Summary
Dit protocol beschrijft een effectieve in situ hybridisatie benadering om de mRNA expressie niveaus en ruimtelijke patronen van doelgenen in Sipunculus nudus coelomic vloeistof te detecteren.
Abstract
In situ hybridisatie (ISH) is een zeer informatieve techniek om cellulaire distributiepatronen van specifieke genen (bijvoorbeeld mRNA en ncRNA) in weefsels te presenteren. De sipunculid worm Sipunculus nudus is een cruciale visbestanden omdat het hoge voedingswaarden en medicinale waarden heeft. Momenteel staat het onderzoek naar de moleculaire biologie van Sipunculus nudus nog in de kinderschoenen. Het doel van dit artikel is het ontwikkelen van een gevoelige methode voor het lokaliseren van specifieke mRNA in Sipunculus nudus coelomic vloeistof. Het protocol omvat gedetailleerde stappen van ISH, met inbegrip van digoxigenin-gelabeld antisense en zin riboprobe voorbereiding, coelomic vloeistof collectie en sectie voorbereiding, specifieke riboprobe hybridisatie, antilichaam incubatie, kleuring en post-coloration behandelingen. De representatieve resultaten verkregen uit een succesvol experiment met behulp van deze methode worden aangetoond. Het protocol moet ook van toepassing zijn op andere Sipuncula-soorten.
Introduction
ISH, met behulp van een gelabelde nucleïnezuursonde om de specifieke DNA- of RNA-sequentie van belang te detecteren, is een nuttige methode om het ruimtelijke expressiepatroon van doelgenen in morfologisch bewaarde weefsels te beschrijven1,2,3. Normaal gesproken wordt de doelsequentie gegenereerd door polymerase kettingreactie (PCR) en vervolgens gebruikt als sjabloon om de antisense/sense RNA-sonde te synthetiseren met digoxigenin uridine-5'-trifosfaat. Monsters worden vastgemaakt en permeabilized voor incubatie met riboprobe. Na het afwassen van de overtollige sonde, hybridisatie wordt gevisualiseerd door immunohistochemie met behulp van een anti-digoxygenin antilichaam, dat is alkalische fosfatase-geconjugeerd3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; order Sipunculida: Sipunculidae) is een niet-gesegmenteerde, coelomaat en bilateraal symmetrische mariene worm7,8. Sipunculus nudus is een kosmopolitische soort op grote schaal verspreid in tropische en gematigde kustwateren. Het is ook een belangrijke mariene visbestanden in het zuiden van China vanwege de hoge voedingswaarden en geneeskrachtige waarden9,10. Echter, Sipunculus nudus in moleculaire biologie staat nog in de kinderschoenen. Om de biologische rol van genen volledig te begrijpen, is het onderzoek naar genenexpressiepatronen bij een cellulaire resolutie van groot belang. In het niet-modelorganisme Sipunculus nudusis de ISH-methode, een ideale methode om de genenexpressiepatronen te detecteren, nog niet vastgesteld. De coelomic vloeistof bevat verschillende celtypes, waaronder granulocyten, urncellen, vesiculaire cellen, kiemcellen, erythrocyten,enz. De dubbele seks /mab-3 gerelateerde transcriptie factor-1 (dmrt1), gebruikt als een representatief gen in deze methode, is een sterk geconserveerde transcriptie regulator van geslachtsbepaling en differentiatie in de meeste soorten, variërend van ongewervelde dieren tot zoogdieren12,13. In een reeks soorten (d.w.z. zwarte porgy, enz.) 14, dmrt1 werd uitgedrukt in de Sertoli cellen, rond de kiemcellen, waarvan de functie is vergelijkbaar met trofoblast cellen van Sipunculus nudus. Daarom veronderstelden we dat dmrt1 van Sipunculus nudus wordt uitgedrukt in trofoblastcellen van spermatozeugmata, en het resultaat van de ISH-methode bevestigde de hypothese duidelijk.
