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Behavior

स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में व्यवहार को संशोधित करने के लिए न्यूरोनल गतिविधि का ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61023
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Biology and Chemistry, Synthetic Biology, University of Bremen, 2Advanced Fluorescence Microscopy, Faculty of Biology and Biotechnology, Ruhr-Universität Bochum

Summary

विशिष्ट न्यूरोनल आबादी या मस्तिष्क क्षेत्रों के ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर के साथ, व्यवहार को स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों में उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ संशोधित किया जा सकता है। लंबे समय से प्रत्यारोपित ऑप्टिकल फाइबर के साथ संयोजन में विभिन्न ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों का उपयोग करके, विभिन्न प्रकार के न्यूरोनल मॉड्यूलेशन और व्यवहार परीक्षण किए जा सकते हैं।

Abstract

स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में न्यूरोनल सर्किट का ऑप्टोजेनेटिक मॉड्यूलेशन तीव्र और दीर्घकालिक व्यवहार को प्रभावित करता है। यह विधि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में पूरे न्यूरोनल सर्किटरी तक एकल न्यूरॉन्स और क्षेत्र-विशिष्ट ट्रांसमीटर रिलीज के जोड़तोड़ करने में सक्षम है, और व्यवहार परिणामों के प्रत्यक्ष माप की अनुमति देती है। न्यूरॉन्स वायरल वैक्टर के एक इंजेक्शन के माध्यम से ऑप्टोजेनेटिक उपकरण व्यक्त करते हैं, जैसे कि चैनलरोडोप्सिन 2 (ChR2)। प्रकाश को पुरानी ऑप्टिकल प्रत्यारोपण के माध्यम से विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में लाया जाता है जो सीधे लक्ष्य क्षेत्र से ऊपर समाप्त होता है। वसूली और उचित उपकरण-अभिव्यक्ति के दो सप्ताह के बाद, चूहों को बार-बार ब्याज के न्यूरॉन्स के ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के साथ व्यवहार परीक्षणों के लिए उपयोग किया जा सकता है।

ऑप्टोजेनेटिक मॉड्यूलेशन में एक उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प होता है जिसे आमतौर पर रासायनिक या विद्युत उत्तेजना जैसे तरीकों की तुलना में उच्च कोशिका विशिष्टता के साथ पूरा किया जा सकता है। प्रकाश न्यूरोनल ऊतक को नुकसान नहीं पहुंचाता है और इसलिए इसका उपयोग दीर्घकालिक प्रयोगों के साथ-साथ एक माउस में कई व्यवहार प्रयोगों के लिए किया जा सकता है। ऑप्टोजेटिक उपकरणों की संभावनाएं लगभग असीमित हैं और पूरे न्यूरॉन्स की सक्रियता या मुंह बंद करने, या यहां तक कि प्रकाश द्वारा एक विशिष्ट रिसेप्टर प्रकार के हेरफेर को सक्षम करती हैं।

एकीकृत ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के साथ इस तरह के व्यवहार प्रयोगों के परिणाम सीधे हेरफेर के कारण व्यवहार में परिवर्तन की कल्पना करते हैं। एक आधार रेखा के रूप में प्रकाश उत्तेजना के बिना एक ही जानवर का व्यवहार प्रेरित परिवर्तनों के लिए एक अच्छा नियंत्रण है। यह चिंता जैसे विशिष्ट व्यवहारों में शामिल न्यूरोनल प्रकार या न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम का विस्तृत अवलोकन करने की अनुमति देता है। ऑप्टिकल उत्तेजना के बाद दीर्घकालिक उत्तेजना या व्यवहार टिप्पणियों के माध्यम से न्यूरोनल नेटवर्क की प्लास्टिसिटी की भी बहुत विस्तार से जांच की जा सकती है। ऑप्टोजेनेटिक्स कई प्रकार के न्यूरोलॉजिकल रोगों में न्यूरोनल सिग्नलिंग को प्रबुद्ध करने में मदद करेगा।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरोनल सर्किट का मॉड्यूलेशन और उनके व्यवहार परिणाम यह समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि मस्तिष्क कैसे काम करता है, विशेष रूप से मनोरोग रोगों और सीखने और स्मृति जैसे संज्ञानात्मक कार्यों में। ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ, पूरे सर्किटरी तक एकल कोशिकाओं या कोशिका आबादी को प्रकाश द्वारा संग्राहक किया जा सकता है। चैनलरोडोप्सिन 2 (ChR2) या आर्काएरहोडोप्सिन (आर्क) जैसे सामान्य ऑप्टोजेनेटिक उपकरण न्यूरॉन्स को सक्रिय या शांत करने में सक्षम हैं, या अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में पेश होने वाले एक्सॉन टर्मिनलों पर ट्रांसमीटर रिलीज को बढ़ाने या बाधित करने में सक्षम हैं1,,2,,3,,4। हालांकि, आर्क को ध्यान से इस्तेमाल करने की जरूरत है क्योंकि यह दिखाया गया था कि प्रेसिनैप्टिक टर्मिनलों पर इसकी सक्रियता सहज ट्रांसमीटर रिलीज5बढ़ जाती है। आर्क एक जावक सुधार प्रोटोन पंप है जो सेल के अंदर पीएच मूल्य को बदलता है। यह क्षारीय परिवेश कैल्शियम की आमद को प्रेरित करता है और ट्रांसमीटर रिलीज5को बढ़ाता है । विशेष रूप से इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग रास्तों को संशोधित करने के लिए, रिसेप्टर कल्पना एक हल्के सक्रिय ऑप्टोजेनेटिक उपकरण से बना है, जैसे कि रोडोप्सिन या शंकु ऑप्सिन, पर्याप्त जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर के साथ मिलकर,6,,7,,8बनाया जा सकता है। पिछलेनौदशक के दौरान उपलब्ध ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों की मात्रा और भिन्नता में काफी वृद्धि हुई है .

ऑप्टोजेनेटिक्स का उद्देश्य व्यवहार के दौरान न्यूरोनल सर्किटरी में हेरफेर करना है। ऑप्टोजेनेटिक्स सक्षम बनाता है, उदाहरण के लिए, तीव्र व्यवहार परिवर्तनों का माप जैसे चिंता व्यवहार में परिवर्तन। ऑप्टोजेनेटिक उपकरण वायरल वैक्टर के माध्यम से मस्तिष्क के लक्षित क्षेत्रों में वितरित किए जाते हैं। विशेष प्रमोटरों और एन् बढ़ाने वालों या क्रे-लोक्सपी सिस्टम की मदद से ऑप्टोजेनेटिक टूल्स(चित्रा 1 ए)की अभिव्यक्ति के लिए सेल टाइप स्पेसिटी सुनिश्चित की जा सकती है। केवल विशिष्ट कोशिका प्रकारों में एंजाइम क्रे-रिकॉम्बिनेंटस को व्यक्त करने वाली कई आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनें हैं। उदाहरण के लिए, नेक्स-क्रे चूहे कॉर्टेक्स में पिरामिड न्यूरॉन्स में क्रे-रिकॉम्बिनेंटस और नेक्स-प्रमोटर10के नियंत्रण में हिप्पोकैम्पस व्यक्त करते हैं। यह एंजाइम डीएनए-दृश्यों को उलटने में सक्षम है, जो11लोक्सपी पक्षों द्वारा घिरा हुआ है। नतीजतन, डबल-फ्लॉक्स्ड ऑप्टोजेनेटिक टूल का डीएनए-अनुक्रम, जो लोक्सपी पक्षों द्वारा उलटा और घिरा हुआ है, केवल उन न्यूरॉन्स द्वारा लिखा जा सकता है जिनके पास क्रे-रिकॉम्बेनेस होताहै, लेकिन अन्य न्यूरोनल प्रकार12,,13द्वारा नहीं। नेक्स-क्रे चूहों के मामले में, ऑप्टोजेनेटिक उपकरण पूरी तरह से पिरामिड न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाएगा। कुछ मस्तिष्क क्षेत्रों की हल्की उत्तेजना तब ब्याज के क्षेत्र से सीधे ऊपर ऑप्टिकल फाइबर के पुराने प्रत्यारोपण के माध्यम से प्राप्त की जाती है। जानवरों को तब एक उपयुक्त प्रकाश स्रोत के साथ मिलकर किया जा सकता है और लगभग सभी प्रकार के व्यवहार परीक्षणों में स्वतंत्र रूप से व्यवहार कर सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: इंजेक्शन और प्रत्यारोपण। ए) ChR2-YFP के लिए क्रे-लोक्सपी सिस्टम । डबल फ़्लोक्स्ड ऑप्टोजेनेटिक टूल को मस्तिष्क के ऊतकों में इंजेक्शन के लिए एडेनो संबद्ध वायरस (एएवी) में पैक किया जाता है। B)एमएफसी के आईएल क्षेत्र में/ऊपर एक ऑप्टिकल न्यूरोनल इंटरफेस के वायरस इंजेक्शन और प्रत्यारोपण का Sagittal दृश्य । ऊपर से इंजेक्शन और इंप्लांटेशन किया गया। ब्याज, आईएल, बीएलए और डीआरएन के सभी क्षेत्रों को दिखाया गया है । C)प्रत्यारोपित ऑप्टिकल फाइबर, आस्तीन और प्रकाश स्रोत का विस्तृत दृश्य। D)ग्रे मैटर ब्रेन टिश्यू में 200 माइक्रोम लाइट फाइबर (येज़हार एट अल 2011) से नीले और लाल लेजर लाइट उत्तेजना का प्रसार। नीली रोशनी फैलती है, अधिकतम, ऊतक में 0.5 मिमी, लाल बत्ती लगभग 1 मिमी। रंग कोडिंग: लाल 50%, पीला 10%, हरा 5%, नीला 1% अगर प्रकाश इस क्षेत्र तक पहुंचता है। ई)एकतरफा प्रत्यारोपण के कोरोनल दृश्य सीधे एक 200 μm ऑप्टिकल फाइबर के साथ बाएं आईएल के ऊपर. आईएल क्षेत्र में प्रत्येक गोलार्द्ध में 0.25 मिमी की चौड़ाई और 0.2 मिमी की गहराई है। नीले और लाल बत्ती बल्ब 5% प्रकाश फैलने के बोर्डर हैं और येज़हर एट अल से सही आकार में स्थानांतरित किए जाते हैं। LoxP: एक्स-ओवर पी 1 का लोकस; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; dflox: डबल floxed; आईएल: इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स; बीएलए: बसोलेटरल एमिग्डाला; डीआरएन: पृष्ठीय राफे नाभिक; पीआरएल: प्रीलिम्बिक क्षेत्र। इस आंकड़े को बर्ग 201948से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है क्योंकि यह उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प14 और सेल प्रकार विशिष्ट मॉड्यूलेशन दोनों को सक्षम बनाता है। इसके अतिरिक्त, आगे के उपचार के बिना प्रत्यारोपित डिवाइस का दोहराव करना संभव है। एक स्टीरियोटाटिक सर्जरी के बाद, जहां ऑप्टोजेनेटिक उपकरण ले जाने वाले एडेनो से जुड़े वायरस का इंजेक्शन और ऑप्टिकल फाइबर का प्रत्यारोपण किया जाता है, चूहे दो सप्ताह तक ठीक हो सकते हैं। हम केवल 2 सप्ताह की एक वसूली समय चुना है, क्योंकि यह पर्याप्त समय के लिए सर्जरी से उबरने और वायरस के लिए व्यक्त करने के लिए है । चूंकि व्यवहार प्रयोगों को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा फॉलो किया जाता है, इसलिए हमें यह सुनिश्चित करना होगा कि प्रयोग के दौरान चूहे बहुत पुराने न हों; अन्यथा ऊतक की गुणवत्ता में कमी आई है। वे प्रत्यारोपण से कोई स्पष्ट व्यवहार हानि दिखाने के लिए और ठेठ पिंजरे व्यवहार में संलग्न हैं । बेशक, प्रत्यारोपण एक महत्वपूर्ण शल्य घाव के साथ है; इसलिए, चूहों की गहनता से निगरानी की जाती है। सर्जरी के बाद, चूहों को एकल रखे जाने की आवश्यकता होती है, क्योंकि समूह में रखे गए चूहे एक-दूसरे के ताजा घावों और प्रत्यारोपण को घायल करते हैं। हालांकि, आवास की स्थिति पुरुष चूहों की चिंता के स्तर पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है, के रूप में एक घर चूहों कम चिंता का स्तर15 और सामांय में कम अवसादग्रस्तता की तरह लक्षण16दिखा ।

मस्तिष्क सर्किटरियों के रासायनिक या विद्युत हेरफेर में ऑप्टोजेनेटिक्स की उच्च कोशिका प्रकार की विशिष्टता की कमी होती है और इसमें अस्थायी और स्थानिक संकल्प14,17,18होता है ।18 प्रायोगिक प्रश्न के आधार पर, विद्युत या रासायनिक उत्तेजना के अलग-अलग फायदे हो सकते हैं। जब एक विशिष्ट क्षेत्र में फाइबर टर्मिनलों गुजर भी उत्तेजित होने की जरूरत है, विद्युत उत्तेजना सबसे अच्छा तरीका है । रासायनिक उत्तेजना एक अच्छा विकल्प है जब एक पूरे क्षेत्र में ट्रांसमीटर विशिष्ट रिसेप्टर्स को एगोनिस्ट द्वारा सक्रिय किया जाना चाहिए। रासायनिक या विद्युत उत्तेजना की तुलना में ऑप्टोजेनेटिक्स का एक और बड़ा लाभ यह है कि अंतर्जात रूप से, न्यूरॉन्स प्रकाश के प्रति संवेदनशील नहीं होते हैं, जोदुष्प्रभाव 19की घटना से बचते हैं। दरअसल, उच्च प्रकाश तीव्रता हीटिंग प्रभाव,8,20को प्रेरित कर सकती है, लेकिन उचित नियंत्रण समूहों के कारण, ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर के कारण व्यवहार प्रभाव को समाप्त किया जा सकता है।

