Optogenetic التلاعب بالنشاط العصبي لتعديل السلوك في الفئران تتحرك بحرية

Summary

مع التلاعب optogenetic من مجموعات عصبية محددة أو مناطق الدماغ، يمكن تعديل السلوك مع ارتفاع دقة الزمان والمكانية في الحيوانات تتحرك بحرية. باستخدام أدوات optogenetic مختلفة في تركيبة مع الألياف البصرية المزروعة بشكل مزمن، يمكن تنفيذ مجموعة متنوعة من التشكيلات العصبية والاختبار السلوكي.

Abstract

يؤثر التعديل Optogenetic من الدوائر العصبية في الفئران تتحرك بحرية على السلوك الحاد والطويل الأجل. هذه الطريقة قادرة على أداء التلاعب من الخلايا العصبية واحدة والإفراج عن منطقة محددة الارسال، وتصل إلى الدوائر الخلايا العصبية بأكملها في الجهاز العصبي المركزي، ويسمح القياس المباشر للنتائج السلوكية. تُعبّر الخلايا العصبية عن أدوات optogenetic عن طريق حقن النواقل الفيروسية التي تحمل الحمض النووي المفضل، مثل Channelrhodopsin2 (ChR2). يتم إحضار الضوء إلى مناطق محددة في الدماغ عن طريق الغرسات البصرية المزمنة التي تنتهي مباشرة فوق المنطقة المستهدفة. بعد أسبوعين من الانتعاش والتعبير عن الأداة المناسبة ، يمكن استخدام الفئران بشكل متكرر للاختبارات السلوكية مع التحفيز البصري للخلايا العصبية ذات الاهتمام.

يحتوي التعديل Optogenetic على دقة زمنية ومكانية عالية يمكن إنجازها مع خصوصية الخلايا العالية ، مقارنة بالطرق الشائعة الاستخدام مثل التحفيز الكيميائي أو الكهربائي. الضوء لا يضر الأنسجة العصبية، وبالتالي يمكن استخدامها للتجارب على المدى الطويل، وكذلك للتجارب السلوكية متعددة في فأرة واحدة. إمكانيات أدوات optogenetic غير محدودة تقريبا وتمكين تفعيل أو إسكات الخلايا العصبية كاملة، أو حتى التلاعب من نوع مستقبلات محددة عن طريق الضوء.

نتائج هذه التجارب السلوكية مع التحفيز الاوبوجينتيك المتكاملة تصور مباشرة التغيرات في السلوك الناجم عن التلاعب. سلوك الحيوان نفسه دون تحفيز الضوء كخط أساس هو تحكم جيد للتغيرات المستحثة. وهذا يسمح لمحة مفصلة عن أنواع الخلايا العصبية أو أنظمة العصبية المشاركة في سلوكيات محددة, مثل القلق. يمكن أيضا أن يتم التحقيق في اللدونة من الشبكات العصبية بتفصيل كبير من خلال التحفيز على المدى الطويل أو الملاحظات السلوكية بعد التحفيز البصري. سوف تساعد Optogenetics على تنوير إشارات الخلايا العصبية في عدة أنواع من الأمراض العصبية.

Introduction

إن تعديل الدوائر العصبية في الجهاز العصبي المركزي ونتائجها السلوكية مهم لفهم كيفية عمل الدماغ، خاصة في الأمراض النفسية والمهام المعرفية مثل التعلم والذاكرة. مع optogenetics، يمكن تعديل الخلايا المفردة أو مجموعات الخلايا تصل إلى الدوائر بأكملها عن طريق الضوء. أدوات البصرية الشائعة مثل Channelrhodopsin2 (ChR2) أو Archaerhodopsin (القوس) قادرة على تنشيط أو إسكات الخلايا العصبية، أو زيادة أو تثبيط إطلاق الارسال في محطات محور عصبي إسقاط لمناطق الدماغ متميزة^1،2،3،4. ومع ذلك، القوس يحتاج إلى أن تستخدم بعناية كما تبين أن تفعيلها في المحطات presynaptic يزيد من الإفراج عن مرسل^{عفوية 5}. Arch هو مضخة بروتون تصحيحية خارجية تغير قيمة pH داخل الخلية. هذا الوسط القلوي يدفع تدفق الكالسيوم ويعزز الارسال الافراج^5. لتعديل مسارات الإشارات داخل الخلايا على وجه التحديد ، يمكن إنشاء chimeras مستقبلات تتألف من أداة optogenetic قابلة للتفعيل الخفيفة ، مثل rhodopsin أو opsin المخروط ، بالتزامن مع مستقبلات G-protein مقرونة كافية ،^6،7،8. وقد زاد مقدار وتنوع الأدوات البصرية المتاحة بشكل كبير خلال العقد الماضي⁹.

الغرض من علم البصريات هو التعامل مع الدوائر العصبية أثناء السلوك. تمكن Optogenetics ، على سبيل المثال ، قياس التغيرات السلوكية الحادة مثل التغيرات في سلوك القلق. يتم تسليم الأدوات البصرية في المناطق المستهدفة من الدماغ عن طريق ناقلات الفيروسية. مع مساعدة من المروجين الخاصة والمقويات، أو نظام كريس لوإكسب، يمكن ضمان نوع الخلية المحددة للتعبير عن أدوات optogenetic (الشكل 1A). هناك عدة خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن انزيم Cre-Recombinase في أنواع خلايا محددة فقط. على سبيل المثال، Nex-Cre الفئران التعبير عن Cre-Recombinase في الخلايا العصبية الهرمية في القشرة والحصن تحت سيطرة Nex-promotor¹⁰. هذا الإنزيم هو قادر على عكس تسلسل الحمض النووي، والتي تحيط بها الجانبين loxP¹¹. وبالتالي، فإن تسلسل الحمض النووي لأداة optogenetic المزدوجة، التي هي مقلوبة وتحيط بها الجانبين loxP، لا يمكن إلا أن تكون منقولة من قبل الخلايا العصبية التي تمتلك Cre-Recombinase، ولكن ليس من قبل أنواع الخلايا العصبية الأخرى^12،13. في حالة الفئران Nex-Cre، سيتم التعبير عن الأداة البصرية فقط في الخلايا العصبية الهرمية. ثم يتم تحقيق التحفيز الضوئي لمناطق معينة في الدماغ عن طريق زرع مزمن للألياف البصرية مباشرة فوق المنطقة ذات الاهتمام. يمكن بعد ذلك أن تقترن الحيوانات بمصدر ضوء مناسب وتتصرف بحرية في جميع أنواع الاختبارات السلوكية تقريبًا.

