Summary
Palmitoylation влечет за собой включение 16-углеродного пальмитата moiety к цистеину остатков целевых белков в обратимым образом. Здесь мы описываем биохимический подход, ацил-PEGyl обмен ный гель сдвиг (APEGS) анализ, чтобы исследовать состояние пальмитоилации любого белка, интересующее в мышиных лизатах мозга.
Abstract
Считается, что изменения, зависящие от активности в уровнях синаптических рецепторов АМРА (АМРАР) в течение постсинаптической плотности (PSD), представляют собой клеточный механизм обучения и памяти. Palmitoylation регулирует локализацию и функцию многих синаптических белков, включая АМРА-Rs, вспомогательные факторы и синаптические леса в активности-зависимым образом. Мы определили синапсовую дифференциацию индуцированного гена (SynDIG) семейства из четырех генов (SynDIG1-4), кодирующих трансмембранные белки, которые ассоциируются с АМРАРами и регулируют силу синапсов. SynDIG1 является palmitoylated на двух остатков цистеина, расположенных на позициях 191 и 192 в регионе juxta-transmembrane важно для деятельности-зависимых возбуждания синапсов развития. Здесь мы описываем инновационный биохимический подход, ацил-PEGyl обменный гель сдвиг (APEGS) анализ, чтобы исследовать состояние пальмитоилации любого белка интерес и продемонстрировать свою полезность с семейством SynDIG белков в мышиных мозговых лизатах.
Introduction
S-palmitoylation является обратимой пост-трансляционной модификации целевых белков, которая регулирует стабильную мембранную ассоциацию, торговлю белками и белково-белковые взаимодействия1. Она включает в себя добавление 16-углеродного пальмитата moiety к остаткам цистеина через тиостер связи катализировали palmitoyl acyltransferase (PAT) ферментов. Многие синаптические белки в головном мозге palmitoylated, в том числе АМРА-Rs и PSD-95, в активности-зависимым образом для регулирования стабильности, локализации, и функции2,3,4. Изменения в уровнях синаптической АМРАРов в PSD через взаимодействие вспомогательных факторов с синаптической эшафот, таких как PSD-95 лежит в основе синаптической пластичности; Таким образом, методы определения состояния пальмитоилации синаптических белков дают важное представление о механизмах синаптической пластичности.
Ранее мы определили семейство SynDIG из четырех генов (SynDIG1-4), кодирующих трансмембранные белки, которые ассоциируются с АМРАРами5. Переэкспрессия или нокдаун SynDIG1 в диссоциированных крысиных гиппокампальных нейронов увеличивается или уменьшается, соответственно, ampA-R размер синапса и число на 50%, как обнаружено с помощью иммуноцитохимии и электрофизиологии5. Мы использовали ацил-биотин обмена (ABE) анализ, чтобы продемонстрировать, что SynDIG1 palmitoylated на двух консервированных juxta-transmembrane Cys остатков (найдено во всех белках SynDIG) в деятельности зависимых образом для регулирования стабильности, локализации и функции6. ABE ассси опирается на обмен биотина на цистеины защищены модификации и последующей очистки сродства7. Здесь мы описываем инновационный биохимический подход, ацил-PEGyl обмен ный гель сдвиг (APEGS) анализ8,9,10,11,12, который не требует очистки сродства и вместо этого использует изменения в подвижности геля, чтобы определить количество изменений для белка интерес. Протокол описан для исследования эндогенных мембранных белков из мозга мыши, для которых доступны подходящие антитела.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных следовали руководящим принципам, установленным Национальными институтами здравоохранения (NIH) и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Калифорнийском университете в Дэвисе.
1. Подготовка мембран мозга мыши
- Обезглавливать мышь с помощью аппарата гильотины и быстро вскрыть мозг (в 1 мин, если это возможно, чтобы свести к минимуму изменения пальмитоилации, которые могут произойти во время процедуры вскрытия). Гомогенизировать сразу в 10 мл буфера гомогенизации(Таблица 1) в стеклянном гомогенизаторе (12 ударов) на льду.
- Центрифуга лисаты в течение 15 мин при 1400 х г при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую трубку на льду. Приостановите гранулы (6 ударов) в равном объеме буфера гомогенизации и центрифуги на уровне 710 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
- Смешайте супернацианты со ступени 1.2 и центрифугу при 40 000 х г в течение 20 мин при 4 градусах По Цельсию.