कृंतक व्यवहार की जांच, विशेष रूप से मनोरोग रोगों के संबंध में, स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ काफी सुधार हुआ है, क्योंकि यह विशिष्ट सेलआबादी 21 और सर्किटरी22तक एकल रिसेप्टर्स के प्रत्यक्ष मॉड्यूलेशन को सक्षम बनाता है। इस तरह के मॉड्यूलेशन के तीव्र प्रभावों को मापने की संभावना, साथ ही एक परिभाषित समय23 के बाद या पुरानी उत्तेजना24के बाद दीर्घकालिक व्यवहार प्रभाव, प्रयोगात्मक डिजाइनों के व्यापक लचीलेपन को सक्षम बनाता है और मस्तिष्क सर्किटरी में बहुत विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। ऑप्टोजेनेटिक उपकरण के इंजेक्शन साइट पर स्थित न्यूरॉन्स को मिलाने के लिए हल्के उत्तेजना का उपयोग किया जा सकता है। जब इंजेक्शन और प्रत्यारोपण दोनों एक ही मस्तिष्क क्षेत्र को संबोधित करते हैं, तो इस क्षेत्र में सिद्धांत न्यूरॉन्स और इंटरन्यूरॉन के सिद्धांत न्यूरॉन्स के बैक प्रोजेक्टिंग एक्सॉन को3,,6,,8लक्षित किया जा सकता है। हालांकि, हल्के फाइबर को इंजेक्शन से अलग क्षेत्र में भी प्रत्यारोपित किया जा सकता है। इस मामले में, प्रकाश उत्तेजना इंजेक्शन क्षेत्र25, 26, 27,26,27के प्रक्षेपण क्षेत्रों में अक्षतंपर टर्मिनलों पर ट्रांसमीटर रिलीज को मिला सकती है।

यहां अध्ययन में, ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग चिंता से संबंधित व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए प्रयोगों के संयोजन में किया जाता है। चिंता से संबंधित मनोरोग रोग दुनिया की एक तिहाई से अधिकआबादी 28,29,,30 को प्रभावित करते हैं और31 उच्च आर्थिक बोझ पैदाकरतेहैं । प्रभावित लोग उत्तेजना, तनाव और चिंता की भावना से पीड़ित हैं और इसके बाद परिहार व्यवहार32,,33 ये लंबे समय से होने वाली नकारात्मक भावनाओं, जो मुख्य रूप से भविष्य की घटनाओं३४पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, दृढ़ता से रोगियों के दैनिक जीवन के साथ हस्तक्षेप । बेंजोडाइज़ेपिन्स या चयनात्मक सेरोटोनिन रीटेक अवरोधक (एसएसआरआई) जैसे सामान्य उपचार केवल कुछ रोगियों में सफल होते हैं। बड़ी मात्रा में लोग सभी35पर उपचार का जवाब नहीं देते हैं, यह दिखाते हुए कि ऐसी बीमारियों में अंतर्निहित तंत्र अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आया है। मध्यपूर्व प्रांतस्था (एमपीएफसी) चिंता 21 , 25,,27, 36 ,,37,,,2538के विकास और अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जानाजाताहै।27 विशेष रूप से, एमपीएफसी में इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स (आईएल) क्षेत्र का अतिसक्रियण चिंता से संबंधित विकारों का हिस्सा हो सकता है39,,40। यहां वर्णित उदाहरण प्रयोग यह समझने में मदद कर सकता है कि एमपीएफसी के आईएल क्षेत्र में मॉड्यूलेशन चिंता व्यवहार को कैसे प्रभावित करते हैं। इसके अतिरिक्त, चिंता से संबंधित मनोरोग रोगों के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को भी संभावित रूप से समर्थित किया जा सकता है।

2-6 महीने पुराने पुरुष नेक्स-क्रे चूहों का उपयोग विशेष रूप से एमपीएफसी41के आईएल क्षेत्र के भीतर पिरामिड न्यूरॉन्स में ChR2 व्यक्त करने के लिए किया जाता है। नेक्स-क्रे चूहों की C57Bl/6 पृष्ठभूमि होती है और विशेष रूप से पिरामिड न्यूरॉन्स में एंजाइम क्रे-रिकॉम्बेन्नेस व्यक्त करते हैं। एक स्टीरियोटैक्टिक सर्जरी के दौरान, डबल floxed ChR2-डीएनए adeno संबद्ध वायरल वैक्टर के माध्यम से आईएल क्षेत्र में इंजेक्शन है । ऑप्टिकल इंप्लांट को सीधे ब्याज(चित्रा 1बी)के क्षेत्र से ऊपर रखा जाता है और इंप्लांट डेंटल सीमेंट के साथ तय किया जाता है । नियंत्रण जानवरों को सेल विशिष्ट अभिव्यक्ति की नकल करने के लिए एक ही क्षेत्र में डबल floxed tdTomato-डीएनए का एक इंजेक्शन प्राप्त होता है ।

जानवरों को सर्जरी के दिन तक समूह-रखे जाते हैं और बाद में अन्य चूहों से चोटों से बचने के लिए एकल रखे जाते हैं। चूहों को एक रखे चूहों के लिए टाइपी-एल पिंजरों में व्यक्तिगत हवादार पिंजरे (आईवीसी) रैक में रखे जाते हैं। प्रकाश-अंधेरे चक्र 12:12 घंटे की लय का अनुसरण करता है, प्रकाश चरण सुबह 10 बजे से शुरू होता है। सभी व्यवहार प्रयोग अंधेरे चरण में किए जाते हैं, जो कृंतक के सक्रिय चरण जैसा दिखता है। पानी और मानक खाद्य छर्रों विज्ञापन libitum उपलब्ध हैं। वसूली के दो सप्ताह के बाद, जो पिरामिड न्यूरॉन्स में ChR2 की पर्याप्त अभिव्यक्ति सुनिश्चित करता है, चूहों का उपयोग व्यवहार प्रयोगों के लिए किया जाता है।

ओपन फील्ड (ओएफ) 50 सेमी x 50 सेमी चुकता भूलभुलैया है जिसमें सैंडब्लास्टेड 40 सेमी ऊंची दीवारें हैं। जमीन को 16 वर्गों में विभाजित किया गया है जहां आंतरिक 4 केंद्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। मापा व्यवहार है: 1) केंद्र में बिताया समय, 2) केंद्र प्रविष्टियों की संख्या, और 3) कुल दूरी चले गए । इस प्रयोग के दौरान कुल 20 मिनट के 4 परीक्षण होते हैं। परीक्षण 1 और 3 में, कोई प्रकाश उत्तेजना नहीं होती है, और परीक्षण 2 और 4 परीक्षणों में, 5 एमएस लाइट पल्स और 1 मेगावाट की हल्की तीव्रता के साथ 20 हर्ट्ज उत्तेजना 473 एनएम(चित्रा 2 ए)किया जाता है। बाद के परीक्षणों में, परीक्षण क्षेत्र में आदत को ध्यान में रखा गया था, लेकिन नकली-इंजेक्शन नियंत्रण जानवरों के उपयोग से पता चलता है कि आदत कैसे व्यक्त की जाती है।

बार्न्स भूलभुलैया सीखने और स्मृति के लिए एक प्रयोग है। यह एक गोलाकार मंच है जो व्यास में 92 सेमी है और परिधि के चारों ओर 20 समान दूरी के छेद होते हैं। छेद के 19 बंद कर रहे हैं और एक छेद के नीचे एक बच बॉक्स प्रस्तुत किया जाता है। लगातार 4 दिनों तक चूहों के पास एस्केप बॉक्स की लोकेशन जानने के लिए 4 ट्रेनिंग ट्रायल होते हैं। 5 वें दिन, एस्केप बॉक्स को हटा दिया जाता है, और चूहों का परीक्षण कियाजाता है कि उन्हें सही छेद खोजने के लिए कितना समय चाहिए। मापा व्यवहार है: 1) समय जब तक एस्केप बॉक्स/सही छेद पाया जाता है, 2) लक्ष्य यात्राओं और त्रुटियों की संख्या, और 3) दूरी भागने बॉक्स में जब तक चले गए । विभिन्न समूहों में प्रकाश उत्तेजना या तो अधिग्रहण या समेकन के दौरान की जाती है, जो प्रशिक्षण के दिनों में 1-4, या परीक्षण के दिन पुनर्प्राप्ति के दौरान होती है, जो दिन 5(चित्रा 2डी)है।

Figure 2
चित्र 2: ऑप्टोजेटिक प्रोटोकॉल के साथ व्यवहार प्रयोग। A)इसी प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल के साथ ओपन फील्ड प्रयोग की योजनाबद्ध ड्राइंग। C)इसी प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल के साथ ऊंचा-प्लस भूलभुलैया प्रयोग की योजनाबद्ध ड्राइंग। D)इसी प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल के साथ बार्न्स भूलभुलैया प्रयोग की योजनाबद्ध ड्राइंग। EPM: एलिवेटेड प्लस भूलभुलैया; के: ओपन फील्ड; बीएम: बार्ंस भूलभुलैया परीक्षण । इस आंकड़े को बर्ग 201948से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के लिए, प्रकाश तीव्रता और आवृत्ति को ऑप्टोजेटिक उपकरण और न्यूरोनल प्रकार के अनुकूल होना चाहिए जो जांच के अधीन है। ऊतक को नुकसान से बचने के लिए सबसे कम संभव प्रकाश तीव्रता का उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि कई अध्ययनों से पता चला है कि मजबूत प्रकाश तीव्रता8,,20के कारण संभावित हीटिंग प्रभाव हैं। ChR2 के लिए, एक 5 एमएस प्रकाश नाड़ी के साथ एक 20 हर्ट्ज उत्तेजना आमतौर पर 2 प्रयोग कियाजाताहै । चूंकि ChR2 काफी हल्का संवेदनशील है, इसलिए 1 एमडब्ल्यू प्रकाश तीव्रता पर्याप्त है। प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल सीधे व्यवहार परिवर्तन को मापने के लिए प्रकाश बंद और परीक्षणों के बीच विकल्प। व्यवहार प्रयोगों के लिए बाहरी कमरे की स्थिति जानवरों के पूरे समूह के लिए स्थिर रहना चाहिए। विचार करने के लिए महत्वपूर्ण शर्तें शोर हैं (ध्यान रखें कि डिवाइस खुद शोर कर सकते हैं), गंध (हमेशा इथेनॉल के साथ व्यवहार सेटअप को साफ करें), प्रकाश तीव्रता और प्रयोगकर्ता। प्रयोगकर्ता हमेशा एक ही व्यक्ति होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, प्रयोगों के दिन का समय एक समूह में सभी जानवरों के लिए समान होना चाहिए, सुविधा में अंधेरे चरण की शुरुआत के कुछ घंटे बाद पसंद किया जाता है।

इस प्रयोग का लक्ष्य उत्तेजक पिरामिड न्यूरॉन्स की मजबूत सक्रियता के माध्यम से आईएल क्षेत्र में उत्तेजना/अवरोध (ई/आई) अनुपात को बढ़ाना है । इस विशेष प्रांतस्था क्षेत्र में एक बढ़ाया गया ई / आई अनुपात चूहों में चिंता के स्तर को बढ़ाने के लिए जाना जाता है40,42,43,44.

Protocol

पशु विषयों से जुड़ी प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु अनुसंधान सुविधा और ब्रेमेन विश्वविद्यालय (#146) में "सीनेटर फ्यूर विस्सेंसचैफ्ट, गेसुंधेत एंड वर्ब्राउचर्सचुट्ज़" द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. ऑप्टिकल प्रत्यारोपण की तैयारी9 (चित्रा 1C)

  1. एक बेंच शिकंजा में एक सिरेमिक फेरुल फ्लैट साइड रखें।
  2. फाइबर स्ट्रिपिंग टूल के साथ 200 माइक्रोन व्यास ग्लास फाइबर के कोट को स्ट्रिप करें और सिरेमिक फाइबर मुंशी के साथ 2-3 सेमी लंबे टुकड़ों को काटें।
  3. कांच के फाइबर के टुकड़े को सिरेमिक फेरुल में रखें, दोनों तरफ एक भी ओवरहांग के साथ।
  4. एक इंजेक्शन कैनुला के साथ सिरेमिक फेरूल के फ्लैट साइड में सुपरग्लू की एक बूंद रखें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
  5. बेंच के विज़ से बाहर और सिरेमिक फेरुल के गोल पक्ष पर प्री-इंप्लांट लें, सिरेमिक फाइबर मुंशी के साथ जितना संभव हो सके ग्लास फाइबर को काट लें।
  6. एक फेरुल पॉलिशिंग पक पर पूर्व प्रत्यारोपण रखें और 4 अलग-अलग पॉलिशिंग पेपर्स पर गोल साइड पॉलिश करें, प्रति पेपर आठ 20 बार ड्राइंग करके (30 माइक्रोम ग्रिट, 6 माइक्रोन ग्रिट, 1 माइक्रोन ग्रिट, और पिछले 0.02 माइक्रोन ग्रिट पर)।
  7. फेरुल पॉलिशिंग पक से प्री-इंप्लांट लें और सिरेमिक फेरुल के फ्लैट साइड पर ग्लास फाइबर को प्रत्यारोपण के लिए जरूरी लंबाई में काट लें । फैला हुआ superglue के पीछे की लंबाई को मापने शुरू करते हैं।
    1. एक भी काटने की सतह के लिए सिर्फ कांच फाइबर 2-3 बार खरोंच और फिर इसे तोड़ ।
      नोट: प्रत्यारोपण की लंबाई की गणना करने के लिए पैक्सिनोस और फ्रैंकलिन45 से माउस मस्तिष्क एटलस का उपयोग करें। प्रत्यारोपण सीधे ब्याज के क्षेत्र से ऊपर समाप्त होना चाहिए और खोपड़ी की मोटाई लंबाई गणना में शामिल किया जाना चाहिए। आईएल क्षेत्र को प्रोत्साहित करने के लिए, ग्लास फाइबर की लंबाई 1.8 मिमी(चित्रा 3) है।

