Summary
棕榈化需要以可逆的方式将16碳棕榈酰化物与靶蛋白的半胱氨酸残留物结合。在这里，我们描述了一种生化方法，即acyl-PEGyl交换凝胶移位（APEGS）测定，以研究小鼠脑水化剂中任何感兴趣的蛋白质的棕榈酸化状态。
Abstract
在脑后密度 （PSD） 中突触性 AMPA 受体 （AMPA） 水平的活动相关变化被认为是一种细胞机制的学习和记忆。棕榈化以活动相关的方式调节许多突触蛋白的定位和功能，包括AMPA-R、辅助因子和突触支架。我们确定了突触分化诱导基因（SynDIG）的四个基因系列（SynDIG1-4），编码与AmpARs关联并调节突触强度的特定于大脑的跨膜蛋白。SynDIG1 在位于并列跨膜区域位置 191 和 192 处的两个半胱氨酸残留物处进行棕榈酸酯化，对活动依赖性兴奋突触发育非常重要。在这里，我们描述了一种创新的生化方法，即acyl-PEGyl交换凝胶移位（APEGS）测定，以调查任何感兴趣的蛋白质的棕榈酸化状态，并证明其与小鼠脑水化中蛋白质的SynDIG家族的作用。
Introduction
S-掌上酸化是一种可逆的转化后靶蛋白，调节稳定的膜关联、蛋白质贩运和蛋白质-蛋白质相互作用1。它涉及通过棕榈酸乙酰乙酰转移酶（PAT）酶催化的硫化物链接，将16碳棕榈酸酶添加到半胱氨酸残留物中。大脑中的许多突触蛋白被棕榈酸化，包括AMPA-R和PSD-95，以活动依赖的方式调节稳定性、定位性和功能22，3，4。3,4通过辅助因素与突触支架（如 PSD-95）之间的相互作用，PSD 中突触性抗量系数水平的变化，导致突触可塑性;因此，确定突触蛋白的棕榈化状态的方法为突触可塑性机制提供了重要的见解。
之前，我们确定了SynDIG家族的四个基因（SynDIG1-4），编码与AmpARs5相关的大脑特异性跨膜蛋白。在分离的大鼠河马神经元中，SynDIG1的过度表达或击倒增加或减少，AMPA-R突触的大小和数量与使用免疫细胞化学和电生理学5检测到的+50%。我们利用acyl-生物素交换（ABE）测定法来证明SynDIG1在两种保存的共聚体-转膜细胞残留物（存在于所有SynDIG蛋白中）中，以活动相关的方式调节稳定性、定位性和功能6。ABE测定依赖于通过修饰和随后的亲和力纯化7保护的半胱氨酸的生物组。在这里，我们描述了一种创新的生化方法，acyl-PEGyl交换凝胶移位（APEGS）测定88，9，10，11，12，它不需要亲和力纯化，而是利用凝胶流动性的变化来确定感兴趣的蛋白质的修改次数。,9,10,11,12该协议被描述为研究小鼠大脑中的内源膜蛋白，适合其抗体。
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Protocol
所有动物程序都遵循国家卫生研究院 （NIH） 制定的指导方针，并经加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会批准。
1. 小鼠脑膜的制备
- 使用断头器将小鼠斩首，并迅速解剖大脑（如果可能，在+lt;1 分钟内，以尽量减少解剖过程中可能发生的棕榈岛化变化）。在冰上的玻璃均质器（+12冲程）中，在10 mL的均质缓冲液（表1）中立即均质化。
- 在4°C下，在1，400 x g下，在1，400 x g下，离心机在15分钟内进行浓缩。将上清液转移到冰上的新管。在相同量的均质缓冲液中重新悬浮颗粒（+6 冲程），在710 x g下以离心机在4°C下10分钟。
- 在4°C下，将来自步骤 1.2 和离心机的超子体以 40，000 x g进行 20 分钟。
- 丢弃上清液（细胞分数），并在均质化缓冲液中重新悬浮颗粒膜（P2）分数。
注：样品可以闪光冷冻，储存在-80°C，供以后使用。 - 执行二头蛋白酸 （BCA） 测定以定量蛋白质水平。对于 APEGS 测定，从 ±100×200 mg 蛋白质（最大 250 毫克）开始，在 1.5 mL 管中，缓冲 A 的体积为 470 μL（表 1）。在 >13，000 x g下进行声波和离心机，在 25°C 下 10 分钟，以去除不溶性蛋白质。将溶解蛋白转移到新的1.5 mL管中。
2. 阿西尔-佩吉尔交换凝胶移位（APEGS）测定
- 破坏二硫化物键，阻止自由半胱氨酸。
- 通过孵育25 mM三分（2卡博克斯海）磷化物（TCEP;25 μL，从股票溶液中加入）来破坏二硫化物债券;表1）在55°C下60分钟。
- 块无半胱氨酸与50 mM N-乙酰胺（NEM;12.5 μL，从库存溶液添加;表1）室温为3小时。
注：反应可以延长一夜之间。
- 执行氯仿甲醇 （CM） 沉淀。
- 将蛋白质溶液从 1.5 mL 管转移到聚丙烯或玻璃管，该管可在摆动的铲斗转子中以适中速度离心。5 mL 管是理想的。简单加入四卷（2 mL）甲醇（MeOH）和涡旋。
