Manipulación optogenética de la actividad neuronal para modular el comportamiento en ratones que se mueven libremente

Summary

Con la manipulación optogenética de poblaciones neuronales específicas o regiones cerebrales, el comportamiento se puede modificar con alta resolución temporal y espacial en animales en movimiento libre. Mediante el uso de diferentes herramientas optogenéticas en combinación con fibras ópticas implantadas crónicamente, se puede realizar una variedad de modulaciones neuronales y pruebas de comportamiento.

Abstract

La modulación optogenética de los circuitos neuronales en ratones que se mueven libremente afecta el comportamiento agudo y a largo plazo. Este método es capaz de realizar manipulaciones de neuronas individuales y liberación de transmisor específico de la región, hasta circuitos neuronales enteros en el sistema nervioso central, y permite la medición directa de los resultados conductuales. Las neuronas expresan herramientas optogenéticas a través de una inyección de vectores virales que llevan el ADN de elección, como Channelrhodopsin2 (ChR2). La luz se introduce en regiones cerebrales específicas a través de implantes ópticos crónicos que terminan directamente por encima de la región objetivo. Después de dos semanas de recuperación y expresión de herramienta adecuada, los ratones se pueden utilizar repetidamente para pruebas conductuales con estimulación optogenética de las neuronas de interés.

La modulación optogenética tiene una alta resolución temporal y espacial que se puede lograr con alta especificidad celular, en comparación con los métodos comúnmente utilizados, como la estimulación química o eléctrica. La luz no daña el tejido neuronal y por lo tanto se puede utilizar para experimentos a largo plazo, así como para múltiples experimentos de comportamiento en un ratón. Las posibilidades de las herramientas optogenéticas son casi ilimitadas y permiten la activación o silenciamiento de neuronas enteras, o incluso la manipulación de un tipo de receptor específico por la luz.

Los resultados de tales experimentos conductuales con estimulación optogenética integrada visualizan directamente los cambios en el comportamiento causados por la manipulación. El comportamiento del mismo animal sin estimulación lumítica como línea de base es un buen control para los cambios inducidos. Esto permite una descripción detallada de los tipos neuronales o sistemas de neurotransmisores implicados en comportamientos específicos, como la ansiedad. La plasticidad de las redes neuronales también se puede investigar con gran detalle a través de la estimulación a largo plazo o observaciones conductuales después de la estimulación óptica. La optogenética ayudará a iluminar la señalización neuronal en varios tipos de enfermedades neurológicas.

Introduction

La modulación de los circuitos neuronales en el sistema nervioso central y sus resultados conductuales son importantes para entender cómo funciona el cerebro, especialmente en enfermedades psiquiátricas y tareas cognitivas como el aprendizaje y la memoria. Con la optogenética, las células individuales o las poblaciones celulares hasta circuitos enteros pueden ser moduladas por la luz. Las herramientas optogenéticas comunes como Channelrhodopsin2 (ChR2) o Archaerhodopsin (Arch) son capaces de activar o silenciar las neuronas, o aumentar o inhibir la liberación del transmisor en terminales de axón que se proyectan a regiones cerebrales distintas^1,,2,,3,,4. Sin embargo, Arch debe utilizarse cuidadosamente, ya que se demostró que su activación en terminales presinápticos aumenta la liberación espontánea del transmisor^5. Arch es una bomba de protones rectificadora hacia afuera que cambia el valor de pH dentro de la célula. Este ambiente alcalino induce la afluencia de calcio y mejora la liberación del transmisor⁵. Para modular específicamente las vías de señalización intracelular, se pueden crear quimeras receptoras compuestas por una herramienta optogenética activable ligera, como rhodopsin o cono opsin, junto con un receptor acoplado adecuada a la proteína G,^6,7,8. La cantidad y variación de las herramientas optogenéticas disponibles ha aumentado significativamente durante la última década⁹.

El propósito de la optogenética es manipular los circuitos neuronales durante el comportamiento. La optogenética permite, por ejemplo, la medición de cambios agudos de comportamiento, como cambios en el comportamiento de ansiedad. Las herramientas optogenéticas se entregan en las regiones diana del cerebro a través de vectores virales. Con la ayuda de promotores y potenciadores especiales, o el sistema Cre-loxP, se puede garantizar la especificidad del tipo de célula para la expresión de herramientas optogenéticas(Figura 1A). Hay varias líneas de ratón modificadas genéticamente que expresan la enzima Cre-Recombinase en tipos celulares específicos solamente. Por ejemplo, los ratones Nex-Cre expresan la Cre-Recombinase en neuronas piramidales en la corteza y el hipocampo bajo el control del Nex-promotor^10. Esta enzima es capaz de invertir secuencias de ADN, que están flanqueadas por lados loxP¹¹. En consecuencia, la secuencia de ADN de una herramienta optogenética de doble hilo uterino, que está invertida y flanqueada por lados loxP, sólo puede ser transcrita por neuronas que poseen la Cre-Recombinase,pero no por otros tipos neuronales^12,,13. En el caso de los ratones Nex-Cre, la herramienta optogenética se expresará únicamente en neuronas piramidales. La estimulación lumítica de ciertas regiones cerebrales se logra a través de la implantación crónica de fibras ópticas directamente por encima de la región de interés. Los animales pueden entonces ser acoplados a una fuente de luz adecuada y comportarse libremente en casi todo tipo de pruebas de comportamiento.

Figura 1: Inyección e implantación. A) Sistema Cre-loxP para ChR2-YFP. La herramienta optogenética de doble floxado se embala en un virus asociado al adeno (AAV) para inyección en el tejido cerebral. B) Vista sagitular de la inyección e implantación del virus de una interfaz neuronal óptica dentro/por encima de la región IL del mPFC. La inyección y la implantación se realizaron desde arriba. Se muestran todas las regiones de interés, IL, BLA y DRN. C) Vista detallada de la fibra óptica implantada, manguito y fuente de luz. D) Difusión de la estimulación de la luz láser azul y roja en el tejido cerebral de materia gris a partir de una fibra de luz de 200 m (Yizhar et al. 2011). La luz azul se extiende, como máximo, 0,5 mm en el tejido, luz roja de aproximadamente 1 mm. Codificación de color: rojo 50%, amarillo 10%, verde 5%, azul 1% si la luz llega a esta área. E) Vista coronal de la implantación unilateral directamente por encima de la IL izquierda con una fibra óptica de 200 m. La región IL tiene una anchura de 0,25 mm en cada hemisferio y una profundidad de 0,2 mm. Las bombillas azules y rojas son la placa de 5% de propagación de luz y se transfieren de Yizhar et al al al tamaño correcto. LoxP: locus de X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: proteína fluorescente amarilla; dflox: doble floxado; IL: corteza inmórbida; BLA: amígdala basolateral; DRN: núcleos de raphe dorsal; PrL: región prelímpico. Esta cifra ha sido modificada de Berg 2019⁴⁸. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se utilizan enfoques optogenéticos, ya que permite una alta resolución temporal y espacial¹⁴ y una modulación específica del tipo de celda. Además, es posible utilizar repetitivamente el dispositivo implantado sin tratamiento adicional. Después de una cirugía estereotáctica, donde se realiza la inyección de un virus adeno-asociado que lleva la herramienta optogenética y la implantación de la fibra óptica, los ratones pueden recuperarse durante dos semanas. Hemos elegido un tiempo de recuperación de sólo 2 semanas, porque este es el tiempo suficiente para recuperarse de la cirugía y para que el virus se exprese. Como los experimentos conductuales son seguidos por inmunohistoquímica, tenemos que asegurarnos de que los ratones no se envejezcas demasiado durante el experimento; de lo contrario, la calidad del tejido disminuye. No muestran impedimentos de comportamiento evidentes del implante y se involucran en el comportamiento típico de la jaula. Por supuesto, la implantación se acompaña de una lesión quirúrgica significativa; por lo tanto, los ratones son monitoreados intensivamente. Después de la cirugía, los ratones necesitan ser alojados en un solo lugar, ya que los ratones alojados en grupo tienden a herirse a las heridas e implantes frescos de los demás. Sin embargo, las condiciones de la vivienda tienen un gran impacto en el nivel de ansiedad de los ratones machos, ya que los ratones de una sola casa muestran niveles de ansiedad más bajos¹⁵ y en general síntomas menos depresivos¹⁶.

La manipulación química o eléctrica de los circuitos cerebrales carece de la alta especificidad del tipo celular de la optogenética y tiene una resolución temporal y espacial más baja^14,17,18. Dependiendo de la pregunta experimental, la estimulación eléctrica o química puede tener diferentes ventajas. Cuando también es necesario estimular los terminales de fibra en una región específica, la estimulación eléctrica es el mejor método. La estimulación química es una buena opción para cuando los receptores específicos del transmisor en toda una región deben ser activados por agonistas. Otra gran ventaja de la optogenética en comparación con la estimulación química o eléctrica es que endógenamente, las neuronas no son sensibles a la luz, lo que evita la aparición de efectos secundarios¹⁹. De hecho, altas intensidades de luz pueden inducir efectos de calentamiento^8,20, pero debido a los grupos de control adecuados, los efectos conductuales debido a la manipulación optogenética pueden ser eliminados.