Figure 3
चित्रा 3: माउस मस्तिष्क एटलस (Paxinos और फ्रैंकलिन) प्रत्यारोपण के प्रतिनिधि लंबाई के साथ आईएल क्षेत्र तक पहुंचने के लिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. इथेनॉल में 10 मिनट के लिए तैयार प्रत्यारोपण कीटाणुरहित करें और इसे प्रत्यारोपण से पहले सूखने दें।

2. इंजेक्शन और प्रत्यारोपण

  1. सर्जिकल कमरे में एक माउस परिवहन और यह वजन। केटामाइन/जाइलाज़ीन (केटामाइन 0.12 मिलीग्राम/ग्राम, जाइलाज़ीन 0.01 मिलीग्राम/ग्राम) के इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के साथ एनेस्थीसिया लगाएं।
    1. माउस को बाएं हाथ से ठीक करें और इसे कम रखे गए सिर के साथ अपनी पीठ पर चालू करें।
    2. सिरिंज के साथ पेट के बाएं निचले चतुर्भुज को निशाना बना लें और इंजेक्शन कैनुला 1 सेमी त्वचा के नीचे प्रवेश करें।
    3. पेट की गुहा में धीमी और निरंतर गति में संज्ञाहरण इंजेक्ट करें।
    4. माउस को अपने पिंजरे में वापस रखें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि यह संज्ञाहरण की गहरी स्थिति तक न पहुंच जाए।
      नोट: संज्ञाहरण की गहराई निमिष और बीच-तारों सजगता की अनुपस्थिति से निर्धारित किया जा सकता है।
  2. माउस को हीटिंग प्लेट पर रखें और सिर को स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में ठीक करें। नाक और दांतों को सामने की ओर और दोनों तरफ कान ठीक करें।
    नोट: सही स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक सुनिश्चित करने के लिए सिर सीधे बाएं-दाएं और रोस्ट्रल-कौडल अक्ष पर होना चाहिए।
  3. माउस के पीछे 2 मिलीग्राम/किलो कार्प्रोफेन के साथ एनाल्जेसिया को बारीकी से लगाएं और उन्हें सूखने से बचाने के लिए दोनों आंखों पर अपारदर्शी आंखों का मरहम लगाएं ।
  4. सिर पर बालों को गीले कागज के तौलिये से गीला करें और फिर कैंची का इस्तेमाल कर उसे काट लें। गीले कागज तौलिया के साथ सभी ढीले बालों को हटाने के लिए सुनिश्चित करें। खोपड़ी को कीटाणुरहित करने के लिए, एक सूती छड़ी का उपयोग करें और आयोडीन युक्त टिंचर के 0.5 एमएल (बेतासोडोना 100 मिलीग्राम/एमएल पोविडन आयोडीन और 11 मिलीग्राम/एमएल आयोडीन) लें और इसे सूखने दें।
    नोट: कैंची के बजाय, यह भी एक बिजली क्लिपर उचित बालों को हटाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. एक चिमटी के साथ ब्याज के क्षेत्र से ऊपर खोपड़ी उठाएं और मिडलाइन के साथ 1 सेमी काटें। खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा को एक तरफ धकेलने के लिए दो चिमटी का उपयोग करें। खोपड़ी के ऊपर पतली त्वचा को भी हटाना सुनिश्चित करें और उजागर खोपड़ी को सूखने दें।
  6. बाद में प्रत्यारोपण के लिए खोपड़ी को खुरदुरा।
    1. फॉस्फोरिक एसिड की 2 एमएम x 2 एमएम ड्रॉप (37%) खोपड़ी पर चिपकने वाली किट (जैसे, ऑप्टिबोंड) से, इसे सिरिंज की नोक के साथ वितरित करें और इसे 15 एस के लिए प्रभावी होने दें।
    2. एक कपास छड़ी के साथ सभी एसिड निकालें और खोपड़ी को 0.9% एनएसीएल के 1 एमएल के साथ दो बार कुल्ला करें।
    3. खोपड़ी को सूती छड़ी और संकुचित हवा से सुखा लें।
      सावधानी: फॉस्फोरिक एसिड खतरनाक है और ऊतक क्षति से बचने के लिए पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए।
  7. व्यक्तिगत निर्देशांक के लिए एफ-फैक्टर की गणना करें।
    1. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में एक ग्लास कैनुला रखें और इसे सीधे ब्रेग्मा के ऊपर पता लगाएं।
    2. समन्वय प्रणाली को शून्य करें और ग्लास कैनुला को लैम्ब्डा में ले जाएं।
    3. निम्नलिखित सूत्र के साथ एफ-फैक्टर46 की गणना करें:
      Equation 1
    4. एफ-फैक्टर को माउस ब्रेन एटलस से निर्देशांक के साथ गुणा करें ताकि उन्हें व्यक्तिगत माउस में समायोजित किया जा सके।
  8. इंजेक्शन के लिए खोपड़ी में एक छेद ड्रिल करें।
    1. ब्याज की संरचना के ऊपर सीधे खोपड़ी पर स्थान खोजने के लिए समायोजित निर्देशांक का उपयोग करें और इसे हड्डी की सतह के ऊपर खरोंच करके एक इंजेक्शन कैनुला की नोक का उपयोग करके चिह्नित करें।
    2. मौके पर कैनुला घुमाकर चिह्नित स्थान पर खोपड़ी में छेद ड्रिल करने के लिए इंजेक्शन कैनुला का उपयोग करें। यदि रक्त बर्र छेद से बाहर निकलता है, तो 0.9% एनएसीएल के 1 एमएल के साथ कुल्ला करें और बाद में खोपड़ी को सुखा लें।
  9. वायरस के घोल को ग्लास कैनुला में लें।
    1. खोपड़ी पर 0.9% एनएसीएल के 100 माइक्रोन की एक बूंद और शीर्ष पर पैराफिल्म (1 सेमी x 1 सेमी) का एक टुकड़ा रखें, बाँझ पक्ष ऊपर।
    2. पैराफिल्म पर वायरस के घोल के 1-2 माइक्रोन रखें और इसमें ग्लास कैनुला की नोक को कम करें।
    3. ग्लास कैनुला को सिरिंज से कनेक्ट करें, न्यूनतम नकारात्मक दबाव लागू करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि कैनुला (सेकंड के भीतर) द्वारा वायरस समाधान नहीं लिया जाता है।
      नोट: यह नकारात्मक दबाव के आवेदन को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है, इससे पहले कि हवा canula में उठाया है । इसलिए, वायरस के समाधान का एक छोटा सा अवशेष हमेशा होगा।
  10. रुचि के क्षेत्र में वायरस समाधान इंजेक्ट करें।
    1. वायरस से भरे ग्लास कैनुला को बर्र होल के ऊपर रखें।
    2. कैनुला की नोक खोपड़ी के स्तर पर होने पर धीरे-धीरे कैनुला को बर्र होल में कम करें और जेड-समन्वय को शून्य करें।
    3. इंजेक्शन साइट की सबसे निचली स्थिति में कैनुला को ध्यान से कम करें।
    4. कैनुला के भीतर वायरस समाधान के मेनिस्कस पर दूरबीन पर ध्यान केंद्रित करें।
    5. सिरिंज के साथ थोड़ी मात्रा में सकारात्मक दबाव लागू करें जब तक कि मेनिस्कस मामूली रूप से कम न हो जाए।
    6. ग्लास कैनुला को अगली स्थिति में ऊपर की ओर ले जाने से पहले वायरस को 2-3 मिनट तक फैलने दें।
    7. ब्याज के पूरे क्षेत्र में हर 200-300 माइक्रोन वायरस समाधान लागू करें।
    8. ग्लास कैनुला को बहुत धीरे-धीरे निकालें और अंतिम इंजेक्शन के बाद इसे त्याग दें।
  11. आसंजन किट (जैसे, ऑप्टिबोंडटीएम एफएल)के साथ प्रत्यारोपण के लिए खोपड़ी तैयार करें।
    1. संकुचित हवा के साथ खोपड़ी सूखी।
    2. प्राइमर के 5 माइक्रोन (जैसे, ऑप्टिबोंड, 1-30% (इथेनॉल, सिलिक एसिड, ग्लिसरीनफोफोस्फेट्डिमेथ्रिलैट, 2-(2-(मेथाक्रिलोक्सी) एथॉक्सीकार्बोनिल) बेंजोसेर, 2-हाइड्रोक्सीथाइलमेथाक्रिललेट) लागू करें।
    3. बांड के 5 माइक्रोन (जैसे, ऑप्टिबोंड, 15-20% 2-हाइड्रोक्सीथाइलमेथाक्रिस्टालैट + 1-2% क्षालहेक्साफ्लोरोसिलिकैट (ना)) एक ही छड़ी के साथ लागू करें और यूवी प्रकाश (420-480 एनएम) के साथ 20 एस के लिए इसका इलाज करें।
      नोट: यह आवश्यक है कि खोपड़ी सूखी है और प्राइमर और बॉन्ड को बहुत पतली परत में लागू किया जाता है।
      सावधानी: यूवी लाइट में सीधे न देखें, क्योंकि यूवी लाइट आंखों को नुकसान पहुंचा सकती है।
  12. इंप्लांट को सीधे ब्याज के क्षेत्र से ऊपर रखें।
    1. इसी धारक में प्रत्यारोपण को ठीक करें।
    2. संकुचित हवा के साथ खोपड़ी सूखी।
    3. कांच फाइबर की नोक को सीधे बर्र होल के ऊपर रखें और इसे ध्यान से कम करें।
    4. जब सुपरग्लू का शेष बल्ब खोपड़ी को छूता है तो प्रत्यारोपण को कम करना बंद कर दें। खोपड़ी पर दबाव न डालें!
      नोट: यदि इंजेक्शन और प्रत्यारोपण विभिन्न क्षेत्रों में किया जा रहा है (जैसे, पृष्ठीय राफे और हिप्पोकैम्पस),फॉस्फोरिक एसिड लागू करने के बाद सभी आवश्यक छेद ड्रिल, लेकिन 2 घटक आसंजन से पहले, तो निर्देशों का पालन करें के रूप में पहले वर्णित (चरण 2.8-2.14) ।
  13. इंप्लांट ठीक करें।
    1. जांच करें कि खोपड़ी अभी भी पूरी तरह से सूखी है या नहीं।
    2. इम्प्लांट के आसपास और आसपास के क्षेत्र में तरल दंत सीमेंट (जैसे, ग्रैडिया डायरेक्ट फ्लो) लागू करें और यूवी लाइट (420-480 एनएम) के साथ 20 एस के लिए इलाज करें।
      नोट: दंत सीमेंट की मात्रा मुफ्त खोपड़ी क्षेत्र पर निर्भर करता है। पूरी खोपड़ी को डेंटल सीमेंट से कवर करना चाहिए।
    3. सीमेंट की दो और परतें लागू करें और पूरी तरह से मुक्त और सूखे खोपड़ी क्षेत्र को भरें। यूवी लाइट (420-480 एनएम) के साथ हर परत का इलाज करें।
  14. सर्जरी खत्म करें।
    1. पूरे घाव पर 0.5 ग्राम आयोडीन मरहम (Betaisodona 100 मिलीग्राम/एमएल पॉविडोन आयोडीन और 11 मिलीग्राम/एमएल आयोडीन) लागू करें।
    2. जल्दी वसूली के लिए गर्दन में 0.9% एनएसीएल में घुल ग्लूकोज की 0.1 मिलीएल इंजेक्ट करें।
    3. नाक और कान निर्धारण जारी करें, माउस को एक ताजा पिंजरे में लाएं और शरीर की गर्मी के नुकसान से बचने के लिए इसे एक हीटिंग लैंप के नीचे रखें।
    4. जब माउस जाग जाए, तो इसे वापस सुविधा में लाएं।
    5. दिन में कम से कम एक बार इसकी स्वास्थ्य स्थिति की जांच करें। यदि चूहे किसी भी खराब संविधान प्रदर्शित करते हैं तो उचित कार्रवाई करें (उदाहरण के लिए, यदि चूहे दर्द के किसी भी संकेत को प्रदर्शित करते हैं तो 3 दिनों तक कार्प्रोफेन के साथ पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया सुनिश्चित करें)।
      नोट: वसूली के दो सप्ताह के बाद, चूहों व्यवहार प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

3. एक नया प्रयोग स्थापित करना (उदाहरण ChR2 उत्तेजना और ओपन फील्ड)

