Summary
Palmitoylation houdt de integratie in van een 16-koolstof palmitaat moiety aan cysteïneresiduen van doelproteïnen op een omkeerbare manier. Hier beschrijven we een biochemische benadering, de acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) test, om de palmitoylation toestand van een eiwit van belang in muis hersenen lysaten te onderzoeken.
Abstract
Activiteitsafhankelijke veranderingen in de niveaus van synaptische AMPA-receptoren (AMPARs) binnen de postsynaptische dichtheid (PSD) wordt beschouwd als een cellulair mechanisme voor leren en geheugen. Palmitoylation regelt lokalisatie en functie van vele synaptische eiwitten, waaronder AMPA-R's, hulpfactoren en synaptische steigers op een activiteitsafhankelijke manier. We identificeerden de synapsdifferentiatie geïnduceerde gen (SynDIG) familie van vier genen (SynDIG1-4) die hersenspecifieke transmembraaneiwitten coderen die associëren met AMPARs en synapssterkte reguleren. SynDIG1 is palmitoylated bij twee cysteïneresiduen die zich op posities 191 en 192 in het nevenxta-transmembraangebied bevinden dat belangrijk is voor activiteitsafhankelijke excitatory synapsenontwikkeling. Hier beschrijven we een innovatieve biochemische benadering, de acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) test, om de palmitoylation toestand van elk eiwit van belang te onderzoeken en het nut ervan aan te tonen met de SynDIG familie van eiwitten in muis hersenen lysaten.
Introduction
S-palmitoylation is een omkeerbare post-translationele modificatie van doeleiwitten die stabiele membraanassociatie, eiwithandel en eiwit-eiwitinteracties reguleert1. Het gaat om toevoeging van een 16-koolstof palmitaat moiety aan cysteïne residuen via thioester linkage gekatalyseerd door palmitoyl acyltransferase (PAT) enzymen. Veel synaptische eiwitten in de hersenen zijn palmitoylated, met inbegrip van AMPA-R's en PSD-95, op een activiteit-afhankelijke manier om stabiliteit, lokalisatie, en functie2te reguleren,3,4. Veranderingen in de niveaus van synaptische AMPARs in de PSD via interactie van hulpfactoren met synaptische steigers zoals PSD-95 liggen ten grondslag aan synaptische plasticiteit; methoden om de palmitoylation-toestand van synaptische eiwitten te bepalen, bieden dus belangrijk inzicht in mechanismen van synaptische plasticiteit.
Eerder identificeerden we de SynDIG-familie van vier genen (SynDIG1-4) die hersenspecifieke transmembraaneiwitten coderen die associëren met AMPARs5. Overexpressie of knock-down van SynDIG1 in gescheiden rat hippocampal neuronen neemt toe of vermindert, respectievelijk, AMPA-R synapsgrootte en aantal met ~ 50% zoals gedetecteerd met behulp van immunocytochemie en elektrofysiologie5. We gebruikten de acyl-biotine uitwisseling (ABE) test om aan te tonen dat SynDIG1 is palmitoylated op twee geconserveerde nevennoa-transmembraan Cys residuen (gevonden in alle SynDIG eiwitten) op een activiteit-afhankelijke manier om stabiliteit te reguleren, lokalisatie, en functie6. De ABE-test is gebaseerd op de uitwisseling van biotine op cysteïnen beschermd door modificatie en daaropvolgende affiniteitzuivering7. Hier beschrijven we een innovatieve biochemische aanpak, de acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) test8,9,10,11,12, die geen affiniteit zuivering vereist en in plaats daarvan maakt gebruik van veranderingen in gel mobiliteit om het aantal wijzigingen voor een eiwit van belang te bepalen. Het protocol wordt beschreven voor onderzoek naar endogene membraaneiwitten uit muizenhersenen waarvoor geschikte antilichamen beschikbaar zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures gevolgd richtlijnen uiteengezet door de National Institutes of Health (NIH) en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Californië, Davis.
1. Voorbereiding van muishersenmembranen
- Onthoofd de muis met behulp van een guillotine-apparaat en ontleed de hersenen snel (in <1 min, indien mogelijk, om palmitoylation veranderingen die kunnen optreden tijdens dissectie procedure te minimaliseren). Homogeniseer onmiddellijk in 10 mL homogenisatiebuffer(tabel 1)in een glazen homogenisator (~12 slagen) op ijs.
- Centrifugelysats gedurende 15 min bij 1.400 x g bij 4 °C. Breng de supernatant over op een nieuwe buis op ijs. De pellet (~ 6 slagen) opnieuw opschorten in een gelijk volume homogenisatiebuffer en centrifugeren op 710 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
- Combineer de supernatants uit stap 1.2 en centrifugeer op 40.000 x g gedurende 20 min bij 4 °C.
