å estimere proteinkonsentrasjon. Det er avgjørende å sikre samme mengde protein på tvers av ulike prøver før eksperimentet utføres. Vi anbefaler at du bruker minst 500 μg protein per reaksjon.
    MERK: I de beskrevne eksperimentene brukte vi kultiverte (Jurkat) celler og primære splenocytter fra musvev. Lysis-metoden som er beskrevet ovenfor, kan også tas i bruk til andre celletyper. Den gjennomsnittlige proteinkonsentrasjonen oppnådd for de ovennevnte celletypene er ca. 500 μg per 1 x 107 celler. Jurkatceller ble opprettholdt i RPMI-1640 medium modifisert til å inneholde 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat, 4500 mg/ l glukose, og 1500 mg / L natriumbikarbonat supplert med 10% FBS ved 37 °C med 5% CO2. Vi brukte 1 x 107 Jurkat celler per reaksjon. Primære splenocytter ble isolert fra musemiltvev som beskrevet26. Kort sagt ble miltvev macerated på is, etterfulgt av lysis av erytrocytter i hypotonisk løsning og separasjon fra lymfocytter ved sentrifugering. Vi brukte 1 x 107 primærceller per reaksjon.

2. Acyl-RAC: Blokkering av gratis tiolgrupper

MERK: Alle påfølgende trinn kan utføres ved romtemperatur (RT).

  1. Overfør lysattil et friskt 1,5 ml mikrofugerør og utfør kloroform-metanol (CM) nedbør som beskrevet nedenfor.
    1. Tilsett metanol (MeOH) og kloroform (CHCl3) til lysatet i et endelig forhold mellom lysat: MeOH: CHCl3 av 2:2:1 og rist kraftig for å skape en homogen suspensjon.
    2. Spinn på 10.000 x g i 5 min for å danne en pellet ("pannekake") i mellomfasen mellom vandige og organiske faser.
    3. Vipp røret og aspirere så mye løsemiddel som mulig ved hjelp av en nål eller en gel lasting tips.
    4. Luft tørke proteinpellet i noen minutter og vask den forsiktig ved å tilsette 600 μL MeOH og blande forsiktig for å unngå å bryte opp pellet
    5. Fjern forsiktig den gjenværende MeOH og tørk proteinpelleten på en benkeplate i ca. 5 min.
    6. (Valgfritt) Utfør et ekstra sentrifugeringstrinn for å spinne ned en ødelagt pellet etter MeOH-vasken for å unngå tap av prøve.
      MERK: Eksperimentet kan stoppes etter CM-nedbørstrinnet. Når pelleten er oppnådd, kan den oppbevares i 500 μL meoh i -20 °C opptil en uke.
      1. Oppløs proteinpelleten i 200 μL av 2SHB-buffer ved å vortexing ved 42 °C/1500 odens i en termisk shaker til pelleten er oppløst.
    7. (Valgfritt) Inkuber i ytterligere 5–10 min i et sonikerende vannbad for å oppløse pelleten.
      MERK: Lengden på sonikering varierer avhengig av løselighet av materialet. Imidlertid kan langvarig sonikering forårsake proteinnedbrytning.
  2. Forbered 0,2 % metanmetionsulfonat (MMTS) (v/v) i 2SHB ved å tilsette 2 μL MMTS til 998 μL 2SHB-buffer.
    MERK: Bruk nylaget 0,2 % MMTS for hvert eksperiment.
  3. Tilsett 200 μL 0,2 % MMTS i 2SHB til hvert rør til en endelig konsentrasjon på 0,1 % MMTS. Inkuber i 15 min ved 42 °C med risting ved 1500 o/min i en termisk shaker.