La investigación del comportamiento de los roedores, especialmente en lo que respecta a las enfermedades psiquiátricas, ha mejorado considerablemente con la optogenética en animales que se mueven libremente, ya que permite la modulación directa de receptores individuales hasta poblaciones celulares específicas²¹ y circuitos²². La posibilidad de medir los efectos agudos de tales modulaciones, así como los efectos conductuales a largo plazo después de un tiempo definido²³ o después de la estimulación crónica²⁴, permite una amplia flexibilidad de los diseños experimentales y proporciona información muy detallada sobre los circuitos cerebrales. La estimulación de la luz se puede utilizar para modular las neuronas situadas en el lugar de inyección de la herramienta optogenética. Cuando tanto la inyección como la implantación abordan la misma región cerebral, los cuerpos celulares y los axones que se proyectan de principios de neuronas e interneuronas en esta región pueden dirigirse^{a 3,,6,,8.} Sin embargo, la fibra ligera también se puede implantar en una región diferente de la inyectada. En este caso, la estimulación de la luz puede modular la liberación del transmisor en terminales de axón en áreas de proyección de la región inyectada^25,26,27.

En el estudio aquí, optogenética se utiliza en combinación con experimentos para analizar el comportamiento relacionado con la ansiedad. Las enfermedades psiquiátricas relacionadas con la ansiedad afectan a más de un tercio de la población mundial^28,29,30 y causan una alta carga económica³¹. Los afectados sufren de una sensación de excitación, tensión y preocupación seguida de comportamiento de evasión^32,,33. Estas emociones negativas de origen crónico, que se centran principalmente en eventos futuros^34,interfieren fuertemente con la vida diaria de los pacientes. Tratamientos comunes como benzodiazepinas o inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRS) sólo son exitosos en algunos de los pacientes. Una gran cantidad de personas no responden al tratamiento en los³⁵años, lo que demuestra que el mecanismo subyacente a tales enfermedades aún no se entiende completamente. La corteza prefrontal medial (mPFC) es conocida por desempeñar un papel importante en el desarrollo y manifestación de la ansiedad^{21,,25,27,36,37,38}. Específicamente, la sobreactivación de la región de la corteza infralimbia (IL) en el mPFC podría ser parte de trastornos relacionados con la ansiedad^39,,40. El experimento de ejemplo descrito aquí podría ayudar a entender cómo las modulaciones en la región IL del mPFC influyen en el comportamiento de ansiedad. Además, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para enfermedades psiquiátricas relacionadas con la ansiedad también puede ser apoyado potencialmente.

Los ratones Nex-Cre macho de 2-6 meses de edad se utilizan para expresar ChR2 específicamente en neuronas piramidales dentro de la región IL del mPFC⁴¹. Los ratones Nex-Cre tienen un fondo C57Bl/6 y expresan la enzima Cre-recombinase específicamente en las neuronas piramidales. Durante una cirugía estereotáctica, se inyecta ADN ChR2 de doble flox en la región de IL a través de vectores virales asociados con adeno. El implante óptico se coloca directamente encima de la región de interés (Figura 1B) y el implante se fija con cemento dental. Los animales de control reciben una inyección de tdTomato-DNA de doble flox en la misma región para imitar la expresión específica de la célula.

Los animales son alojados en grupo hasta el día de la cirugía y después son alojados en una sola casa para evitar lesiones de otros ratones. Los ratones se alojan en bastidores individuales de jaula ventilada (IVC) en jaulas TypI-L para ratones de una sola casa. El ciclo luz-oscuridad sigue un ritmo de 12:12 h, la fase de luz a partir de las 10 AM. Todos los experimentos conductuales se realizan en la fase oscura, que se asemeja a la fase activa de los roedores. El agua y los pellets de alimentos estándar están disponibles ad libitum. Después de dos semanas de recuperación, lo que garantiza una expresión suficiente de ChR2 en las neuronas piramidales, los ratones se utilizan para experimentos conductuales.

El Campo Abierto (OF) es un laberinto cuadrado de 50 cm x 50 cm con paredes de 40 cm de altura. El suelo se divide en 16 cuadrados donde el interior 4 representa el centro. El comportamiento medido es: 1) tiempo invertido en el centro, 2) número de entradas centrales y 3) distancia total movida. Durante este experimento, hay 4 ensayos que suman 20 minutos. En los ensayos 1 y 3, no se produce estimulación lumínica, y en los ensayos 2 y 4, se realiza una estimulación de 20 Hz con pulso de luz de 5 ms y 1 mW de intensidad de luz de 473 nm (Figura 2A). En los ensayos posteriores, se tuvo en cuenta la habituación en el área de prueba, pero el uso de animales de control inyectados falsas indican cómo se expresa la habituación.

El Laberinto de Barnes es un experimento para el aprendizaje y la memoria. Es una plataforma circular de 92 cm de diámetro y contiene 20 agujeros equidistantes alrededor de la circunferencia. 19 de los agujeros están cerrados y debajo de un agujero se presenta una caja de escape. Durante 4 días consecutivos, los ratones tienen 4 ensayos de entrenamiento para aprender la ubicación de la caja de escape. El día 5, se retira la caja^de escape, y se prueba a los ratones en cuanto a cuánto tiempo necesitan encontrar el agujero correcto. El comportamiento medido es: 1) Tiempo hasta que se encuentre el cuadro de escape/agujero correcto, 2) Número de visitas y errores de destino, y 3) Distancia movida hasta que se encuentre en el cuadro de escape. La estimulación lumítica en diferentes grupos se realiza ya sea durante la adquisición o consolidación, que tienen lugar en los días de entrenamiento 1-4, o durante la recuperación el día de la prueba, que es el día 5 (Figura 2D).

Figura 2: Experimentos conductuales con protocolos optogenéticos. A) Dibujo esquemático del experimento Campo Abierto con el protocolo de estimulación de luz correspondiente. C) Dibujo esquemático del experimento Elevated-Plus Maze con el protocolo de estimulación de la luz correspondiente. D) Dibujo esquemático del experimento Barnes Maze con el protocolo de estimulación de la luz correspondiente. EPM: Laberinto Elevado-Plus; OF: Campo abierto; BM: Prueba de laberinto de Barnes. Esta cifra ha sido modificada de Berg 2019⁴⁸. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para la estimulación optogenética, la intensidad y frecuencia de la luz deben adaptarse a la herramienta optogenética y al tipo neuronal que se está investigando. La menor intensidad lumínica posible debe utilizarse para evitar daños en el tejido, ya que varios estudios han demostrado que hay posibles efectos de calentamiento debido a la intensidad de la luz fuerte^8,20. Para ChR2, una estimulación de 20 Hz con un pulso de luz de 5 ms se utiliza comúnmente². Como ChR2 es bastante sensible a la luz, la intensidad de la luz de 1 mW es suficiente. El protocolo de estimulación de la luz alterna entre la luz apagada y los ensayos para medir directamente los cambios de comportamiento. Las condiciones externas de la habitación para los experimentos conductuales deben permanecer estables para todo el grupo de animales. Las condiciones importantes a tener en cuenta son el ruido (tenga en cuenta que los propios dispositivos pueden hacer ruido), el olor (limpiar siempre las configuraciones de comportamiento con etanol), la intensidad de la luz y el experimentador. El experimentador siempre debe ser la misma persona. Además, la hora del día de los experimentos debe ser la misma para todos los animales de un grupo, se prefiere unas horas después del inicio de la fase oscura en la instalación.

El objetivo de este experimento es aumentar la relación excitación/inhibición (E/I) en la región de IL a través de una fuerte activación de las neuronas piramidales excitatorias. Una relación E/I mejorada en esta región especial de la corteza se sabe para aumentar los niveles de ansiedad en ratones^40,42,43,44.

Protocol

Los procedimientos con sujetos animales han sido aprobados por el centro institucional de investigación animal y el "Senatorin f'r Wissenschaft, Gesundheit und Verbraucherschutz" en la Universidad de Bremen (#146)

1. Preparación del implante óptico⁹ (Figura 1C)

1. Coloque una férula de cerámica plana hacia arriba en una visera de banco.
2. Pelar la capa de una fibra de vidrio de 200 m de diámetro con una herramienta de desprendimiento de fibra y cortar piezas de 2-3 cm de largo con un escriba de fibra de cerámica.
3. Coloque la pieza de fibra de vidrio en la férula de cerámica con un voladizo uniforme en ambos lados.
4. Coloque una gota de superpegamento en el lado plano de la férula de cerámica con una cánula de inyección.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
5. Saque el preimplantato de la visera del banco y, en el lado redondo de la férula de cerámica, corte la fibra de vidrio lo más corta posible con el escriba de fibra de cerámica.
6. Colocar el preimplante en un disco de pulido de férula y pulir el lado redondo en 4 papeles de pulido diferentes, dibujando un ocho 20 veces por papel (grano de 30 m, grano de 6 m, grano de 1 m y grano de 0,02 m).
7. Saque el preimplantato del disco de pulido de la férula y corte la fibra de vidrio en el lado plano de la férula de cerámica a la longitud necesaria para la implantación. Comience a medir la longitud detrás del superpegamento que sobresale.
   1. Para una superficie de corte uniforme sólo arañar la fibra de vidrio 2-3 veces y luego romperlo.
      NOTA: Utilice el atlas cerebral del ratón de Paxinos y Franklin⁴⁵ para calcular la longitud del implante. El implante debe terminar directamente por encima de la región de interés y el grosor del cráneo debe incluirse en el cálculo de la longitud. Para estimular la región il, la fibra de vidrio tiene una longitud de 1,8 mm(Figura 3).