الشكل 1: الحقن والزرع. أ) نظام Cre-loxP لـ ChR2-YFP. يتم حزم أداة optogenetic floxed مزدوج في فيروس أدينو المرتبطة (AAV) للحقن في أنسجة الدماغ. ب) عرض القوس لحقن الفيروس وزرع واجهة الخلايا العصبية البصرية داخل / فوق المنطقة IL من mPFC. تم الحقن والزرع من فوق. وتظهر جميع المناطق ذات الاهتمام، IL، وD BLA و DRN. ج) عرض مفصل للألياف البصرية المزروعة، والأكمام ومصدر الضوء. د) انتشار تحفيز الضوء الليزري الأزرق والأحمر في أنسجة المخ المادة الرمادية من 200 ميكرومتر من الألياف الضوئية (Yizhar وآخرون 2011). ينتشر الضوء الأزرق ، في الحد الأقصى ، 0.5 ملم في الأنسجة ، الضوء الأحمر حوالي 1 ملم. لون الترميز: أحمر 50٪، أصفر 10٪، أخضر 5٪، أزرق 1٪ إذا كان الضوء يصل إلى هذه المنطقة. E) منظر إكورال للزرع الأحادي مباشرة فوق IL الأيسر مع 200 ميكرومتر من الألياف الضوئية. منطقة IL لديها عرض 0.25 ملم في كل نصف وعمق 0.2 ملم. مصابيح زرقاء وحمراء هي المصابيح من 5٪ انتشار الضوء ويتم نقلها من Yizhar وآخرون إلى الحجم الصحيح. LoxP: موضع X-over P1؛ ChR2: Channelrhodopsin; YFP: البروتين الفلورسنت الأصفر؛ dflox: floxed مزدوجة; IL: القشرة اللافراعية; BLA: اللوزة البصينية; DRN: ناوية الظهرية رابي؛ PrL: منطقة prelimbic. تم تعديل هذا الرقم من Berg 2019⁴⁸. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وتستخدم النُهج البصرية لأنها تتيح الدقة الزمنية والمكانية العالية¹⁴ ونوع الخلية المحددة. بالإضافة إلى ذلك، من الممكن استخدام الجهاز المزروع بشكل متكرر دون مزيد من العلاج. بعد جراحة مجسمة، حيث يتم تنفيذ حقن فيروس مرتبط بـ adeno يحمل الأداة البصرية وزراعة الألياف البصرية، يمكن للفئران التعافي لمدة أسبوعين. لقد اخترنا وقت الانتعاش من 2 أسابيع فقط، لأن هذا هو الوقت الكافي للتعافي من الجراحة وللفيروس للتعبير عن. كما يتبع التجارب السلوكية من قبل الكيمياء المناعية, علينا أن نضمن أن الفئران لا تحصل على القديم جدا خلال التجربة; وإلا فإن نوعية الأنسجة تنخفض. أنها تظهر أي عاهات سلوكية واضحة من زرع والانخراط في السلوك قفص نموذجي. بالطبع ، يرافق الزرع آفة جراحية كبيرة . لذلك، يتم رصد الفئران بشكل مكثف. بعد الجراحة ، الفئران تحتاج إلى أن تكون واحدة في مكان ، كما الفئران مجموعة يضم تميل إلى إصابة الجروح الطازجة بعضها البعض ويزرع. ومع ذلك ، فإن ظروف السكن لها تأثير كبير على مستوى القلق من الفئران الذكور ، حيث تظهر الفئران ذات المأوى الفردي مستويات قلق أقل¹⁵ وبشكل عام أعراض أقل اكتئابًا^{تشبه 16}.

التلاعب الكيميائي أو الكهربائي من دوائر الدماغ تفتقر إلى نوع الخلية عالية خصوصية optogenetics ولها أقل دقة الزمان والمكانية^14,17,18. اعتمادا على السؤال التجريبي، يمكن أن يكون التحفيز الكهربائي أو الكيميائي مزايا مختلفة. عند مرور محطات الألياف في منطقة معينة تحتاج أيضا إلى تحفيز، التحفيز الكهربائي هو أفضل طريقة. التحفيز الكيميائي هو خيار جيد عندما مستقبلات محددة الارسال في منطقة بأكملها ينبغي تفعيلها من قبل ناهضات. ميزة أخرى كبيرة من optogenetics بالمقارنة مع التحفيز الكيميائي أو الكهربائي هو أن الذاتية، والخلايا العصبية ليست حساسة للضوء، والذي يتجنب حدوث الآثار الجانبية¹⁹. في الواقع، قد يؤدي شدة الضوء العالي تأثيرات التدفئة^8،20، ولكن بسبب مجموعات التحكم المناسبة ، يمكن القضاء على الآثار السلوكية بسبب التلاعب optogenetic.

