Summary
Este protocolo describe un enfoque eficaz de hibridación in situ para detectar los niveles de expresión de ARNm y los patrones espaciales de los genes diana en el líquido celómico Sipunculus nudus.
Abstract
La hibridación in situ (ISH) es una técnica muy informativa para presentar patrones de distribución celular de genes específicos (por ejemplo, ARNm y NCRNA) en los tejidos. El gusano sipunculid Sipunculus nudus es un recurso pesquero crucial, ya que tiene altos valores nutricionales y medicinales. Actualmente, la investigación sobre la biología molecular de Sipunculus nudus todavía está en su infancia. El propósito de este artículo es desarrollar un método sensible para localizar un ARNm específico en sipunculus nudus líquido celómico. El protocolo incluye pasos detallados de la ISH, incluyendo la preparación de ribosondas con nombre digoxigenina y de sentido, la recolección de fluidos celómicos y la preparación de secciones, la hibridación ribosondas específicas, la incubación de anticuerpos, la coloración y los tratamientos posteriores a la coloración. Se muestran los resultados representativos obtenidos de un experimento exitoso con este método. El protocolo también debe ser aplicable a otras especies de Sipuncula.
Introduction
Ish, utilizando una sonda de ácido nucleico etiquetada para detectar la secuencia específica de ADN o ARN de interés, es un método útil para describir el patrón de expresión espacial de genes diana en tejidos morfológicamente preservados1,2,3. Normalmente, la secuencia diana es generada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y luego se utiliza como plantilla para sintetizar la sonda de ARN antisentido/sentido etiquetada con digoxigenina uridina-5'-trifosfato. Las muestras se fijan y permeabilizan antes de la incubación con ribosondas. Después de lavar el exceso de sonda, la hibridación es visualizada por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-digoxigenina, que es fosfatasa alcalina conjugada3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; order Sipunculida: Sipunculidae) es un gusano marino no segmentado, coelomate y bilateralmente simétrico7,8. Sipunculus nudus es una especie cosmopolita ampliamente distribuida en aguas costeras tropicales y templadas. También es un importante recurso pesquero marino en el sur de China debido a sus altos valores nutricionales y medicinales9,,10. Sin embargo, Sipunculus nudus en biología molecular todavía está en su infancia. Para entender plenamente el papel biológico de los genes, la investigación de los patrones de expresión de genes a una resolución celular es de gran interés. En el organismo no modelo Sipunculus nudus, el método ISH, que es un método ideal para detectar los patrones de expresión de genes, aún no se ha establecido. Su líquido celómico contiene varios tipos de células, incluyendo granulocitos, células de urna, células vesiculares, células germinales, eritrocitos, etc11. El doble factor de transcripción relacionado con el sexo/mab-3(dmrt1),utilizado como gen representativo en este método, es un regulador transcripcional altamente conservado de la determinación y diferenciación del sexo en la mayoría de las especies que van desde invertebrados hasta mamíferos12,,13. En una gama de especies (es decir, porgy negro, etc.) 14, dmrt1 se expresó en las células sertoli, rodeando las células germinales, cuya función es similar a las células trofoblastos de Sipunculus nudus. Por lo tanto, hipotetizaron que dmrt1 de Sipunculus nudus se expresa en células trofoblastos de espermatozoides, y el resultado del método ISH confirmó claramente la hipótesis.
Este protocolo describe por primera vez la ISH, con sondas de ARNm antisentido/sentido con etiqueta digoxigenina, para determinar los patrones de expresión de ARNm en su frotis de fluido coelómico. Se proporcionan las condiciones óptimas de reacción, que permiten una visualización muy sensible de la expresión de ARNm a alta resolución. El método ISM desarrollado podría aplicarse potencialmente en más especies de Sipunculida distintas de Sipunculus nudus.
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Protocol
El procedimiento animal fue aprobado por el Comité de Cuidado y Bienestar Animal de la Universidad de Huaqiao.
1. Preparación de ribosondas
- Diseño de imprimación
- Abra el programa Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copie la secuencia dmrt1 (GenBank: MK182259) en la ventana de secuencia.
- Ajuste la longitud de imprimación (23-25 bp), la temperatura de fusión (55-60 oC) y el contenido de G/C (40-60%). Haga clic en Seleccionar imprimaciones.
NOTA: El tamaño mínimo requerido para la sonda de ARN es de aproximadamente 500 bp. Las sondas más largas normalmente tienen mayor especificidad. - Agregue la secuencia promotora de la polimerasa de ARN T7 (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,) a una de las imprimaciones seleccionadas. Las secuencias de imprimación dmrt1 para ISH se muestran en la Tabla 1.