Figura 3: Atlas cerebral de ratón (Paxinos y Franklin) con longitud representativa del implante para llegar a la región il. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

8. Desinfecte el implante terminado durante 10 minutos en etanol y déjelo secar al aire antes de la implantación.

2. Inyección e implantación

1. Transportar un solo ratón a la sala quirúrgica y pesarlo. Aplicar anestesia con una inyección intraperitoneal (i.p.) de ketamina/xiazina (Ketamina 0,12 mg/g, Xylazine 0,01 mg/g).
   1. Fije el ratón con la mano izquierda y gire en su espalda con la cabeza baja.
   2. Apunte al cuadrante inferior izquierdo del abdomen con la jeringa y entre en la cánula inyectable 1 cm debajo de la piel.
   3. Inyectar anestesia en un movimiento lento y constante en la cavidad abdominal.
   4. Coloque el ratón de nuevo en su jaula y espere hasta que alcance un estado profundo de anestesia.
      NOTA: La profundidad de la anestesia se puede determinar por la ausencia de reflejos parpadeantes y entre los dedos de los dedos.
2. Coloque el ratón sobre una placa calefactora y fije la cabeza en un marco estereotáctico. Fijar la nariz y los dientes en la parte delantera, y las orejas en ambos lados.
   NOTA: La cabeza debe ser recta en el eje izquierdo-derecho y rostral-caudal para asegurar las coordenadas estereotácticas correctas.
3. Aplicar analgesia con 2 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea en la parte posterior del ratón y aplicar un pomada ocular opaca en ambos ojos para protegerlos del secado.
4. Humedezca el cabello del cuero cabelludo con una toalla de papel húmeda y luego córtelo con tijeras. Asegúrese de quitar todo el cabello suelto con la toalla de papel mojada. Para desinfectar el cuero cabelludo, utilice un palo de algodón y tome 0,5 ml de una tintura que contenga yodo (Betaisodona 100 mg/ml de yodo Povidon y 11 mg/ml de yodo) y déjelo secar al aire.
   NOTA: En lugar de tijeras, también se puede utilizar un clipper eléctrico para la depilación adecuada.
5. Levante el cuero cabelludo por encima de la región de interés con una pinza y corte 1 cm a lo largo de la línea media. Usa dos pinzas para empujar la piel a un lado para exponer el cráneo. Asegúrese de eliminar también la piel delgada por encima del cráneo y deje que el cráneo expuesto se seque.
6. Desbaste el cráneo para su posterior implantación.
   1. Aplicar una gota de ácido fosfórico de 2 mm x 2 mm (37%) del kit adhesivo (por ejemplo, Optibond) en el cráneo, distribuirlo con la punta de la jeringa y dejar que surta efecto durante 15 s.
   2. Retire todo el ácido con un palo de algodón y enjuague el cráneo con 1 ml de 0,9% de NaCl dos veces.
   3. Seque el cráneo con un palo de algodón y aire comprimido.
      Precaución: El ácido fosfórico es peligroso y debe eliminarse por completo para evitar daños en los tejidos.
7. Calcule el factor F para coordenadas individuales.
   1. Coloque una cánula de vidrio en el marco estereotáctico y localícela directamente sobre el bregma.
   2. Cero el sistema de coordenadas y mover la cánula de vidrio a lambda.
   3. Calcule el factor F⁴⁶ con la siguiente fórmula:
      
   4. Multiplique el Factor F con las coordenadas del atlas cerebral del ratón para ajustarlos al ratón individual.
8. Perforar un agujero en el cráneo para la inyección.
   1. Utilice las coordenadas ajustadas para encontrar la ubicación en el cráneo directamente por encima de la estructura de interés y márquela usando la punta de una cánula de inyección rascándola por encima de la superficie ósea.
   2. Utilice la cánula de inyección para perforar un agujero en el cráneo en la ubicación marcada girando la cánula en el lugar. Si sale sangre del orificio de la rebaba, enjuague con 1 ml de 0,9% de NaCl y seque el cráneo después.
9. Tome la solución de virus en la cánula de vidrio.
   1. Coloque una gota de 100 l de 0,9% de NaCl sobre el cráneo y un trozo de parafilmar (1 cm x 1 cm) en la parte superior, lado estéril hacia arriba.
   2. Colocar 1-2 l de solución de virus en el parafilm y bajar la punta de la cánula de vidrio en ella.
   3. Conecte la cánula de vidrio a una jeringa, aplique una presión negativa mínima y espere hasta que la cánula tome la solución antivirus (en cuestión de segundos).
      NOTA: Es importante detener la aplicación de presión negativa, antes de que el aire se recoja en la cánula. Por lo tanto, siempre habrá un pequeño remanente de la solución de virus.
10. Inyecte la solución de virus en la región de interés.
    1. Coloque la cánula de vidrio llena de virus por encima del orificio de la rebaba.
    2. Baje lentamente la cánula en el agujero de la rebaba y cero la coordenada z cuando la punta de la cánula esté al nivel del cráneo.
    3. Baje la cánula cuidadosamente a la posición más baja del lugar de inyección.
    4. Enfoque el binocular en el menisco de la solución del virus dentro de la cánula.
    5. Aplique una pequeña cantidad de presión positiva con la jeringa hasta que el menisco se reduzca marginalmente.
    6. Deje que el virus se propague durante 2-3 minutos antes de mover la cánula de vidrio hacia arriba a la siguiente posición.
    7. Aplicar la solución de virus cada 200-300 m en toda la región de interés.
    8. Retire la cánula de vidrio muy lentamente y deséchela después de la inyección final.
11. Prepare el cráneo para su implantación con el kit de adhesión (por ejemplo, Optibond^TMFL).
    1. Seque el cráneo con aire comprimido.
    2. Aplicar 5 l de imprimación (p. ej., Optibond, 1-30% (etanol, ácido silícico, glicenizsfatdimetrilato, 2-(2-(Methacryloyloxy)ethoxycarbonyl)benzoes-ure, 2-Hydroxyethylmethacrylat)) con el palo correspondiente y dejar secar durante 15 s.
    3. Aplicar 5 l de unión (p. ej., Optibond, 15-20% 2-Hidroxietilometacrilato + 1-2% Alkalihexafluorosilikat(Na)) con el mismo palo y curarlo durante 20 s con luz UV (420-480 nm).
       NOTA: Es esencial que el cráneo esté seco y que la imprimación y el enlace se apliquen en una capa muy delgada.
       Precaución: No mire directamente a la luz UV, ya que la luz UV puede dañar los ojos.
12. Coloque el implante directamente encima de la región de interés.
    1. Fije el implante en el soporte correspondiente.
    2. Seque el cráneo con aire comprimido.
    3. Coloque la punta de la fibra de vidrio directamente por encima del orificio de la rebaba y baje con cuidado.
    4. Deja de bajar el implante cuando el bulbo restante de superpegamento toque el cráneo. ¡No ejerza presión sobre el cráneo!
       NOTA: Si la inyección y la implantación se están realizando en diferentes regiones (por ejemplo, raphe dorsal e hipocampo),taladre todos los orificios necesarios después de aplicar ácido fosfórico, pero antes de la adhesión de 2 componentes, siga las instrucciones descritas anteriormente (paso 2.8-2.14).
13. Arregla el implante.
    1. Compruebe si el cráneo aún está completamente seco.
    2. Aplicar cemento dental líquido (p. ej., Gradia direct flo) alrededor del implante y en el área circundante y curar durante 20 s con luz UV (420-480 nm).
       NOTA: La cantidad de cemento dental depende de la zona libre del cráneo. Todo el cráneo debe estar cubierto por cemento dental.
    3. Aplique dos capas más de cemento y llene completamente el área del cráneo libre y seca. Curar cada capa con luz UV (420-480 nm).
14. Termina la cirugía.
    1. Aplicar 0,5 g de pomada de yodo (Betaisodona 100 mg/ml de yodo povidona y 11 mg/ml de yodo) en toda la herida.
    2. Inyectar 0,1 ml de glucosa disuelta en 0,9% de NaCl por vía subcutánea en el cuello para una rápida recuperación.
    3. Suelte la nariz y la fijación del oído, lleve el ratón a una jaula fresca y colóquelo debajo de una lámpara de calentamiento para evitar la pérdida de calor corporal.
    4. Cuando el ratón se despierte, tráelo de vuelta a la instalación.
    5. Compruebe su estado de salud al menos una vez al día. Tome las medidas apropiadas si los ratones muestran alguna constitución incorrecta (por ejemplo, asegúrese de que la analgesia postoperatoria con Carprofeno hasta 3 días si los ratones muestran algún signo de dolor).
       NOTA: Después de dos semanas de recuperación, los ratones se pueden utilizar para experimentos de comportamiento.