التحقيق في سلوك القوارض، وخاصة فيما يتعلق بالأمراض النفسية، قد تحسنت كثيرا مع optogenetics في الحيوانات تتحرك بحرية، كما أنه يتيح التشكيل توجيه مستقبلات واحدة تصل إلى مجموعات الخلايا^{المحددة 21} والدوائر²². إمكانية لقياس الآثار الحادة لمثل هذه التشكيلات، فضلا عن الآثار السلوكية على المدى الطويل بعد وقت محدد²³ أو بعد التحفيز المزمن^24،تمكن مرونة واسعة من التصاميم التجريبية ويوفر رؤى مفصلة جدا في دوائر الدماغ. يمكن استخدام تحفيز الضوء لتعديل الخلايا العصبية الموجودة في موقع الحقن من أداة optogenetic. عندما كل من الحقن والزرع عنوان نفس منطقة الدماغ, أجسام الخلايا والخلف إسقاط محاور عصبية من المبدأ و interneurons في هذه المنطقة يمكن أن تستهدف^3,,6,,8. ومع ذلك، يمكن أيضا أن الألياف الخفيفة تزرع في منطقة مختلفة عن حقن واحد. في هذه الحالة، يمكن أن التحفيز الضوء تعدل إطلاق الارسال في محطات محور عصبي في مناطق الإسقاط من المنطقة المحقونة^25،26،27.

في الدراسة هنا، يتم استخدام علم الوراثة البصرية في تركيبة مع التجارب لتحليل السلوك المرتبط بالقلق. الأمراض النفسية المرتبطة بالقلق تؤثر على أكثر من ثلث سكان العالم^28,29,30 وتسبب عبئا اقتصاديا كبيرا³¹. المصابون يعانون من الشعور بالإثارة والتوتر والقلق متبوعاً بسلوك التجنب^32,33. هذه المشاعر السلبية التي تحدث بشكل مزمن ، والتي تركز بشكل رئيسي على الأحداث المستقبلية³⁴، تتداخل بقوة مع الحياة اليومية للمرضى. العلاجات الشائعة مثل البنزوديازيبينات أو مثبطات امتصاص السيروتونين الانتقائية (SSRIs) ناجحة فقط في بعض المرضى. وهناك كمية كبيرة من الناس لا تستجيب للعلاج في جميع³⁵, تبين أن الآلية الكامنة في هذه الأمراض ليست مفهومة تماما حتى الآن. ومن المعروف أن القشرة قبل الجبهية الوسيطة (mPFC) تلعب دورا هاما في تطوير ومظهر القلق^{21,25,27,36,37,38}. على وجه التحديد، قد يكون التّحَدُّم المفرط لمنطقة القشرة الـ(IL) في منطقة الـ mPFC جزءًا من الاضطرابات المرتبطة بالقلق^39،40. يمكن أن تساعد التجربة المذكورة هنا في فهم كيفية تأثير التعديلات في منطقة IL في mPFC على سلوك القلق. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضاً دعم وضع استراتيجيات علاجية جديدة للأمراض النفسية المرتبطة بالقلق.

2-6 الشهر الذكور الفئران Nex-Cre القديمة تستخدم للتعبير عن ChR2 على وجه التحديد في الخلايا العصبية الهرمية داخل المنطقة IL من mPFC⁴¹. Nex-Cre الفئران لديها خلفية C57Bl/6 والتعبير عن إنزيم Cre-recombinase على وجه التحديد في الخلايا العصبية الهرمية. أثناء جراحة مجسمة، يتم حقن الحمض النووي ChR2-DNA المزدوج المخفق في منطقة IL عبر النواقل الفيروسية المرتبطة adeno. يتم وضع الزرع البصري مباشرة فوق المنطقة ذات الاهتمام(الشكل 1B)ويتم إصلاح الزرع مع أسمنت الأسنان. الحيوانات السيطرة تلقي حقنة من tdTomato-DNA floxed مزدوجة في نفس المنطقة لتقليد التعبير خلية محددة.

الحيوانات هي مجموعة يسكنها حتى يوم الجراحة وبعد ذلك هي واحدة يسكن لتجنب الإصابات من الفئران الأخرى. يتم إيواء الفئران في رفوف فردية في قفص تهوية (IVC) في أقفاص TypI-L للفئران المفردة. وتتبع دورة الضوء الداكن إيقاع 12:12 ساعة، وتبدأ مرحلة الضوء من الساعة 10 صباحًا. يتم تنفيذ جميع التجارب السلوكية في المرحلة المظلمة ، والتي تشبه المرحلة النشطة من القوارض. تتوفر حبيبات الماء والطعام القياسي إعلان libitum. بعد أسبوعين من الانتعاش، والذي يضمن تعبير كاف من ChR2 في الخلايا العصبية الهرمية، وتستخدم الفئران للتجارب السلوكية.

الحقل المفتوح (OF) هو متاهة 50 سم × 50 سم مربعة مع الجدران الرملية 40 سم. وتنقسم الأرض في 16 مربعات حيث الداخلية 4 تمثل المركز. السلوك المقاس هو: 1) الوقت الذي يقضيه في المركز، 2) عدد مداخل المركز، و 3) نقل المسافة الإجمالية. خلال هذه التجربة، هناك 4 تجارب مجموعها 20 دقيقة. في التجارب 1 و 3، لا يحدث أي تحفيز الضوء، وفي التجارب 2 و 4، يتم تنفيذ التحفيز 20 هرتز مع نبض ضوء 5 مللي ثانية وكثافة ضوء 1 مللي واط من 473 نانومتر (الشكل 2A). في التجارب اللاحقة ، تم أخذ التعود على منطقة الاختبار في الاعتبار ، ولكن استخدام التحكم المحقونة تشير إلى كيفية التعبير عن التعود.