- 简单添加两卷 （1 mL） 的氯仿和涡流。
- 简单添加三卷 （1.5 mL） dH2O 和涡流。
- 在摆动的铲斗转子中，在 25°C 下将样品在 3，000 x g下离心 30 分钟。
- 小心地拆下并丢弃上相。
- 加入3卷（1.5 mL）的MeOH，轻轻，但彻底混合，小心不要碎片不透明的蛋白质煎饼。
- 在摆动的铲斗转子中，在 3，000 x g下离心 10 分钟，温度为 25°C。
- 使用玻璃血清学移液器，去除尽可能多的顶相，而不会干扰蛋白质煎饼。
- 用 1 mL MOH 仔细冲洗颗粒。
- 空气干燥颗粒至少10分钟。
注：干颗粒可储存在-20°C。
- 与羟基胺（NH2OH，HAM）进行棕榈-硫酯联系的裂解。
- 在缓冲A的125μL中重新悬浮蛋白沉淀，并短暂声波。在 25°C 下，在 >13，000 x g下离心 10 分钟，以去除不溶性材料。将溶解蛋白转移到新的1.5 mL管中。
- 加入375 μL的缓冲液H（HAM+;表1）或缓冲 T（HAM-;表1）在25°C下孵育样品60分钟。
- 重复步骤 2.2 中描述的 CM 沉淀。
注：干颗粒可储存在-20°C。 - 将 mPEG 添加到未受保护的半胱氨酸。
- 在含有 10 mM TCEP 的缓冲液 A 的 100 μL 中重新悬浮颗粒。转移到 1.5 mL 管。
注：在CM沉淀步骤期间发生蛋白质显著损失是正常的。所有后续步骤都将在 1.5 mL 管中执行，将蛋白质的体积限制在 ±120±130 μL。这将减少蛋白质损失在最后的CM沉淀。 - 添加 20 mM mPEG-5k （25 μL，从库存溶液中添加;表1）蛋白质样品，并通过移液混合。在25°C下孵育60分钟，进行末端旋转。
- 要去除未合并的 mPEG-5k，请使用这些调整体积执行步骤 2.2 中描述的 CM 沉淀：4 卷 MeOH （500 μL）、2 卷氯仿 （250 μL） 和 3 卷 dH2O （375 μL）。在 >13，000 x g下离心 10 分钟，在 25 °C 下。
- 小心地去除上相，避免厚厚的，絮状的煎饼。加入 1 mL 的 MeOH，轻轻但彻底地混合。在 >13，000 x g下离心 10 分钟，在 25 °C 下。
- 小心地取出上清液，用 1 mL 的 MeOH 冲洗颗粒。在 >13，000 x g下离心 10 分钟，在 25 °C 下。空气干燥颗粒。
注：干颗粒可储存在-20°C。 - 将干颗粒重新悬浮在50μL的缓冲液A（不含TCEP或任何还原剂）。保留 5 μL 用于 BCA 蛋白质定量。定量后，加入适当数量的4x莱姆利样品缓冲液，并根据感兴趣的蛋白质，可能将样品加热到70~100°C10分钟。
注：沸腾可能导致一些膜蛋白聚集。
- 在含有 10 mM TCEP 的缓冲液 A 的 100 μL 中重新悬浮颗粒。转移到 1.5 mL 管。
3. 皮吉酸蛋白的西斑分析
- 将样品加载到硫酸钠多丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶13。
注：在此协议中使用了 10% 聚丙烯酰胺。 - 使用标准分离，传输和检测协议为西方印迹14。
- 使用密度测定14来确定PEGylated蛋白和非皮环蛋白的相对量。
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Representative Results
与不包括HAM的样品相比，用抗体对感兴趣的蛋白质进行免疫膨胀，可以揭示小鼠脑解解液中的棕榈酸化状态（非、单独、双重等）。此前，我们已经证明SynDIG1是使用ABE测定6在两个地点进行棕榈酸盐测定的;然而，我们无法确定这两个位点是否在脑组织中被修改。在这里，我们显示，SynDIG1，SynDIG4/Prrt1，和Prrt2在小鼠大脑中被棕榈酸化，他们有两个潜在的棕榈酸化位点（图1）。有趣的是，每种蛋白质在小鼠大脑中具有不同的棕榈酸化状态，其基础是非、单独和双棕榈酸化蛋白的信号。印迹的密度测量分析提供了有关棕榈酸化状态的定量信息。
图1：小鼠膜制剂中PEGylate蛋白物种的检测。老鼠的大脑被迅速解剖，并立即同质化。P2膜分数受到该协议所述的APEGs测定。在这个实验中，产后第18天（P18）使用10%SDS-PAGE凝胶分离，并用针对SynDIG1（SD1）、Prrt2和SynDIG4（SD4）的抗体进行免疫斑点和探出。符号表示蛋白质不是棕榈酸酯 （*），棕榈酸酯单独 （*）， 或双倍 （*）。在 HAM （-） 条件下存在微弱带表示 NEM 不完全减少二硫化物键或完全堵塞游自由半胱氨酸。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 缓冲区 | 组件 | 工作锥。 | 评论 |