3. Creación de un nuevo experimento (ejemplo de estimulación ChR2 y campo abierto)

1. Emisor
   1. Programe el pulsador (p. ej., Prizmatix) para la estimulación de la luz.
   2. Abra el software y seleccione el puerto COM USB en el que está conectada la fuente de luz.
   3. Seleccione Seleccionar modo de operación (3) Ejecute la secuencia de pulsos después del disparador HIGH y, a continuación, deténgase cuando LOW permita que un software externo controle la fuente de luz.
   4. Programe el protocolo de luz. Para una estimulación de 20 Hz con pulso de luz de 5 ms: elija TI a 23 ms, P1D a 5 ms, P1I a 22 ms y P2D a 0 ms.
   5. Pulse Iniciar secuencia. Este estado permanecerá hasta que finalicen los experimentos.
      NOTA: El software del pulsador (Prizmatix Pulser) debe iniciarse antes del software de seguimiento de vídeo; de lo contrario, el software de seguimiento de vídeo no podrá reconocer el dispositivo.
2. Software de seguimiento de vídeo (por ejemplo, Ethovision XT)
   1. Cree un nuevo experimento a partir de una plantilla predefinida.
      1. Abra el software, vaya a Archivo, elija Nuevo en Plantilla. Seleccione Aplicar una plantilla predefinida.
      2. Elija Seguimiento en vivo y seleccione la cámara pulsando en Fuente y confirme el Basler GenICam conectado.
         NOTA: La imagen en vivo de la cámara ahora se mostrará en la ventana de la parte superior derecha.
      3. Pulse Siguiente y elija el animal que se debe grabar (Roedores, Ratón).
      4. Pulse Siguiente y seleccione la plantilla de arena Campo abierto, cuadrado. Seleccione la plantilla de zona Centro, Borde, Esquinas y confirme con Siguiente.
      5. Confirme 1 asunto que debe ser rastreado con Siguiente.
      6. Seleccione Punto central, punto de nariz y cola-base y confirme el color del animal en comparación con el fondo como más oscuro con Siguiente.
      7. Confirme la frecuencia de muestreo recomendada de 12,5 con Siguiente y termine el paso.
      8. Asigne el nombre apropiado al experimento y elija una ubicación para guardar.
   2. Defina los ajustes experimentales.
      1. Vaya a Configuración y configuración experimental. Elija Detección de punto central, punto de nariz y base de cola como entidades de seguimiento.
      2. Seleccione Uso del hardware de control de prueba y vaya a Configuración.
      3. Seleccione Noldus USB-IO box y confirme con Ok.
      4. Elija el hardware personalizado como tipo de dispositivo en el puerto TTL, que se ha conectado al dispositivo del pulsador, y confirme con ok.
   3. Defina la configuración de la arena.
      1. Ve a Configuración de arena y selecciona Configuración de arena 1.
         NOTA: La cámara ahora abrirá automáticamente una imagen de fondo.
      2. Confirme la imagen con Grab.
      3. Adapta las zonas predefinidas a la arena real cambiando su tamaño. Utilice la flecha y los dos símbolos a su derecha. Si algunas zonas no son necesarias, elimínelas.
      4. Pulse 1. Dibuja Escala para Calibrar y tira de una línea de una esquina del laberinto a la otra. Introduzca la longitud de la distancia real en cm.
      5. Repita eso para el otro eje.
   4. Compruebe si la estimulación de la luz está funcionando.
      1. Vaya a Arena - Asignación de hardware y seleccione Probar en la barra gris.
      2. Seleccione Salida de comando 1 Alta y pulse Probar.
         NOTA: Debe haber luz emitiendo desde el extremo de la fibra óptica. Al seleccionar Salida 1 Baja y Prueba,la estimulación debe detenerse.
   5. Defina la configuración del control de prueba durante 20 minutos de experimento. Establezca las pruebas Off1, On1, Off2 y On2 en cada una de 5 minutos de duración.
      1. Vaya a Configuración de control de prueba y seleccione Duración de la pista 30 minutos.
      2. Prepare la regla principal ajustando la Condición: Tiempo a 20 minutos seleccionando Ajustes y cambie de 30 a 20 minutos. Confirme con Ok.
         NOTA: La condición para la pista de inicio debe ser cuando el sujeto está en la arena durante 2 segundos. De esta manera el sistema iniciará automáticamente el seguimiento cuando el ratón esté en la arena.
      3. Crear una subreberción para la estimulación de la luz: Ir a Estructuras, más y seleccione Subreberción.
      4. Asigne un nombre como el protocolo de estimulación de la luz.
      5. Colóquelo debajo de la regla principal y extienda las dos casillas seleccionando el área azul con el rodillo del ratón.
      6. Ir a Condiciones, Tiempo y darle un nombre como luz en 1.
      7. Ajustar Condición se cumple después de 5 minutos. Confirme con Ok.
      8. Coloque la caja directamente detrás del cuadro Inicio de regla de la subreberción tirando de ella a la línea negra.
      9. Ir a Acción Hardware personalizado y asígnelo el nombre: luz ON 1.
      10. Seleccione Acción para realizar como Salida 1 Alta y confirme con Ok.
      11. Coloque la caja directamente detrás del cuadro Condición.
          NOTA: Ahora, después de 5 minutos del experimento, la estimulación de la luz debe comenzar.
      12. Repita los pasos para definir la condición de tiempo Después de 5 minutos y la acción Salida 1 Baja para detener la estimulación de la luz después de otros 5 minutos.
      13. Repita los pasos de nuevo para programar otra luz apagada y ligera En prueba.
      14. Ir a Estructuras ( Structures) Referencia de subreberción y compruebe que la referencia pertenece a la subreberción correcta.
      15. Elija Condiciones de inicio como sin demora y Detener condiciones como Ejecutar una vez por condición de inicio. Confirme con Ok.
      16. Coloque el cuadro de referencia entre el cuadro de acción 1 y el cuadro de condición 2 de la regla principal y dibuje una línea desde Acción - iniciar pista a la Referencia.
          NOTA: Ahora la regla principal inicia directamente la subreberción después de iniciar la pista.
   6. Defina los ajustes de detección para mostrar el sistema de lo que debe rastrear.
      1. Vaya a Configuración de detección y seleccione Configuración de detección 1.
      2. Coloque un ratón de prueba en la arena y seleccione Configuración automatizada.
      3. Elige Rodent como tipo de animal y usa el cursor del ratón para dibujar un cuadro alrededor del ratón en la arena. Confirme la pregunta Resultados OK? con Sí.
   7. Defina la lista de prueba para todos los animales experimentales que deben ser rastreados.
      1. Vaya a la lista de pruebas y planifique todos los animales para grabar hoy: seleccione Agregar pruebas y seleccione un número.
      2. Seleccione todas las condiciones definidas antes para cada ratón.
      3. Asigne correctamente el nombre Animal-ID y el tratamiento para simplificar el análisis.
         NOTA: El ID animal es irrelevante para el sistema y sólo es importante para el análisis posterior de datos por parte del experimentador. La agrupación en el grupo Tratamiento y Control es importante para que el sistema sepa cómo agrupar y cómo comparar todas las pistas en pasos posteriores de análisis.
   8. Vaya a Adquisición y comience con el experimento.

4. Experimento de campo abierto (ansiedad)

1. Lleve el ratón experimental a la sala de comportamiento justo antes del experimento para asegurar un nivel adecuado de ansiedad.
   NOTA: Los experimentos conductuales deben realizarse durante la fase oscura cuando los ratones están despiertos, y siempre en la misma franja horaria para garantizar la comparabilidad.
2. Acote el ratón a través de una funda a la fuente de luz presionándolo suavemente sobre la rejilla de la jaula.
3. Colóquelo en una jaula de espera con arena fresca durante 10 minutos para aclimatarse al cable de luz.
4. Inicie la adquisición pulsando el botón Inicio en el software de seguimiento de vídeo (por ejemplo, Ethovision XT).
5. Transfiera el ratón de la jaula de espera a la esquina superior izquierda del campo abierto. Retire el brazo en 2 segundos para evitar rastrear un brazo en lugar del ratón.
6. Deje el campo visual del ratón durante el experimento y mantenga la calma.
7. Después de 20 minutos, cuando termine el experimento, retire el ratón del laberinto, desconecte el cable de luz y vuelva a colocarlo en su jaula de origen.
8. Traiga el ratón de vuelta a la instalación.

5. Barnes Maze (aprendizaje)

1. Lleve todos los ratones experimentales a la sala de comportamiento alrededor de 1 hora antes del experimento.
2. Prepara el Laberinto de Barnes cerrando todos los agujeros excepto uno, bajo el cual se coloca una caja de escape. Coloque una pared de cartón en el centro de la plataforma, que es el área de partida para el ratón.
3. Conecte un ratón a la fuente de luz (manguito en un cable de luz) en ambos implantes.
4. Coloque el ratón directamente en el centro del laberinto de Barnes en la pared de cartón, lo que impide que el ratón corra antes de que comience el experimento.
5. Pulse Iniciar en el software de seguimiento de vídeo (por ejemplo, Ethovision XT) y retire la caja.
   NOTA: El software realiza un seguimiento del ratón hasta que se alcance el agujero correcto, pero esté preparado para detener la prueba manualmente en caso de que el software no reconozca la transición del agujero.
6. Saque el ratón del laberinto y retire la conexión al cable de luz.
   NOTA: Si se trata de un día de entrenamiento con varias pruebas por ratón, deje el ratón en la sala de espera junto a la sala de comportamiento hasta que comience la siguiente sesión de entrenamiento. Si este fue el día de prueba con solo una prueba de prueba por ratón, traiga el ratón de vuelta a la instalación.