Dit protocol beschrijft voor het eerst ISH, met digoxigenin-gelabelde antisense/sense mRNA-sondes, om mRNA-expressiepatronen in zijn coelomic vloeistofuitstrijkje te bepalen. De optimale reactieomstandigheden worden geleverd, die een zeer gevoelige visualisatie van mRNA-expressie bij hoge resolutie mogelijk maken. De ontwikkelde ISH-methode kan mogelijk worden toegepast in meer Sipunculida-soorten anders dan Sipunculus nudus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierprocedure werd goedgekeurd door het Comité voor dierenwelzijn en welzijn van de Huaqiao-universiteit.
1. Voorbereiding van de ribosonde
- Primer ontwerp
- Open het programma Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Kopieer de dmrt1-reeks (GenBank: MK182259) naar het sequentievenster.
- Stel de primerlengte (23-25 bp), smelttemperatuur (55-60 °C) en g/c-gehalte (40-60%) in. Klik op Primers kiezen.
OPMERKING: De minimale grootte die nodig is voor de RNA-sonde is ongeveer 500 bp. Langere sondes hebben normaal gesproken een hogere specificiteit. - Voeg de T7 RNA polymerase promotor sequentie (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,) toe aan een van de geselecteerde primers. De dmrt1 primersequenties voor ISH worden weergegeven in tabel 1.
OPMERKING: Voor zintuiglijke sondes bevindt de T7 RNA polymerase promotor zich aan het 5' einde van de voorwaartse primers. Voor antisense sondes bevindt de T7 RNA polymerase promotor zich aan het 5'-uiteinde van de omgekeerde primers.
- PCR-versterking
- Plaats de microfugebuizen op ijs en bereid het volgende reactiemengsel voor (voor een 50 μL-reactie): 1x Taq DNA polymerasemix, 1 μg cDNA (dat wordt bereid vanaf 100 μL coelomic fluid), 1 μM forward primer, 1 μM reverse primer en nuclease-vrij water.
- Meng de PCR-reactie door te pipetteren en centrifugeer kort.
- Plaats de reactiebuis in een thermische cycler en voer de PCR uit onder de volgende voorwaarden: eerste denaturatie bij 95 °C gedurende 2 min, gevolgd door 36 cycli van denaturatie bij 95 °C voor 30 s, annealing bij 55-60 °C voor 30 s, verlenging bij 72 °C voor 30 s en een definitieve verlenging bij 72 °C voor 7 min.
LET OP: De gloeiende temperatuur moet worden geoptimaliseerd volgens de primers.
- PCR-productzuivering en -verificatie
- Laad het 50 μL PCR-mengsel direct op een agarosegel van 1%. Voer de agarose gel op 150-180 V voor 10 min in 0.5x TBE. Isoleer de specifieke DNA-fragmenten van de 1% agarose gel.
OPMERKING: DNA moet verschijnen als een enkele band en niet als een uitstrijkje. - Zuiver de DNA-fragmenten met behulp van een gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant. Kwantificeren van de gezuiverde producten door spectrofotometrie op een golflengte van 260 nm.
- Controleer de authenticiteit van de PCR-producten door te rangschikken.
LET OP: (Pauzepunt) De gezuiverde PCR-producten kunnen enkele maanden bij -20 °C worden bewaard.
- Laad het 50 μL PCR-mengsel direct op een agarosegel van 1%. Voer de agarose gel op 150-180 V voor 10 min in 0.5x TBE. Isoleer de specifieke DNA-fragmenten van de 1% agarose gel.
- Riboprobe synthese
- Plaats de RNase-vrije microfugebuizen op ijs en voeg het volgende toe aan de microfugebuis (voor een 10 μL-reactie): 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x transcriptiebuffer, 0,5 μL RNase-remmers, 1 μL T7 RNA polymerases, 1 μg PCR-product en RNase-vrij water. Meng de reactie door te pipetteren en centrifugeer kort. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C.
- Voeg 2 μL RNase-vrije DNase I. Meng de reactie door te pipetteren en centrifugeer kort. Incubeer gedurende 15 min bij 37 °C.