متاهة بارنز هي تجربة للتعلم والذاكرة. وهو منصة دائرية يبلغ قطرها 92 سم وتحتوي على 20 حفرة متساوية البعد حول محيط المحيط. يتم إغلاق 19 من الثقوب وتحت حفرة واحدة يتم تقديم مربع الهروب. لمدة 4 أيام متتالية، والفئران لديها 4 تجارب التدريب لمعرفة موقع مربع الهروب. في يوم^5، تتم إزالة مربع الهروب، ويتم اختبار الفئران على مقدار الوقت الذي يحتاجونه للعثور على الحفرة الصحيحة. السلوك المقاس هو: 1) الوقت حتى يتم العثور على مربع الهروب / ثقب الصحيح، 2) عدد الزيارات والأخطاء الهدف، و 3) المسافة انتقلت حتى في مربع الهروب. يتم تحفيز الضوء في مجموعات مختلفة إما أثناء الاستحواذ أو الدمج ، والتي تجري في أيام التدريب 1-4 ، أو أثناء الاسترجاع في يوم الاختبار ، وهو اليوم 5 (الشكل 2D).

الشكل 2: التجارب السلوكية مع بروتوكولات optogenetic. أ)الرسم التخطيطي لتجربة الحقل المفتوح مع بروتوكول تحفيز الضوء المقابل. C)الرسم التخطيطي لتجربة المتاهة المرتفعة مع بروتوكول تحفيز الضوء المقابل. D)الرسم التخطيطي للتجربة بارنز المتاهة مع بروتوكول التحفيز الضوئي المقابلة. EPM: متاهة مرتفعة زائد; من: حقل مفتوح; BM: بارنز متاهة اختبار. تم تعديل هذا الرقم من Berg 2019⁴⁸. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

للتحفيز optogenetic، شدة الضوء والتردد يجب أن تتكيف مع أداة optogenetic ونوع الخلايا العصبية التي هي قيد التحقيق. يجب استخدام أدنى كثافة ضوء ممكن من أجل تجنب تلف الأنسجة ، حيث أظهرت العديد من الدراسات أن هناك تأثيرات محتملة للتدفئة بسبب شدة الضوء القوي^8،20. لChr2، 20 هرتز التحفيز مع نبض ضوء 5 مللي ثانية يستخدم عادة². كما ChR2 هو خفيف جدا حساسة، 1 كيلوواط شدة الضوء كافية. يتناوب بروتوكول تحفيز الضوء بين الضوء والتجارب لقياس التغيرات السلوكية بشكل مباشر. يجب أن تظل ظروف الغرفة الخارجية للتجارب السلوكية مستقرة لمجموعة الحيوانات بأكملها. الشروط الهامة للنظر هي الضوضاء (نضع في اعتبارنا أن الأجهزة نفسها قد تجعل الضوضاء)، رائحة (دائما تنظيف الاجهزة السلوكية مع الإيثانول)، وكثافة الضوء، والمجرب. يجب أن يكون المجرب هو الشخص نفسه. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون الوقت من يوم التجارب هو نفسه لجميع الحيوانات في مجموعة واحدة ، بعد ساعات قليلة من بدء المرحلة المظلمة في المرفق المفضل.

والهدف من هذه التجربة هو زيادة نسبة الإثارة/التثبيط (E/I) في منطقة IL من خلال التنشيط القوي للخلايا العصبية الهرمية الإثارة. ومن المعروف أن نسبة E/ I المعززة في هذه المنطقة القشرة الخاصة لزيادة مستويات القلق في الفئران^{40،42،43،44}.

Protocol

وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تنطوي على رعايا الحيوانات من قبل منشأة البحوث الحيوانية المؤسسية و "السيناتور für Wissenschaft، Gesundheit und Verbraucherschutz" في جامعة بريمن (#146)

1. إعداد زرع البصرية⁹ (الشكل 1C)

1. وضع السيراميك شق الجانب شقة حتى في فيز مقاعد البدلاء.
2. تعري معطف من 200 ميكرومتر الألياف الزجاجية قطرها 200 مع أداة تجريد الألياف وقطع 2-3 سم طويلة القطع مع ألياف السيراميك الكاتب.
3. ضع قطعة من الألياف الزجاجية في شراك السيراميك مع وجود اغلاء حتى على كلا الجانبين.
4. ضع قطرة من الغليغ في الجانب المسطح من شراسة السيراميك مع كانولا حقن.
   ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
5. اتخاذ قبل زرع من فيز مقاعد البدلاء وعلى الجانب جولة من نسيج السيراميك، وقطع الألياف الزجاجية قصيرة قدر الإمكان مع ألياف السيراميك الكاتب.
6. ضع ما قبل الزرع في عفريت تلميع وحشي وتلميع الجانب المستدير على 4 أوراق تلميع مختلفة ، عن طريق رسم ثماني مرات 20 لكل ورقة (30 ميكرومتر حصى ، 6 ميكرومتر حصى ، 1 ميكرومتر حصى ، وأخيرا 0.02 ميكرومتر حصى).
7. اتخاذ ما قبل زرع من عفريت تلميع شراسة وقطع الألياف الزجاجية على الجانب المسطح من نسيج السيراميك إلى الطول اللازم لزرع. ابدأ بقياس الطول خلف الغلوبير الناجلي.
   1. لسطح القطع حتى مجرد خدش الألياف الزجاجية 2-3 مرات ومن ثم كسره.
      ملاحظة: استخدم أطلس دماغ الفأر من باكسوس وفرانكلين⁴⁵ لحساب طول الزرع. يجب أن تنتهي الغرسة مباشرة فوق المنطقة ذات الاهتمام وينبغي تضمين سمك الجمجمة في حساب الطول. لتحفيز المنطقة IL، والألياف الزجاجية وطول 1.8 ملم(الشكل 3).