6. Análisis de datos (Ejemplo de datos de campo abierto con 4 ensayos distinguibles)

1. Software de seguimiento de vídeo (por ejemplo, Ethovision XT)
   1. Defina los grupos experimentales y los ensayos en el perfil de datos.
      1. Vaya a Perfiles de datos a la izquierda y elija Tratado frente a Control.
      2. Vaya a Anidamiento en la nueva ventana en el centro izquierdo y seleccione Estado de control de prueba.
      3. Elija el intervalo de estado de la acción del elemento: iniciar la pista a la acción del elemento: la luz va ON 1.
      4. Coloque el cuadro Anidación entre el cuadro Filtro y el cuadro de resultados correspondiente.
         NOTA: Este intervalo definido es Off1, que describe los primeros 2,5 minutos del experimento en los que no hay estimulación lumítica.
      5. Repita los pasos para los intervalos On1 (desde el elemento Acción: la luz se enciende 1 al elemento Acción: la luz se apaga 1), Off2 (desde el elemento Acción: la luz se apaga 1 a la luz del elemento se enciende 2) y On2 (desde el elemento Acción: la luz se enciende 2 al elemento Acción: detener pista).
      6. Repita los 4 intervalos para el grupo de filtros de control.
         NOTA: Cada caja de anidamiento necesita su propio cuadro de resultado con los nombres Off1, On1, Off2, On2. Ahora tanto el grupo de tratamiento como el de control se dividen en 4 ensayos de estimulación lumídicos diferentes que se analizan por separado.
   2. Defina los parámetros que se analizarán en el perfil de análisis.
      1. Vaya a Perfiles de análisis a la izquierda y seleccione En zonas.
      2. Seleccione la variable dependiente en la zona y seleccione Centro como zona.
      3. Haga doble clic en En el centro y elija cualquiera de los puntos seleccionados y seleccione sólo en el centro.
      4. Antes de salir de la ventana, vaya a Estadísticas de prueba y seleccione Frecuencia, Duración acumulativa y Latencia en primer lugar.
      5. Agregue la distancia variable dependiente movida.
         NOTA: En Estadísticas de grupo, elija si desea utilizar el error estándar o la desviación estándar como error. Con este perfil, los datos de Tiempo invertido en el centro,Entradas de centro y Distancia total movida están disponibles.
   3. Extraer datos
      1. Vaya a Resultados y seleccione Estadísticas y gráficos.
      2. Pulse Calcular para ver los datos analizados.
         NOTA: Las estadísticas de prueba proporcionan información sobre cada ratón y estadísticas de grupo analiza la media y el error para ambos grupos, divididos en 4 ensayos con la gráfica de barras correspondiente.
      3. Pulse Exportar datos y seleccione las estadísticas de prueba y la ubicación que desea guardar.
         NOTA: Los datos exportados se guardan como un archivo de Excel y con valores individuales para cada ratón. En este archivo de Excel, el ID de animal ayuda a identificar los ratones.
      4. Vaya a Visualización de mapas de calor y pulse Trazar mapas de calor.
      5. Seleccione Pruebas a la derecha para ver mapas de calor individuales para cada ratón y prueba.
      6. Haga clic con el botón derecho en el ratón y exporte mapas de calor como imágenes.
2. Trazado
   1. Abra el archivo de hoja de cálculo en el ordenador y calcule los medios y los errores estándar (SEM) para los 4 ensayos en cada condición y grupo medidos.
   2. Generar gráficos en un programa de estadísticas (por ejemplo, Sigma Plot).
      1. Copie los medios y seM en el orden correcto desde el archivo de hoja de cálculo a Sigma Plot. Las filas tienen que contener los datos de Off1, On1, etc. y las columnas contienen trial, mean y SEM como cabezas.
      2. Seleccione las tres columnas y vaya a Crear gráfico.
      3. Seleccione el cuadro Barra y elija barras no agrupadas con error (fila superior, tercer cuadro).
      4. Confirme con Finalizar para abrir una nueva página de gráfico.
      5. Etiquete todo el gráfico, luego vaya a Inicio, seleccione el cuadro Gráfico a la izquierda y presione Exportar. Seleccione una carpeta de destino y elija MetaFile (*.wmf) como formato.
         NOTA: El formato .wmf se puede procesar más adelante en un software gráfico como CorelDraw.
   3. Calcular estadísticas para los datos obtenidos.
      1. Copie los datos sin procesar de la hoja de cálculo (Off1, On1, etc.) en columnas individuales de Sigma Plot.
      2. Marque las columnas para comparar y vaya a Análisis, elija t-test y pulse Ejecutar.
      3. Confirme el formato de datos Raw con Next y ejecute la prueba con Finish.

Representative Results

El objetivo de este protocolo es medir los cambios en el comportamiento de los ratones modificados genéticamente durante un experimento optogenético. La manipulación optogenética se realiza mediante la inyección de un vector viral asociado a adeno. La estimulación de la luz en ratones que se mueven libremente es posible mediante la implantación de una fibra ligera directamente por encima de la región de interés.

En la Figura 4,se presentan los resultados de un experimento optogenético. Una fuerte activación de las neuronas piramidales excitatorias en la región de IL a través de ChR2 aumentó el comportamiento relacionado con la ansiedad en el campo abierto. ChR2 se inyectó en la región IL del mPFC en ratones Nex-Cre para su expresión en neuronas piramidales (Figura 4A). Durante dos pruebas de ansiedad, el Campo Abierto (Figura 4B,C) y la prueba de alimentación suprimida por la novedad (Figura 4F, G), ChR2 se estimula con luz azul y activa las neuronas piramidales. Como control, otro grupo de ratones recibió una inyección del fluoróforo tdTomato en lugar de ChR2 (Figura 4D,G). En tal experimento, la ansiedad se define como la evitación de la zona central más brillante. Los ratones muestran una evitación intrínseca de las áreas abiertas porque están ansiosos por los depredadores.

En el experimento Campo abierto, que se muestra en la Figura 4B,los ratones ejecutaron 4 ensayos de 5 minutos cada uno. En los ensayos 1 y 3 no se produjo estimulación lumínica (Off1,2) y en los ensayos 2 y 4, se realizó estimulación de luz azul con 20 Hz (pulso de luz de 5 ms) y 1 mW (On1,2). Los mapas de calor muestran que, en el grupo experimental, la duración del centro difería entre los ensayos Off y On. Durante la estimulación de la luz, los ratones permanecen preferentemente en la zona fronteriza. Los animales de control también prefieren la frontera, pero no cambian su comportamiento en la estimulación de la luz. En la Figura 4C,se muestran las principales mediciones de comportamiento durante el experimento Campo Abierto para el grupo experimental. Si los datos pasaron la prueba Shapiro-Wilk para la normalidad, las estadísticas se hicieron con una prueba t independiente de dos colas. Si la prueba de normalidad falló, la prueba Mann-Whitney-Rank Sum se utilizó como alternativa no paramétrica. Para este tipo de experimentos, se eligió una comparación dentro del grupo para investigar si la estimulación de la luz puede cambiar directamente el comportamiento de ansiedad con el tiempo, independientemente de la ansiedad basal de los animales experimentales y de control. La duración del centro disminuyó significativamente durante ambos ensayos de estimulación de la luz, lo que indica un aumento de los niveles de ansiedad. La distancia total movida no se alteró, lo que demuestra que el comportamiento locomotor no se vio afectado. El número de entradas de centro se incrementó, aunque no significativamente. En la Figura 4D,se muestran los datos del grupo de control. Los animales de control no mostraron ningún cambio de comportamiento entre los ensayos Off y On en ninguno de los parámetros analizados, lo que demuestra que la estimulación o implantación de la luz no causó los efectos observados. En resumen, esta prueba muestra aumento de la ansiedad durante la estimulación ligera de las neuronas piramidales IL a través de ChR2.

En la Figura 5, los datos de un experimento optogenético sin éxito se muestran para el Laberinto Elevado-Plus. Durante el experimento Elevated-Plus Maze, que se presenta en la Figura 5A,los ratones completaron 6 ensayos de 3 minutos cada uno. En los ensayos 1, 3 y 5 no se realizó estimulación lumínica (Off1, Off2, Off3) y en los ensayos 2, 4 y 6, se realizó estimulación de luz azul con 20 Hz (pulso de luz de 5 ms) y 1 mW de intensidad (On1, On2, On3). En estos resultados ejemplares, la longitud del protocolo optogenético y la construcción del laberinto en sí no eran adecuados para la línea de ratón transgénico. En la Figura 5B,se puede ver, que varios ratones se deslizaron del laberinto con sus patas traseras o incluso se cayeron. Cuando esto sucedió, los ratones tienen una segunda oportunidad de realizar el EPM un día después. Si se caían de nuevo, fueron excluidos del análisis. Cuando los ratones se deslizó varias veces, pero lograron permanecer en el laberinto, los datos se analizaron normalmente. Sin embargo, los datos tienen que ser interpretados con mucho cuidado y controlar a los animales obtener una mayor importancia. Los ratones Nex-Cre tenían dificultades motoras para permanecer en los brazos estrechos abiertos. Para evitar esto, pequeñas paredes, con una altura de 1 cm, habrían ayudado a una sujeción segura de las patas traseras en los brazos del laberinto. Tanto los mapas de calor como los gráficos muestran que los ratones experimentales, así como los ratones de control, comenzaron a evitar los brazos abiertos del ensayo 2 (On1) en(Figura 5C-E). El tiempo en los brazos abiertos se reduce significativamente para ambos grupos, al igual que las entradas del brazo abierto. El análisis del grupo experimental sólo obtuvo datos que implican un gran efecto ansiogénico de la estimulación de la luz, ya que el tiempo en el brazo abierto y las entradas del brazo abierto disminuyen significativamente durante el ensayo On1. Sin embargo, al comparar estos datos con el grupo de control, que muestran el mismo comportamiento, queda claro que el comportamiento observado no está mediado por la estimulación optogenética, sino por la evitación de los brazos abiertos en general debido a la habituación al laberinto. Estos datos subrayan la importancia de un grupo de control adecuado para distinguir entre los efectos conductuales mediados por la estimulación optogenética y la posible adaptación conductual. Además, estos datos arrojan luz sobre la importancia de adaptar adecuadamente una configuración experimental para adaptarse a la línea de mousse específica y la pregunta experimental.