NOTA: Para las sondas de detección, el promotor de la polimerasa de ARN T7 se encuentra en el extremo de 5' de las imprimaciones delanteras. Para las sondas antisentido, el promotor de la polimerasa de ARN T7 se encuentra en el extremo 5 de las imprimaciones inversas.
- Amplificación de PCR
- Colocar los tubos de microfúctil sobre hielo y preparar la siguiente mezcla de reacción (para una reacción de 50 l): 1 mezcla de ADN polimerasa Taq, 1 g de ADNc (que se prepara a partir de 100 ml de líquido celómico), imprimación delantera de 1 m, imprimación inversa de 1 m y agua libre de nucleasas.
- Mezcle brevemente la reacción de PCR pipeteando y centrífuga.
- Colocar el tubo de reacción en un ciclor térmico, y ejecutar el PCR utilizando las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 oC durante 2 min seguida de 36 ciclos de desnaturalización a 95 oC durante 30 s, recocido a 55-60 oC para 30 s, extensión a 72 oC para 30 s y una extensión final a 72 oC durante 7 min.
NOTA: La temperatura de recocido debe optimizarse de acuerdo con las imprimaciones.
- Purificación y verificación de productos PCR
- Cargue la mezcla de PCR de 50 ml directamente sobre un gel de agarosa del 1%. Ejecute el gel de agarosa a 150-180 V durante 10 min en 0.5x TBE. Aísle los fragmentos específicos de ADN del gel de agarosa del 1%.
NOTA: El ADN debe aparecer como una sola banda y no como un frotis. - Purificar los fragmentos de ADN utilizando un kit de extracción de gel de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuantificar los productos purificados mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 260 nm.
- Verifique la autenticidad de los productos PCR por secuenciación.
NOTA: (Punto de pausa) Los productos de PCR purificados se pueden almacenar a -20 oC durante varios meses.
- Cargue la mezcla de PCR de 50 ml directamente sobre un gel de agarosa del 1%. Ejecute el gel de agarosa a 150-180 V durante 10 min en 0.5x TBE. Aísle los fragmentos específicos de ADN del gel de agarosa del 1%.
- Síntesis de ribosondas
- Coloque los tubos de microfúgelos libres de RNase sobre hielo y añada lo siguiente al tubo de microfúge (para una reacción de 10 l): 1 x mezcla de etiquetado de ARN Digoxygenin, 1 tampón de transcripción de 1x, 0,5 l de inhibidores de la RNase, 1 l de polimerasas de ARN T7, 1 g de producto de PCR y agua libre de rnalos. Mezcle brevemente la reacción pipeteando y centrífuga. Incubar durante 2 h a 37oC.
- Añadir 2 l de DNase I libre de RNase. Mezclar brevemente la reacción pipeteando y centrífuga. Incubar durante 15 min a 37oC.
- Añadir 2 sL 0,2 M EDTA (pH 8.0). Mezcle brevemente la reacción pipeteando y centrífuga.
- Añadir 2,5 ml de LiCl de 4 M y 75 ml de etanol preenfriado a la reacción anterior. Mezcla bien. Dejar actuar durante 30 min a -70oC.
- Centrífuga a 12.000 x g durante 10 min a 4oC. Decantar el etanol. Añadir 1 ml de etanol preenfriado al 70% (v/v) y lavar la precipitación mezclando suavemente.
- Centrífuga a 12.000 x g durante 5 min a 4oC. Decantar el 70% de etanol y secar la precipitación brevemente cerca de una lámpara de alcohol. Disuelve la precipitación añadiendo 30 ml de agua libre de RNase y mezcle suavemente.
- Cargar 2 ml de ARN sintetizado en un gel de agarosa del 1%. Ejecute el gel de agarosa a 180 V durante 5-10 min en 0.5x TBE. Mida la concentración del ARN etiquetado utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm.
- Utilice tubos de microfusión libres de RNase y puntas de filtro para evitar la contaminación de RNase.
NOTA: (Punto de pausa) Las sondas etiquetadas con digoxigenina se pueden almacenar a -70 oC durante varios meses.
- Utilice tubos de microfusión libres de RNase y puntas de filtro para evitar la contaminación de RNase.
2. Recolección de fluidos coelómicos
- Fije el S. nudus en la mesa de disección con alfileres. Abra el cuerpo del S. nudus con pequeñas tijeras autoclave. Aísle el líquido celómico con una pipeta.
- Recoger y transferir 1 ml de líquido coelómico con una pipeta a diapositivas de microscopio tratadas con poli-D-lisina. Aplique el líquido celómico uniformemente con una punta de pipeta. Seque los portaobjetos durante 1 h a 37oC.
3. Hibridación in situ
- Día 1
- Rehidrata los portaobjetos en un frasco de tinción deslizante que contiene 100 ml de 1 x solución salina tamponada con fosfato tratado con pirocarbonato de dietil (DEPC-PBS). Rehidratar 3 veces con 1x DEPC-PBS, 5 min por lavado con agitación suave.