- Gooi de supernatant (cytosolic fractie) weg en storing de gepelleteerde membraan (P2) fractie opnieuw op in homogenisatiebuffer.
OPMERKING: Monsters kunnen worden flash frozen en opgeslagen bij -80 °C voor later gebruik. - Voer een bicinchoninezuur (BCA) test uit om eiwitniveaus te kwantificeren. Begin voor de APEGS-test met ~100−200 mg eiwit (maximaal 250 mg) in een volume van 470 μL buffer A (tabel 1) in een buis van 1,5 mL. Sonicaat en centrifugeer bij >13.000 x g gedurende 10 min bij 25 °C om onoplosbaar eiwit te verwijderen. Breng solubilized eiwit over op een nieuwe buis van 1,5 mL.
2. Acyl-PEGyl exchange gel-shift (APEGS) test
- Verstoor disulfidebindingen en blokkeer vrije cysteïnen.
- Disulfide-bindingen verstoren door incubatie in 25 mM tris(2-carboxyethyl)fosphine (TCEP; 25 μL, toegevoegd uit een voorraadoplossing; Tabel 1) gedurende 60 min bij 55 °C.
- Blokvrije cysteïnen met 50 mM N-ethylmaleimide (NEM; 12,5 μL, toegevoegd uit een voorraadoplossing; Tabel 1) bij kamertemperatuur gedurende 3 uur.
LET OP: De reactie kan 's nachts worden verlengd.
- Voer chloorvorm methanol (CM) neerslag uit.
- Breng de eiwitoplossing van 1,5 mL buis naar een polypropyleen of glazen buis die kan worden gecentrifugeerd in een swingende emmer rotor op bescheiden snelheid. Een 5 mL buis is ideaal. Voeg kort vier volumes (2 mL) methanol (MeOH) en vortex toe.
- Voeg twee volumes (1 mL) chloroform en vortex kort toe.
- Voeg kort drie volumes (1,5 mL) dH2O en vortex toe.
- Centrifugeer de monsters op 3.000 x g gedurende 30 min bij 25 °C in een slingerende emmerrotor.
- Verwijder en gooi de bovenste fase voorzichtig weg.
- Voeg 3 volumes (1,5 mL) van MeOH toe en meng voorzichtig maar grondig, wees voorzichtig om de ondoorzichtige eiwitpannenkoek niet te fragmenteren.
- Centrifugeer op 3.000 x g gedurende 10 min bij 25 °C in een slingerende emmerrotor.
- Met behulp van een glazen serologische pipet, verwijder zoveel mogelijk van de bovenste fase mogelijk zonder verstoring van de eiwitpannenkoek.
- Spoel de pellet voorzichtig af met 1 mL MeOH.
- Laat de pellet minstens 10 min drogen.
LET OP: Gedroogde pellet kan worden opgeslagen bij -20 °C.
- Voer decolleté van palmitoyl-thioester verbindingen uit met hydroxylamine (NH2OH, HAM).
- Resuspendeer eiwitneerslag in 125 μL buffer A en sonicaat kort. Centrifugeer >13.000 x g gedurende 10 min bij 25 °C om onoplosbaar materiaal te verwijderen. Breng solubilized eiwit over op een nieuwe buis van 1,5 mL.
- Voeg 375 μL buffer H (HAM+; Tabel 1) of buffer T (HAM-; Tabel 1) en incubeer monsters gedurende 60 min bij 25 °C.
- Herhaal de CM-neerslag beschreven in stap 2.2.
LET OP: Gedroogde pellet kan worden opgeslagen bij -20 °C. - Voeg mPEG toe aan onbeschermde cysteïnen.
- Resuspend pellet in 100 μL buffer A met 10 mM TCEP. Overzetten naar een buis van 1,5 mL.
OPMERKING: Het is normaal dat er significant eiwitverlies is opgetreden tijdens cm-neerslagstappen. Alle volgende stappen worden uitgevoerd in een buis van 1,5 mL, waardoor het volume eiwit wordt beperkt tot een maximum van ~120−130 μL. Dit vermindert eiwitverlies tijdens de uiteindelijke CM neerslag. - Voeg 20 mM mPEG-5k (25 μL, toegevoegd uit een voorraadoplossing; Tabel 1) eiwitmonster en meng door pipetteren. Incubeer gedurende 60 min bij 25 °C met end-over-end rotatie.
- Om mPEG-5k zonder rechtspersoonlijkheid te verwijderen, voert u CM-neerslag uit zoals beschreven in stap 2.2 met behulp van deze aangepaste volumes: 4 volumes MeOH (500 μL), 2 volumes chloroform (250 μL) en 3 volumes dH2O (375 μL). Centrifugeer >13.000 x g gedurende 10 min bij 25 °C.