Para validar y fortalecer los datos de comportamiento recopilados, los cerebros de los ratones se eliminan después del último experimento para controlar la inyección e implantación correctas (Figura 6). Los cerebros se fijan en un 4% de paraformaldehído y se extraen del cráneo. Los cerebros se deshidratan en 30% de sacarosa durante 1-2 días y se crion después. Las rebanadas cerebrales coronales de 40 m de espesor se lavan y montan en diapositivas objetivos de superfrost con un medio de montaje que contiene DAPI, que mancha los núcleos celulares. Esto permite la identificación de áreas objetivo en las rodajas coronales. La fluorescencia de la etiqueta YFP o tdTomato indica la ubicación de la inyección de virus. En la Figura 6B se presentan los sitios ejemplares de inyección de ChR2-YFP a la izquierda (amarillo) y tdTomato a la derecha (rojo). Con la ayuda de una plantilla, adaptada del atlas cerebral de ratón Paxinos y Franklin^45, se puede identificar la región IL. En ambas diapositivas, la herramienta optogenética se expresa en la región IL, pero también en las regiones cerebrales adyacentes. Para una interpretación adecuada, se consulta la propagación de la luz azul en el tejido cerebral⁸ (Figura 1D,E). Se puede ver que la luz azul alcanzará la región DP por debajo de la IL con sólo menos del 5% de la intensidad de luz inicial de 1 mW en la punta de fibra (línea azul en la figura 1D)⁸. Además, una pequeña cantidad de luz puede ir hacia arriba a la región prL debido a la dispersión posterior⁴⁷. En consecuencia, se puede decir que la región de IL está iluminada con mayor fuerza, sin embargo, las regiones adyacentes como el PD y la región prL también pueden ser ligeramente estimuladas. Por lo tanto, la estimulación específica de las células IL no está garantizada y se debe realizar un análisis inmunohistoquímico de las regiones adyacentes, para ver si la actividad de las células PrL y DP se modula a través de la luz. En la Figura 6C, se muestra otro control importante: la especificidad de la línea del ratón Nex-Cre. A través de la tinción de anticuerpos contra los dos tipos de células en la región de IL, las neuronas de principio glutamatérgica e interneuronas GABAérgicas, se puede ver, que la expresión ChR2-YFP sólo se produce en las neuronas glutamatérgicas y no con las GABAérgicas.

Con todo, nuestros experimentos muestran que con la manipulación optogenética durante las pruebas de comportamiento, se podrían observar cambios en el comportamiento relacionado con la ansiedad. Mediante el uso de más de una prueba para el mismo comportamiento, se puede extraer una conclusión confiable. Además, el análisis inmunohistoquímico confirma los datos obtenidos. Nuestros experimentos sugieren.que la activación específica de las neuronas piramidales en la corteza infralimbica aumentó el comportamiento relacionado con la ansiedad en ciertos ensayos.

Figura 4: La activación optogenética de las neuronas piramidales IL aumenta el comportamiento de ansiedad. Estimulación lumítica durante los experimentos: 473 nm, 1 mW, estimulación de 20 Hz. A) Dibujo esquemático del lugar de inyección e implantación para ChR2-YFP o tdTomato en la IL. Durante el experimento, las neuronas piramidales en la región IL del mPFC son activadas por ChR2. Rebanadas cerebrales saggital adaptadas del atlas cerebral de ratón Paxinos y Franklin, saggital: lateral o,6. B) laberinto de campo abierto con protocolo de estimulación de la luz (20 min con 4x5 min alternando Off y On trials; left) y mapas de calor de ratones ejemplares ChR2-injected(EXP) y tdTomato-injected (CT) en los 4 ensayos del experimento (derecha). Los animales EXP pasan menos tiempo en el centro de la OF cuando se estimulan con luz láser azul. Para los animales con TC, el tiempo que pasa en el centro no difiere entre los ensayos light Off y On. C) Datos de grupo para animales EXP en el OF, n.o 11. Los ratones pasan mucho menos tiempo en el centro de la OF cuando se estimulan con luz azul (Off1 39.49±6.9 s, On1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p á 0.033, *; Off1:On2, MWRS, p-0,049, *). La distancia movida no se ve afectada (Off1 2703.09±292.65 cm, On1 3113.4±491.15 cm, Off2 3331.86 ±482.62 cm, On2 3082.17±658,61 cm). Las entradas del centro disminuyen con el tiempo, pero no muestran diferencias significativas (Off 1 22.36±3.78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D) Datos de grupo para animales CT en el OF, n.o 15. Tiempo que los ratones pasan en el centro de la OF, la distancia movida, el número de entradas centrales no cambia entre las pruebas de encendido y apagado de luz (Tiempo en el centro Off116.73±2.65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Distancia 1 3399.69±296.77 cm, On1 3210.6±446.9 cm, Off2 3030.28±513.83 cm, On2 2955±617.7 cm; N.o de entradas centrales Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). Los ratones con TC muestran una ansiedad basal significativamente mayor (Off1 EXP:CT, MWRS, p-0.005, **). Los valores son medios±S.E.M. * indican diferencias significativas (p≤0.05), ** indican diferencias significativas (p≤0.01). t-test siempre de dos colas, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum prueba; IL: corteza inmórbida; BLA: amígdala basolateral; DRN: núcleos de raphe dorsal; OF: Campo abierto; TC: animales de control; EXP: animal experimental; L: luz. Esta cifra ha sido modificada de Berg et al. 2019, PLoS One⁴³ y de Berg 2019⁴⁸. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: El experimento EPM no mostró efectos conductuales en ratones Nex-Cre. Estimulación lumítica durante los experimentos: 473 nm, 1 mW, estimulación de 20 Hz. A) Laberinto Elevado-Plus con protocolo de estimulación de la luz (18 min, 6x3 min, alternando Off y En ensayos). B) Los datos de grupo para los ratones que "se deslizan" se incluyen en los datos, total n.o 23. Los ratones Nex-Cre tenían una tendencia a deslizarse del brazo abierto con sus patas traseras, independientemente del grupo experimental (izquierda). Sólo los ratones que se quedaron en el laberinto durante los 6 ensayos fueron considerados en análisis posteriores. Slip off's en la primera fase Off1 son razones para evitar más tarde los brazos abiertos (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Gráfico circular (derecha) muestra ratones cayendo desde el laberinto durante los 18 min con 42.42%. Sólo el 57,57% terminó el experimento. C) Mapas de calor de ratones EXP y CT ejemplares en los 6 ensayos del experimento. Ambos grupos muestran una disminución en la duración del brazo abierto después de la prueba Off1. D) Datos de grupo para animales EXP en el EPM, n.o 12. El tiempo dedicado a los brazos abiertos disminuyó significativamente durante las dos primeras pruebas y constantemente después (Off1 73.91±12.22 s, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p-0,041, *). La distancia movida no se ve afectada (Off1 679.96±71.63 cm, On1 712.24±112.82 cm, Off2 717.49±97.39 cm, On2 782.51±81.11 cm, Off3 722.11±68.60 cm, On3 663.90±106.57 cm). La cantidad de entradas de brazo abierto disminuye significativamente de Off1 a On1 y, a continuación, permanece constante (Off1 8.08±1.08, En 1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Off1:On1, t-test, p-0.002, **). El tiempo que pasa en el centro del EPM disminuye a lo largo de los ensayos, pero no muestra ninguna diferencia significativa entre Off a On trial (Off1 41.71±5.34 s, On1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E) Agrupar los datos de los animales CT en el EPM, n.o 11. Los datos de TC muestran las mismas disminuciones significativas que los datos de EXP, lo que indica que el experimento no ha funcionado correctamente (Tiempo en brazos abiertos Off1 86.92±12.74 s, On1 33.78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p-0.009, **; Distancia Fuera1 705.11±88.36 cm, On1 789.45±77.53 cm, Apagado2 724.74±80.49 cm, On2 676.57±111.99 cm, Off3 716.99±132.47 cm, On3 663.03±132.46 cm; Entradas de brazo abierto Apagado1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.0.59. Off1:On1, MWRS, p-0.01, *; Tiempo pasado en el centro Off1 35.89 s, En 1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). Los valores son medios ± S.E.M. * indican diferencias significativas (p≤0.05), ** indican diferencias significativas (p≤0.01). La prueba t es siempre de dos colas, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum prueba; EPM: Laberinto Elevado-Plus; TC: animales de control; EXP: animal experimental; OA: brazos abiertos. Esta cifra ha sido modificada de Berg et al. 2019, PLoS One⁴³ y de Berg 2019⁴⁸. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Lado de inyección de ChR2 y tdTomato en la especificidad de IL y Nex-Cre. A) Dibujo esquemático del sitio de implantación en rebanadas cerebrales coronales a AP + 1,66 mm, ml 0,3 mm, DV -1,8 mm, con inyección unilateral e implantación (adaptado a partir del atlas cerebral del ratón, Paxinos y Franklin, Bregma +1,54 mm). B) Sitios ejemplares de inyección de ChR2-YFP (izquierda, amarillo) y tdTomato (derecha, rojo) se fusionaron con núcleos celulares manchados DAPI (azul) en ratones Nex-Cre. Barra de escala 1 mm. Los recuadros muestran un alto aumento de la región de IL. Barra de escala de 150 m. Las casillas blancas indican la ubicación de los insertos. C) Fila superior: imágenes confocales de la región IL izquierda de un ratón Nex-Cre manchado con CamKII como marcador para las neuronas glutamatérgicas (azul), y ChR2-YFP (amarillo) o Gad67 como marcador para los neurógicos GABAer (verde), de un ratón Nex-Cre. Fila inferior: colocación de ChR2-YFP (amarillo) con CamKII (izquierda, azul), pero no con Gad67 (derecha, verde), mostrando especificidad de ratones Nex-Cre para neuronas glutamatérgicas. Barra de escala de 50 m. PrL: corteza prelímpico; IL: corteza inmórbida; DP: corteza peduncular dorsal. Esta cifra ha sido modificada de Berg et al. 2019, PLoS One⁴³ y de Berg 2019⁴⁸. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El uso de la luz para manipular la señalización neuronal ha sido el método de elección desde hace casi una década. Desde 2005, el número de artículos publicados sobre el desarrollo de nuevas herramientas optogenéticas^{4,6,8,14,49,50,51} y estudios donde tales herramientas se utilizan para investigar circuitos cerebrales^{21,23,40,43,52}, altamente aumentado. Por un lado, con la enorme diversidad de herramientas optogenéticas inyectables, variantes de implantación, líneas transgénicas de ratón y experimentos conductuales, la posibilidad de experimentos es múltiple e ilimitada. Por otro lado, la posibilidad de hacer fallas en la elección de condiciones experimentales es muy alta y los experimentos son tan específicos, que a menudo la comparabilidad con otros estudios es difícil.