الشكل 3: أطلس دماغ الفأر (Paxinos و Franklin) مع طول تمثيلي للزرع للوصول إلى منطقة IL. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

8. تطهير زرع الانتهاء لمدة 10 دقائق في الإيثانول والسماح لها الجافة قبل زرع.

2. الحقن والزرع

1. نقل فأر واحد إلى غرفة العمليات الجراحية ووزنها. تطبيق التخدير مع حقن داخل الصفاق (i.p.) من الكيتامين / زيلازين (الكيتامين 0.12 ملغ / غرام, Xylazine 0.01 ملغ / ز).
   1. إصلاح الماوس باليد اليسرى وتحويله على ظهره مع عقد الرأس منخفضة.
   2. الهدف من الربع السفلي الأيسر من البطن مع الحقنة وأدخل القنطرة حقن 1 سم تحت الجلد.
   3. حقن التخدير في حركة بطيئة ومستمرة في تجويف البطن.
   4. ضع الفأرة مرة أخرى في قفصها وانتظر حتى تصل إلى حالة عميقة من التخدير.
      ملاحظة: يمكن تحديد عمق التخدير من خلال عدم وجود ردود فعل وامض وبين أصابع القدمين.
2. ضع الماوس على لوحة التدفئة وإصلاح الرأس في إطار مجسم. إصلاح الأنف والأسنان في الجبهة، والأذنين على كلا الجانبين.
   ملاحظة: يجب أن يكون الرأس مستقيمًا على المحور الأيسر لليمين و axis الcaudal من اليسار إلى اليسار لضمان إحداثيات مجسمة صحيحة.
3. تطبيق المسكن مع 2 ملغ / كغ Carprofen تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفأرة وتطبيق مرهم العين معتمة على كلتا العينين لحمايتهم من التجفيف.
4. ترطيب الشعر على فروة الرأس بمنشفة ورقية مبللة ثم قطعه باستخدام مقص. تأكد من إزالة جميع الشعر فضفاضة مع منشفة ورقية مبللة. لتطهير فروة الرأس، استخدم عصا قطنية وخذ 0.5 مل من صبغة تحتوي على اليود (Betaisodona 100 ملغ/مل Povidon اليود و 11 ملغ/مل اليود) والسماح لها الهواء الجاف.
   ملاحظة: بدلا من مقص، كما يمكن استخدام مقص الكهربائية لإزالة الشعر السليم.
5. رفع فروة الرأس فوق المنطقة ذات الاهتمام مع ملاقط وقطع 1 سم على طول خط الوسط. استخدمي ملاقطتين لدفع الجلد جانباً لفضح الجمجمة. تأكد من إزالة الجلد الرقيق فوق الجمجمة والسماح للجمجمة المكشوفة الجافة.
6. اُجَهّئ الجمجمة لإغراءها لاحقاً
   1. تطبيق 2 مم × 2 مم قطرة من حمض الفوسفوريك (37٪ ) من مجموعة المواد اللاصقة (على سبيل المثال، Optibond) على الجمجمة، وتوزيعها مع غيض من حقنة والسماح لها نافذة المفعول لمدة 15 ثانية.
   2. إزالة كل حمض مع عصا القطن وشطف الجمجمة مع 1 مل من 0.9٪ 19000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
   3. جفف الجمجمة بعصا قطنية و هواء مضغوط.
      تحذير: حمض الفوسفوريك خطير ويجب إزالته بالكامل لتجنب تلف الأنسجة.
7. حساب عامل F للإحداثيات الفردية.
   1. ضع علبة زجاجية في الإطار المجسم وحدد مكانها مباشرة فوق البريغما.
   2. صفر نظام الإحداثيات ونقل القنية الزجاجية إلى لامدا.
   3. حساب عامل^F-46 مع الصيغة التالية:
      