3. Acyl-RAC: Hydroxylamine (HAM) spalting og fangst av S-acylated proteiner

  1. Gjenta 3-4x CM nedbør som beskrevet ovenfor for å fjerne MMTS. Fjerning av MMTS kan estimeres ved mangel på tydelig lukt av MMTS. Etter hver nedbør oppløses pelleten i 100 μL av 2SHB-buffer ved å vortexing ved 42 °C/1500 rpm i en termisk shaker til pelleten oppløses, og fortynn deretter med 300 μL buffer A.
  2. Etter endelig nedbør oppløses prøvene i 200 μL av 2SHB-buffer som beskrevet ovenfor og fortynnes med 240 μL buffer A.
  3. Ved sammenligning av endringer i S-acylation som svar på flere behandlingsforhold, måle proteinkonsentrasjon igjen og fortsett med like mye protein for hver tilstand.
  4. Hold 40 μL fra hver prøve som en inndatakontroll.
  5. Del prøver i to like deler av 200 μL og merk rør som "+ HAM" og "- HAM". Tilsett 50 μL nylaget nøytral 2 M HAM (pH 7,0-7,5) til en endelig konsentrasjon på 400 mM til et av rørene (+ HAM) og 50 μL nøytral 2 M NaCl til det andre røret (- HAM), som vil bli brukt som en negativ kontroll. Fortsett til tilsetning av thiopropyl-Sepharose (TS) perler.
    MERK: Eksperimentet kan stoppes etter noen av CM-nedbørstrinnene. Når pelleten er oppnådd, kan den oppbevares i 500 μL meoh i -20 °C opptil en uke. Nøytral pH på 2 M HAM sikrer selektivitetfor acyl-cysteine tioester binding og bør justeres nøye. Det bør utvises forsiktighet ved håndtering av prøver i 2SHB-buffer for å unngå tap av prøve på grunn av overdreven skumdannelse. Alle følgende trinn er identiske for - HAM- og + HAM-prøver.
  6. Tilsett 30 μL TS perleslam til hvert rør og roter rørene i 1-2 timer ved RT.
  7. Vask TS-perlene 4x med 1 % SDS i buffer A for å fjerne gjenværende HAM.
    1. Snurr er alle perleprøver forsiktig ved hjelp av en mikrofuge i 1 min og forsiktig aspirere supernatanten.
    2. Resuspend perlene i 500 μL av 1% SDS i buffer A.
    3. Gjenta trinn 3.7.1–3.7.2 tre ganger.
      MERK: Aktivert tiopropyl-sepharose (TS) leveres frysetørket i nærvær av tilsetningsstoffer som må vaskes bort ved nøytral pH før kobling. Destillert vann anbefales for hevelse og vasking. Vei 0,1 g perler og resuspend i 1 ml destillert vann og la den svulme mens du roterer i 30 min-1 timer ved RT. Vask perler 1x med buffer A og klargjør en slurry med buffer A, i et forhold på 50% avgjort middels til 50% buffer. Hovent TS kan oppbevares ved nøytral pH i nærvær av 20 % etanol ved 4 °C opptil en uke. Ikke bruk natriumazid som bakteriestatisk middel siden azideioner reagerer med 2-pyridyldisulfidgruppene. For høyere effektivitet, forberede friske perler. Ved håndtering av perlene kan spissen på en P200 pipettespiss kuttes litt for å forhindre skade.
      MERK: Eksperimentet kan stoppes når som helst etter CM-nedbør. Pelletkan oppbevares i 500 μL meoh i -20 °C opptil en uke.

4. Elution og påvisning av S-acylated proteiner

  1. Etter den siste vasken, saktere ned perlene som beskrevet ovenfor og aspirere så mye supernatant som mulig uten å forstyrre perlene.
  2. Gjenopprett proteinene fra perler med 4x SDS prøvebuffer med DTT.
    1. Tilsett 50 μL 4x SDS prøvebuffer til perlene og inkuber ved 80 °C, 1500 o/min i en termisk shaker. La rørene avkjøles.
    2. Sentrifuger perlene på 5000 x g i 3 min for å fullstendig pellet perlene og overføre eluted proteiner til et friskt 1,5 ml rør ved hjelp av en gel lasting tips.
  3. Kjør SDS-PAGE og analyser S-acylation av proteinet(e) av interesse ved vestlig blotting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter protokollen beskrevet ovenfor, vi først brukt acyl-RAC å samtidig oppdage S-acylation av flere proteiner i Jurkat celler, en udødeliggjort T cellelinje opprinnelig avledet fra perifert blod av en T celle leukemi pasient27. Regulatoriske T celle proteiner tidligere identifisert som S-acylated9,28,29 ble valgt for å demonstrere nytten av denne metoden. Som vist i figur 2A,kan tyrosin kinase Lck påvises i lysater behandlet med nøytral 2 M hydroksylamin for å holde tioesterbindingen mellom cysteinrester og en fettsyremoiety (+ HAM lane). Prøven behandlet med 2 M NaCl (- HAM lane) representerer en viktig negativ kontroll, noe som indikerer selektiviteten til analysen for påvisning av tioester bindingene. Inngangsfeltet bekrefter videre spesifisiteten til signalet og kan tjene som en positiv kontroll hvis proteinet av interesse ikke er S-acylated. Membranen ble deretter strippet og reprobed med antistoffer mot proteiner Fyn og LAT for å vise at acyl-RAC-analysen kan brukes til å analysere S-acylation av flere proteiner samtidig (Figur 2A).