- Verwijder voorzichtig de bovenste fase als voorheen, het vermijden van de dikke, flocculente pannenkoek. Voeg 1 mL MeOH toe en meng voorzichtig maar grondig. Centrifugeer >13.000 x g gedurende 10 min bij 25 °C.
- Verwijder de supernatant voorzichtig en spoel de pellet af met 1 mL MeOH. Centrifugeer >13.000 x g gedurende 10 min bij 25 °C. Lucht droge pellet.
LET OP: Gedroogde pellet kan worden opgeslagen bij -20 °C. - De gedroogde pellet opnieuw opschorten in 50 μL buffer A (zonder TCEP of een reducerend middel). Reserveer 5 μL voor BCA eiwitkwantitatie. Voeg na de kwantificering een geschikte hoeveelheid 4x Laemmli-monsterbuffer toe en verwarm, afhankelijk van het eiwit van belang, het monster mogelijk tot 70−100 °C gedurende 10 min.
OPMERKING: Koken kan aggregatie van sommige membraaneiwitten veroorzaken.
- Resuspend pellet in 100 μL buffer A met 10 mM TCEP. Overzetten naar een buis van 1,5 mL.
3. Westerse vlekanalyse van PEGylated eiwitten
- Laad het monster op een natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) gel13.
OPMERKING: In dit protocol werd 10% polyacrylamide gebruikt. - Gebruik standaard scheidings-, overdrachts- en detectieprotocollen voor western blotting14.
- Gebruik densitometry14 om de relatieve hoeveelheden PEGylated versus nonPEGylated eiwitten te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunoblotting met antilichamen tegen het eiwit van belang onthult de palmitoylated staat (niet, afzonderlijk, dubbel, enz.) in muis hersenen lysaten zoals bepaald door mobiliteit verschuiving in vergelijking met monsters waarin HAM niet was opgenomen. Eerder hadden we aangetoond dat SynDIG1 was palmitoylated op twee locaties met behulp van de ABE test6; we konden echter niet bepalen of beide sites werden gewijzigd in hersenweefsel. Hier laten we zien dat SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 en Prrt2 palmitoylated zijn in muishersenen en dat ze twee potentiële palmitoylation sites hebben (Figuur 1). Interessant is dat elk eiwit heeft een andere palmitoylation staat in muis hersenen op basis van het signaal voor de niet, afzonderlijk en dubbel palmitoylated eiwit. Densitometry analyse van vlekken biedt kwantitatieve informatie over de palmitoylated staat.
Figuur 1: Detectie van PEGylated eiwitsoorten in muismembraanpreparaten. Muizenhersenen werden snel ontleed en onmiddellijk gehomogeniseerd. P2 membraanfracties werden onderworpen aan de APEGs-test zoals beschreven in dit protocol. In dit experiment werden postnatale dag 18 (P18) gescheiden met behulp van een 10% SDS-PAGE gel en immunoblotted en gesondeerd met antilichamen tegen SynDIG1 (SD1), Prrt2 en SynDIG4 (SD4). Symbolen geven eiwit aan dat niet palmitoylated is (•), palmitoylated afzonderlijk (*), of dubbel (**). De aanwezigheid van zwakke banden in de HAM (-) omstandigheden duidt op een onvolledige vermindering van disulfidebindingen of onvolledige blokkade van vrije cysteïnedoor NEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Buffer | Onderdelen | Werken conc. | Opmerkingen |
| Homogenisering | 0,32 m sacharose, 1 mM Tris pH 7.2, 1 mM MgCl2 | Voeg vlak voor gebruik PMSF- en proteaseremmers toe. | |
| Buffer A | PBS pH 7.2, 5 mM EDTA, 4% SDS (w/v) | Voeg vlak voor gebruik PMSF- en proteaseremmers toe. | |
| TCEP-oplossing | 500 mM TCEP in ddH2O (pH 7.2) | 25 mM | Voeg 10 N NaOH toe om de pH te verhogen. |
| NEM-oplossing | 2,0 M NEM in 100% ethanol | 50 mM | Bereid je vers voor. |
| Buffer H (HAM+) | 1,33 M HAM, pH 7,0, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 (w/v) | 1.0 M | Bereid je vers voor. |
| Buffer T (HAM-) | 1,33 M Tris-HCl, pH 7,0, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 (w/v) | ||
| mPEG-5k | 100 mM mPEG-5k in ddH2O | 20 mM | Meng goed. Zeer stroperig. |
Tabel 1: Oplossingen die worden gebruikt voor APEGS-test. Homogenisatiebuffer en buffer A kunnen van tevoren worden voorbereid; voeg echter vlak voor gebruik proteaseremmers en fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) toe. Alle andere oplossingen moeten vers worden bereid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In ons vorige werk gebruikten we de ABE-test om aan te tonen dat SynDIG1 palmitoylated is op twee geconserveerde nevenprovliecys-residuen (gevonden in alle SynDIG-eiwitten) op een activiteitsafhankelijke manier om stabiliteit, lokalisatie en functie te reguleren6. Een beperking is dat de ABE-test affiniteitszuivering vereist met agaroseharsen die tot avidin moieties worden vervoegd als de laatste stap in de procedure, wat resulteert in een aanzienlijk verlies van signaal dat kwantitatieve analyse bemoeilijkt. Bovendien kan de ABE-test niet onderscheiden of een eiwit eenmaal of op meerdere plaatsen palmitoylated is.