  1. पल्सर
    1. प्रकाश उत्तेजना के लिए स्पीटर (जैसे, प्रिज़्मेमिक्स) को प्रोग्राम करें।
    2. सॉफ्टवेयर खोलें और यूएसबी कॉम पोर्ट का चयन करें जिसे प्रकाश स्रोत में प्लग किया गया है।
    3. चुनें ऑपरेशन मोड (3) । उच्च ट्रिगर करने के बाद पल्स अनुक्रम निष्पादित करें, फिर किसी बाहरी सॉफ़्टवेयर को प्रकाश स्रोत को नियंत्रित करने की अनुमति देने के लिए कम होने पर रोकें।
    4. प्रकाश प्रोटोकॉल कार्यक्रम। 5 एमएस लाइट पल्स के साथ 20 हर्ट्ज उत्तेजना के लिए: टीआई = 23 एमएस, पी 1डी = 5 एमएस, पी 1आई = 22 एमएस और पी2डी = 0 एमएस चुनें।
    5. प्रेस स्टार्ट सीक्वेंस। यह स्थिति तब तक रहेगी जब तक प्रयोग समाप्त नहीं हो जाते।
      नोट: वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर से पहले पल्सर सॉफ्टवेयर (प्रिज़मैटिक्स पल्सर) लॉन्च किया जाना चाहिए; अन्यथा वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर डिवाइस को पहचानने में सक्षम नहीं होगा।
  2. वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर (उदाहरण के लिए, एथोविजन एक्सटी)
    1. पूर्व-निर्धारित टेम्पलेट से एक नया प्रयोग बनाएं।
      1. सॉफ्टवेयर खोलें, फाइलपर जाएं, टेम्पलेट से नयाचुनें। एक पूर्व-परिभाषित टेम्पलेट लागू करें।
      2. लाइव ट्रैकिंग चुनें और स्रोत पर दबाकर कैमरे का चयन करें और कनेक्टेड बेसलर जेनीकैम की पुष्टि करें।
        नोट: कैमरे की लाइव छवि अब ऊपरी दाईं ओर खिड़की में प्रदर्शित किया जाएगा ।
      3. आगे प्रेस करें और उस जानवर को चुनें जिसे रिकॉर्ड किया जाना चाहिए(कृंतक, माउस)।
      4. आगे प्रेस और एरिना टेम्पलेट ओपन फील्ड, स्क्वायरका चयन करें । जोन टेम्पलेट सेंटर, बॉर्डर, कॉर्नर का चयन करें और अगले के साथ पुष्टि करें।
      5. 1 विषय है कि अगलेके साथ ट्रैक किया जाना चाहिए की पुष्टि करें ।
      6. केंद्र बिंदु, नाक बिंदु और पूंछ आधार का चयन करें और अगलेके साथ गहरे रंग के रूप में पृष्ठभूमि की तुलना में जानवरों के रंग की पुष्टि करें ।
      7. अगले के साथ 12.5 की अनुशंसित नमूना दर की पुष्टि करें और कदम खत्म करें।
      8. प्रयोग को उपयुक्त नाम देना और सहेजने के लिए स्थान चुनें.
    2. प्रायोगिक सेटिंग्स को परिभाषित करें।
      1. सेटअप और प्रायोगिक सेटिंग्स परजाएं । ट्रैक सुविधाओं के रूप में केंद्र बिंदु, नाक बिंदु और पूंछ आधार का पता लगाने का चयन करें ।
      2. परीक्षण नियंत्रण हार्डवेयर का उपयोग चुनें और सेटिंग्समें जाएं ।
      3. Noldus यूएसबी-IO बॉक्स का चयन करें और ठीक केसाथ पुष्टि करें ।
      4. टीटीएल पोर्ट पर डिवाइस प्रकार के रूप में कस्टम हार्डवेयर चुनें, जिसे पल्सर डिवाइस से जोड़ा गया है, और ठीक सेपुष्टि करें।
    3. अखाड़ा सेटिंग्स को परिभाषित करें।
      1. एरिना सेटिंग्स पर जाएं और एरिना सेटिंग्स 1 काचयन करें ।
        नोट: कैमरा अब स्वचालित रूप से एक पृष्ठभूमि छवि खोल देगा।
      2. ग्रैबके साथ छवि की पुष्टि करें ।
      3. पूर्व-परिभाषित क्षेत्रों को उनके आकार को बदलकर वास्तविक क्षेत्र में अनुकूलित करें। इसके दाईं ओर तीर और दो प्रतीकों का प्रयोग करें। अगर कुछ जोन अनावश्यक हैं तो उन्हें हटा दें।
      4. 1 प्रेस करें। स्केल को कैलिब्रेट करने के लिए ड्रा करें और भूलभुलैया के एक कोने से दूसरे को एक लाइन खींचें। सेमी में वास्तविक दूरी की लंबाई दर्ज करें।
      5. दूसरी धुरी के लिए दोहराएं।
    4. अगर प्रकाश उत्तेजना काम कर रहा है परीक्षण करें।
      1. एरिना में जाएं - हार्डवेयर मैपिंग और ग्रे बार पर टेस्ट का चयन करें।
      2. कमांड आउटपुट 1 हाई और प्रेस टेस्टका चयन करें ।
        नोट: ऑप्टिकल फाइबर के अंत से प्रकाश उत्सर्जक होना चाहिए। आउटपुट 1 कम और टेस्टका चयन करते समय, उत्तेजना बंद होनी चाहिए।
    5. प्रयोग के 20 मिनट के लिए परीक्षण नियंत्रण सेटिंग्स को परिभाषित करें। प्रत्येक के लिए प्रत्येक के लिए ऑफ1, On1, Off2 और On2 सेट करें 5 मिनट लंबा है।
      1. ट्रायल कंट्रोल सेटिंग पर जाएं और ट्रैक अवधि 30 मिनटका चयन करें ।
      2. शर्त को समायोजित करके मुख्य नियम तैयार करें: सेटिंग का चयन करके 20 मिनट का समय और 30 से 20 मिनट बदलें। ठीक हैके साथ पुष्टि करें ।
        नोट: स्टार्ट ट्रैक के लिए शर्त तब होनी चाहिए जब विषय 2 सेकंड के लिए अखाड़े में हो। इस तरह माउस के अखाड़े में होने पर सिस्टम अपने आप ट्रैकिंग शुरू कर देगा।
      3. प्रकाश उत्तेजना के लिए एक उप-नियम बनाएं: संरचनाओंपर जाएं, अधिक और उप-नियमका चयन करें।
      4. इसे प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉलजैसे नाम दें ।
      5. इसे मुख्य नियम के नीचे रखें और माउस कोर्सर के साथ नीले क्षेत्र का चयन करके दो बक्से फैलाएं।
      6. शर्तोंपर जाएं , समय और इसे 1 पर प्रकाशजैसा नाम दें ।
      7. समायोजित स्थिति 5 मिनटके बाद के साथ मुलाकात की है । ठीक हैके साथ पुष्टि करें ।
      8. बॉक्स को सीधे नियम के पीछे रखें, इसे काली रेखा पर खींचकर उप-नियम का बॉक्स शुरू करें।
      9. कार्रवाई के लिए जाओ । कस्टम हार्डवेयर और यह नाम: 1 पर प्रकाश।
      10. आउटपुट 1 उच्च के रूप में प्रदर्शन करने के लिए कार्रवाई का चयन करें और ठीक के साथ पुष्टि करें।
      11. बॉक्स को सीधे कंडीशन बॉक्स के पीछे रखें।
        नोट: अब प्रयोग के 5 मिनट के बाद प्रकाश उत्तेजना शुरू कर देना चाहिए।
      12. 5 मिनट के बाद समय की स्थिति को परिभाषित करने के लिए कदम दोहराएं और एक और 5 मिनट के बाद प्रकाश उत्तेजना को रोकने के लिए एक्शन आउटपुट 1 कम।
      13. एक और प्रकाश बंद और परीक्षण पर प्रकाश कार्यक्रम के लिए कदम फिर से दोहराएं।
      14. संरचनाओं पर जाएं । उप-नियम संदर्भ और जांच करें कि संदर्भ सही उप-नियम से संबंधित है।
      15. बिना देरी के प्रारंभ शर्तों का चयन करें और शुरू की स्थिति के अनुसार एक बार निष्पादितके रूप में शर्तों को रोकें । ठीक हैके साथ पुष्टि करें ।
      16. मुख्य नियम के एक्शन बॉक्स 1 और कंडीशन बॉक्स 2 के बीच संदर्भ बॉक्स रखें और एक्शन -स्टार्ट ट्रैक से संदर्भ तक एक लाइन खींचें।
        नोट: अब मुख्य नियम ट्रैक शुरू करने के बाद सीधे उप-नियम शुरू होता है।
    6. सिस्टम को ट्रैक करने के लिए डिटेक्शन सेटिंग्स को परिभाषित करें।
      1. डिटेक्शन सेटिंग्स पर जाएं और डिटेक्शन सेटिंग्स 1का चयन करें ।
      2. एक परीक्षण माउस को क्षेत्र में रखें और स्वचालित सेटअप का चयन करें।
      3. कृंतक को पशु प्रकार के रूप में चुनें और अखाड़े में माउस के चारों ओर एक बॉक्स आकर्षित करने के लिए माउस शापर का उपयोग करें। परिणाम ठीक की पुष्टि करें? हांके साथ सवाल ।
    7. उन सभी प्रयोगात्मक जानवरों के लिए परीक्षण सूची को परिभाषित करें जिन्हें ट्रैक किया जाना चाहिए।
      1. परीक्षण सूची में जाएं और आज रिकॉर्ड करने के लिए सभी जानवरों की योजना बनाएं: जोड़ें परीक्षणों का चयन करें और एक नंबर चुनें।
      2. हर माउस के लिए पहले परिभाषित सभी शर्तों का चयन करें।
      3. बाद में विश्लेषण को सरल बनाने के लिए पशु-आईडी और उपचार को सही ढंग से नाम दो।
        नोट: पशु आईडी प्रणाली के लिए अप्रासंगिक है और प्रयोगकर्ता द्वारा बाद में डेटा विश्लेषण के लिए केवल महत्वपूर्ण है । उपचार और नियंत्रण समूह में समूह प्रणाली के लिए महत्वपूर्ण है पता है कि कैसे समूह के लिए और कैसे बाद में कदम का विश्लेषण में सभी पटरियों की तुलना करने के लिए ।
    8. अधिग्रहण पर जाएं और प्रयोग के साथ शुरू करें।

4. ओपन फील्ड प्रयोग (चिंता)

  1. प्रयोग से ठीक पहले व्यवहार कक्ष में प्रयोगात्मक माउस लाओ चिंता का एक उचित स्तर सुनिश्चित करने के लिए ।
    नोट: व्यवहार प्रयोगों अंधेरे चरण के दौरान किया जाना चाहिए जब चूहों जाग रहे हैं, और हमेशा एक ही समय स्लॉट में तुलनीयता सुनिश्चित करने के लिए ।
  2. पिंजरे के ग्रिड पर धीरे से दबाकर प्रकाश स्रोत के लिए एक आस्तीन के माध्यम से माउस युगल ।
  3. प्रकाश केबल को स्वीकार करने के लिए 10 मिनट के लिए ताजा कूड़े के साथ एक प्रतीक्षा पिंजरे में रखें।
  4. वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर (जैसे, Ethovision XT) में स्टार्ट बटन दबाकर अधिग्रहण शुरू करें।
  5. माउस को प्रतीक्षा पिंजरे से खुले मैदान के बाएं ऊपरी कोने में स्थानांतरित करें। माउस के बजाय एक हाथ पर नज़र रखने से बचने के लिए 2 सेकंड के भीतर हाथ निकालें।
  6. प्रयोग के दौरान माउस के दृश्य क्षेत्र को छोड़ दें और शांत रहें।
  7. 20 मिनट के बाद, जब प्रयोग समाप्त हो जाता है, तो चूहे को भूलभुलैया से हटा दें, प्रकाश केबल को डिस्कनेक्ट करें और इसे वापस अपने घर के पिंजरे में डाल दें।
  8. माउस को वापस सुविधा में लाएं।

5. बार्न्स भूलभुलैया (सीखना)

  1. प्रयोग से लगभग 1 घंटे पहले व्यवहार कक्ष में सभी प्रयोगात्मक चूहों को लाएं।
  2. एक को छोड़कर सभी छेद बंद करके बार्न्स भूलभुलैया तैयार करें, जिसके तहत एक एस्केप बॉक्स रखा गया है। मंच के बीच में दफ़्ती की एक दीवार रखें, जो माउस के लिए शुरुआती क्षेत्र है।
  3. दोनों प्रत्यारोपण पर प्रकाश स्रोत (एक प्रकाश केबल पर आस्तीन) के लिए एक माउस कनेक्ट करें।
  4. माउस को सीधे कार्टन की दीवार में बार्न्स भूलभुलैया के बीच में रखें, जो प्रयोग शुरू होने से पहले माउस को इधर-उधर चलने से रोकता है।
  5. वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर (जैसे, Ethovision XT) में प्रेस शुरू करें और दफ़्ती को हटा दें।
    नोट: सॉफ्टवेयर माउस को तब तक ट्रैक करता है जब तक कि सही छेद नहीं पहुंच जाता है लेकिन यदि सॉफ्टवेयर छेद संक्रमण को नहीं पहचानता है तो मैन्युअल रूप से परीक्षण को रोकने के लिए तैयार रहें।
  6. भूलभुलैया से माउस बाहर ले लो और प्रकाश केबल के लिए कनेक्शन हटा दें।
    नोट: यदि यह माउस प्रति कई परीक्षणों के साथ एक प्रशिक्षण दिन है, तो अगले प्रशिक्षण सत्र शुरू होने तक व्यवहार कक्ष के बगल में प्रतीक्षा कक्ष में माउस छोड़ दें। यदि यह माउस प्रति केवल एक परीक्षण परीक्षण के साथ परीक्षण दिवस था, तो माउस को सुविधा में वापस लाएं।

6. डेटा विश्लेषण (4 विशिष्ट परीक्षणों के साथ उदाहरण ओपन फ़ील्ड डेटा)