- Permeabilizar el frotis de líquido celómico por digestión con 10 g/ml de proteinasa K a temperatura ambiente durante 5 min. Incubar los portaobjetos en 4% paraformaldehído (PFA) durante 20 minutos para detener la digestión. Lave los portaobjetos en 1x DEPC-PBS con agitación suave durante 5 min 3 veces.
- Añadir 50 l de mezcla de hibridación (HM) que contiene la ribosondas sentido/antisentido en las diapositivas y añadir un resbalón de cubierta.
- Agregue el tampón de la caja húmeda a la caja húmeda. Coloque las diapositivas en la caja húmeda y selle bien con película de parafina. Hibridación durante la noche (al menos 16 h) a 60oC.
- Día 2
- Precalentar el tampón de lavado a 65 oC. Sumerja la diapositiva en el frasco de tinción de la diapositiva que contiene el tampón de lavado y déjelo reposar hasta que el cubreobjetos se deslice automáticamente. Se tarda unos 5 minutos.
- Lavar 2 veces con tampón de lavado a 65oC, 30 min por lavado con agitación suave. Lavar 2 veces con un citrato de solución salina-sodio (SSC) a 65oC, 30 min por lavado con una agitación suave. Lavar 2 veces con tampón de ácido maleico que contiene Tween 20 (MABT) a temperatura ambiente, 30 min por lavado con agitación suave.
- Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 3-4 h en el tampón de bloqueo. Incubar las diapositivas en 1 ml de solución de fragmentos antidigoxigenina-AP Fab diluido a 1/5000 con el tampón de bloqueo a 4oC durante la noche.
- Día 3
- Retire la solución de anticuerpos y lave los portaobjetos brevemente en MABT. Lavar 4 veces con MABT a temperatura ambiente, 25 minutos por lavado con agitación suave.
- Incubar los portaobjetos con tampón de fosfatasa alcalina a temperatura ambiente 3 veces, 5 min por lavado. Retire el tampón de fosfatasa alcalina y agregue 1 ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolyl fosfato (BCIP)/nitro azul tetrazolium (NBT) solución de tinción. Mantenga las diapositivas en la oscuridad.
- Observe la reacción del color periódicamente bajo un microscopio óptico. Cuando el color esté completamente desarrollado (tiempo de reacción en el rango de 1-4 h), lave los portaobjetos 2 veces con MABT a temperatura ambiente, 5 min por lavado con agitación suave.
- Lavar 2 veces con solución de parada a temperatura ambiente, 15 minutos por lavado con agitación suave. Incubar los portaobjetos en metanol para eliminar el exceso de manchas, a temperatura ambiente durante 30 min. De acuerdo con el color de fondo, el lavado de metanol se puede hacer 2 o 3 veces y el tiempo de decoloración se puede extender.
- Lavar 2 veces con MABT a temperatura ambiente, 5 min por lavado con agitación suave. Transfiera las diapositivas a un papel de filtro nuevo. Añadir 50 s de glicerol. Agregue los labios de las cubiertas y observe microscópicamente.
NOTA: La composición de la solución se muestra en la Tabla 2.
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Representative Results
En la Figura 1se ilustra un resumen de los pasos implicados en la ISH. Las ribosondas de sentido antisentido y correspondientes para dmrt1 se sintetizaron a partir de productos PCR amplificados a partir de los cDNA de fluido celómico. La autenticidad de los productos de ITP se verificó mediante la secuenciación directa. Las ribosondas se sintetizaron utilizando polimerasas de ARN T7 de acuerdo con los protocolos del fabricante y un informe anterior4 con algunas modificaciones menores. Las señales representativas de ISH se muestran en la Figura 2. ISH de Sipunculus nudus celomic fluid con riboscopa antisentido que se dirige a dmrt1 revela tinción púrpura concentrada en las células trofoblastos del espermatozoide(Figura 2A, B,flechas rojas). Se utilizó una ribosondas de sentido como un control negativo, y el riboscopio de sentido para dmrt1 no detectó ninguna señal de hibridación(Figura 2C).