Hier gebruiken we de APEGS-test8,9,10,11,12 om de palmitoylation-toestand van de AMPAR-hulptransmembraaneiwitten SynDIG1 en de verwante eiwitten SynDIG4 (ook bekend als Prrt1) en Prrt2 te bepalen uit muishersenextracten; de test kan echter worden toegepast op membraaneiwit waarvoor een hoogwaardig en specifiek antilichaam beschikbaar is dat geschikt is voor westerse blotting. Gebruik van hersenmembranen van wilde type (WT) en knock-out (KO) muizen biedt een ideale controle voor antilichaam specificiteit zoals we hebben aangetoond voor antilichamen tegen SynDIG115 en SynDIG416. Het uitvoeren van de APEGS-test met hersenlysaten van WT- en KO-muizen biedt een belangrijke controle op de specificiteit van antilichamen in deze methode. Deze methode kan ook worden toegepast op verschillende membraanfracties verkregen via differentiële centrifugatie gevolgd door de APEGS-test om de subcellulaire lokalisatie van het eiwit van belang te onderzoeken.
Een cruciale stap van de APEGS-test is CM-neerslag, waarvan het doel is om chemische stoffen (NEM en HAM) te verwijderen van het verstoren van latere downstreamreacties. Hoewel het mogelijk is om CM-neerslag uit te voeren in een buis van 1,5 mL, moet het gebruik van grotere buizen en volumes meer optimale resultaten opleveren. Tegelijkertijd, deels vanwege de meervoudige CM-neerslag, moet men een aanzienlijk eiwitverlies verwachten van begin tot eind. Dit kan resulteren in schijnbare variabiliteit in de totale eiwitniveaus in de min- en plus HAM-omstandigheden.
Zoals geïllustreerd in figuur 1,leidt de toevoeging van mPEG-5k (5 kDa) niet noodzakelijkerwijs tot een lineaire verschuiving op een immunoblot. Dit kan voordelen hebben bij het oplossen van eiwitten die op meerdere locaties palmitoylated zijn. Bovendien duidt de aanwezigheid van banden op mobiliteitsploegenlocaties in de negatieve omstandigheden van ham op een onvolledige vermindering van disulfidebindingen of onvolledige blokkade van vrije cysteïnedoor NEM. Als alternatief kunnen schijnbare verschoven banden in de HAM-negatieve aandoening erop wijzen dat vrije cysteïnes binnen een bepaald eiwit moeilijk te blokkeren zijn. Zo kan extra optimalisatie van de blokkeringsstap nodig zijn als slechts een klein percentage van het totale eiwit palmitoylated is in tegenstelling tot SynDIG1, SynDIG4 en Prrt2, waarbij het grootste deel van het eiwit ofwel afzonderlijk of dubbel palmitoylated is (Figuur 1).
Deze methode is niet beperkt tot muis hersenen lysaten. Deze methode is bijvoorbeeld gebruikt om te screenen op depalmitoylating enzymen voor PSD-95 uitgedrukt in heterologe cellen9. Expressie van eiwitten in heterologe cellen maakt het ook mogelijk om de exacte plaats van modificatie te bepalen via site-gerichte mutagenese. Deze methode informeerde ook de rol van de synaptische steiger AKAP150 in synaptische plasticiteit17,18, waaruit een brede toepassing in de neurowetenschappen.
Het is belangrijk op te merken dat de APEGS-test niet exclusief is voor 16-koolstofpalmitaat moieties als de test zal andere lange keten vette acyl koppelingen die onderhevig zijn aan decolleté en vervanging door mPEG detecteren. Om palmitaat modificatie overtuigend vereist extra experimenten, zoals metabole etikettering met tritiated palmitaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken K. Woolfrey voor advies en input op de APEGS-test. Deze studies werden gefinancierd door onderzoekssubsidies aan E.D. van de Whitehall Foundation en de NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