- Voeg 2 μL 0,2 M EDTA (pH 8.0) toe. Meng de reactie door te pipetteren en centrifugeer kort.
- Voeg 2,5 μL van 4 M LiCl en 75 μL voorgekoelde ethanol toe aan de bovenstaande reactie. Meng goed. Laat 30 min bij -70 °C.
- Centrifugeer op 12.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Decanteer de ethanol. Voeg 1 mL voorgekoelde 70% ethanol (v/v) toe en was de neerslag door zachtjes te mengen.
- Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Decanteer de 70% ethanol en droog de neerslag kort in de buurt van een alcohollamp. Los de neerslag op door 30 μL RNase-vrij water toe te voegen en meng zachtjes.
- Laad 2 μL gesynthetiseerd RNA op een 1% agarose gel. Voer de agarose gel op 180 V voor 5-10 min in 0.5x TBE. Meet de concentratie van het gelabelde RNA met behulp van een spectrofotometer op een golflengte van 260 nm.
- Gebruik RNase-vrije microfugebuizen en filtertips om RNase-besmetting te voorkomen.
LET OP: (Pauzepunt) De met digoxygenin gelabelde sondes kunnen enkele maanden bij -70 °C worden opgeslagen.
- Gebruik RNase-vrije microfugebuizen en filtertips om RNase-besmetting te voorkomen.
2. Coelomic vloeistofverzameling
- Bevestig de S. nudus op de dissectietafel met pinnen. Open het lichaam van de S. nudus met een kleine autoclaved schaar. Isoleer de coelomic vloeistof met een pipet.
- Verzamel en breng 1 mL coelomic vloeistof met een pipet naar poly-D-lysine behandelde microscoop dia's. Breng de coelomic vloeistof gelijkmatig aan met een pipetpunt. Droog de glijbanen 1 uur af bij 37 °C.
3. In situ hybridisatie
- Dag 1
- Rehydrateer de dia's in een diakleur tik met 100 mL van 1x diethyl pyrocarbonaat behandeld fosfaat gebufferd zoutoplossing (DEPC-PBS). Rehydrateren 3 keer met 1x DEPC-PBS, 5 min per was met zachte agitatie.
- Permeabilize het uitstrijkje van coelomic vloeistof door de spijsvertering met 10 μg/mL proteinase K bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Incubeer de dia's in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 min om de spijsvertering te stoppen. Was de dia's in 1x DEPC-PBS met zachte agitatie gedurende 5 min 3 keer.
- Voeg 50 μL hybridisatiemix (HM) toe met de sense/antisense riboprobe op de dia's en voeg een afdekslip toe.
- Voeg natte doosbuffer toe aan de natte doos. Doe de dia's in de natte doos en sluit goed af met paraffinefolie. Hybridiseren 's nachts (ten minste 16 uur) bij 60 °C.
- Dag 2
- Verwarm de wasbuffer voor op 65 °C. Dompel de schuif in de dia kleurpot met de wasbuffer en laat het staan totdat de coverslip glijdt automatisch af. Het duurt ongeveer 5 min.
- Was 2 keer met wasbuffer bij 65 °C, 30 min per was met zachte agitatie. Was 2 keer met 0,2x zout-natriumcontraat (SSC) bij 65 °C, 30 min per was met zachte agitatie. Was 2 keer met maleïnezuurbuffer met Tween 20 (MABT) bij kamertemperatuur, 30 min per was met zachte agitatie.
- Incubeer de glijbanen bij kamertemperatuur voor 3-4 uur in de blokkerende buffer. Incubeer de dia's in 1 mL anti-digoxigenin-AP Fab fragmenten oplossing verdund op 1/5000 met de blokkerenbuffer bij 4 °C 's nachts.
- Dag 3
- Verwijder de antilichaamoplossing en was de glijbanen kort in MABT. Was 4 keer met MABT bij kamertemperatuur, 25 min per was met zachte agitatie.