   4. اضرب عامل F مع الإحداثيات من أطلس دماغ الماوس لضبطها إلى الماوس الفردي.
8. حفر ثقب في الجمجمة للحقن.
   1. استخدام الإحداثيات المعدلة للعثور على موقع الجمجمة مباشرة فوق هيكل الفائدة ووضع علامة عليه باستخدام غيض من canula حقن عن طريق خدش فوق سطح العظام.
   2. استخدام كانولا حقن لحفر حفرة في الجمجمة في الموقع ملحوظ عن طريق تناوب الكانولا على الفور. إذا تسرب الدم من ثقب البور، شطف مع 1 مل من 0.9٪ كلوريد الغثيان وتجفيف الجمجمة بعد ذلك.
9. تناول حل الفيروس في القنية الزجاجية.
   1. ضع قطرة 100 ميكرولتر من 0.9٪ من كلوريد النيتلاك على الجمجمة وقطعة من البارا فيلم (1 سم × 1 سم) على الجانب العلوي المعقم.
   2. مكان 1-2 μL من حل الفيروسات على parafilm وخفض غيض من المظلة الزجاجية في ذلك.
   3. ربط القنية الزجاجية إلى حقنة، وتطبيق الحد الأدنى من الضغط السلبي والانتظار حتى يتم تناول حل الفيروس من قبل cannula (في غضون ثوان).
      ملاحظة: من المهم وقف تطبيق الضغط السلبي، قبل أن يتم التقاط الهواء في اللب. لذلك، سيكون هناك دائما بقايا صغيرة من حل الفيروس.
10. حقن حل الفيروس في المنطقة من الفائدة.
    1. وضع الفيروس شغل الزجاج القدّار فوق ثقب البور.
    2. ببطء خفض القنية في حفرة البور وصفر z-الإحداثي عندما يكون طرف الـ canula على مستوى الجمجمة.
    3. خفض القنية بعناية إلى أدنى موضع من موقع الحقن.
    4. تركيز المنظار في الغضروف المفصلي من حل الفيروسات داخل canula.
    5. تطبيق كمية صغيرة من الضغط الإيجابي مع الحقنة حتى يتم تخفيض الغضروف المفصلي هامشيا.
    6. اسمحوا الفيروس ينتشر لمدة 2-3 دقيقة قبل تحريك الزجاج كانلا صعودا إلى الموضع التالي.
    7. تطبيق حل الفيروس كل 200-300 μm في جميع أنحاء المنطقة من الفائدة.
    8. إزالة الزجاج الوَرَب ببطء شديد وتخلص منه بعد الحقنة النهائية.
11. إعداد الجمجمة لزرع مع عدة التصاق (على سبيل المثال، Optibond^TMFL).
    1. جفف الجمجمة بالهواء المضغوط.
    2. تطبيق 5 ميكرولتر من التمهيدي (على سبيل المثال، Optibond، 1-30٪ (الإيثانول، حمض سيليسيتش، Glycerinphosphatimethacrylat، 2-(2-(Methacryloyloxy)ethoxycarbonyl)benzoesäure، 2-Hydroxyethylmethacrylat)) مع عصا المقابلة والسماح لها الجافة ل15 s.
    3. تطبيق 5 ميكرولتر من السندات (على سبيل المثال، Optibond، 15-20٪ 2-Hydroxyethylmethacrylat + 1-2٪ Alkalihexafluorosilikat(Na)) مع العصا نفسها وعلاجه لمدة 20 ثانية مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (420-480 نانومتر).
       ملاحظة: من الضروري أن تكون الجمجمة جافة وأن يتم تطبيق التمهيدي والسندات في طبقة رقيقة جدا.
       تحذير: لا تنظر مباشرة إلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية، حيث أن ضوء الأشعة فوق البنفسجية قد يضر بالعينين.
12. ضع الغرسة مباشرة فوق منطقة الاهتمام.
    1. إصلاح الزرع في حامل المقابلة.
    2. جفف الجمجمة بالهواء المضغوط.
    3. ضع طرف الألياف الزجاجية مباشرة فوق ثقب البور وقم بخفضه بعناية.
    4. توقف عن خفض الزرع عندما تلامس المصباح المتبقي من الغليغة الفائقة الجمجمة. لا تمارس الضغط على الجمجمة!
       ملاحظة: إذا كان يتم الحقن والزرع في مناطق مختلفة (على سبيل المثال، رفح الظهري وحصانات النهر)،حفر جميع الثقوب اللازمة بعد تطبيق حمض الفوسفوريك، ولكن قبل التصاق مكون 2، ثم اتبع التعليمات كما هو موضح سابقا (الخطوة 2.8-2.14).
13. إصلاح الزرع.
    1. تحقق مما إذا كانت الجمجمة لا تزال جافة تماما.
    2. تطبيق الأسمنت السائل الأسنان (على سبيل المثال، Gradia فلو مباشرة) حول زرع وفي المنطقة المحيطة بها وعلاج لمدة 20 مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (420-480 نانومتر).
       ملاحظة: كمية أسمنت الأسنان تعتمد على منطقة الجمجمة الحرة. الجمجمة كلها يجب أن تكون مغطاة بالاسمنت الأسنان.
    3. تطبيق طبقتين أكثر من الاسمنت وملء تماما منطقة الجمجمة الحرة والمجففة. علاج كل طبقة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (420-480 نانومتر).
14. أنهي الجراحة
    1. تطبيق 0.5 غ مرهم اليود (Betaisodona 100 ملغ/ مل بوديندون اليود و 11 ملغ / مل اليود) في الجرح كله.
    2. حقن 0.1 مل من الجلوكوز الذائبة في 0.9٪ دون الجلد في 1999 في الرقبة للانتعاش السريع.
    3. إطلاق تثبيت الأنف والأذن، وجلب الماوس إلى قفص جديد ووضعها تحت مصباح التدفئة لتجنب فقدان حرارة الجسم.
    4. عندما يستيقظ الماوس، إعادته إلى المنشأة.
    5. تحقق من حالته الصحية مرة واحدة على الأقل في اليوم. اتخاذ الإجراء المناسب إذا الفئران عرض أي الدساتير السيئة (على سبيل المثال، ضمان مسكن بعد العملية مع الكاربروفين تصل إلى 3 أيام إذا الفئران عرض أي علامات الألم).
       ملاحظة: بعد أسبوعين من الانتعاش، يمكن استخدام الفئران للتجارب السلوكية.

3. إعداد تجربة جديدة (مثال ChR2 التحفيز و حقل مفتوح)