Pasos críticos
Un paso crítico importante de este protocolo es la planificación adecuada. La elección de la herramienta optogenética debe coincidir con la cuestión científica. ¿Sólo es necesario manipular la actividad general de una neurona o sinapsis? Entonces las herramientas proporcionadas comercialmente como ChR2^21,25,,27 y Arch³⁷ son una buena opción. Pero aparte de eso, Si un sistema de neurotransmisores especial o incluso un solo receptor debe ser manipulado, una quimera del receptor individual es a menudo la mejor opción^3,6. Varias quimeras receptoras con GPCR, los llamados Opto-XRs, y las pautas para producirlas ya están disponibles^4,,50. Aparte de la elección de las herramientas optogenéticas, la línea del ratón en combinación con el experimento conductual también es crítica. Diferentes cepas de fondo, como por ejemplo C57Bl/6 y BALB/cByJ, muestran diferentes fenotipos de comportamiento en algunos aspectos^53,54. Los ratones C57Bl/6 tienen una ansiedad basal baja y se pueden utilizar para la manipulación ansiogénica, mientras que BALB/cByJ muestran niveles de ansiedad más altos y, por lo tanto, son más sensibles a los fármacos ansiolíticos. Además, las variantes transgénicas de estas cepas de fondo también pueden variar en su fenotipo^48. Con una combinación adecuada de promotores específicos junto con una herramienta optogenética y una línea de ratón transgénico, casi todas las poblaciones celulares deseadas pueden ser objetivo.

Un paso crítico durante la cirugía es apuntar a la ubicación correcta. Con la ayuda del atlas cerebral del ratón, las coordenadas adecuadas para el eje anterior-posterior, y el eje medial-lateral, y la profundidad de la estructura se pueden establecer⁴⁵. En realidad, cada cráneo tiene una forma y un tamaño ligeramente diferentes. Por lo tanto, el factor F⁴⁶ para ajustar las coordenadas estereotácticas es bastante importante, al igual que la fijación correcta de la nariz y el oído durante la cirugía estereotáctica. Si la cabeza del ratón está inclinada, la cánula de inyección no se dirigirá a la región de interés deseada.

Además, el diámetro de la cánula de inyección también es crítico. Si es demasiado pequeño, ningún virus puede ser liberado en el tejido, si es demasiado ancho, la cánula filtrará la solución de virus en su camino a la región de interés. Si la fibra óptica implantada termina directamente encima de la región de destino, la expresión del virus en las regiones de la corteza anterior no importa. Pero si el implante se coloca por encima de otras regiones para estimular los terminales de axón, los axones de las regiones de la corteza superior también se activarán por la luz y falsificarán los datos obtenidos. Como ejemplo: La región il y la región prelimbia (PrL) se proyectan a la amígdala basal^55,56 pero tienen funciones y roles completamente diferentes en la modulación de la ansiedad^26,57. Si el implante se coloca por encima de la amígdala para activar terminales de axón desde la región de IL, y durante la solución del virus de inyección también se colocó en la PrL debido a la cánula de inyección incorrecta, el riesgo de activar también terminales de axón desde el PrL es muy alto.

Durante la preparación del cráneo para la fijación del implante, el uso disperso de imprimación y unión es crucial para una fijación confiable y duradera. Si el sistema de adhesión de 2 componentes no se aplica delgadamente, el cemento dental podría desprenderse del cráneo después de un par de días o semanas. Además, el cráneo también tiene que ser completamente secado antes de fijar el implante, ya que de lo contrario el cemento no se fijará correctamente al cráneo.

También existen pasos críticos en la parte de comportamiento de este protocolo. En primer lugar, la construcción del laberinto es muy importante. En cada configuración de comportamiento, existen varias variantes en la literatura con respecto al tamaño y la forma, así como para el propio procedimiento^58,,59,,60. Es importante elegir una variante que haga que los datos sean comparables y reproducibles. Además, deben tenerse en cuenta los requisitos especiales para las líneas de ratón utilizadas^43,48. En los datos representativos del EPM se puede ver que varios ratones Nex-Cre cayeron del laberinto o se deslizaron varias veces(Figura 2b). Para estos ratones, un laberinto con una pequeña pared alrededor de los brazos abiertos habría sido una mejor alternativa.

En segundo lugar, es fundamental mantener todas las condiciones de la habitación externa constantes^61,de lo contrario diferentes grupos de ratones no serían comparables en absoluto. En este sentido, es muy importante elegir el momento del experimento como uno en el que la configuración experimental está vacante y el experimentador siempre está presente. Además, se deben considerar eventos en el edificio, tales como trabajos de construcción, pruebas de cualquier sistema (alarma de incendio) o el día de limpieza de la instalación del ratón, con el fin de evitar interferencias con los datos obtenidos.

Por último, las condiciones de manejo y alojamiento son fundamentales para los experimentos de comportamiento. Cuando se realiza una implantación, los ratones necesitan ser alojados por el riesgo de lesiones de otros ratones. Para garantizar una buena comparabilidad entre grupos y un error bajo dentro de un grupo, cada ratón debe tener el mismo tamaño de jaula y enriquecimiento. Para los experimentos relacionados con la ansiedad, la vivienda individual tiene algunas ventajas, ya que los ratones macho alojados en singe muestran un nivel de ansiedad basal más bajo, menos variación en su nivel de ansiedad, y síntomas menos depresivos^15,,16. Los ratones macho alojados en grupo podrían diferir fuertemente en su nivel de ansiedad debido a la jerarquía entre los ratones. Además de la vivienda, también es importante un manejo constante e igualitario de todos los ratones y grupos. Agarrar el ratón para conectar la fibra ligera en el implante es muy estresante. Por lo tanto, este procedimiento tiene que ser el mismo para cada ratón, lo que significa la misma técnica y el mismo experimentador. Además, el tiempo de habituación en la jaula de espera, que está destinado a calmar al ratón del procedimiento de conexión estresante, también necesita tener las mismas condiciones en duración, basura y posición al laberinto. El manejo dentro de la instalación del ratón también es crítico para el rendimiento conductual posterior. Los animales experimentales y de control no deben ser limpiados en diferentes días o por diferentes personas, ya que esto también es estresante para ratones. Además, el día de limpieza no debe ser el día experimental para evitar diferencias en el comportamiento.

Solución de problemas
Hay varios problemas que pueden ocurrir durante el protocolo. Por ejemplo, perforar un todo en el cráneo durante la cirugía estereotáctica podría dañar los vasos sanguíneos. Por lo general, se produce un sangrado fuerte, especialmente por encima del bregma y la lambda. Si esto sucede, no trate de detener el sangrado con palos de algodón, ya que tienden a extender aún más sangrado fuera del vaso debido a su absorbencia, en su lugar, enjuague directamente con NaCl.

También puede suceder que la inyección de presión de la solución de virus no está funcionando. En este caso, podría ser que la parafilm, una costra del agujero de la rebaba o el tejido cerebral, está obstruyendo la punta de la cánula. En este caso, retire la cánula lentamente fuera del cerebro sin cambiar el eje X o Y y use una pinza para extraer 1-2 mm de la parte frontal de la punta de la cánula. Antes de reducir la cánula de nuevo, pruebe la funcionalidad aplicando una pequeña cantidad de presión para ver si el virus sale de la punta de la cánula. Para evitar el estreñimiento, baje la cánula con una velocidad constante y no detenga el movimiento hasta que se alcance la profundidad más profunda del lado de inyección. Si se extrae demasiado de la punta de la cánula y el diámetro es demasiado grande, la cánula dañará el tejido y se aumentará el riesgo de aplicar el virus a la vez. Por lo tanto, asegúrese de que sólo la parte obstruida de la punta se elimina cuidadosamente.

Durante el experimento de comportamiento, la configuración del experimento en el software de seguimiento de vídeo (por ejemplo, Ethovision XT) puede causar problemas. Si, por ejemplo, la salida de luz no funciona correctamente, esto puede deberse a varias razones. El Pulser tiene que ser abierto, programado e iniciado antes de que se abra Ethovision XT. El hardware debe seleccionarse correctamente en la "Configuración experimental" (paso 3.2.2.4). Si se selecciona la IO-Box incorrecta, o algo que no sea "Costume Hardware", el dispositivo Pulser no puede ser controlado por Ethovision. Si la prueba de la salida de luz se realiza correctamente, pero el protocolo de luz programado en "Configuración de control de prueba" no funciona durante la adquisición, la referencia de subreberción o subreberción podría ubicarse incorrectamente o las condiciones y acciones no están claras. Por ejemplo: ¿pertenece la referencia a la subreberción correcta? ¿La referencia está programada correctamente (por ejemplo, con qué frecuencia se ejecuta la subreberción)?