  1. वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर (उदाहरण के लिए, एथोविजन एक्सटी)
    1. डेटा प्रोफाइल में प्रायोगिक समूहों और परीक्षणों को परिभाषित करें।
      1. बाईं ओर डेटा प्रोफाइल पर जाएं और इलाज बनाम नियंत्रणचुनें।
      2. बीच-बाएं नई खिड़की में नेस्टिंग पर जाएं और परीक्षण नियंत्रण स्थिति का चयन करें।
      3. तत्व कार्रवाई से राज्य अंतराल चुनें: तत्व कार्रवाई के लिए ट्रैक शुरू: प्रकाश 1 पर चला जाताहै ।
      4. फिल्टर बॉक्स उपचार और इसी परिणाम बॉक्स के बीच नेस्टिंग बॉक्स रखें।
        नोट: यह परिभाषित अंतराल Off1 है, जो प्रयोग के पहले 2.5 मिनट का वर्णन करता है जहां कोई प्रकाश उत्तेजना मौजूद नहीं है।
      5. अंतराल On1 के लिए चरणों को दोहराएं (तत्व क्रिया से: प्रकाश तत्व कार्रवाई के लिए 1 पर चला जाता है: प्रकाश 1 पर चला जाता है),ऑफ2 (तत्व कार्रवाई से: प्रकाश तत्व प्रकाश के लिए 1 बाहर चला जाता है 2 पर चला जाता है)और On2 (तत्व कार्रवाई से: प्रकाश तत्व कार्रवाई करने के लिए 2 पर चला जाता है: ट्रैक बंद करो)।
      6. नियंत्रण फ़िल्टर समूह के लिए 4 अंतराल दोहराएं.
        नोट: हर घोंसले बॉक्स नाम Off1, On1, Off2, On2 के साथ अपने स्वयं के परिणाम बॉक्स की जरूरत है । अब उपचार और नियंत्रण समूह दोनों को 4 अलग-अलग प्रकाश उत्तेजना परीक्षणों में विभाजित किया गया है जिनका अलग-अलग विश्लेषण किया जाता है।
    2. विश्लेषण प्रोफ़ाइल में विश्लेषण करने के लिए मापदंडों को परिभाषित करें।
      1. बाईं ओर विश्लेषण प्रोफाइल पर जाएं और क्षेत्रों मेंचयन करें ।
      2. ज़ोन में डिपेंडेंट वेरिएबल का चयन करें और जोन के रूप में केंद्र का चयन करें।
      3. केंद्र में डबल क्लिक करें और चयनित अंक के किसी भी चुनते है और केवल केंद्र मेंचयन करें ।
      4. विंडो छोड़ने से पहले परीक्षण सांख्यिकी में जाएं और पहले आवृत्ति, संचयी अवधि और विलंबताका चयन करें ।
      5. डिपेंडेंट वेरिएबल डिस्टेंस कोजोड़ा गया ।
        नोट: समूह सांख्यिकीमें, चुनें कि मानक त्रुटि या मानक विचलन का उपयोग त्रुटि के रूप में करना है या नहीं. इस प्रोफ़ाइल के साथ, केंद्र में बिताए गए समयके लिए डेटा, केंद्र प्रविष्टियां और कुल दूरी स्थानांतरित उपलब्ध है।
    3. डेटा निकालें
      1. परिणामों पर जाएं और सांख्यिकी और चार्टका चयन करें ।
      2. विश्लेषण किए गए डेटा को देखने के लिए प्रेस गणना करें।
        नोट: परीक्षण के आंकड़े हर एक माउस के बारे में जानकारी देता है और समूह के आंकड़े दोनों समूहों के लिए मतलब और त्रुटि का विश्लेषण करता है, इसी बार साजिश के साथ 4 परीक्षणों में विभाजित है ।
      3. निर्यात डेटा दबाएं और परीक्षण के आंकड़ों और बचाने के लिए स्थान का चयन करें।
        नोट: निर्यात किए गए डेटा को एक्सेल फ़ाइल के रूप में और हर माउस के लिए व्यक्तिगत मूल्यों के साथ सहेजा जाता है। इस एक्सेल फाइल में एनिमल आईडी चूहों की पहचान करने में मदद करती है।
      4. हीटमैप विज़ुअलाइज़ेशन पर जाएं और प्लॉट हीटमैप्स दबाएं।
      5. हर माउस और परीक्षण के लिए व्यक्तिगत हीटमैप देखने के अधिकार पर परीक्षण का चयन करें।
      6. माउस पर सही क्लिक करें और छवियों के रूप में हीटमैप्स निर्यात करें।
  2. प्लॉटिंग
    1. कंप्यूटर पर स्प्रेडशीट फ़ाइल खोलें और हर मापी गई स्थिति और समूह में सभी 4 परीक्षणों के लिए साधन और मानक त्रुटियों (एसईएम) की गणना करें।
    2. एक सांख्यिकी कार्यक्रम (जैसे, सिग्मा प्लॉट) में रेखांकन उत्पन्न करें।
      1. स्प्रेडशीट फ़ाइल से सिग्मा प्लॉट तक सही क्रम में साधनों और एसईएम की प्रतिलिपि करें। पंक्तियों में Off1, On1 आदि के लिए डेटा शामिल करना होता है और स्तंभों में परीक्षण, मतलब और एसईएम प्रमुखों के रूप में होते हैं।
      2. सभी तीन कॉलम का चयन करें और ग्राफ बनानेके लिए जाएं ।
      3. बार बॉक्स का चयन करें और त्रुटि (ऊपरी पंक्ति, तीसरा बॉक्स) के साथ असमूहित बार चुनें।
      4. एक नया ग्राफ पेज खोलने के लिए फिनिश के साथ पुष्टि करें।
      5. पूरे ग्राफ लेबल, तो घरजाओ, बाईं ओर ग्राफ बॉक्स का चयन करें और निर्यातप्रेस । एक गंतव्य फ़ोल्डर का चयन करें और प्रारूप के रूप में मेटाफाइल (*.wmf) चुनें।
        नोट: .wmf प्रारूप को बाद में कोरलड्रा जैसे ग्राफिकल सॉफ्टवेयर में संसाधित किया जा सकता है।
    3. प्राप्त आंकड़ों के लिए आंकड़ों की गणना करें।
      1. सिग्मा प्लॉट के एकल कॉलम में स्प्रेडशीट (Off1, On1 आदि) से कच्चे डेटा की प्रतिलिपि।
      2. तुलना करने और विश्लेषण करने के लिए जाने के लिए कॉलम चिह्नितकरें, टी-टेस्ट चुनें और रन दबाएं।
      3. अगले के साथ डेटा प्रारूप कच्चे की पुष्टि करें और खत्म के साथ परीक्षण चलाते हैं।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग के दौरान आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के व्यवहार में परिवर्तन को मापने के लिए है। ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर एक एडेनो संबद्ध वायरल वेक्टर के इंजेक्शन द्वारा किया जाता है। स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में प्रकाश उत्तेजना ब्याज के क्षेत्र से सीधे ऊपर एक हल्के फाइबर के प्रत्यारोपण के माध्यम से संभव है।

चित्र 4में, ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग के परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं। ChR2 के माध्यम से आईएल क्षेत्र में उत्तेजक पिरामिड न्यूरॉन्स की एक मजबूत सक्रियता खुले मैदान में चिंता से संबंधित व्यवहार में वृद्धि हुई है । ChR2 को पिरामिड न्यूरॉन्स(चित्रा 4 ए)में अभिव्यक्ति के लिए नेक्स-क्रे चूहों में एमपीएफसी के आईएल क्षेत्र में इंजेक्ट किया गया था। दो चिंता परीक्षणों के दौरान, ओपन फील्ड(चित्रा 4बी, सी)और नवीनता-दबा फीडिंग टेस्ट(चित्रा 4एफ, जी),ChR2 नीली रोशनी से उत्तेजित होता है और पिरामिड न्यूरॉन्स को सक्रिय करता है। नियंत्रण के रूप में, चूहों के एक अन्य समूह को ChR2(चित्रा 4डी, जी)के बजाय फ्लोरोफोर tdTomato का एक इंजेक्शन प्राप्त हुआ। इस तरह के प्रयोग में, चिंता उज्जवल केंद्रीय क्षेत्र के परिहार के रूप में परिभाषित किया गया है । चूहे खुले क्षेत्रों का आंतरिक परिहार दिखाते हैं क्योंकि वे शिकारियों से चिंतित हैं।

ओपन फील्ड प्रयोग में, चित्रा 4Bमें दिखाया गया है, चूहों ने प्रत्येक 5 मिनट के 4 परीक्षणों को निष्पादित किया। परीक्षणों में 1 और 3 कोई प्रकाश उत्तेजना (Off1,2) और परीक्षणों में 2 और 4, 20 हर्ट्ज (5 एमएस लाइट पल्स) और 1 मेगावाट तीव्रता के साथ नीली रोशनी उत्तेजना (On1,2) किया गया था। हीटमैप्स बताते हैं कि, प्रायोगिक समूह में, केंद्र अवधि बंद और परीक्षणों के बीच भिन्न थी। प्रकाश उत्तेजना के दौरान, चूहों अधिमानतः सीमा क्षेत्र में रहते हैं। नियंत्रण जानवरों को भी सीमा पसंद करते हैं, लेकिन प्रकाश उत्तेजना पर उनके व्यवहार को बदल नहीं है। चित्रा 4Cमें, ओपन फील्ड प्रयोग के दौरान मुख्य व्यवहार माप प्रायोगिक समूह के लिए दिखाए जाते हैं। अगर आंकड़ों ने सामान्यता के लिए शापिरो-विल्क टेस्ट पास किया तो आंकड़े एक स्वतंत्र दो पूंछ वाले टी-टेस्ट के साथ किए गए । अगर नॉर्मली टेस्ट फेल हो गया तो मान-व्हिटनी-रैंक सम टेस्ट को नॉन पैरामेट्रिक विकल्प के तौर पर इस्तेमाल किया गया । प्रयोगों के इन प्रकार के लिए, एक समूह तुलना के भीतर की जांच करने के लिए चुना गया था अगर प्रकाश उत्तेजना सीधे समय के साथ चिंता व्यवहार बदल सकते हैं, प्रयोगात्मक और नियंत्रण जानवरों की आधारभूत चिंता से स्वतंत्र । दोनों प्रकाश उत्तेजना परीक्षणों के दौरान केंद्र अवधि में काफी कमी आई, जो चिंता के स्तर में वृद्धि का संकेत है। कुल दूरी ले जाया नहीं बदला गया था, दिखा रहा है कि लोकोमोटर व्यवहार प्रभावित नहीं था । केंद्र प्रविष्टियों की संख्या में वृद्धि हुई थी, हालांकि महत्वपूर्ण नहीं है । चित्रा 4Dमें, नियंत्रण समूह का डेटा दिखाया गया है। नियंत्रण जानवरों का विश्लेषण मापदंडों में से किसी में बंद और परीक्षणों के बीच किसी भी व्यवहार परिवर्तन प्रदर्शित नहीं किया, दिखा रहा है कि प्रकाश उत्तेजना या प्रत्यारोपण मनाया प्रभाव का कारण नहीं था । संक्षेप में, इस परीक्षण ChR2 के माध्यम से आईएल पिरामिड न्यूरॉन्स की प्रकाश उत्तेजना के दौरान चिंता में वृद्धि से पता चलता है ।

चित्र 5में, एक असफल ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग का डेटा एलिवेटेड-प्लस भूलभुलैया के लिए दिखाया गया है। एलिवेटेड-प्लस भूलभुलैया प्रयोग के दौरान, जो चित्रा 5Aमें प्रस्तुत किया जाता है, चूहों ने प्रत्येक 3 मिनट के 6 परीक्षणों को पूरा किया। परीक्षणों में 1, 3 और 5 कोई प्रकाश उत्तेजना (Off1, Off2, Off3) और परीक्षणों में 2, 4 और 6, 20 हर्ट्ज (5 एमएस प्रकाश पल्स) और 1 मेगावाट तीव्रता के साथ नीली रोशनी उत्तेजना (On1, On2, On3) प्रदर्शन किया गया था । इन अनुकरणीय परिणामों में, ऑप्टोजेनेटिक प्रोटोकॉल की लंबाई और भूलभुलैया का निर्माण ट्रांसजेनिक माउस लाइन के लिए उपयुक्त नहीं था। चित्रा 5Bमें, यह देखा जा सकता है, कि कई चूहों अपनी पीठ पंजे के साथ भूलभुलैया से फिसल गया या यहां तक कि नीचे गिर गया । जब ऐसा हुआ तो चूहों को एक दिन बाद ईपीएम प्रदर्शन करने का दूसरा मौका मिला । अगर वे फिर से नीचे गिर गए तो उन्हें विश्लेषण से बाहर कर दिया गया । जब चूहों से कई बार फिसल गया, लेकिन भूलभुलैया पर रहने में कामयाब रहे, डेटा सामांय रूप से विश्लेषण किया गया । फिर भी, आंकड़ों की बहुत सावधानीपूर्वक व्याख्या की जानी चाहिए और जानवरों को नियंत्रित करने का अधिक महत्व मिलता है । नेक्स-क्रे चूहों को संकीर्ण खुली बाहों पर रहने के लिए मोटर कठिनाइयों थी । इससे बचने के लिए, 1 सेमी की ऊंचाई के साथ छोटी दीवारों ने भूलभुलैया की बाहों पर पीछे के पंजे की सुरक्षित पकड़ के लिए मदद की होगी। हीटमैप और रेखांकन दोनों बताते हैं कि प्रयोगात्मक, साथ ही चूहों को नियंत्रित करने के लिए, परीक्षण 2 (On1) से खुले हाथों से बचने के लिए शुरू कर दिया(चित्रा 5सी-ई)। खुली बाहों पर समय दोनों समूहों के लिए काफी कम हो गया है, के रूप में खुले हाथ प्रविष्टियों रहे हैं । प्रयोगात्मक समूह का विश्लेषण केवल प्रकाश उत्तेजना का एक बड़ा एक्सियोजेनिक प्रभाव फंसाने डेटा प्राप्त किया, के रूप में खुले हाथ और खुले हाथ प्रविष्टियों पर समय काफी On1 परीक्षण के दौरान कम हो रहे हैं । हालांकि, जब इस डेटा की तुलना नियंत्रण समूह से करते हैं, जो एक ही व्यवहार दिखाते हैं, तो यह स्पष्ट हो जाता है कि मनाया गया व्यवहार ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना द्वारा मध्यस्थता नहीं करता है, बल्कि भूलभुलैया की आदत के कारण सामान्य रूप से खुली बाहों से बचा जाता है। यह डेटा ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना और संभावित व्यवहार अनुकूलन द्वारा मध्यस्थता किए गए व्यवहार प्रभावों के बीच अंतर करने के लिए एक उचित नियंत्रण समूह के महत्व को रेखांकित करता है। इसके अलावा, यह डेटा विशिष्ट मूस लाइन और प्रयोगात्मक प्रश्न के अनुरूप एक प्रयोगात्मक सेटअप को ठीक से अनुकूलित करने के महत्व पर प्रकाश डालता है।