Figura 1. Diagrama de flujo de ISH. Las cajas azules son los pasos para sintetizar ribosondas. Las cajas verdes claros son pasos para los procedimientos in situ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La expresión de dmrt1 en el líquido celómico Sipunculus nudus detectado por ISH. (A, B) Hibridación con ribosonda antisentido dmrt1. (C) Hibridación con ribosondas con sentido dmrt1. Las flechas rojas representan señales de hibridación en células trofoblasto. sz, espermatozoides. Barra de escala: 50 m. Esta cifra ha sido modificada de Li et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre | Secuencia (5o-3o) |
| Antisonda F | ACAATGTAGCAGGGTTTAATCTTGG |
| Antisonda R | TAATACGACTCACTATAGGGAGACTGTTTCTCTATGCATCCAGTAAA |
| Sonda de sentido F | TAATACGACTCACTATAGGGAGAGACAATGTAGCAGGGTTTAATCTTGG |
| Sonda de sentido R | CTGTTTTCTCTATCATCCAGTAAA |
Tabla 1. Las secuencias de imprimación dmrt1.
| Reactivo | Composición |
| 5 - TBE (1 L) | 54 g de Tris, 27,5 g de ácido bórico y 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). |
| 10 PBS (5 L) | 400 g de NaCl, 10 g de KCl, 72 g de Na2HPO4 y 12 g de KH2PO4. |
| DEPC-PBS (1 L) | 1 L de 1 PBS y 1 mL de DEPC. |
| 4% PFA en 1 PBS (100 mL, pH 7,4) | 4 g de PFA y 100 mL PBS. |
| 10 mg/ml de proteinasa K (1 mL) | 10 mg de proteinasa K. |
| 20o SSC (1 L) | 175,3 g de NaCl y 88,2 g de sal trisódica de ácido cítrico. |
| Búfer de caja húmeda (50 ml) | 2,5 mL de 20o SSC, 22,5 mL de RNase de agua libre y 25 mL de formamida desionizada. |
| Mezcla de hibridación (HM, 200 mL) | 100 ml de formación desionizada, 50 ml de 20o SSC, 10 mg de heparina, 100 mg de ARNm, 0,39 g de ácido cítrico, 200 ml de Tween-20 y agua libre de RNase a 200 ml. |
| Tampón de lavado (1 L) | 50 mL de 20o SSC, 500 mL de formamida desionizada, 450 mL de agua estéril y 1 mL Tween-20. |
| MABT (1 L) | 11,6 g de ácido maleico, 8,77 g de NaCl, 8,25 g de NaOH y 1 mL de Tween-20. |
| Bloqueo del búfer | 1 - MABT, 2% de suero de oveja (vol/vol) y 2 mg/ml de BSA. |
| Tampón de fosfatasa alcalina | 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl (pH 9.5), 50 mM MgCl2y 0,1% Tween 20 (vol/vol). |
| Detener solución | 0,1 M glicina, pH 2.2. |
Cuadro 2. La composición de las soluciones utilizadas en el protocolo ISH.
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Discussion
Estudios anteriores mostraron que la ISH es adecuada para detectar múltiples ARN objetivo16,17,18. En este protocolo, describimos un método ISH de alta resolución para detectar el ARNm en fluido celómico y enfatizar las condiciones de hibridación optimizadas en Sipunculus nudus. Las señales obvias de dmrt1 que observamos demostraron la aplicación exitosa de este protocolo en la detección de la expresión génica(Figura 2).
Durante el experimento, una serie de pasos deben ser prestados especialmente. En primer lugar, las ribosondas de sentido para los genes diana deben sintetizarse como el control. Después de la síntesis, la calidad de la ribosondas debe comprobarse en un gel. La síntesis deficiente de ARN dará lugar a que no se tinñen en las secciones. En segundo lugar, el proceso de recolección de muestras debe ser suave para evitar la deformación celular y el experimento debe realizarse inmediatamente después de la recolección de líquido celómico para evitar la degradación del ARN. En tercer lugar, el tiempo y los tiempos de incubación deben seguirse exactamente en todos los pasos sin acortarse ni alargarse. En particular, preste atención al momento del tratamiento con proteinasa K. El tiempo de tratamiento demasiado largo de la proteinasa K conducirá a la destrucción de la estructura celular de la muestra, mientras que el tiempo de tratamiento demasiado corto no permitirá que la ribosonda entre correctamente en la célula. Por último, las diapositivas no deben secarse durante el experimento. Este método implica un paso de hibridación a 60 oC, lo que aumentará los riesgos de evaporación de reactivos. Como se indica en la sección de protocolo, las diapositivas deben colocarse en una caja húmeda y cubiertas con película de parafina para evitar la evaporación.
Una limitación de este protocolo es la adquisición de secuencias de ribosondas en el organismo no modelo Sipunculus nudus, porque el ARNm mal secuenciado puede conferir baja especificidad de la ribosonda. Con el desarrollo de la tecnología de secuenciación, se lanzarán más y más secuencias de alta calidad de Sipunculus nudus, lo que mejorará en gran medida esta situación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Jóvenes Científicos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Beca No. 31801034), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Fujian, China (2016J01161), los Fondos de Investigación Científica de la Universidad de Huaqiao (15BS306) y el Fondo Innovador de Posgrados en Investigación Científica de la Universidad de Huaqiao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
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