1. نبض
   1. برمج النبض (على سبيل المثال، Prizmatix) لتحفيز الضوء.
   2. افتح البرنامج وحدد منفذ USB COM الذي يتم توصيل مصدر الضوء به.
   3. اختر تحديد وضع التشغيل (3) | تنفيذ تسلسل النبض بعد تشغيل HIGH، ثم التوقف عند منخفض للسماح لبرنامج خارجي للسيطرة على مصدر الضوء.
   4. برمج بروتوكول الضوء. ل20 هرتز التحفيز مع 5 مللي ثانية نبض الضوء: اختر TI = 23 مللي ثانية، P1D = 5 مللي ثانية، P1I = 22 مللي ثانية و P2D = 0 مللي ثانية.
   5. اضغط على تسلسل بدء. ستبقى هذه الحالة حتى يتم الانتهاء من التجارب.
      ملاحظة: يجب أن يتم إطلاق برنامج pulser (Prizmatix Pulser) قبل برنامج تتبع الفيديو؛ وإلا فإن برامج تتبع الفيديو لن تكون قادرة على التعرف على الجهاز.
2. برامج تتبع الفيديو (مثل Ethovision XT)
   1. إنشاء تجربة جديدة من قالب محدد مسبقًا.
      1. افتح البرنامج، انتقل إلى ملف، اختر جديد من القالب. حدد تطبيق قالب معرّف مسبقًا.
      2. اختر تتبع لايف وحدد الكاميرا عن طريق الضغط على المصدر وتأكيد GenICam Basler متصلة.
         ملاحظة: سيتم الآن عرض الصورة المباشرة للكاميرا في الإطار على أعلى اليمين.
      3. اضغط التالي واختيار الحيوان الذي ينبغي أن يسجل (القوارض، الماوس).
      4. اضغط التالي وحدد قالب الساحة حقل مفتوح، مربع. حدد مركز قالب المنطقة، الحدود، الزوايا ثم قم بالتأكيد باستخدام التالي.
      5. تأكيد 1 الموضوع الذي يجب تعقبه مع التالي.
      6. حدد نقطة الوسط، نقطة الأنف وذيل القاعدة وتأكيد لون الحيوان مقارنة مع الخلفية كما أغمق مع التالي.
      7. تأكيد معدل العينة الموصى بها من 12.5 مع التالي ثم إنهاء الخطوة.
      8. قم بتسمية التجربة المناسبة واختر موقعًا لحفظه.
   2. تحديد الإعدادات التجريبية.
      1. انتقل Setup إلى الإعداد والإعدادات التجريبية. اختر اكتشاف نقطة الوسط ونقطة الأنف وقاعدة الذيل كميزات متعقبة.
      2. حدد استخدام أجهزة التحكم التجريبية ثم انتقل إلى الإعدادات.
      3. حدد Noldus USB-IO مربع وتأكيد مع موافق.
      4. اختر الأجهزة المخصصة كـ نوع الجهاز في منفذ TTL، الذي تم توصيله بجهاز pulser، ثم قم بالتأكيد باستخدام Ok.
   3. تحديد إعدادات الساحة.
      1. انتقل إلى إعدادات الساحة وحدد إعدادات الساحة 1.
         ملاحظة: ستقوم الكاميرا الآن بفتح صورة خلفية تلقائيًا.
      2. تأكيد الصورة باستخدام Grab.
      3. تطويع المناطق المحددة مسبقاً مع الساحة الحقيقية من خلال تغيير حجمها. استخدام السهم واثنين من الرموز على يمينه. إذا كانت بعض المناطق غير ضرورية، قم بحذفها.
      4. اضغط على 1. رسم مقياس لمعايرة وسحب خط من زاوية واحدة من المتاهة إلى أخرى. أدخل طول المسافة الحقيقية في سم.
      5. كرر ذلك للمحور الآخر.
   4. اختبار ما إذا كان يعمل التحفيز الضوء.
      1. انتقل إلى Arena - تخطيط الأجهزة وحدد اختبار على الشريط الرمادي.
      2. حدد إخراج الأوامر 1 عالي واضغط على اختبار.
         ملاحظة: يجب أن يكون هناك انبعاث للضوء من نهاية الألياف البصرية. عند اختيار الإخراج 1 منخفض واختبار، يجب أن يتوقف التحفيز.
   5. حدد إعدادات التحكم التجريبي لمدة 20 دقيقة من التجربة. تعيين الإصدارات التجريبية Off1 و On1 و Off2 و On2 إلى أن يكون طول كل منها 5 دقائق.
      1. انتقل إلى إعداد التحكم التجريبي وحدد مسار المدة 30 دقيقة.
      2. إعداد القاعدة الرئيسية عن طريق ضبط الشرط: الوقت إلى 20 دقيقة عن طريق تحديد إعدادات وتغيير 30 إلى 20 دقيقة. تأكيد مع موافق.
         ملاحظة: يجب أن يكون شرط مسار البدء عندما يكون الموضوع في الساحة لمدة 2 ثانية. بهذه الطريقة سيبدأ النظام تلقائيا تتبع عندما يكون الماوس في الساحة.
      3. إنشاء قاعدة فرعية لتحفيز الضوء: انتقل إلى الهياكل، والمزيد وحدد القاعدة الفرعية.
      4. إعطائها اسما مثل بروتوكول التحفيز الضوئي.
      5. وضعه تحت القاعدة الرئيسية وانتشرت خارج مربعين عن طريق اختيار المنطقة الزرقاء مع الماوس courser.
      6. انتقل إلى الشروط، والوقت واعطاءه اسما مثل الضوء على 1.
      7. يتم استيفاء شرط ضبط مع بعد 5 دقائق. تأكيد مع موافق.
      8. ضع المربع مباشرة خلف مربع قاعدة البدء للقاعدة الفرعية عن طريق سحبه إلى الخط الأسود.
      9. الذهاب إلى العمل | الأجهزة المخصصة وتسمها: ضوء على 1.
      10. حدد الإجراء الذي يجب تنفيذه كـ "الإخراج 1 عالي" وتأكيده مع "موافق".
      11. ضع المربع مباشرة خلف مربع الشرط.
          ملاحظة: الآن بعد 5 دقائق من التجربة يجب أن يبدأ تحفيز الضوء.
      12. كرر الخطوات لتحديد شرط الوقت بعد 5 دقائق والعمل الناتج 1 منخفضة لوقف التحفيز الضوء بعد 5 دقائق أخرى.
      13. كرر الخطوات مرة أخرى إلى برنامج آخر ضوء إيقاف والضوء على المحاكمة.
      14. اذهب إلى الهياكل | مرجع القاعدة الفرعية والتحقق من أن المرجع ينتمي إلى القاعدة الفرعية الصحيحة.
      15. اختر شروط البدء بدون تأخير و شروط الإيقاف كـ تنفيذ مرة واحدة لكل شرط بدء. تأكيد مع موافق.
      16. ضع مربع المرجع بين مربع الإجراء 1 ومربع الشرط 2 من القاعدة الرئيسية وارسم خطًا من الإجراء - بدء المسار إلى المرجع.
          ملاحظة: الآن تبدأ القاعدة الرئيسية مباشرة القاعدة الفرعية بعد بدء تشغيل المسار.
   6. تحديد إعدادات الكشف لإظهار النظام ما يجب عليه تعقب.
      1. انتقل إلى إعدادات الكشف وحدد إعدادات الكشف 1.
      2. ضع ماوس اختبار في الساحة وحدد الإعداد التلقائي.
      3. اختيار القوارض كنوع واستخدام الماوس لعن لرسم مربع حول الماوس في الساحة. تأكيد النتائج موافق؟ السؤال مع نعم.
   7. تحديد قائمة تجريبية لجميع الحيوانات التجريبية التي ينبغي تتبعها.
      1. انتقل إلى قائمة المحاكمات واخطط لجميع الحيوانات للتسجيل اليوم: حدد إضافة تجارب وحدد رقمًا.
      2. حدد كافة الشروط التي تم تعريفها من قبل لكل ماوس.
      3. اسم الحيوان-ID والمعالجة بشكل صحيح لتبسيط التحليل لاحقاً.
         ملاحظة: معرف الحيوان غير ذات صلة للنظام والمهم فقط لتحليل البيانات لاحقاً بواسطة المجرب. التجمع في مجموعة العلاج والتحكم من المهم للنظام لمعرفة كيفية مجموعة وكيفية مقارنة جميع المسارات في وقت لاحق تحليل الخطوات.
   8. انتقل إلى اكتساب والبدء في التجربة.