इकट्ठे हुए व्यवहार डेटा को मान्य और मजबूत करने के लिए, चूहों के दिमाग को सही इंजेक्शन और प्रत्यारोपण(चित्रा 6)के लिए नियंत्रित करने के लिए अंतिम प्रयोग के बाद हटा दिया जाता है। दिमाग 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड में तय किया जाता है और खोपड़ी से हटा दिया जाता है। दिमाग 1-2 दिनों के लिए 30% सुक्रोज में निर्जलित होते हैं और बाद में क्रायोस्लिकेटेड होते हैं। 40 माइक्रोन मोटी कोरोनल मस्तिष्क स्लाइस धोया और DAPI, जो कोशिका नाभिक दाग युक्त एक बढ़ते माध्यम के साथ सुपरफ्रॉस्ट उद्देश्य स्लाइड पर मुहिम शुरू कर रहे हैं। यह कोरोनल स्लाइस में लक्षित क्षेत्रों की पहचान करने में सक्षम बनाता है। वाईएफपी-टैग या टीडीटोमाटो का फ्लोरेसेंस ही वायरस इंजेक्शन के स्थान को इंगित करता है। चित्रा 6B में बाईं ओर ChR2-YFP की अनुकरणीय इंजेक्शन साइटें (पीला), और दाईं ओर tdTomato (लाल) प्रस्तुत किए जाते हैं। एक टेम्पलेट की मदद से, पैक्सिनोस और फ्रैंकलिन45 माउस ब्रेन एटलस से अनुकूलित, आईएल क्षेत्र की पहचान की जा सकती है। दोनों स्लाइडों में, ऑप्टोजेनेटिक उपकरण आईएल क्षेत्र में व्यक्त किया जाता है, लेकिन आसन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में भी। एक उचित व्याख्या के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों में नीली रोशनी के प्रसार8 (चित्रा 1डी, ई)से परामर्श किया जाता है। यह देखा जा सकता है कि नीली रोशनी आईएल के नीचे डीपी क्षेत्र तक पहुंचेगी, जिसमें फाइबर टिप (चित्रा 1Dमें नीली रेखा)8पर प्रारंभिक 1 एमडब्ल्यू प्रकाश तीव्रता का केवल 5% से कम होगा । इसके अतिरिक्त, प्रकाश की छोटी राशि वापस बिखरने४७के कारण पीआरएल क्षेत्र में ऊपर की ओर जा सकते हैं । नतीजतन एक कह सकते है कि आईएल क्षेत्र सबसे दृढ़ता से प्रबुद्ध है, लेकिन डीपी और पीआरएल क्षेत्र की तरह आसन्न क्षेत्रों को भी थोड़ा उत्तेजित किया जा सकता है । इसलिए, आईएल-सेल विशिष्ट उत्तेजना की गारंटी नहीं है और आसन्न क्षेत्रों का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण किया जाना चाहिए, यह देखने के लिए कि क्या पीआरएल और डीपी कोशिकाओं की गतिविधि प्रकाश के माध्यम से संग्राहक है। चित्रा 6Cमें, एक और महत्वपूर्ण नियंत्रण दिखाया गया है: नेक्स-क्रे माउस लाइन की विशिष्टता। आईएल क्षेत्र में दो सेल प्रकारों, ग्लूटाएत्जिक सिद्धांत न्यूरॉन्स और गाबार्गिक इंटरन्यूरॉन्स के खिलाफ एंटीबॉडी धुंधला के माध्यम से, यह देखा जा सकता है, कि ChR2-YFP अभिव्यक्ति केवल ग्लूटाएत्जिक न्यूरॉन्स में होती है न कि गाबेर्गिक लोगों के साथ।

कुल मिलाकर, हमारे प्रयोगों से पता चलता है कि व्यवहार परीक्षण के दौरान ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर के साथ, चिंता से संबंधित व्यवहार में परिवर्तन देखा जा सकता है। एक ही व्यवहार के लिए एक से अधिक परीक्षण का उपयोग करके, एक विश्वसनीय निष्कर्ष निकाला जा सकता है। इसके अलावा, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण प्राप्त डेटा की पुष्टि करता है। हमारे प्रयोगों से पता चलता है, कि इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स में पिरामिड न्यूरॉन्स की विशिष्ट सक्रियता ने कुछ परखों में चिंता से संबंधित व्यवहार में वृद्धि की।

Figure 4
चित्रा 4: आईएल पिरामिड न्यूरॉन्स की ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण चिंता व्यवहार को बढ़ाता है। प्रयोगों के दौरान प्रकाश उत्तेजना: 473 एनएम, 1 एमडब्ल्यू, 20 हर्ट्ज उत्तेजना। A)आईएल में ChR2-YFP या tdTomato के लिए इंजेक्शन और प्रत्यारोपण साइट की योजनाबद्ध ड्राइंग। प्रयोग के दौरान, एमपीएफसी के आईएल क्षेत्र में पिरामिड न्यूरॉन्स ChR2 द्वारा सक्रिय होते हैं। पैक्सिनोस और फ्रैंकलिन माउस ब्रेन एटलस से अनुकूलित सगिटल मस्तिष्क स्लाइस, सगिटल: पार्श्व ओ, 6. बी)प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल के साथ ओपन फील्ड भूलभुलैया (4x5 मिनट के साथ 20 मिनट बारी और परीक्षणों पर; बाएं) और अनुकरणीय ChR2 के हीट मैप्स-इंजेक्शन (EXP) और tdTomato इंजेक्शन (सीटी) चूहों प्रयोग के सभी 4 परीक्षणों में (सही) EXP जानवरों के केंद्र में कम समय बिताने जब नीले लेजर प्रकाश के साथ उत्तेजित । सीटी जानवरों के लिए, केंद्र में बिताए गए समय प्रकाश बंद और परीक्षणों के बीच अलग नहीं है । C)ओएफ में एक्सपी जानवरों के लिए समूह डेटा, n =11 । चूहों के केंद्र में काफी कम समय खर्च जब नीली रोशनी के साथ उत्तेजित (Off1 39.49±6.9 s, On1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, टी-टेस्ट, पी = 0.033, *; Off1: On2, MWRS, पी = 0,049, *) । दूरी प्रभावित नहीं हुई (Off1 2703.09±292.65 सेमी, On1 3113.±491.15 सेमी, Off2 3331.86 ±482.62 सेमी, 2 3082.17±658,61 सेमी)) । # केंद्र प्रविष्टियों के # समय के साथ कमी है, लेकिन कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखाने के लिए (बंद 1 22.36±3.78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On 13.27±2.64) । घ)ओएफ, एन = 15 में सीटी जानवरों के लिए समूह डेटा । समय चूहों के केंद्र में खर्च करते हैं, दूरी चली गई, # केंद्र प्रविष्टियों के प्रकाश पर और बंद परीक्षणों के बीच नहीं बदलता है (केंद्र Off116.73±2.65 एस, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On 23.04±2.58 s; दूरी Off1 3399.69±296.77 सेमी, On1 3210.6±446.9 सेमी, Off2 3030.28±513.83 सेमी, On2 2955±617.7 सेमी; # केंद्र प्रविष्टियों के Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±.2.5) । सीटी चूहों काफी अधिक बेसलाइन चिंता (Off1 EXP: सीटी, MWRS, पी = 0.005, **) दिखाते हैं। मानों का मतलब है±S.E.M. * महत्वपूर्ण मतभेदों (पी≤0.05) का संकेत देता है, ** महत्वपूर्ण मतभेदों (पी≤0.01) का संकेत देता है। टी-टेस्ट हमेशा दो पूंछ, MWRS: मान-व्हिटनी रैंक राशि परीक्षण; आईएल: इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स; बीएलए: बसोलेटरल एमिग्डाला; डीआरएन: पृष्ठीय राफे नाभिक; के: ओपन फील्ड; सीटी: जानवरों को नियंत्रित; EXP: प्रयोगात्मक पशु; एल: प्रकाश। इस आंकड़े को बर्ग एट अल 2019, पीएलओएवन 43 और बर्ग 201948से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: ईपीएम प्रयोग नेक्स-क्रे चूहों में व्यवहार प्रभाव दिखाने में विफल रहा। प्रयोगों के दौरान प्रकाश उत्तेजना: 473 एनएम, 1 एमडब्ल्यू, 20 हर्ट्ज उत्तेजना। A)प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल (18 मिनट, 6x3 मिनट, बारी बंद और परीक्षणों पर) के साथ ऊंचा प्लस भूलभुलैया । B)चूहों के लिए समूह डेटा है कि "बंद पर्ची" डेटा में शामिल है, कुल n = 23 । नेक्स-क्रे चूहों को प्रायोगिक समूह (बाएं) से स्वतंत्र, उनकी पीठ पंजे के साथ खुले हाथ से फिसलने की प्रवृत्ति थी। केवल चूहों कि सभी 6 परीक्षणों के लिए भूलभुलैया पर रहे बाद में विश्लेषण में विचार किया गया । पहले Off1 चरण में स्लिप बंद खुले हाथों के बाद परिहार के लिए कारण है (Off1 EXP 1.63±0.6, सीटी 2.2±0.79, Off2 +3 EXP 0.125±0.125, सीटी 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, सीटी 0.1±0.1)। पाई चार्ट (दाएं) ४२.४२% के साथ 18 मिनट के दौरान भूलभुलैया से गिरने चूहों से पता चलता है । केवल 57.57% प्रयोग समाप्त हो गया। C)प्रयोग के सभी 6 परीक्षणों में अनुकरणीय EXP और सीटी चूहों के हीट मैप्स । दोनों समूहों ऑफ1 परीक्षण के बाद खुले हाथ की अवधि में कमी दिखाते हैं । घ)ईपीएम में EXP जानवरों के लिए समूह डेटा, n = 12 । खुले हाथों में बिताए गए समय में पहले दो परीक्षणों के दौरान काफी कमी आई और लगातार बाद में (ऑफ1 73.91±12.22 एस, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, टी-टेस्ट, पी =0,041, *) । स्थानांतरित दूरी प्रभावित नहीं है (Off1 679.96±71.63 सेमी, On1 712.24±112.82 सेमी, Off2 717.49±97.39 सेमी, On2 782.51±81.11 सेमी, Off3 722.11±68.60 सेमी, On3 663.90±106.57 सेमी) । ओपन आर्म प्रविष्टियों की मात्रा ऑफ1 से ओ1 तक काफी कम हो जाती है और फिर स्थिर रहती है (Off1 8.08±1.08, 1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, 3.73±0.66. Off1: On1, टी टेस्ट, पी = 0.002, **) । ईपीएम के केंद्र में बिताया गया समय परीक्षणों के साथ कम हो जाता है लेकिन परीक्षण पर बंद से कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाता है (Off1 41.71±5.34 एस, 1 31.2±4.59 एस, ऑफ2 19.8±3.44 एस, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, 3 18.85±4.07 s) । ई)ईपीएम में सीटी जानवरों के लिए समूह डेटा, n = 11 । सीटी डेटा EXP डेटा के रूप में एक ही महत्वपूर्ण घटता है, प्रयोग का संकेत ठीक से काम नहीं किया है (खुले हाथों में समय Off1 86.92±12.74 s, On1 33.78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p=0.009, **; दूरी Off1 705.11±88.36 सेमी, On1 789.45±77.53 सेमी, बंद 2 724.74±80.49 सेमी, On2 676.57±111.99 सेमी, Off3 716.99±132.47 सेमी, On3 663.03±132.46 सेमी; ओपन आर्म प्रविष्टियां ऑफ1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.99. Off1:On1, MWRS, p =0.01, *; केंद्र में समय बिताना Off1 35.89 एस, 1 29.25±3.96 एस, ऑफ2 22.17±3.58 एस, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s) । मानों का मतलब है ± एसईएम * महत्वपूर्ण मतभेदों (पी≤0.05) का संकेत देता है, ** महत्वपूर्ण मतभेदों (पी≤0.01) का संकेत देता है। टी-टेस्ट हमेशा दो पूंछ वाला होता है, एमडब्ल्यूआरएस: मान-व्हिटनी रैंक योग परीक्षण; EPM: एलिवेटेड प्लस भूलभुलैया; सीटी: जानवरों को नियंत्रित; EXP: प्रयोगात्मक पशु; OA: खुली बाहों। इस आंकड़े को बर्ग एट अल 2019, पीएलओएवन 43 और बर्ग 201948से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: आईएल और नेक्स-क्रे विशिष्टता में ChR2 और tdTomato के इंजेक्शन पक्ष। A)एपी + 1.66 मिमी, एमएल 0.3 मिमी, डीवी -1.8 मिमी पर कोरोनेशन साइट पर प्रत्यारोपण साइट की योजनाबद्ध ड्राइंग, एकतरफा इंजेक्शन और प्रत्यारोपण के साथ (माउस ब्रेन एटलस, पैक्सिनोस और फ्रैंकलिन, ब्रेग्मा +1.54 मिमी से अनुकूलित)। B)ChR2-YFP (बाएं, पीले) और tdTomato (दाएं, लाल) के अनुकरणीय इंजेक्शन साइटों नेक्स-क्रे चूहों में DAPI दाग सेल नाभिक (नीला) के साथ विलय कर दिया । स्केल बार 1 मिमी। इनसेट आईएल क्षेत्र का उच्च आवर्धन दिखाते हैं। स्केल बार 150 माइक्रोन। सफेद बक्से इनसेट के स्थान का संकेत देते हैं। C)शीर्ष पंक्ति: एक नेक्स-क्रे माउस के बाएं आईएल क्षेत्र की कॉन्फोकल छवियां कैमकिई के साथ ग्लूटामेर्गिक न्यूरॉन्स (नीले), और ChR2-YFP (पीला) या Gad67 के लिए एक मार्कर के रूप में गैबएर्जिक न्यूरॉन्स (हरे), एक नेक्स-क्रे माउस के लिए एक मार्कर के रूप में । निचली पंक्ति: कैमकीआई (बाएं, नीले) के साथ ChR2-YFP (पीला) का कोलोकैलाइजेशन, लेकिन Gad67 (दाएं, हरे) के साथ नहीं, ग्लूटामेर्गिक न्यूरॉन्स के लिए नेक्स-क्रे चूहों की विशिष्टता दिखाता है। स्केल बार 50 माइक्रोन। पीआरएल: प्रीलिम्बिक कॉर्टेक्स; आईएल: इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स; डीपी: पृष्ठीय पेडुलर कॉर्टेक्स। इस आंकड़े को बर्ग एट अल 2019, पीएलओएवन 43 और बर्ग 201948से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