- Откажитесь от супернатанта (цитосоликофракции) и отбросите фракцию гранулированной мембраны (P2) в буфере гомогенизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть флэш-заморожены и храниться при -80 градусов по Цельсию для последующего использования. - Выполните анализ бисинхониновой кислоты (BCA) для количественной оценки уровня белка. Для aPEGS анализ, начните с белка 100-200 мг (максимум 250 мг) в объеме 470 л буфера А (Таблица 1) в трубке 1,5 мл. Соникат и центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию, чтобы удалить нерастворимый белок. Перенесите растворимый белок в новую трубку 1,5 мл.
2. Acyl-PEGyl обмен гель-сдвиг (APEGS) асссе
- Нарушить дисульфидные связи и блокировать свободные цистеина.
- Нарушить дисульфидные связи путем инкубации в 25 мм три (2-карбоксехил) фосфин (TCEP; 25 Л, добавленный из акционерного раствора; Таблица 1) в течение 60 мин при 55 градусах По цельсии.
- Блок свободных цистеина с 50 мМ N-этилмалеймид (NEM; 12,5 л, добавленный из бульонного раствора; Таблица 1) при комнатной температуре 3 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция может быть продлена на ночь.
- Выполните хлороформметаное (СМ) осадки.
- Перенесите белковый раствор из 1,5 мл трубки в полипропилена или стеклянную трубку, которую можно центрифугировать в размахивающем роторе ведра с небольшой скоростью. Идеально подходит для трубки 5 мл. Добавьте четыре тома (2 мл) метанола (MeOH) и вихрь кратко.
- Добавьте два тома (1 мл) хлороформа и вихря кратко.
- Добавьте три тома (1,5 мл) dH2O и вихрь кратко.
- Centrifuge образцы на 3000 х г в течение 30 мин при 25 градусов по Цельсию в размахивая ротор ведро.
- Тщательно удалите и отбросьте верхнюю фазу.
- Добавьте 3 тома (1,5 мл) MeOH и аккуратно перемешайте, но тщательно, стараясь не фрагментировать непрозрачный белковый блин.
- Центрифуга при 3000 х г в течение 10 мин при 25 градусах По Цельсию в размахивающем роторе ведра.
- Используя стеклянный серологический пипетка, удалите как можно больше верхней фазы, не нарушая белок блин.
- Тщательно промыть гранулы с 1 мл MeOH.
- Воздух сушить гранулы, по крайней мере 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные гранулы могут храниться при -20 градусах Цельсия.
- Выполните расщепление пальмитоил-тиоэстерных связей с гидроксиламином (NH2OH, HAM).
- Повторное протеина осаждается в 125 л буфера А и снотворно езлит. Центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию, чтобы удалить нерастворимый материал. Перенесите растворимый белок в новую трубку 1,5 мл.
- Добавьте 375 л буфера H (HAM; Таблица 1) или буфер T (HAM-; Таблица 1) и инкубировать образцы в течение 60 мин при 25 градусах Цельсия.
- Повторите осадки СМ, описанные в шаге 2.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные гранулы могут храниться при -20 градусах Цельсия. - Добавьте mPEG в незащищенные цистеина.
- Повторное удаление гранул в 100 л буфера А, содержащего 10 мМ TCEP. Перенесите на трубку 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально для значительной потери белка, которые произошли во время см осадков шаги. Все последующие шаги будут выполняться в трубке объемом 1,5 мл, что ограничивает объем белка максимум в 120-130 мл. Это позволит уменьшить потерю белка во время окончательного осадков СМ. - Добавить 20 мМ mPEG-5k (25 л, добавленный из запасного раствора; Таблица 1) к образцу белка и перемешать путем пипетки. Инкубировать в течение 60 мин при 25 градусах Цельсия с конечным вращением.
- Для удаления неинкорпорированных mPEG-5k, выполнить СМ осадков, как описано в шаге 2.2 с использованием этих скорректированных объемов: 4 тома MeOH (500 л), 2 тома хлороформа (250 л), и 3 тома dH2O (375 л). Центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию.
