Summary
La palmitoylation implique l’incorporation d’une noisette palmitate de 16 carbone aux résidus de cystéine des protéines cibles d’une manière réversible. Ici, nous décrivons une approche biochimique, l’essai de gel d’échange d’acyl-PEGyl (APEGS), pour étudier l’état de palmitoylation de toute protéine d’intérêt pour les lysates de cerveau de souris.
Abstract
Les altérations dépendantes de l’activité dans les niveaux des récepteurs synaptiques d’AMPA (AMPA) dans la densité postsynaptique (PSD) sont pensés pour représenter un mécanisme cellulaire pour l’apprentissage et la mémoire. La palmitoylation régule la localisation et la fonction de nombreuses protéines synaptiques, y compris les AMPA-R, les facteurs auxiliaires et les échafaudages synaptiques d’une manière dépendante de l’activité. Nous avons identifié la famille induite par la différenciation synapse (SynDIG) de quatre gènes (SynDIG1-4) codant des protéines transmémbranées spécifiques au cerveau qui s’associent aux AMPARs et régulent la force synapse. SynDIG1 est palmitoylated à deux résidus de cystéine situés aux positions 191 et 192 dans la région de juxta-transmembrane importante pour le développement de synapse excitatrice activité-dépendante. Ici, nous décrivons une approche biochimique innovante, l’essai de changement de gel d’échange d’acyl-PEGyl (APEGS), pour étudier l’état de palmitoylation de toute protéine d’intérêt et démontrer son utilité avec la famille SynDIG des protéines dans les lysates de cerveau de souris.
Introduction
S-palmitoylation est une modification post-translationnelle réversible des protéines cibles qui régule l’association stable de membrane, le trafic de protéine, et les interactions protéine-protéine1. Il s’agit de l’ajout d’une meety palmitate de 16 carbone aux résidus de cystéine via le lien thioester catalysé par les enzymes palmitoyl acyltransferase (PAT). Beaucoup de protéines synaptiques dans le cerveau sont palmitoylated, y compris AMPA-Rs et PSD-95, d’une manière dépendante de l’activité pour réguler la stabilité, la localisation, et la fonction2,3,4. Les modifications dans les niveaux des AMPARs synaptiques dans le PSD par l’interaction des facteurs auxiliaires avec des échafaudages synaptiques tels que PSD-95 sous-tend la plasticité synaptique ; ainsi, les méthodes pour déterminer l’état de palmitoylation des protéines synaptiques fournit un aperçu important des mécanismes de plasticité synaptique.
Auparavant, nous avons identifié la famille SynDIG de quatre gènes (SynDIG1-4) codant des protéines transmémbranes spécifiques au cerveau qui s’associent à DES AMPAR5. La surexpression ou la chute de SynDIG1 dans les neurones hippocampal de rat dissociés augmente ou diminue, respectivement, la taille et le nombre de synapse d’AMPA-R de 50 % détectés à l’aide de l’immunocytochimie et de l’électrophysiologie5. Nous avons utilisé l’essai d’échange d’acyl-biotine (ABE) pour démontrer que SynDIG1 est palmitoylated à deux résidus conservés juxta-transmembrane Cys (trouvés dans toutes les protéines SynDIG) d’une manière dépendante de l’activité pour réguler la stabilité, la localisation, et la fonction6. L’essai ABE repose sur l’échange de biotine sur les cystéines protégées par la modification et la purification d’affinité ultérieure7. Ici, nous décrivons une approche biochimique innovante, le changement de gel d’échange d’acyl-PEGyl (APEGS) assay8,9,10,11,12, qui ne nécessite pas de purification d’affinité et utilise plutôt des changements dans la mobilité de gel pour déterminer le nombre de modifications pour une protéine d’intérêt. Le protocole est décrit pour l’étude des protéines endogènes de membrane du cerveau de souris pour lesquelles des anticorps appropriés sont disponibles.
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Protocol
Toutes les procédures animales ont suivi les lignes directrices établies par les National Institutes of Health (NIH) et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Davis.
1. Préparation des membranes cérébrales de souris
- Décapiter la souris à l’aide d’un appareil de guillotine et disséquer le cerveau rapidement (en lt;1 min, si possible, pour minimiser les changements de palmitoylation qui peuvent se produire pendant la procédure de dissection). Homogénéisez immédiatement dans 10 ml de tampon d’homogénéisation(tableau 1) dans un homogénéisateur en verre (12 coups) sur la glace.
- Centrifugeuse lysates pendant 15 min à 1 400 x g à 4 oC. Transférer le supernatant dans un nouveau tube sur glace. Réutilisez la granule (6 coups) dans un volume égal de tampon d’homogénéisation et de centrifugeuse à 710 x g pendant 10 min à 4 oC.
- Combinez les supernatants de l’étape 1.2 et la centrifugeuse à 40.000 x g pendant 20 min à 4 oC.
- Jetez la fraction supernatante (fraction cytosolique) et réutilisez la fraction de la membrane granulée (P2) dans le tampon d’homogénéisation.
REMARQUE : Les échantillons peuvent être congelés et stockés à -80 oC pour une utilisation ultérieure. - Effectuez un essai d’acide bicinchoninique (BCA) pour quantifier les niveaux de protéines. Pour l’essai APEGS, commencez par 100 à 200 mg de protéines (maximum 250 mg) dans un volume de 470 l de tampon A(tableau 1) dans un tube de 1,5 mL. Sonicate et centrifugeuse à 13 000 x g pendant 10 min à 25 oC pour éliminer les protéines insolubles. Transférer la protéine solubilisée dans un nouveau tube de 1,5 mL.
2. Acyl-PEGyl échange gel-shift (APEGS) analyse
- Perturber les liens de disulfide et bloquer les cystéines libres.
- Perturber les liaisons de disulfide en incuber en tris de 25 mM (2-carboxyethyl)phosphine (TCEP; 25 l,l, ajoutée à partir d’une solution de stock; Tableau 1) pendant 60 min à 55 oC.
- Bloquer les cystéines libres avec 50 mM N-ethylmaleimide (NEM; 12,5 l,l, ajouté à partir d’une solution de stock; Tableau 1) à température ambiante pendant 3 h.
REMARQUE : La réaction peut être prolongée du jour au lendemain.
- Effectuer des précipitations de méthanol chloroforme (CM).
- Transférer la solution protéique du tube de 1,5 mL à un tube de polypropylène ou de verre qui peut être centrifugé dans un rotor de seau oscillant à une vitesse modeste. Un tube de 5 ml est idéal. Ajouter quatre volumes (2 ml) de méthanol (MeOH) et de vortex brièvement.
- Ajouter brièvement deux volumes (1 ml) de chloroforme et de vortex.
- Ajouter trois volumes (1,5 mL) de dH2O et vortex brièvement.
- Centrifuge les échantillons à 3.000 x g pendant 30 min à 25 oC dans un rotor de seau oscillant.
- Retirez et jetez soigneusement la phase supérieure.
- Ajouter 3 volumes (1,5 ml) de MeOH et mélanger doucement mais soigneusement, en prenant soin de ne pas fragmenter la crêpe aux protéines opaques.
- Centrifugeuse à 3 000 x g pendant 10 min à 25 oC dans un rotor de seau oscillant.
- À l’aide d’une pipet sérologique en verre, enlever autant de la phase supérieure que possible sans déranger la crêpe aux protéines.
- Rincer délicatement la boulette avec 1 ml de MeOH.
- Aérer le granulé pendant au moins 10 min.
REMARQUE : Les granulés séchés peuvent être entreposés à -20 oC.
- Effectuez le clivage des liens palmitoyl-thioester avec l’hydroxylamine (NH2OH, HAM).
- La protéine de résuspendance précipitent dans 125 L de tampon A et sonicate brièvement. Centrifugeuse à 13 000 x g pendant 10 min à 25 oC pour enlever le matériau insoluble. Transférer la protéine solubilisée dans un nouveau tube de 1,5 mL.
- Ajouter 375 L de tampon H (HAMMD; Tableau 1) ou tampon T (HAM-; Tableau 1) et incuber des échantillons pendant 60 min à 25 oC.
- Répétez les précipitations de CM décrites à l’étape 2.2.
REMARQUE : Les granulés séchés peuvent être entreposés à -20 oC. - Ajouter le mPEG aux cystéines non protégées.
- Pellet de résuspendance dans 100 l de tampon A contenant 10 mM TCEP. Transférer dans un tube de 1,5 mL.
REMARQUE : Il est normal que la perte significative de protéines se soit produite pendant les étapes de précipitation de CM. Toutes les étapes suivantes seront effectuées dans un tube de 1,5 mL, ce qui limitera le volume de protéines à un maximum de 120 à 130 ll. Cela réduira la perte de protéines lors des précipitations finales de CM. - Ajouter 20 mM mPEG-5k (25 ll, ajouté à partir d’une solution de stock; Tableau 1) à l’échantillon de protéines et mélanger par tuyauterie. Incuber pendant 60 min à 25 oC avec rotation de bout en bout.
- Pour enlever le mPEG-5k non constitué en cocorporé, effectuer des précipitations CM telles que décrites à l’étape 2.2 à l’aide de ces volumes ajustés : 4 volumes de MeOH (500 ll), 2 volumes de chloroforme (250 lL) et 3 volumes de dH2O (375 ll). Centrifugeuse à 13 000 x g pendant 10 min à 25 oC.
- Retirez soigneusement la phase supérieure comme avant, en évitant l’épaisse crêpe flocculente. Ajouter 1 ml de MeOH et mélanger délicatement mais soigneusement. Centrifugeuse à 13 000 x g pendant 10 min à 25 oC.
- Retirez soigneusement le supernatant et rincez la boulette avec 1 ml de MeOH. Centrifugeuse à 13 000 x g pendant 10 min à 25 oC. Granule sèche à l’air.
REMARQUE : Les granulés séchés peuvent être entreposés à -20 oC. - Réutilisez la granule séchée dans 50 L de tampon A (sans TCEP ou aucun agent de réduction). Réservez 5 ll pour la quantitation des protéines BCA. Après la quantitation, ajoutez une quantité appropriée de tampon d’échantillon de 4x Laemmli et, selon la protéine d’intérêt, potentiellement chauffer l’échantillon à 70 à 100 oC pendant 10 min.
REMARQUE : L’ébullition peut causer l’agrégation de certaines protéines membranaires.
- Pellet de résuspendance dans 100 l de tampon A contenant 10 mM TCEP. Transférer dans un tube de 1,5 mL.
3. Analyse occidentale des protéines PEGylated
- Charger l’échantillon sur un gel de gel de sulfate de dodéthyle de sodium electrophoresis (SDS-PAGE) gel13.
REMARQUE : Dans ce protocole, 10 % de polyacrylamide a été utilisé. - Utilisez des protocoles standard de séparation, de transfert et de détection pour les ballonnementsoccidentaux 14.
- Utilisez la densitométrie14 pour déterminer les quantités relatives de protéines PEGylated par rapport aux protéines non-TPEGylated.
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Representative Results
L’immunoblotting avec des anticorps contre la protéine d’intérêt révèle l’état palmitoylated (non, individuellement, doublement, etc.) dans les lysates de cerveau de souris comme déterminé par décalage de mobilité comparé aux échantillons dans lesquels HAM n’a pas été inclus. Auparavant, nous avions démontré que SynDIG1 était palmitoylated à deux sites en utilisant l’essai ABE6; cependant, nous n’avons pas pu déterminer si les deux sites ont été modifiés dans le tissu cérébral. Ici, nous montrons que SynDIG1, SynDIG4/Prrt1, et Prrt2 sont palmitoylated dans le cerveau de la souris et qu’ils ont deux sites potentiels de palmitoylation (Figure 1). Fait intéressant, chaque protéine a un état de palmitoylation différente dans le cerveau de souris basé sur le signal pour la protéine non, individuellement et doublement palmitoylated. L’analyse de densitométrie des taches fournit des informations quantitatives sur l’état palmitoylated.
Figure 1 : Détection des espèces de protéines PEGylated dans les préparations de membranes de souris. Les cerveaux de souris ont été disséqués rapidement et homogénéisés immédiatement. Les fractions de membrane de P2 ont été soumises à l’essai d’APEGs comme décrit dans ce protocole. Dans cette expérience, le jour postnatal 18 (P18) ont été séparés à l’aide d’un gel SDS-PAGE de 10 % et d’immunoblotted et sondés avec des anticorps contre SynDIG1 (SD1), Prrt2 et SynDIG4 (SD4). Les symboles indiquent des protéines qui ne sont pas palmitoylated (en), palmitoylated individuellement (MD), ou doublement (MD). La présence de bandes faibles dans les conditions HAM (-) indique soit une réduction incomplète des liaisons de disulfide ou le blocage incomplet des cystéines libres par NEM. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Tampon | Composants | Travailler conc. | Commentaires |
| Homogénéisation | 0,32 M saccharose, 1 mM Tris pH 7,2, 1 mM MgCl2 | Ajouter le PMSF et les inhibiteurs de la protéase immédiatement avant utilisation. | |
| Tampon A | PBS pH 7,2, 5 mM EDTA, 4% SDS (w/v) | Ajouter le PMSF et les inhibiteurs de la protéase immédiatement avant utilisation. | |
| Solution TCEP | 500 mM TCEP en ddH2O (pH 7.2) | 25 mM | Ajouter 10 N NaOH pour augmenter le pH. |
| Solution NEM | 2,0 M NEM en 100% d’éthanol | 50 mM | Préparez-vous frais. |
| Tampon H (HAMMD) | 1,33 M HAM, pH 7,0, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 (w/v) | 1,0 M | Préparez-vous frais. |
| Tampon T (HAM-) | 1,33 M Tris-HCl, pH 7,0, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 (w/v) | ||
| mPEG-5k | 100 mM mPEG-5k en ddH2O | 20 mM | Bien mélanger. Très visqueux. |
Tableau 1 : Solutions utilisées pour l’analyse APEGS. Le tampon d’homogénéisation et le tampon A peuvent être préparés à l’avance; cependant, ajouter les inhibiteurs de la protéase et le fluorure de phénylmethylsulfonyl (PMSF) immédiatement avant utilisation. Toutes les autres solutions doivent être préparées à nouveau.
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Discussion
Dans nos travaux précédents, nous avons utilisé l’essai ABE pour démontrer que SynDIG1 est palmitoylated à deux résidus conservés juxta-transmembrane Cys (trouvés dans toutes les protéines SynDIG) d’une manière dépendante de l’activité pour réguler la stabilité, la localisation, et la fonction6. Une limitation est que l’essai ABE nécessite la purification d’affinité avec des résines agarose conjuguées à des moieties avides comme dernière étape dans la procédure, ayant pour résultat la perte significative de signal qui compliquent l’analyse quantitative. En outre, l’essai ABE ne peut pas distinguer si une protéine est palmitoylated une fois ou à plusieurs sites.
Ici, nous utilisons l’apEGS assay8,9,10,11,12 pour déterminer l’état de palmitoylation des protéines de transmembrane auxiliaires AMPAR SynDIG1 et les protéines connexes SynDIG4 (également connu sous le nom Prrt1) et Prrt2 à partir d’extraits de cerveau de souris; cependant, l’essai peut être appliqué à n’importe quelle protéine membranaire pour laquelle un anticorps spécifique et de haute qualité approprié pour le ballonnement occidental est disponible. L’utilisation de membranes cérébrales de type sauvage (WT) et de souris KNOCK (KO) fournit un contrôle idéal pour la spécificité des anticorps comme nous l’avons démontré pour les anticorps contre SynDIG115 et SynDIG416. L’exécution de l’essai APEGS avec des lysates de cerveau des souris WT et KO fournit un contrôle important pour la spécificité des anticorps dans cette méthode. Cette méthode pourrait également être appliquée à différentes fractions de membrane obtenues par centrifugation différentielle suivie de l’essai APEGS pour étudier la localisation subcellulaire de la protéine d’intérêt.
Une étape critique de l’essai APEGS est les précipitations CM, dont le but est d’éliminer les produits chimiques (NEM et HAM) d’interférer avec les réactions ultérieures en aval. Bien qu’il soit possible d’effectuer des précipitations CM dans un tube de 1,5 mL, l’utilisation de tubes et de volumes plus grands devrait produire des résultats plus optimaux. En même temps, en partie à cause des multiples précipitations de CM, il faut s’attendre à une perte substantielle de protéines du début à la fin. Cela pourrait entraîner une variabilité apparente dans les niveaux totaux de protéines dans les conditions moins et plus HAM.
Comme l’illustre la figure 1, l’ajout de mPEG-5k (5 kDa) ne produit pas nécessairement un changement linéaire sur un immunoblot. Cela peut avoir des avantages dans la résolution des protéines qui sont palmitoylated à plusieurs sites. En outre, la présence de bandes à des endroits de déplacement de mobilité dans les conditions négatives HAM indique soit une réduction incomplète des liaisons de disulfide ou le blocage incomplet des cystéines libres par NEM. Alternativement, bandes décalées apparentes dans l’état négatif de HAM pourrait indiquer que les cystéines libres dans une protéine particulière sont difficiles à bloquer. Ainsi, une optimisation supplémentaire de l’étape de blocage pourrait être nécessaire si seulement un faible pourcentage de protéines totales est palmitoylated contrairement à SynDIG1, SynDIG4, et Prrt2 dans lequel la majorité de la protéine est soit individuellement ou doublement palmitoylated (figure 1).
Cette méthode ne se limite pas aux lysates du cerveau de souris. Par exemple, cette méthode a été utilisée pour dépalmitoylating enzymes pour PSD-95 exprimé dans les cellules hétérologues9. L’expression des protéines dans les cellules hétérologues permet également de déterminer le site exact de modification par l’intermédiaire de la mutanèse dirigée par le site. Cette méthode a également informé le rôle de l’échafaudage synaptique AKAP150 dans la plasticité synaptique17,18, démontrant une application large en neurosciences.
Il est important de noter que l’essai APEGS n’est pas exclusif aux moieties de palmitate de 16 carbones car l’essai détectera d’autres liens d’acyl gras à longue chaîne qui sont sujets au clivage et au remplacement par mPEG. Pour établir la modification de palmitate de façon concluante exige l’expérimentation supplémentaire telle que l’étiquetage métabolique avec le palmitate tritiated.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient K. Woolfrey pour ses conseils et leurs commentaires sur l’analyse APEGS. Ces études ont été financées par des subventions de recherche à E.D. de la Whitehall Foundation et du NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
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