न्यूरोनल सिग्नलिंग में हेरफेर करने के लिए प्रकाश का उपयोग करना लगभग एक दशक से पसंद की विधि रही है। 2005 के बाद से, नए ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों के विकास के बारे में प्रकाशित लेखों की संख्या,4,,,,6,8,,14,,49,50, 51,51 और अध्ययन जहां मस्तिष्क सर्किट,21, 23,40,,43,52,अत्यधिक वृद्धि की जांच करने के लिए ऐसे उपकरणों का उपयोग किया,जाताहै। एक तरफ, इंजेक्शन ऑप्टोजेनेटिक टूल, इम्प्लांटेशन वेरिएंट, ट्रांसजेनिक माउस लाइनों और व्यवहार प्रयोगों की भारी विविधता के साथ, प्रयोगों के लिए संभावना कई गुना और असीमित है। दूसरी ओर, प्रयोगात्मक स्थितियों को चुनने में दोष करने की संभावना बहुत अधिक है और प्रयोग इतने विशिष्ट हैं, कि अक्सर अन्य अध्ययनों की तुलनीयता मुश्किल होती है।

महत्वपूर्ण कदम
इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण कदम उचित योजना है । ऑप्टोजेनेटिक उपकरण का चुनाव वैज्ञानिक प्रश्न से मेल र होना चाहिए। क्या केवल न्यूरॉन या सिनेप्स की समग्र गतिविधि में हेरफेर करना आवश्यक है? फिर व्यावसायिक रूप से प्रदान किए गए उपकरण जैसे ChR221,,25,,27 और आर्क37 एक अच्छा विकल्प हैं। लेकिन इसके अलावा, यदि एक विशेष न्यूरोट्रांसमीटर प्रणाली या यहां तक कि एक रिसेप्टर में हेरफेर किया जाना चाहिए, तो एक व्यक्तिगत रिसेप्टर कल्पना अक्सर बेहतर विकल्प3,,6है। जीपीसीआर के साथ कई रिसेप्टर कल्पना, तथाकथित ऑप्टो-एक्सआरएस, और उन्हें उत्पादित करने के दिशा-निर्देश पहले से ही4,,50उपलब्ध हैं। ऑप्टोजेटिक उपकरणों की पसंद के अलावा, व्यवहार प्रयोग के साथ संयोजन में माउस लाइन भी महत्वपूर्ण है। विभिन्न पृष्ठभूमि उपभेदों, उदाहरण के लिए C57Bl/6 और BALB/cByJ, कुछ मामलों में विभिन्न व्यवहार फेनोटाइप प्रदर्शित53,,54. C57Bl/6 चूहों एक कम आधारभूत चिंता है और anxiogenic हेरफेर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि BALB/cByJ उच्च चिंता का स्तर दिखाने के लिए और इसलिए अधिक anxiolytic दवाओं के प्रति संवेदनशील हैं । इसके अतिरिक्त, इन पृष्ठभूमि उपभेदों के ट्रांसजेनिक वेरिएंट भी उनके फेनोटाइप48में भिन्न हो सकते हैं। ऑप्टोजेनेटिक टूल और ट्रांसजेनिक माउस लाइन के साथ विशिष्ट प्रमोटरों के उचित संयोजन के साथ, लगभग हर वांछित सेल आबादी को लक्षित किया जा सकता है।

सर्जरी के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम सही स्थान को लक्षित कर रहा है । माउस मस्तिष्क एटलस की मदद से, पूर्वकाल-पीछे की धुरी, और मध्य-पार्श्व धुरी के लिए उचित निर्देशांक, और संरचना की गहराई45 स्थापितकी जा सकती है। असलियत में हर खोपड़ी का थोड़ा अलग रूप और आकार होता है। इस प्रकार, स्टीरियोटाटिक निर्देशांक को समायोजित करने के लिए एफ-फैक्टर46 काफी महत्वपूर्ण है, जैसा कि स्टीरियोटाटिक सर्जरी के दौरान सही नाक और कान निर्धारण है। यदि माउस का सिर झुका हुआ है, तो इंजेक्शन कैनुला ब्याज के वांछित क्षेत्र को लक्षित करने में विफल हो जाएगा।

इसके अतिरिक्त, इंजेक्शन कैनुला का व्यास भी महत्वपूर्ण है। यदि यह बहुत छोटा है, तो ऊतक में कोई वायरस जारी नहीं किया जा सकता है, यदि यह बहुत व्यापक है, तो कैनुला ब्याज के क्षेत्र में अपने रास्ते पर वायरस समाधान लीक करेगा। यदि प्रत्यारोपित ऑप्टिकल फाइबर सीधे लक्ष्य क्षेत्र से ऊपर समाप्त होता है, तो ऊपर के प्रांतस्था क्षेत्रों में वायरस अभिव्यक्ति कोई फर्क नहीं पड़ता। लेकिन अगर प्रत्यारोपण को अक्षों टर्मिनलों को प्रोत्साहित करने के लिए अन्य क्षेत्रों के ऊपर रखा जाता है, तो ऊपरी प्रांतस्था क्षेत्रों के अक्षतंप भी प्रकाश द्वारा सक्रिय किए जाएंगे और प्राप्त डेटा को हेराफेरी करेंगे। एक उदाहरण के रूप में: आईएल क्षेत्र और प्रीलिम्बिक (पीआरएल) क्षेत्र दोनों बेसल एमिग्डाला55, 56के लिए परियोजना करते हैं, लेकिन चिंता26,,,57 के मॉड्यूलेशन में पूरी तरह से अलग कार्य और भूमिकाएं हैं।57 यदि इंप्लांट को आईएल क्षेत्र से अक्षतिंक टर्मिनलों को सक्रिय करने के लिए एमिग्डाला के ऊपर रखा जाता है, और इंजेक्शन के दौरान वायरस समाधान भी गलत इंजेक्शन कैनुला के कारण पीआरएल में रखा गया था, तो पीआरएल से अक्षत टर्मिनलों को भी सक्रिय करने का खतरा बहुत अधिक होता है।

प्रत्यारोपण के निर्धारण के लिए खोपड़ी की तैयारी के दौरान, प्राइमर और बांड का विरल उपयोग एक विश्वसनीय और टिकाऊ निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है। यदि 2-घटक आसंजन प्रणाली को बारीकी से लागू नहीं किया जाता है, तो दंत सीमेंट कुछ दिनों या हफ्तों के बाद खोपड़ी से अलग हो सकता है। इसके अलावा इंप्लांट ठीक करने से पहले खोपड़ी को भी पूरी तरह से सुखा लेना पड़ता है, अन्यथा सीमेंट ठीक से खोपड़ी से अटैच नहीं होगा।

इस प्रोटोकॉल के व्यवहार भाग में महत्वपूर्ण कदम भी मौजूद हैं। सबसे पहले, भूलभुलैया का निर्माण बहुत महत्वपूर्ण है। हर व्यवहार सेटअप में, आकार और रूप के बारे में साहित्य में कई वेरिएंट मौजूद हैं, साथ ही प्रक्रिया के लिए ही58,,59,,60। एक वैरिएंट चुनना महत्वपूर्ण है जो डेटा को तुलनीय और प्रजनन योग्य बनाता है। साथ ही, उपयोग की गई माउस लाइनों के लिए विशेष आवश्यकताओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए43,48. ईपीएम के प्रतिनिधि डेटा में यह देखा जा सकता है कि कई नेक्स-क्रे चूहे भूलभुलैया से गिर गए या कई बार(चित्रा 2b)से फिसल गए। इन चूहों के लिए, खुली बाहों के चारों ओर एक छोटी दीवार के साथ एक भूलभुलैया एक बेहतर विकल्प होता ।

दूसरा, सभी बाहरी कमरे की स्थिति को स्थिररखनामहत्वपूर्ण है, अन्यथा चूहों के विभिन्न समूह बिल्कुल तुलनीय नहीं होंगे। इस संबंध में प्रयोग के समय को एक के रूप में चुनना बहुत महत्वपूर्ण है जहां प्रायोगिक सेटअप खाली है और प्रयोगकर्ता हमेशा मौजूद रहता है। इसके अलावा, निर्माण कार्य, किसी भी सिस्टम (फायर अलार्म) का परीक्षण या माउस सुविधा के सफाई दिवस जैसे भवन में होने वाली घटनाओं पर विचार किया जाना चाहिए ताकि प्राप्त डेटा के साथ हस्तक्षेप से बचा जा सके।

अंत में, व्यवहार प्रयोगों के लिए हैंडलिंग और आवास की स्थिति महत्वपूर्ण है। जब एक प्रत्यारोपण किया जाता है, तो चूहों को अन्य चूहों से चोट के जोखिम के कारण एकल घर की आवश्यकता होती है। समूहों और एक समूह के भीतर एक कम त्रुटि के बीच अच्छी तुलनीयता सुनिश्चित करने के लिए, हर माउस के लिए एक ही पिंजरे का आकार और संवर्धन की जरूरत है । चिंता से संबंधित प्रयोगों के लिए, एकल आवास के कुछ फायदे हैं क्योंकि सिंगल हाउस्ड पुरुष चूहे कम बेसलाइन चिंता का स्तर, उनकी चिंता के स्तर में कम भिन्नता, और कम अवसादग्रस्तता जैसे लक्षण15,,16दिखाते हैं। समूह रखे पुरुष चूहों दृढ़ता से चूहों के बीच पदानुक्रम की वजह से उनकी चिंता के स्तर में अलग हो सकता है । आवास के अलावा, सभी चूहों और समूहों की एक निरंतर और समान हैंडलिंग भी महत्वपूर्ण है। प्रत्यारोपण पर प्रकाश फाइबर को जोड़ने के लिए माउस हथियाने बहुत तनावपूर्ण है। इसलिए, इस प्रक्रिया को हर माउस के लिए एक ही होना चाहिए, जिसका अर्थ है एक ही तकनीक और एक ही प्रयोगकर्ता। इसके अलावा, प्रतीक्षा पिंजरे में आदत का समय, जो तनावपूर्ण कनेक्टिंग प्रक्रिया से माउस को शांत करने के लिए है, को भी भूलभुलैया में अवधि, कूड़े और स्थिति में समान शर्तों की आवश्यकता होती है। माउस सुविधा के भीतर हैंडलिंग भी बाद में व्यवहार प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है । प्रायोगिक और नियंत्रण जानवरों को विभिन्न दिनों या विभिन्न लोगों द्वारा साफ नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि यह चूहों के लिए भी तनावपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, सफाई दिवस व्यवहार में मतभेदों से बचने के लिए प्रयोगात्मक दिन नहीं होना चाहिए।

समस्या निवारण
प्रोटोकॉल के दौरान कई समस्याएं हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, स्टीरियोटाैक्टिक सर्जरी के दौरान खोपड़ी में एक पूरी ड्रिलिंग रक्त वाहिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है । आमतौर पर, मजबूत रक्तस्राव होता है, विशेष रूप से ब्रेग्मा और लैम्ब्डा के ऊपर। यदि ऐसा होता है, तो कपास की छड़ियों के साथ रक्तस्राव को रोकने की कोशिश न करें क्योंकि वे अपनी अवशोषण के कारण पोत से बाहर और भी अधिक रक्तस्राव का विस्तार करते हैं, इसके बजाय, सीधे एनएसीएल के साथ कुल्ला करें।

यह भी हो सकता है कि वायरस के घोल का प्रेशर इंजेक्शन काम नहीं कर रहा है। इस मामले में, यह हो सकता है कि पैराफिल्म, बर्र होल या मस्तिष्क ऊतक से एक पपड़ी, कैनुला की नोक को रोक रही है। इस मामले में, एक्स-या वाई-एक्सिस को बदले बिना मस्तिष्क से धीरे-धीरे कैनुला को हटा दें और कैनुला टिप के सामने के हिस्से के 1-2 मिमी को हटाने के लिए चिमटी का उपयोग करें। कैनुला को फिर से कम करने से पहले, यह देखने के लिए दबाव की थोड़ी मात्रा लागू करके कार्यक्षमता के लिए परीक्षण करें कि क्या वायरस कैनुला टिप से बाहर आता है। कब्ज से बचने के लिए, कैनुला को निरंतर गति से कम करें और इंजेक्शन पक्ष की गहरी गहराई तक पहुंचने तक आंदोलन को न रोकें। यदि कैनुला टिप का बहुत अधिक हटा दिया जाता है और व्यास बहुत बड़ा है, तो कैनुला ऊतक को नुकसान पहुंचाएगा और वायरस को एक बार में लागू करने का जोखिम बढ़ जाएगा। इस प्रकार, सुनिश्चित करें कि टिप का केवल भरा हुआ हिस्सा ध्यान से हटा दिया गया है।

व्यवहार प्रयोग के दौरान, वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर (जैसे, Ethovision XT) में प्रयोग के सेटअप से समस्याएं हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, यदि प्रकाश उत्पादन ठीक से काम नहीं कर रहा है, तो यह कई कारणों से हो सकता है। एथोविजन एक्सटी खुलने से पहले पल्सर को खोला, प्रोग्राम करना और शुरू करना होगा। हार्डवेयर को "प्रायोगिक सेटअप" (चरण 3.2.2.4) में सही ढंग से चुना जाना चाहिए। यदि गलत आईओ-बॉक्स, या "कॉस्ट्यूम हार्डवेयर" के अलावा कुछ भी चुना जाता है, तो पल्सर डिवाइस को एथोविजन द्वारा नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। यदि प्रकाश उत्पादन का परीक्षण सफल होता है, लेकिन "परीक्षण नियंत्रण सेटिंग्स" में प्रोग्राम किया गया प्रकाश प्रोटोकॉल अधिग्रहण के दौरान काम नहीं करता है, तो उप-नियम या उप-नियम संदर्भ गलत तरीके से स्थित हो सकता है या शर्तें और कार्य अस्पष्ट हैं। उदाहरण के लिए: क्या संदर्भ सही उप-नियम से संबंधित है? क्या संदर्भ को सही ढंग से प्रोग्राम किया गया है (उदाहरण के लिए, उप-नियम कितनी बार निष्पादित किया जाता है)?