For å demonstrere nytten av denne metoden for å oppdage protein S-acylation i vevsprøver, brukte vi acyl-RAC-protokollen til musemilten. Som vist i figur 2B,kan S-acylation av Lck, Fyn og LAT lett oppdages i primære museplenocytter som indikerer at denne endringen er bevart mellom to arter.

Figure 1
Figur 1. Skjematisk representasjon av acyl-RAC. Metoden består av 4 hovedtrinn: (1) blokkerer frie tiolgrupper med metymetantiosulfonat (MMTS), (2) selektiv spalting av cystein-acyl tioester binding med nøytral hydroksylamin (HAM) for å eksponere cysteintiolgrupper, (3) fangst av proteiner med nylig eksponert cysteintiol ved direkte bøyning med tiolreaktiv harpiks og (4) gjenoppretting av fangede proteiner ved hjelp av en reduksjon av elutionbuffer, etterfulgt av immunblotting eller MS-analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Påvisning av S-acylated proteiner. En acyl-RAC analyse ble brukt til å oppdage S-acylation av T celle signalproteiner i Jurkat T celler (A) og murine miltvev (B). Immunblotting med Lck-, Fyn- og LAT-spesifikke antistoffer viser S-acylation av disse proteinene i hydroksylaminbehandlet prøve (+ HAM lane). En prøve behandlet med natriumklorid (- HAM lane) fungerer som negativ kontroll. Ubehandlede lysates vises i inndatafeltet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Buffer Sammensetning Notater
Lysis Buffer (LB) 1% DDM i DPBS; 10 μM ML211; Fosfatase Inhibitor Cocktail 2 (01:100); Protease hemmer cocktail (1X), PMSF (10 mM) Forbered frisk, chill ved 4 °C før bruk.
SDS Buffer (2SHB) 2% SDS; 5 mM EDTA; 100 mM HEPES; PH 7.4 (Andre)
Buffer A 5 mM EDTA; 100 mM HEPES; PH 7.4 (Andre)
Hydroksylamin (HAM) 2 M lagerløsning i destillert H20 Forbered deg frisk. Når du først oppløses, har HAM en svært lav pH. Bruk 5 M NaOH til pH til 7-7.5.
4X SDS-prøvebuffer 200 mM Tris-Cl (pH 6.8), 8% SDS (natrium dodecylsulfat) 0,01% bromofenol blå, 10% glyserol Tillegg med 5 mM DTT like før bruk.

Tabell 1: Buffersammensetning av vanlige buffere som kreves i protokollen. 2SHB buffer og buffer A kan tilberedes på forhånd, men deres pH må kontrolleres regelmessig. Lysis buffer og HAM må være forberedt på eksperimentdagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her brukte vi acyl-RAC-analysen for å oppdage S-acylation av utvalgte proteiner i både kultiverte menneskelige celler og primære celler avledet fra musevev. Denne metoden er enkel, følsom, og kan enkelt utføres med minimale utstyrskrav ved hjelp av standard biokjemiteknikker. Denne metoden har vist seg å identifisere nye S-acylated proteiner som β-subunit av protein translocating system (Sec61b), ribosomal protein S11 (Rps11), og mikrosomal glutation-S-transferase 3 (MGST3)22. Følsomheten og tilpasningsevnen til acyl-RAC gjør den egnet til å studere protein S-acylation i en rekke biologiske prøver.

En betydelig brøkdel av S-acylated proteiner kan være forbundet med glykosphingolipid-beriket deler av plasmamembranen, også kjent som lipid flåter. Dermed kan noen S-acylated proteiner ikke være fullstendig ekstrahert hvis milde vaskemidler, som Triton X-100, NP-40 eller Brij58, brukes til lysis30. Anioniske vaskemidler (som SDS) eller maltosidbaserte ikke-ioniske vaskemidler (som n-dodecyl β-D-maltoside (DDM)) kan brukes til å sikre dissosiasjon av lipidflåter og full gjenoppretting av proteinene av interesse30,,31,32. I denne protokollen brukte vi DDM, et mildt, lipidlignende ikke-ionisk vaskemiddel som har vist seg å være effektive i membranproteinutvinning og opprettholde sin stabile innfødte tilstand over lengre perioder33.

Den uregulerte tioesteraseaktiviteten under lysis av prøven kan potensielt føre til redusert proteinutbytte etter TS-nedtrekkstrinnet og dermed påvirke påvisning av S-acylated proteiner. En tioesterasehemmer, som ML211, en dobbel hemmer for Acyl-Protein Thioesterase 1 (APT1, LYPLA1) og Acyl-Protein Thioesterase 2 (APT2, LYPLA2) kan legges til for å forhindre ukritisk deacylering av proteiner i lysat3434,35.