- Incubeer de glijbanen met alkalische fosforbuffer bij kamertemperatuur 3 keer, 5 min per wasbeurt. Verwijder de alkalische fosforatasebuffer en voeg 1 mL 5-bromo-4-chloor-3-indolylfosfaat (BCIP)/nitroblauwe tetrazolium (NBT) kleuringsoplossing toe. Houd de dia's in het donker.
- Observeer de kleurreactie periodiek onder een optische microscoop. Wanneer de kleur volledig is ontwikkeld (reactietijd in het bereik van 1-4 uur), was de dia's 2 keer met MABT bij kamertemperatuur, 5 min per was met zachte agitatie.
- Was 2 keer met stopoplossing bij kamertemperatuur, 15 min per was met zachte agitatie. Incubeer de dia's in methanol om overtollige vlek te verwijderen, bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Afhankelijk van de achtergrondkleur kan de methanolwas 2 of 3 keer worden gedaan en kan de decolorisatietijd worden verlengd.
- Was 2 keer met MABT bij kamertemperatuur, 5 min per was met zachte agitatie. Breng de dia's over naar een vers filterpapier. Voeg 50 μL glycerol toe. Voeg de coverslips toe en observeer microscopisch.
OPMERKING: De samenstelling van de oplossing wordt getoond in tabel 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een samenvatting van de stappen die betrokken zijn bij ISH wordt geïllustreerd in figuur 1. Antisense en overeenkomstige zin riboprobes voor dmrt1 werden gesynthetiseerd uit PCR-producten versterkt uit de coelomic vloeistof cDNO's. De authenticiteit van de PCR-producten werd geverifieerd door middel van directe sequencing. Riboprobes werden gesynthetiseerd met behulp van T7 RNA polymerases volgens de protocollen van de fabrikant en een vorig rapport4 met enkele kleine wijzigingen. De representatieve signalen van ISH worden weergegeven in figuur 2. ISH van Sipunculus nudus coelomic vloeistof met antisense riboprobe die richt op dmrt1 onthult paarse vlekken geconcentreerd in trofoblast cellen van de spermatozeugmata (Figuur 2A, B, rode pijlen). Een sense riboprobe werd gebruikt als een negatieve controle, en de zin riboprobe voor dmrt1 niet detecteren geen hybridisatie signaal (Figuur 2C).
Figuur 1. Stroomdiagram van ISH. Blauwe dozen zijn de stappen voor het synthetiseren van riboprobe. Lichtgroene vakken zijn stappen voor in situ procedures. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. De uitdrukking van dmrt1 in Sipunculus nudus coelomic vloeistof gedetecteerd door ISH. (A, B) Hybridisatie met dmrt1 antisense riboprobe. (C) Hybridisatie met dmrt1 zin riboprobe. De rode pijlen vertegenwoordigen hybridisatiesignalen in trophoblastcellen. sz, spermatozeugmata. Schaalbalk: 50 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Li et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Naam | Volgorde (5′-3′) |
| Anti-Probe F | ACAATGTAGCAGGGTGTATCTTGG |
| Anti-Probe R | TAATACGACTCTAGGGAGACTGTTTCTCTCTATGCATCCAGTAA |
| Sense-Probe F | TAATACGACTCTAGGGAGAACAATGTAGCAGGGTTTAATCTTGG |
| Sense-Probe R | CTGTTTCTCTATGCATCCAGTAA |
Tabel 1. De dmrt1 primer sequenties.