इसके अतिरिक्त, ऐसा हो सकता है कि "डिटेक्शन सेटिंग्स" के दौरान जानवर को पर्याप्त रूप से ट्रैक किया जाता है, लेकिन अधिग्रहण के दौरान ऐसे नमूने होते हैं जहां विषय नहीं मिलता है। इस मामले में, जांच करें कि क्या प्रायोगिक कमरे में रोशनी बदल दी गई थी, या यदि भूलभुलैया के भीतर कुछ भी अवांछित छाया का उत्पादन किया जाता है। भूलभुलैया के पूरे नीचे एक ही रंग है, के रूप में सेटिंग केवल एक विशिष्ट संयोजन के लिए काम करेंगे । यदि जो भी कारणों से अलग नीचे रंग या छाया से बचा नहीं जा सकता है, भूलभुलैया के अंधेरे भाग में पता लगाने की सेटिंग को परिभाषित करें ।

पहले जानवरों के अधिग्रहण के बाद किसी भी सेटिंग को बदलने के लिए, पहले से उपयोग की गई सेटिंग्स में इन परिवर्तनों को लागू न करें। उन्हें समायोजित करने के लिए उन्हें डुप्लिकेट करें। इसका यह भी मतलब है कि पहले से दर्ज परीक्षण डेटा विश्लेषण के लिए अब मान्य नहीं है। ऐसे मामले में, मूल सेटिंग्स के साथ इस प्रयोगात्मक समूह के लिए सभी जानवरों को रिकॉर्ड करें, और बाद में एक नया प्रयोग बनाएं जहां लाइव ट्रैकिंग के बजाय रिकॉर्ड किए गए वीडियो का विश्लेषण किया जाता है। इस "वीडियो से" प्रयोग में, जानवरों या यहां तक कि डेटा के बीच तुलनीयता खोने के बिना विश्लेषण के लिए कई सेटिंग्स का उपयोग किया जा सकता है।

सीमाएं और भविष्य के अनुप्रयोग
स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ व्यवहार में हेरफेर करने की इस विधि में भी सीमाएं शामिल हैं। सर्जरी के दौरान, दो प्रत्यारोपण की निकटता प्रतिबंधित है। डबल प्रत्यारोपण के लिए, दो प्रत्यारोपण के बीच की दूरी कम से कम प्रत्यारोपण पकड़ उपकरण की चौड़ाई होना चाहिए। उपकरण को बर्र होल में दूसरे प्रत्यारोपण को कम करने की जरूरत है, जबकि पहले प्रत्यारोपण पहले से ही तय है। इसके लिए एक समाधान एक कोणित प्रत्यारोपण हो सकता है, जहां ग्लास फाइबर की युक्तियां बहुत करीब हो सकती हैं जबकि खोपड़ी के ऊपर सिरेमिक फेर्यूल्स की बड़ी दूरी23,,55,,56,57,62, 63,63है।,, कोण प्रत्यारोपण का नुकसान प्रकाश फैल रहा है। जब फाइबर टिप के बजाय सीधे ऊपर से तिरछा है, उत्तेजित क्षेत्र अलग है । निकटता में दो लक्षित क्षेत्रों के मामले में, प्रकाश उत्तेजना की बदली हुई स्थिति पर विचार करने की आवश्यकता है।

व्यवहार प्रयोग के दौरान, भूलभुलैया का निर्माण जानवर से जुड़े ऑप्टिकल केबल के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। कुछ व्यवहार परीक्षण, जैसे कि प्रकाश-डार्क बॉक्स, एक इनडोर क्षेत्र64,65,और अन्य भूलभुलैया में ऐसे डिब्बे होते हैं जिन्हें माउस में प्रवेश करने की आवश्यकता होती है।, इस सेटअप के साथ इस तरह के प्रयोग नहीं किए जा सकते। वैकल्पिक रूप से, एक वायरलेस सिस्टम एक विकल्प22,26,,66हो सकता है।, लेकिन सौभाग्य से कुछ भूलभुलैया, जैसे बार्न्स भूलभुलैया, इस तरह से व्यवस्थित किया जा सकता है, कि चूहों को प्रासंगिक डिब्बों में प्रवेश करने में सक्षम हैं67।

बंद क्षेत्रों के साथ उन लोगों के अलावा, भूलभुलैया है कि बहुत व्यापक है भी समस्याओं का कारण बन सकता है । भूलभुलैया का क्षेत्रफल जितना बड़ा होगा, केबल को जानवर को भूलभुलैया में हर स्थिति में जाने की अनुमति नुसार होना चाहिए। देखभाल करनी होगी कि जानवर केबल पर कदम न रख सके और न ही उसे पकड़ कर काट सके। इसके लिए एक समाधान एक निर्माण हो सकता है जो अनावश्यक केबल को रोल करता है। एक नुकसान यह है कि केबल को अनरोल करने के लिए ड्रैग चूहों के लिए कठिन है। यह समाधान चूहों के लिए बेहतर अनुकूल होगा। प्रयोग के दौरान प्रकाश उत्तेजना के बजाय, एक अन्य संभव विकल्प पहले से प्रकाश उत्तेजना करना हो सकता है, निश्चित रूप से यह केवल संभव है यदि प्रकाश उत्तेजना के कारण दीर्घकालिक प्रभाव23होता है।

मौजूदा/वैकल्पिक तरीकों की तुलना
वैकल्पिक तरीके 8,18व्यवहार केदौरानरासायनिक या विद्युत उत्तेजना होंगे । रासायनिक एगोनिस्ट या विरोधी विशिष्ट रिसेप्टर्स के माध्यम से न्यूरॉन्स को सक्रिय या शांत करने में सक्षम होते हैं और एकल न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम38,68में भी हेरफेर कर सकते हैं । एक तरफ, रिसेप्टर-विशिष्टता रसायनों के लिए काफी अधिक है, क्योंकि विशिष्ट एगोनिस्ट या विरोधी केवल कुछ रिसेप्टर्स39को सक्रिय करते हैं। दूसरी ओर, एक ही न्यूरोट्रांसमीटर समूह के रिसेप्टर उपप्रकारों के लिए विशिष्टता अक्सर अपर्याप्त होती है। अधिकांश रसायन विभिन्न संभावनाओं69के साथ कम से कम दो उप-प्रकारों से बांधते हैं। इसके अतिरिक्त, रसायन न्यूरोनल सेल प्रकारों के बीच अंतर नहीं कर सकते हैं जब तक कि उनके पास एक ही रिसेप्टर प्रकार होते हैं। इसके अलावा, ऑप्टोजेनेटिक्स की तुलना में रासायनिक जोड़तोड़ के लिए लौकिक और स्थानिक संकल्प खराब है। अगोनिस्ट या विरोधी अक्सर मौखिक रूप से35 या प्रणालीगत इंजेक्शन57,70के माध्यम से प्रशासित होते हैं। यदि रसायन का अर्क सीधे मस्तिष्क के ऊतकों में किया जाता है, तो प्रभाव मौखिक अनुप्रयोगों की तुलना में तेजी से दिखाई देता है, लेकिन फिर भी प्रकाश उत्तेजना की तुलना में धीमी टाइमस्केल पर। प्रशासित रसायनों के रूप में मस्तिष्क में फैलाना और न्यूरोनल प्रकार या मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए विशिष्ट नहीं हैं, विशिष्ट मस्तिष्क circuitries के हेरफेर यह संभव नहीं है।

विद्युत उत्तेजना में रासायनिक उत्तेजना9,14की तुलना में अधिक लौकिक संकल्प होता है . न्यूरोनल ऊतक में भीतर का प्रसार रासायनिक उत्तेजना की तुलना में कम होता है और स्थानिक संकल्प रासायनिक उत्तेजना की तुलना में बेहतर होता है। हालांकि, विद्युत उत्तेजना में विशेष रूप से विभिन्न न्यूरोनल सेल प्रकार या रिसेप्टर प्रकारों को संबोधित करने की संभावना का अभाव है, क्योंकि इलेक्ट्रोड के निकट हर न्यूरॉन विद्युत उत्तेजना का जवाब देगा।

स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में व्यवहार के लिए वैकल्पिक तरीके उदाहरण के लिए मस्तिष्क स्लाइस में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग हैं, जहां एकल न्यूरॉन्स या एक्सोन को ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ संग्राहक किया जा सकता है और इलेक्ट्रोड6,,71रिकॉर्डिंग के माध्यम से अमृत प्रभाव मापा जा सकता है। इन विट्रो प्रयोग ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजनाओं के आणविक और सेलुलर आधार की जांच करने की संभावना प्रदान करते हैं लेकिन यह सीमा है कि आंतरिक कनेक्टिविटी और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से इनपुट गायब है। एक अन्य विकल्प यह है कि वे मल्टीफोटोजन इमेजिंग1,72के साथ ऑप्टोजेनेटिक का उपयोग करें . इस मामले में, चूहों ने अपना सिर ठीक किया है और सरल कार्यों को हल करने के लिए एनेस्थेटाइज्ड किया जा सकता है या जाग सकता है।

एक सफल ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग करने के लिए, आजकल उपकरणों और अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध है। विशिष्ट शोध प्रश्नों के उत्तर देने के लिए ऑप्टोजेनेटिक टूल्स और व्यवहार सेट-अप का चयन महत्वपूर्ण है। यदि उपकरणों और प्रयोगों का सही संयोजन चुना जाता है, तो ऑप्टोजेनेटिक्स उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ न्यूरोनल सर्किटरी की अभूतपूर्व, गहराई से जांच की अनुमति देता है। यह मनोरोग रोगों और अनुभूति के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियों को समझने और विकसित करने में मदद करेगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

कृपया नेक्स-क्रे चूहों को उपलब्ध कराने के लिए प्रो क्लाऊस-आर्मिन नार्वे और डॉ सैंड्रा गोएबल्स (मैक्स-प्लैंक-इंस्टीट्यूट ऑफ एक्सपेरिमेंटल मेडिसिन, गोएटिंगेन, जर्मनी) को बहुत धन्यवाद। इसके अलावा, हम इस लेख के लिए जोवे वीडियो की रिकॉर्डिंग और प्रसंस्करण के लिए हमारी वीडियो-टीम यूनुस डिकी और रूबेन विस्नर का शुक्रिया अदा करते हैं। इसके अलावा, क्रिस्टिन क्लासेन को उसकी आवाज-ओवर और किम्बर्ली ऐनी गो के लिए पांडुलिपि के प्रूफरीडिंग के लिए बहुत धन्यवाद।

प्रस्तुत परिणाम बोचम में रूर-विश्वविद्यालय में प्राप्त किए गए थे और वीडियो ब्रेमेन विश्वविद्यालय में दर्ज किया गया था ।

इस काम को ड्यूश फोर्स्चुंग्सगेमेन्चाफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) द्वारा वित्त पोषित किया गया था - प्रोजेक्टनम 122679504 - एसएफबी 874 और डीएफजी एमए 4692/3-2।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamin Sigma-Aldrich K2753-64 Anestasia
20 % Glucose AlleMan Pharma Injection s.c. for fast recovery
Behavioral mazes Costum made Measure anxiety
Bepanthen Bayer Ophthalmic oinment
Betaisodona Monodipharma Sterilant containing iodine
Betaisodona Monodipharma Iodine oinment
Binocular Olympus SZ52, 110AL0.62x WD160 Surgery
Ceramic ferrules Thorlabs CFLC230-10 Implant
Ceramic Fiber Scribe Thorlabs CSW12.5 Cutting of the glass fiber
Channelrhodopsin2-YFP virus Penn Vector Core Addgene 20298 Optogenetic tool
Compressed air Kontakt Chemie Druckluft 67 Drying of the skull
Coordinate system Stoelting Stereotactic coordinates for the surgery
Correl Draw Graphical software version 13
Cryoslicer MICROM HM500OM Production of brain slices for staining
Ethovision XT 14 Noldus Software for behavioral tracking
Exel Statistical Software
Ferrule Polishing Puck Thorlabs D50-F Polishing implants round side
Fiber Patch Cord dual Prizmatix Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation
Fiber Patch Cord single Prizmatix Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm Cable, which is connected with the implant via a sleeve
Fiber Stripping Tool Thorlabs T06S13 Stripping glass fiber for implant
Filter paper VWR European 516-0300 Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test
Food pellets Mühle Levers Höveler Nagerfutter Nutrition for the mice
Glass pipettes Harvard Apparatus GC150-10 Injection pipettes
Gradia direct-Flo Henry Schein 103322 Fluid dental cementum
Heating lamp efbe-Schott/Phillips R95E Prevent the mice from cooling after the surgery
Heating plate Stoelting Integrated into coordinate system
Injection canula Braun 100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20 All injections and to bore hole into the skull
Litter T 1350 Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test
Mouse cages Zoonlab 405 cm^2 Single housing for experiments
Optibond FL Kerr 26684E Preparation of the skull for implantation
Optical glass fiber Thorlabs FT200EMT Light fiber for implant
Optogenetics-LED.STSI Prizmatix Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R Perfusion of mice to remove the brains
Polishing sheet 0.02 µm grit Thorlabs LFCF Polishing implants round side
Polishing sheet 1 µm grit Thorlabs LF1D Polishing implants round side
Polishing sheet 30 µm grit Thorlabs LF30D Polishing implants round side
Polishing sheet 6 µm grit Thorlabs LF6D Polishing implants round side
Pulser Software Prizmatix Software for light device control
Rimadyl-Carprofen Zoetis Analgesia
Sigma Plot Software for statistics
Sleeve Thorlabs FT200EMT Connection of implant and light cable
SodiumCloride (NaCl) Braun 3570410 Rinsing of the skull
Superglue Pattex Henkel To Fix the glass fiber in the ferrule
td-Tomato virus Penn Vector Core Addgene 51503 Optogenetic tool
UV light KoQGHJ wireless, 1200 mW/cm^2 Polymeration lamp for dental cementum
Xylavet-Xylazin cp pharma Anesthesia

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Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. … More

Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (164), e61023, doi:10.3791/61023 (2020).

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