En ufullstendig blokade av cysteinrester kan føre til binding av ikke-acylated proteiner til TS, noe som resulterer i en høy bakgrunn tydelig av høyt signal i -HAM-prøvene. Bakgrunnsbindingen kan reduseres betydelig med en ekstra inkubasjon med et tiol-crosslinking agent-2,2'-dithiodipyridin som beskrevet i en modifisert ABE-protokoll av Zhou et al.36.

I motsetning til metabolsk merking er acyl-RAC ikke begrenset til levende celler og kan utføres for å oppdage protein S-acylation i nyisolerte eller frosne vevsprøver. Siden acyl-RAC-protokollen unngår et immunnedbørstrinn, kan den brukes til å samtidig oppdage lipidering av flere proteiner av interesse i samme analyse, og dermed potensielt redusere mengden biologisk materiale som kreves i et enkelt eksperiment. Metabolske merkingsbaserte analyser er imidlertid mer egnet for eksperimenter som tar sikte på å spesifikt oppdage de novo S-acylation eller måle fettsyreomsetningsrater på et protein av interesse. En annen viktig begrensning av acyl-RAC er at denne teknikken ikke er i stand til å skille mellom forskjellige fettsyrer som kan være kovalent bundet til cysteinrester via samme tioester bond3,4,5,6,7.

Både acyl-RAC og ABE analyser er basert på selektiv spalting av tioester-bindingen mellom cysteinrester og en fettsyre for å avsløre en gratis tiolgruppe. Siden acyl-RAC bruker direkte nedtrekk av S-acylated proteiner ved en tiol-reaktiv harpiks, krever denne metoden færre trinn i forhold til ABE. Selv om lignende, proteome-wide studier av S-acylation viser noen variasjon i proteiner oppdaget ved hjelp av disse to metodene, mest sannsynlig på grunn av de tekniske forskjellene. For eksempel, i rotte hjernen homogenat, ABE-basert analyse identifisert 241 S-acylated proteiner mens acyl-RAC-basert analyse identifisert 14425. 61 proteiner i rottehjernenproteome ble ofte oppdaget ved begge metodene som understreker behovet for bruk av flere teknikker for å fastslå S-acylation status av et protein.

En annen potensiell ulempe med acyl-RAC og ABE metoder er manglende evne til å pålitelig evaluere stoichiometry av S-acylation og bestemme antall lipiderte cystein. En endring av disse teknikkene, kalt acyl-PEG utveksling eller PEG-skift analyse, ble utviklet for å løse disse begrensningene37,38. I denne metoden erstattes pull-down-trinnet etter hydrokylalanspaltning ved inkubasjon med en PEG-maleimide massemerke. Resulterende PEGylation av eksponerte frie cysteinrester kan observeres som masseskift av SDS-PAGE.

Til slutt er acyl-RAC en rask, følsom og pålitelig metode som kan gi verdifull innsikt i dynamikken i protein S-acylation under både fysiologiske og patofysiologiske forhold i et stort utvalg av biologiske prøver. Tatt i betraktning begrensninger av metoden som diskuteres ovenfor, anbefales en kombinasjon av acyl-RAC med andre teknikker å karakterisere S-acylation av et protein av interesse fullt ut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd 5R01GM115446 og 1R01GM130840.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets Sigma 11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424 Eppendorf 22620444
Hydroxylamine (HAM) Sigma 159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS) Sigma 64306
Mini tube rotator LabForce
ML211 Cayman 17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake Benchmark Scientific H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) Sigma D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) Sigma T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator L & R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
  2. Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).
  3. Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).
  4. DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).
  5. Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).
  6. Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).
  7. Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
  8. Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).
  9. Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).
  10. Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
  11. Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).
  12. O'Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
  13. Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
  14. Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40 (2), 191-197 (2006).
  15. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
  16. Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
  17. Rami, N., Hannoush, N. A. -R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).
  18. Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
  19. Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
  20. Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
  21. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).
  22. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  23. Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
  24. Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).
  25. Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  26. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
  27. Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
  28. Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).
  29. Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).
  30. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
  31. Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).
  32. Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).
  33. Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), (2017).
  34. Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
  35. Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
  36. Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).
  37. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).
  38. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).

Tags

Biokjemi Utgave 158 Biokjemi immunologi cellebiologi S-acylasjon palmitoylering post-translasjonell modifikasjon Acyl-RAC splenocytter lymfocytter
Påvisning av protein s-acylasjon ved hjelp av Acyl-harpiks assistert fangst
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tewari, R., West, S. J., Shayahati,… More

Tewari, R., West, S. J., Shayahati, B., Akimzhanov, A. M. Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture. J. Vis. Exp. (158), e61016, doi:10.3791/61016 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter