Summary
Palmitoilação implica a incorporação de um moiety palmitato de 16 carbonos a resíduos de cisteína de proteínas alvo de forma reversível. Aqui, descrevemos uma abordagem bioquímica, o ensaio de mudança de gel de troca acil-PEGyl (APEGS), para investigar o estado de palmitoilação de qualquer proteína de interesse em lysatos cerebrais de camundongos.
Abstract
Acredita-se que alterações dependentes da atividade nos níveis de receptores AMPA sinápticos (AMPARs) dentro da densidade postynaptic (PSD) representem um mecanismo celular para aprendizagem e memória. Palmitoilação regula a localização e a função de muitas proteínas sinápticas, incluindo AMPA-Rs, fatores auxiliares e andaimes sinápticos de forma dependente da atividade. Identificamos a família de genes induzidos por diferenciação sinapse (SynDIG) de quatro genes (SynDIG1-4) codificando proteínas transmembranas específicas do cérebro que se associam às AMPARs e regulam a força da sinapse. SynDIG1 é palmitoilado em dois resíduos de cisteína localizados nas posições 191 e 192 na região justxta-transmembrana importante para o desenvolvimento da sinapse excitatória dependente da atividade. Aqui, descrevemos uma abordagem bioquímica inovadora, o ensaio acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS), para investigar o estado de palmitoilação de qualquer proteína de interesse e demonstrar sua utilidade com a família SynDIG de proteínas em lysates cerebrais de camundongos.
Introduction
S-palmitoylation é uma modificação pós-translacional reversível de proteínas-alvo que regula a associação estável de membranas, tráfico de proteínas e interações proteína-proteína1. Envolve a adição de um moiety palmitato de 16 carbonos a resíduos de cisteína via ligação thioester catalisado por enzimas palmitoxil aciltransferase (PAT). Muitas proteínas sinápticas no cérebro são palmitoiladas, incluindo AMPA-Rs e PSD-95, de forma dependente da atividade para regular a estabilidade, a localização e a função2,3,4. Alterações nos níveis de AMPARs sinápticas no PSD por interação de fatores auxiliares com andaimes sinápticos como o PSD-95 subjacentes à plasticidade sináptica; assim, métodos para determinar o estado de palmitoilação de proteínas sinápticas fornecem uma visão importante sobre mecanismos de plasticidade sináptica.
Anteriormente, identificamos a família SynDIG de quatro genes (SynDIG1-4) codificando proteínas transmembranas específicas do cérebro que se associam às AMPARs5. A superexpressão ou derrubada do SynDIG1 em neurônios hipocampais de ratos dissociados aumenta ou diminui, respectivamente, o tamanho e o número da sinapse AMPA-R em ~50% conforme detectado usando imunocitoquímica e eletrofisiologia5. Utilizamos o ensaio de troca de acilina (ABE) para demonstrar que o SynDIG1 é palmitoilado em dois resíduos de Cisa justa-transmembrana conservados (encontrados em todas as proteínas SynDIG) de forma dependente da atividade para regular a estabilidade, a localização e a função6. O ensaio ABE baseia-se na troca de biotina em cisteínas protegidas por modificação e posterior purificação de afinidade7. Aqui, descrevemos uma abordagem bioquímica inovadora, o ensaio de mudança de gel de troca acil-PEGyl (APEGS)8,,9,,10,,11,,12,que não requer purificação de afinidade e, em vez disso, utiliza mudanças na mobilidade do gel para determinar o número de modificações para uma proteína de interesse. O protocolo é descrito para investigação de proteínas endógenas de membrana do cérebro do camundongo para as quais anticorpos adequados estão disponíveis.
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Protocol
Todos os procedimentos animais seguiram as diretrizes estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais da Universidade da Califórnia, Davis.
1. Preparação de membranas cerebrais do camundongo
- Decapitar o rato usando um aparelho de guilhotina e dissecar o cérebro rapidamente (em <1 min, se possível, para minimizar as alterações de palmitoilação que podem ocorrer durante o procedimento de dissecção). Homogeneize imediatamente em 10 mL de tampão de homogeneização(Tabela 1)em um homogeneizador de vidro (~12 traços) no gelo.
- Linsatos de centrífuga saem por 15 min a 1.400 x g a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo no gelo. Ressuspensão da pelota (~6 traçados) em um volume igual de tampão de homogeneização e centrífuga a 710 x g por 10 min a 4 °C.
- Combine os sobrenatantes do passo 1.2 e centrífugas a 40.000 x g por 20 min a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante (fração citossólica) e resuspenda a fração da membrana pelleted (P2) no tampão de homogeneização.
NOTA: As amostras podem ser congeladas e armazenadas a -80 °C para uso posterior. - Realize um ensaio de ácido bicinchonínico (BCA) para quantitar os níveis de proteína. Para o ensaio APEGS, comece com ~100-200 mgs de proteína (máximo de 250 mgs) em um volume de 470 μL de tampão A(Tabela 1)em um tubo de 1,5 mL. Sonicate e centrífuga em >13.000 x g por 10 min a 25 °C para remover proteína insolúvel. Transfira a proteína solubilizada para um novo tubo de 1,5 mL.
2. Ensaio de troca acil-PEGyl (APEGS)
- Interrompa as ligações de dissulfeto e bloqueie cisteínas livres.
- Interromper as ligações de dissulfeto incubando em 25 mM tris (2-carboxyethyl)fosfina (TCEP; 25 μL, adicionado a partir de uma solução de estoque; Tabela 1) por 60 min a 55 °C.
- Bloquear cisteínas livres com N-etilmaleimida de 50 mM (NEM; 12,5 μL, adicionadas a partir de uma solução de estoque; Tabela 1) em temperatura ambiente por 3 h.
NOTA: A reação pode ser estendida durante a noite.
- Realizar precipitação de metanol clorofórmio (CM).
- Transfira a solução proteica de tubo de 1,5 mL para um tubo de polipropileno ou vidro que pode ser centrifugado em um rotor de balde balançando a uma velocidade modesta. Um tubo de 5 mL é ideal. Adicione quatro volumes (2 mL) de metanol (MeOH) e vórtice brevemente.
- Adicione dois volumes (1 mL) de clorofórmio e vórtice brevemente.
- Adicione três volumes (1,5 mL) de dH2O e vórtice brevemente.
- Centrifugar as amostras a 3.000 x g por 30 min a 25 °C em um rotor de balde balançando.
- Remova cuidadosamente e descarte a fase superior.
- Adicione 3 volumes (1,5 mL) de MeOH e misture suavemente, mas cuidadosamente, tomando cuidado para não fragmentar a panqueca de proteína opaca.
- Centrifugação a 3.000 x g por 10 min a 25 °C em um rotor de balde balançando.
- Usando um tubo sorológico de vidro, remova o máximo possível da fase superior sem perturbar a panqueca de proteína.
- Enxágüe cuidadosamente a pelota com 1 mL de MeOH.
- Seque a pelota por pelo menos 10 min.
NOTA: A pelota seca pode ser armazenada a -20 °C.
- Realizar decotes de ligações palmitoyl-thioester com hidroxilamina (NH2OH, HAM).
- Resuspender a proteína precipitar em 125 μL de tampão A e sônica brevemente. Centrifugação a >13.000 x g por 10 min a 25 °C para remover material insolúvel. Transfira a proteína solubilizada para um novo tubo de 1,5 mL.
- Adicionar 375 μL de buffer H (HAM+; Tabela 1) ou tampão T (HAM-; Tabela 1) e incubar amostras para 60 min a 25 °C.
- Repita a precipitação cm descrita na etapa 2.2.
NOTA: A pelota seca pode ser armazenada a -20 °C. - Adicione mPEG a cisteínas desprotegidas.
- Ressuspensão da pelota em 100 μL de tampão A contendo 10 mM TCEP. Transfira para um tubo de 1,5 mL.
NOTA: É normal que a perda significativa de proteína tenha ocorrido durante as etapas de precipitação de CM. Todas as etapas subseqüentes serão realizadas em um tubo de 1,5 mL, restringindo o volume de proteína a um máximo de ~120-130 μL. Isso reduzirá a perda de proteínadurante a precipitação final de CM. - Adicionar 20 mM mPEG-5k (25 μL, adicionado a partir de uma solução de estoque; Tabela 1) à amostra de proteínas e mistura por pipetting. Incubar por 60 min a 25 °C com rotação de extremidade superior.
- Para remover mPEG-5k não incorporado, realize a precipitação cm conforme descrito na etapa 2.2 utilizando estes volumes ajustados: 4 volumes de MeOH (500 μL), 2 volumes de clorofórmio (250 μL) e 3 volumes de dH2O (375 μL). Centrifugação a >13.000 x g por 10 min a 25 °C.
- Remova cuidadosamente a fase superior como antes, evitando a panqueca espessa e floculente. Adicione 1 mL de MeOH e misture delicadamente, mas completamente. Centrifugação a >13.000 x g por 10 min a 25 °C.
- Retire cuidadosamente o sobrenadante e enxágue a pelota com 1 mL de MeOH. Centrifugação a >13.000 x g por 10 min a 25 °C. Pelota seca a ar.
NOTA: A pelota seca pode ser armazenada a -20 °C. - Ressuspensão da pelota seca em 50 μL de tampão A (sem TCEP ou qualquer agente redutor). Reserve 5 μL para quantificar proteína BCA. Após a quantificação, adicione uma quantidade apropriada de tampão de amostra de 4x Laemmli e, dependendo da proteína de interesse, potencialmente aqueça a amostra a 70-100 °C por 10 min.
NOTA: A ebulição pode causar agregação de algumas proteínas de membrana.
- Ressuspensão da pelota em 100 μL de tampão A contendo 10 mM TCEP. Transfira para um tubo de 1,5 mL.
3. Análise de manchas ocidentais de proteínas PEGylated
- Carregue a amostra em um gel de gel de poliacrilamida de sulfato de dodecil de sódio13.
NOTA: Neste protocolo foi utilizado 10% de poliacrilamida. - Use protocolos padrão de separação, transferência e detecção para manchas ocidentais14.
- Use a densitometria14 para determinar as quantidades relativas de proteínas PEGylated versus nonPEGylated.
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Representative Results
A imunoaspiração com anticorpos contra a proteína de interesse revela o estado palmitoylated (não, sozinho, duplamente, etc.) em lysatos cerebrais de camundongos determinados por mudança de mobilidade em comparação com amostras em que o HAM não foi incluído. Anteriormente, tínhamos demonstrado que o SynDIG1 foi palmitoilado em dois locais usando o ensaio ABE6; no entanto, não pudemos determinar se ambos os locais foram modificados no tecido cerebral. Aqui mostramos que SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 e Prrt2 são palmitoilados no cérebro do rato e que eles têm dois potenciais sítios de palmitoilação(Figura 1). Curiosamente, cada proteína tem um estado de palmitoilação diferente no cérebro do camundongo com base no sinal para a proteína não, singly e duplamente palmitoylated. A análise de densitometria das manchas fornece informações quantitativas sobre o estado palmitoylated.
Figura 1: Detecção de espécies de proteínas PEGylated nas preparações da membrana do camundongo. Os cérebros dos ratos foram dissecados rapidamente e homogeneizados imediatamente. As frações de membrana P2 foram submetidas ao ensaio apegs conforme descrito neste protocolo. Neste experimento, o dia 18 pós-natal (P18) foi separado utilizando um gel SDS-PAGE de 10% e imunoblotado e sondado com anticorpos contra SynDIG1 (SD1), Prrt2 e SynDIG4 (SD4). Os símbolos indicam proteína sem palmitoilado (•), palmitoilada singly (*) ou duplamente (**). A presença de bandas fracas nas condições ham (-) indica uma redução incompleta de ligações de dissulfeto ou bloqueio incompleto de cisteínas livres por NEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Buffer | Componentes | Trabalhando conc. | Comentários |
| Homogeneização | 0,32 M sacarose, 1 mM Tris pH 7.2, 1 mM MgCl2 | Adicione os inibidores de PMSF e protease imediatamente antes do uso. | |
| Tampão A | PBS pH 7.2, 5 mM EDTA, 4% SDS (w/v) | Adicione os inibidores de PMSF e protease imediatamente antes do uso. | |
| Solução TCEP | 500 mM TCEP em ddH2O (pH 7.2) | 25 mM | Adicione 10 N NaOH para aumentar o pH. |
| Solução NEM | 2,0 M NEM em 100% etanol | 50 mM | Prepare-se fresco. |
| Tampão H (HAM+) | 1,33 M HAM, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 (w/v) | 1,0 M | Prepare-se fresco. |
| Tampão T (HAM-) | 1,33 M Tris-HCl, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 (p/v) | ||
| mPEG-5k | 100 mM mPEG-5k em ddH2O | 20 mM | Misture bem. Altamente viscoso. |
Tabela 1: Soluções utilizadas para o ensaio APEGS. O buffer e o buffer de homogeneização A podem ser preparados com antecedência; no entanto, adicione inibidores de protease e flúor de fenilmesulfonnil (PMSF) imediatamente antes do uso. Todas as outras soluções devem ser preparadas de novo.
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Discussion
Em nosso trabalho anterior, utilizamos o ensaio ABE para demonstrar que o SynDIG1 é palmitoilado em dois resíduos de Ciscos de justa-transmembrana conservados (encontrados em todas as proteínas SynDIG) de forma dependente da atividade para regular a estabilidade, a localização e a função6. Uma limitação é que o ensaio ABE requer purificação de afinidade com resinas agaroseconjugadas aos moieties avidin como a etapa final do procedimento, resultando em perda significativa de sinal que complica matita análise quantitativa. Além disso, o ensaio ABE não pode distinguir se uma proteína é palmitoilada uma vez ou em vários locais.
Aqui utilizamos o ensaio APEGS8,,9,,10,,11,,12 para determinar o estado de palmitoilação das proteínas transmembranas auxiliares AMPAR SynDIG1 e as proteínas relacionadas SynDIG4 (também conhecida como Prrt1) e Prrt2 de extratos cerebrais de camundongos; no entanto, o ensaio pode ser aplicado a qualquer proteína de membrana para a qual um anticorpo de alta qualidade e específico adequado para a mancha ocidental está disponível. O uso de membranas cerebrais de camundongos do tipo selvagem (WT) e knockout (KO) fornece um controle ideal para a especificidade de anticorpos, como demonstramos para anticorpos contra o SynDIG115 e o SynDIG416. A realização do ensaio APEGS com lisatos cerebrais de camundongos WT e KO fornece um controle importante para a especificidade de anticorpos neste método. Este método também poderia ser aplicado a diferentes frações de membrana obtidas através de centrifugação diferencial seguida pelo ensaio APEGS para investigar a localização subcelular da proteína de interesse.
Um passo crítico do ensaio APEGS são as precipitações cm, o objetivo é remover produtos químicos (NEM e HAM) de interferir com reações subsequentes a jusante. Embora seja possível realizar precipitações cm em um tubo de 1,5 mL, o uso de tubos e volumes maiores deve produzir resultados mais ideais. Ao mesmo tempo, em parte por causa das múltiplas precipitações de CM, deve-se esperar uma perda substancial de proteína do início ao fim. Isso pode resultar em variabilidade aparente nos níveis totais de proteína nas condições de menos e mais HAM.
Conforme ilustrado na Figura 1,a adição de mPEG-5k (5 kDa) não produz necessariamente uma mudança linear em uma imunoblota. Isso pode ter vantagens na resolução de proteínas que são palmitoiladas em vários locais. Além disso, a presença de bandas em locais de mudança de mobilidade nas condições negativas do HAM indica uma redução incompleta das ligações de dissulfeto ou o bloqueio incompleto de cisteínas livres pelo NEM. Alternativamente, bandas aparentes deslocadas na condição negativa do HAM podem indicar que cisteínas livres dentro de uma determinada proteína são difíceis de bloquear. Assim, uma otimização adicional da etapa de bloqueio pode ser necessária se apenas uma pequena porcentagem da proteína total for palmitoilada em contraste com synDIG1, SynDIG4 e Prrt2 em que a maioria da proteína é singly ou duplamente palmitoilated(Figura 1).
Este método não se limita aos lisatos cerebrais do rato. Por exemplo, este método tem sido usado para tela para enzimas depalmitoylating para PSD-95 expressas em células heterólogas9. A expressão de proteínas em células heterólogas também permite determinar o local exato da modificação através da mutagênese dirigida ao local. Este método também informou o papel do andaime sináptico AKAP150 na plasticidade sináptica17,18, demonstrando uma ampla aplicação na neurociência.
É importante notar que o ensaio APEGS não é exclusivo de moieties de palmitato de 16 carbonos, pois o ensaio detectará outras ligações de acila gordurosas de cadeia longa que estão sujeitas a decote e substituição por mPEG. Para estabelecer a modificação palmitato conclusivamente requer experimentação adicional, como rotulagem metabólica com palmitato tritiado.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a K. Woolfrey por conselhos e contribuições sobre o ensaio da APEGS. Esses estudos foram financiados por bolsas de pesquisa para a E.D. da Whitehall Foundation e do NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
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