| 均匀 | 0.32 M 蔗糖，1 mM 三轮车 pH 7.2，1 mM MgCl2 | 使用前立即加入PMSF和蛋白酶抑制剂。 | |
| 缓冲区 A | PBS pH 7.2， 5 mM EDTA， 4% SDS （w/v） | 使用前立即加入PMSF和蛋白酶抑制剂。 | |
| TCEP 解决方案 | 500 mM TCEP，ddH2O （pH 7.2） | 25 mM | 添加 10 N NaOH 以增加 pH。 |
| NEM 解决方案 | 2.0 M NEM，100%乙醇 | 50 mM | 准备新鲜。 |
| 缓冲器 H （HAM+） | 1.33 M HAM，pH 7.0，5 mM EDTA，0.2% 特里顿 X-100 （vv） | 1.0 M | 准备新鲜。 |
| 缓冲器 T （HAM-） | 1.33 M Tris-HCl，pH 7.0，5 mM EDTA，0.2% Triton X-100 （w/v） | ||
| mPEG-5k | 100 mM mPEG-5k 在 ddH2O | 20 mM | 混合好。高度粘稠。 |
表1：用于APEGS测定的解决方案。可提前准备均质缓冲器和缓冲区 A;然而，在使用前立即添加蛋白酶抑制剂和苯乙二甲基磺酸基氟化物（PMSF）。所有其他解决方案都应新鲜准备。
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Discussion
在之前的工作中，我们利用 ABE 测定来证明 SynDIG1 在两种保存的共聚膜细胞残渣（存在于所有 SynDIG 蛋白质中）中以活动相关的方式进行棕榈酸化，以调节稳定性、定位性和功能6。一个限制是ABE测定需要亲和纯化与阿甘丝树脂结合作为程序的最后一步，导致信号的重大丢失，使定量分析复杂化。此外，ABE测定无法区分蛋白质是棕榈酸酯一次还是在多个地点。
在这里，我们使用APEGS测定8,8，9，10，11，12来确定阿帕辅助跨膜蛋白SynDIG1和相关蛋白质SynDIG4（也称为Prrt1）和Prrt2从小鼠脑提取物的棕榈化状态;9,10,11,12然而，该测定可应用于任何膜蛋白，其优质和特异性抗体适用于西方印迹。使用来自野生类型 （WT） 和挖空 （KO） 小鼠的脑膜为抗体特异性提供了理想的控制，正如我们针对 SynDIG115和 SynDIG416的抗体演示的那样。使用WT和KO小鼠的脑致解毒物进行APEGS测定，为该方法的抗体特异性提供了重要的控制。该方法还可用于通过差分离心获得的不同膜分数，然后进行APEGS测定，以研究感兴趣的蛋白质的亚细胞定位。
APEGS 测定的一个关键步骤是 CM 沉淀，其目的是去除化学物质 （NEM 和 HAM） 干扰后续的下游反应。虽然在 1.5 mL 管中可以执行 CM 沉淀，但使用较大的管和体积应产生更优异的结果。同时，部分由于多次CM沉淀，人们应该期望蛋白质从开始到结束大量流失。这可能导致在负和加HAM条件下总蛋白质水平的明显变异。
如图1所示，添加 mPEG-5k（5 kDa）不一定在免疫布洛位上产生线性偏移。这可以在解决在多个部位被棕榈酸酯的蛋白质方面具有优势。此外，在HAM负条件下的移动移位位置存在带，表明NEM的二硫化物键不完全减少或游自由半胱氨酸的不完全堵塞。或者，在HAM阴性条件下的明显转移带可能表明，特定蛋白质中的游和自由半胱氨酸很难阻挡。因此，如果只有一小部分总蛋白质与 SynDIG1、SynDIG4 和 Prrt2 相比，大部分蛋白质是单独或双棕榈酸酯的，则可能需要对阻塞步骤进行额外的优化（图 1）。
这种方法并不限于小鼠脑力灰分。例如，该方法已用于筛选在异质细胞9中表达的PSD-95脱糖酶。异质细胞中蛋白质的表达还允许通过站点定向诱变确定修饰的确切部位。该方法还通报了突触支架AKAP150在突触可塑性17、18,18中的作用，在神经科学领域有着广泛的应用。
需要注意的是，APEGS 测定并非 16 碳棕榈酸的摩尔特类专用，因为该测定将检测其他需要 mPEG 裂解和替换的长链脂肪酸基联系。要最终建立棕榈体修饰需要额外的实验，如代谢标记与三联棕榈。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢K.Woolfrey对APEGS测定的建议和意见。这些研究由白厅基金会和NIH-NIMH（1R01MH119347）对E.D.的研究资助资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
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