Además, puede suceder que durante la "configuración de detección" el animal sea rastreado adecuadamente, pero durante la adquisición hay muestras donde no se encuentra el sujeto. En este caso, compruebe si la iluminación en la sala experimental ha cambiado, o si algo produjo sombras no deseadas dentro del laberinto. Toda la parte inferior del laberinto tiene que tener el mismo color, ya que el ajuste sólo funcionará para una combinación específica. Si por cualquier razón no se pueden evitar diferentes colores de fondo o sombras, defina la configuración de detección en la parte más oscura del laberinto.

Para cambiar cualquier configuración después de la adquisición de los primeros animales, no aplique estos cambios en la configuración ya utilizada. Duplíquelos para ajustarlos. Esto también significa que la versión de prueba ya registrada ya no es válida para el análisis de datos. En tal caso, registre todos los animales para este grupo experimental con la configuración original, y cree un nuevo experimento después donde se analizan los videos grabados en lugar de seguimiento en vivo. En este experimento "de vídeo", se pueden utilizar varios ajustes para el análisis sin perder comparabilidad entre animales o incluso datos.

Limitaciones y aplicaciones futuras
Este método de manipulación del comportamiento con optogenética en animales que se mueven libremente también incluye limitaciones. Durante la cirugía, la proximidad de los dos implantes está restringida. Para la doble implantación, la distancia entre los dos implantes debe ser mínimamente la anchura del aparato para sostener el implante. El aparato necesita bajar el segundo implante en el agujero de la rebaba, mientras que los primeros implantes ya están fijos. Una solución para esto podría ser una implantación en ángulo, donde las puntas de la fibra de vidrio pueden estar muy cerca mientras que las férulas cerámicas por encima del cráneo tienen mayor distancia^{23,,55,56,57,62,63}. Una desventaja de una implantación en ángulo es la difusión de la luz. Cuando la punta de la fibra está inclinada en lugar de desde la recta superior, el área estimulada es diferente. En el caso de dos regiones objetivo cercanas, es necesario tener en cuenta la posición cambiada de la estimulación de la luz.

Durante el experimento conductual, la construcción del laberinto podría interferir con el cable óptico conectado al animal. Algunas pruebas de comportamiento, como la caja oscura clara, contienen un área interior^64,65,y otros laberintos contienen compartimentos que el ratón necesita para entrar. Estos experimentos no se pueden realizar con esta configuración. Alternativamente, un sistema inalámbrico podría ser una opción^22,26,66. Pero afortunadamente algunos laberintos, como el Barnes Maze, se pueden organizar de tal manera, que los ratones son capaces de entrar en los compartimentos relevantes⁶⁷.

Además de aquellos con zonas cerradas, los laberintos que son demasiado anchos pueden causar también problemas. Cuanto más grande sea el área del laberinto, más tiempo debe ser el cable para permitir que el animal vaya a todas las posiciones del laberinto. Hay que tener cuidado de que el animal no sea capaz de pisar el cable o agarrarlo y morderlo. Una solución para eso podría ser una construcción que enrolla el cable redundante. Una desventaja es que el arrastre para desenrollar el cable es difícil para los ratones. Esta solución se adaptaría mejor a las ratas. Otra posible opción podría ser hacer la estimulación de la luz de antemano, en lugar de durante el experimento, por supuesto esto sólo es factible si se produce un efecto a largo plazo debido a la estimulación de la luz²³.

Comparación con métodos existentes/alternativos
Los métodos alternativos serían la estimulación química o eléctrica durante^elcomportamiento^8,18. Agonistas químicos o antagonistas son capaces de activar o silenciar las neuronas a través de receptores específicos y también pueden manipular sistemas de neurotransmisores individuales^38,,68. Por un lado, la especificidad del receptor es bastante alta para los productos químicos, porque el agonista o antagonista específico sólo activan ciertos receptores³⁹. Por otro lado, la especificidad de los subtipos de receptores del mismo grupo de neurotransmisores es a menudo insuficiente. La mayoría de los productos químicos se unen a al menos dos sub-tipos con diferentes probabilidades⁶⁹. Además, los productos químicos no pueden distinguir entre los tipos de células neuronales siempre y cuando posean los mismos tipos de receptores. Más allá de esto, la resolución temporal y espacial es pobre para las manipulaciones químicas en comparación con la optogenética. Agonistas o antagonistas a menudo se administran por vía oral³⁵ o a través de inyecciones sistémicas^57,70. Si la infusión del producto químico se realiza directamente en el tejido cerebral, los efectos aparecen más rápido que con las aplicaciones orales, pero todavía en una escala de tiempo más lenta que con la estimulación de la luz. Como las sustancias químicas administradas se difunden en el cerebro y no son específicas para los tipos neuronales o regiones cerebrales, la manipulación de circuitos cerebrales específicos no es posible.

La estimulación eléctrica tiene una resolución temporal más alta que la estimulación química^9,,14. La propagación en el tejido neuronal es menor que con la estimulación química y la resolución espacial es mejor que con la estimulación química. Sin embargo, la estimulación eléctrica carece de la posibilidad de abordar específicamente diferentes tipos de células neuronales o tipos de receptores, ya que cada neurona cercana al electrodo responderá a la estimulación eléctrica.

Los métodos alternativos al comportamiento en ratones que se mueven libremente son, por ejemplo, grabaciones electrofisiológicas en rebanadas cerebrales, donde las neuronas individuales o los axones se pueden modular con optogenéticas y los efectos provocados se pueden medir mediante la grabación de electrodos^6,,71. Los experimentos in vitro ofrecen la posibilidad de investigar la base molecular y celular de las estimulaciones optogenéticas, pero tienen la limitación de que falta conectividad intrínseca y la entrada de otras regiones cerebrales. Otra opción es utilizar optogenética junto con imágenes multifotográficas^1,72. En este caso, los ratones tienen la cabeza fija y pueden ser anestesiados o estar despiertos para resolver tareas simples.

Para realizar un experimento optogenético exitoso, una amplia gama de herramientas y aplicaciones están disponibles hoy en día. La selección de herramientas optogenéticas y la configuración del comportamiento es fundamental para responder a preguntas específicas de investigación. Si se elige la combinación correcta de herramientas y experimentos, la optogenética permite una investigación sin precedentes y en profundidad de los circuitos neuronales con alta resolución temporal y espacial. Esto ayudará a entender y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para las enfermedades psiquiátricas y la cognición.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamin	Sigma-Aldrich	K2753-64	Anestasia
20 % Glucose	AlleMan Pharma		Injection s.c. for fast recovery
Behavioral mazes	Costum made		Measure anxiety
Bepanthen	Bayer		Ophthalmic oinment
Betaisodona	Monodipharma		Sterilant containing iodine
Betaisodona	Monodipharma		Iodine oinment
Binocular	Olympus	SZ52, 110AL0.62x WD160	Surgery
Ceramic ferrules	Thorlabs	CFLC230-10	Implant
Ceramic Fiber Scribe	Thorlabs	CSW12.5	Cutting of the glass fiber
Channelrhodopsin2-YFP virus	Penn Vector Core	Addgene 20298	Optogenetic tool
Compressed air	Kontakt Chemie	Druckluft 67	Drying of the skull
Coordinate system	Stoelting		Stereotactic coordinates for the surgery
Correl Draw			Graphical software version 13
Cryoslicer	MICROM	HM500OM	Production of brain slices for staining
Ethovision XT 14	Noldus		Software for behavioral tracking
Exel			Statistical Software
Ferrule Polishing Puck	Thorlabs	D50-F	Polishing implants round side
Fiber Patch Cord dual	Prizmatix	Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm	Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation
Fiber Patch Cord single	Prizmatix	Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm	Cable, which is connected with the implant via a sleeve
Fiber Stripping Tool	Thorlabs	T06S13	Stripping glass fiber for implant
Filter paper	VWR European	516-0300	Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test
Food pellets	Mühle Levers	Höveler Nagerfutter	Nutrition for the mice
Glass pipettes	Harvard Apparatus	GC150-10	Injection pipettes
Gradia direct-Flo	Henry Schein	103322	Fluid dental cementum
Heating lamp	efbe-Schott/Phillips	R95E	Prevent the mice from cooling after the surgery
Heating plate	Stoelting		Integrated into coordinate system
Injection canula	Braun	100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20	All injections and to bore hole into the skull
Litter		T 1350	Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test
Mouse cages	Zoonlab	405 cm^2	Single housing for experiments
Optibond FL	Kerr	26684E	Preparation of the skull for implantation
Optical glass fiber	Thorlabs	FT200EMT	Light fiber for implant
Optogenetics-LED.STSI	Prizmatix		Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R	Perfusion of mice to remove the brains
Polishing sheet 0.02 µm grit	Thorlabs	LFCF	Polishing implants round side
Polishing sheet 1 µm grit	Thorlabs	LF1D	Polishing implants round side
Polishing sheet 30 µm grit	Thorlabs	LF30D	Polishing implants round side
Polishing sheet 6 µm grit	Thorlabs	LF6D	Polishing implants round side
Pulser Software	Prizmatix		Software for light device control
Rimadyl-Carprofen	Zoetis		Analgesia
Sigma Plot			Software for statistics
Sleeve	Thorlabs	FT200EMT	Connection of implant and light cable
SodiumCloride (NaCl)	Braun	3570410	Rinsing of the skull
Superglue	Pattex Henkel		To Fix the glass fiber in the ferrule
td-Tomato virus	Penn Vector Core	Addgene 51503	Optogenetic tool
UV light	KoQGHJ	wireless, 1200 mW/cm^2	Polymeration lamp for dental cementum
Xylavet-Xylazin	cp pharma		Anesthesia