| Reagens | Samenstelling |
| 5 × TBE (1 L) | 54 g Tris, 27,5 g boorzuur en 20 mL 0,5 M EDTA (pH 8.0). |
| 10 × PBS (5 L) | 400 g NaCl, 10 g KCl, 72 g Na2HPO4 en 12 g KH2PO4. |
| DEPC-PBS (1 L) | 1 L van 1 × PBS en 1 mL DEPC. |
| 4% PFA in 1 × PBS (100 mL, pH 7,4) | 4 g PFA en 100 mL PBS. |
| 10 mg/mL proteinase K (1 mL) | 10 mg proteinase K. |
| 20 × SSC (1 L) | 175,3 g NaCl en 88,2 g citroenzuur zout. |
| Natte boxbuffer (50 mL) | 2,5 mL van 20 × SSC, 22,5 mL RNase vrij water en 25 mL gedeïoniseerde formamide. |
| Hybridisatiemix (HM, 200 mL) | 100 mL van gedeïoniseerde formamide, 50 mL van 20 × SSC, 10 mg heparine, 100 mg tRNA, 0,39 g citroenzuur, 200 μL Tween-20 en RNase vrij water tot 200 mL. |
| Buffer wassen (1 L) | 50 mL van 20 × SSC, 500 mL van gedeïoniseerde formamide, 450 mL steriel water en 1 mL Tween-20. |
| MABT (1 L) | 11,6 g maleïnezuur, 8,77 g NaCl, 8,25 g NaOH en 1 mL Tween-20. |
| Buffer blokkeren | 1 × MABT, 2% schapenserum (vol/vol) en 2 mg/mL BSA. |
| Alkalische fosforbuffer | 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl (pH 9.5), 50 mM MgCl2, en 0,1% Tween 20 (vol/vol). |
| Stopoplossing | 0.1 M glycine, pH 2.2. |
Tabel 2. De samenstelling van oplossingen die in het ISH-protocol worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eerdere studies toonden aan dat ISH geschikt is voor het opsporen van meerdere doel-RNAs16,17,18. In dit protocol beschreven we een ISH-methode met hoge resolutie om het mRNA in coelomic vloeistof te detecteren en de geoptimaliseerde hybridisatieomstandigheden in Sipunculus nudus te benadrukken. De voor de hand liggende signalen van dmrt1 die we waarnamen toonden de succesvolle toepassing van dit protocol bij de detectie van genexpressie (Figuur 2).
Tijdens het experiment moet bijzondere aandacht worden besteed aan een reeks stappen. Ten eerste, zin riboprobes voor de doelgenen moeten worden gesynthetiseerd als de controle. Na de synthese moet de kwaliteit van de riboprobe worden gecontroleerd op een gel. Slechte RNA synthese zal resulteren in geen vlekken in de secties. Ten tweede moet het monsterverzamelingsproces zacht zijn om celvervorming te voorkomen en moet het experiment onmiddellijk na het verzamelen van coelomische vloeistof worden uitgevoerd om RNA-afbraak te voorkomen. Ten derde moeten incubatietijd en -tijden in alle stappen precies worden gevolgd zonder te verkorten of te verlengen. Let in het bijzonder op de timing van de behandeling van proteinase K. Een te lange behandelingstijd van proteinase K zal leiden tot de vernietiging van de celstructuur van het monster, terwijl een te korte behandelingstijd de riboprobe niet goed in de cel zal toelaten. Ten slotte mogen dia's tijdens het experiment niet uitdrogen. Deze methode omvat een hybridisatiestap bij 60 °C, waardoor het risico op reagensverdamping toeneemt. Zoals vermeld in het protocolgedeelte moeten dia's in een natte doos worden geplaatst en bedekt met paraffinefolie om verdamping te voorkomen.
Een beperking van dit protocol is de verwerving van riboprobe sequenties in niet-model organisme Sipunculus nudus, omdat slecht gesequenced mRNA kan een lage specificiteit van de riboprobe verlenen. Met de ontwikkeling van sequencing technologie, meer en meer hoge kwaliteit sequenties van Sipunculus nudus zal worden vrijgegeven, die sterk zal verbeteren deze situatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Young Scientists Fund van de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), de Natural Science Foundation van de provincie Fujian, China (2016J01161), de Wetenschappelijke Onderzoeksfondsen van de Huaqiao University (15BS306) en het Innovatieve Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek van de Huaqiao University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
- Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
- Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
- Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
- Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
- Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
- Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
- Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
- Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
- Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
- Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
- Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).