- Тщательно удалите верхнюю фазу, как и раньше, избегая густой, flocculent блин. Добавить 1 мл MeOH и аккуратно перемешать, но тщательно. Центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию.
- Тщательно удалите супернатант и промыть гранулы с 1 мл MeOH. Центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию. Воздух сухой гранулы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные гранулы могут храниться при -20 градусах Цельсия. - Приостановите высушенные гранулы в 50 злбуфера А (без TCEP или какого-либо редукционного агента). Резерв 5 ЗЛ для количественной оценки белка BCA. После количественной оценки добавьте соответствующее количество 4x буфера образца Laemmli и, в зависимости от интересующего белка, потенциально нагреть образец до 70-100 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кипение может привести к агрегации некоторых мембранных белков.
- Повторное удаление гранул в 100 л буфера А, содержащего 10 мМ TCEP. Перенесите на трубку 1,5 мл.
3. Западный анализ поблужей PEGylated белков
- Загрузите образец на гель натрия dodecyl sulfate polyacrylamide гель электрофорес (SDS-PAGE) гель13.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе было использовано 10% полиакриламид. - Используйте стандартные протоколы разделения, передачи и обнаружения для западных blotting14.
- Используйте денситометрию14 для определения относительного количества PEGylated по сравнению с неПЕГилатированных белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Иммуноблоттинг с антителами против белка интереса показывает palmitoylated состояние (не, посредственный, вдвойне и т.д.) в мышиных мозговых лисатов, как определяется сдвиг мобильности по сравнению с образцами, в которых HAM не был включен. Ранее мы продемонстрировали, что SynDIG1 был palmitoylated на двух сайтах с помощью ABE обзор6; однако, мы не смогли определить были ли оба места доработаны в тканях мозга. Здесь мы показываем, что SynDIG1, SynDIG4/Prrt1, и Prrt2 являются palmitoylated в мозге мыши и что они имеют два потенциальных palmitoylation сайтов (Рисунок 1). Интересно, что каждый белок имеет различное состояние пальмитоилации в мозге мыши на основе сигнала для не, познавательно и вдвойне palmitoylated белка. Денситометрия анализ помарки предоставляет количественную информацию о palmitoylated состоянии.
Рисунок 1: Обнаружение PEGylated белков оговороса видов в мышечной мембраны препаратов. Мозги мыши были вскрыты быстро и однородны немедленно. Фракции мембран P2 были подвергнуты ассею APEGs, как описано в этом протоколе. В этом эксперименте, послеродовой день 18 (P18) были разделены с помощью 10% SDS-PAGE гель и иммуноблатные и зондируется с антителами против SynDIG1 (SD1), Prrt2, и SynDIG4 (SD4). Символы указывают на белок, который не palmitoylated (я), palmitoylated посевно (я), или вдвойне (я). Наличие слабых полос в условиях HAM (-) указывает либо на неполное сокращение дисульфидных связей, либо на неполную блокировку свободных цистеин NEM свободных цистеинов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Буфера | Компоненты | Рабочий конк. | Комментарии |
| Гомогенизации | 0.32 M сахароза, 1 мМ Трис рН 7.2, 1 мМ MgCl2 | Добавить ИНГибиторы PMSF и протеазы непосредственно перед использованием. | |
| Буфер А | PBS pH 7.2, 5 mM EDTA, 4% SDS (w/v) | Добавить ИНГибиторы PMSF и протеазы непосредственно перед использованием. | |
| Решение TCEP | 500 мМ TCEP в ddH2O (pH 7.2) | 25 мМ | Добавьте 10 N NaOH, чтобы увеличить рН. |
| Решение NEM | 2.0 M NEM в 100% этаноле | 50 мМ | Приготовьте свежие. |
| Буфер H (ХАМЗ) | 1.33 M HAM, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0.2% Triton X-100 (w/v) | 1,0 М | Приготовьте свежие. |
| Буфер T (HAM-) | 1.33 M Tris-HCl, pH 7.0, 5 mM EDTA, 0.2% Triton X-100 (w/v) | ||
| mPEG-5k | 100 мМ мПЭГ-5к в ddH2O | 20 мМ | Хорошо перемешать. Высоковязких. |
Таблица 1: Решения, используемые для асссеа APEGS. Буфер гомогенизации и буфер А могут быть подготовлены заранее; однако, добавить ингибиторы протеазы и фенилметилсульфонил фтора (PMSF) непосредственно перед использованием. Все остальные решения должны быть подготовлены свежими.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В нашей предыдущей работе, мы использовали анализ ABE, чтобы продемонстрировать, что SynDIG1 является palmitoylated на двух консервированных juxta-transmembrane Cys остатков (найдено во всех белках SynDIG) в деятельности-зависимым образом для регулирования стабильности, локализации и функции6. Ограничение заключается в том, что анализ ABE требует очистки сродства с агарозными смолами, спряженными с алынскими муатами в качестве последнего шага в процедуре, что приводит к значительной потере сигнала, усложняющего количественный анализ. Кроме того, анализ ABE не может различить, если белок palmitoylated один раз или на нескольких участках.
Здесь мы используем анализ APEGS8,9,10,11,12 для определения состояния пальмитоилации вспомогательных трансмембранных белков AMPAR SynDIG1 и связанных с ними белков SynDIG4 (также известный как Prrt1) и Prrt2 из экстрактов мозга мыши; однако, анализ может быть применен к любому мембранному белку, для которого доступно высококачественное и специфическое антитело, подходящее для западного промотирования. Использование мозговых мембран от диких типов (WT) и нокаут (KO) мышей обеспечивает идеальный контроль для антител специфичность, как мы продемонстрировали для антител против SynDIG115 и SynDIG416. Выполнение APEGS асссе с мозга lysates от WT и KO мышей обеспечивает важный контроль для антител специфичность в этом методе. Этот метод также может быть применен к различным мембранным фракциям, полученным с помощью дифференциальной центрифугации, а затем aPEGS анализ для изучения субклеточной локализации белка интерес.
Одним из важнейших этапов ассеа APEGS является выпадение осадков СМ, целью которых является удаление химических веществ (NEM и HAM) от вмешательства в последующие реакции вниз по течению. Хотя можно выполнить см осадков в 1,5 мл трубки, использование больших труб и объемов должны дать более оптимальные результаты. В то же время, отчасти из-за многочисленных осадков СМ, следует ожидать существенной потери белка от начала до конца. Это может привести к очевидной изменчивости общего уровня белка в минус и плюс HAM условиях.
Как показано на рисунке 1, добавление mPEG-5k (5 kDa) не обязательно приводит к линейной сдвиг на иммуноблот. Это может иметь преимущества в разрешении протеинов которые palmitoylated на множественных местах. Кроме того, наличие полос в местах смещения подвижности в негативных условиях HAM указывает либо на неполное сокращение дисульфидных связей, либо на неполную блокировку свободных цистеин NEM. Кроме того, очевидно ежемосенные полосы в отрицательном состоянии HAM могут указывать на то, что свободные цистеины в пределах конкретного белка трудно блокировать. Таким образом, дополнительная оптимизация блокирующего шага может потребоваться, если только небольшой процент от общего белка palmitoylated в отличие от SynDIG1, SynDIG4, и Prrt2, в котором большинство белка либо познавательно или вдвойне palmitoylated (Рисунок 1).
Этот метод не ограничивается мышью мозга lysates. Например, этот метод был использован для проверки депалмитоилирования ферментов для PSD-95, выраженных в гетерологических клетках9. Выражение белков в гетерологических клетках также позволяет определить точное место модификации с помощью направленного на сайт мутагенеза. Этот метод также сообщил о роли синаптической эшафот AKAP150 в синаптической пластичности17,18, демонстрируя широкое применение в неврологии.
Важно отметить, что APEGS асссе не является эксклюзивным для 16-углеродного palmitate moieties как проверка будет обнаружить другие длинноцепочечные жирные связки acyl, которые подлежат расщепления и замены mPEG. Для установления пальмитатной модификации окончательно требуются дополнительные эксперименты, такие как метаболическая маркировка с тритриатом пальмитатом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят К. Вулфри за советы и вклад в aPEGS. Эти исследования финансировались за счет научно-исследовательских грантов E.D. от Фонда Уайтхолла и NIH-NIMH (1R01MH19347).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