4. تجربة حقل مفتوح (القلق)

1. جلب الماوس التجريبي إلى الغرفة السلوكية الحق قبل التجربة لضمان مستوى مناسب من القلق.
   ملاحظة: ينبغي إجراء التجارب السلوكية خلال المرحلة المظلمة عندما تكون الفئران مستيقظة، ودائما في نفس الوقت لضمان المقارنة.
2. زوجين الماوس عبر كم إلى مصدر الضوء عن طريق الضغط عليه بلطف على شبكة القفص.
3. وضعه في قفص الانتظار مع القمامة الطازجة لمدة 10 دقيقة للحصول على التأقلم مع كابل الضوء.
4. ابدأ عملية الشراء بالضغط على زر البدء في برنامج تتبع الفيديو (على سبيل المثال، Ethovision XT).
5. نقل الماوس من قفص الانتظار في الزاوية العليا اليسرى من الحقل المفتوح. إزالة الذراع في غضون 2 ثانية لتجنب تتبع ذراع بدلا من الماوس.
6. اترك المجال البصري للماوس أثناء التجربة واحفظ الهدوء.
7. بعد 20 دقيقة، عند الانتهاء من التجربة، وإزالة الماوس من المتاهة، وقطع كابل الضوء ووضعها مرة أخرى في قفص المنزل.
8. أعيدوا الفأر إلى المنشأة

5. بارنز المتاهة (التعلم)

1. جلب جميع الفئران التجريبية في غرفة السلوك حوالي 1 ساعة قبل التجربة.
2. إعداد المتاهة بارنز عن طريق إغلاق جميع الثقوب باستثناء واحد، تحت التي يتم وضع مربع الهروب. وضع جدار من الكرتون في منتصف المنصة، والتي هي منطقة البداية للماوس.
3. قم بتوصيل فأرة واحدة بمصدر الضوء (كم على كبل خفيف) عند كل من الغرسات.
4. ضع الفأر مباشرة في منتصف بارنز متاهة في جدار الكرتون ، والذي يمنع الماوس من الركض قبل بدء التجربة.
5. اضغط ابدأ في برنامج تتبع الفيديو (على سبيل المثال، Ethovision XT) وإزالة الكرتون.
   ملاحظة: البرنامج يتتبع الماوس حتى يتم الوصول إلى الحفرة الصحيحة ولكن تكون مستعدة لوقف المحاكمة يدويا فقط في حالة البرنامج لا تعترف انتقال حفرة.
6. أخرج الماوس من المتاهة وأزل الاتصال بكابل الضوء.
   ملاحظة: إذا كان هذا هو يوم تدريب مع عدة تجارب لكل ماوس، اترك الماوس في غرفة الانتظار بجوار غرفة السلوك حتى يبدأ جلسة التدريب التالية. إذا كان هذا هو يوم الاختبار مع اختبار واحد فقط لكل فأرة، إحضار الماوس مرة أخرى إلى المرفق.

6. تحليل البيانات (مثال بيانات حقل مفتوح مع 4 تجارب مميزة)

1. برامج تتبع الفيديو (مثل Ethovision XT)
   1. تحديد المجموعات التجريبية والتجارب في ملف البيانات.
      1. انتقل إلى ملفات تعريف البيانات على اليسار واختر المعالجة مقابل التحكم.
      2. انتقل إلى تداخل في الإطار الجديد على اليسار الأوسط وحدد حالة التحكم التجريبي.
      3. اختر الفاصل الزمني للدولة من "الإجراء العنصر:بدء المسار إلى "الإجراء العنصر": يذهب الضوء على 1.
      4. ضع مربع التداخل بين مربع تصفية المعالجة ومربع النتيجة المقابلة.
         ملاحظة: هذا الفاصل الزمني المحدد هو Off1، الذي يصف أول 2.5 دقيقة من التجربة حيث لا يوجد أي تحفيز الضوء.
      5. كرر الخطوات لفواصل On1 (من عنصر العمل: يذهب الضوء على 1 إلى العمل العنصر: ضوء يخرج 1),Off2 (من العمل العنصر: ضوء يخرج 1 إلى ضوء عنصر يذهب على 2)و On2 (من عنصر عمل: يذهب ضوء على 2 إلى العنصر عمل: وقف مسار).
      6. كرر الفواصل الزمنية 4 لمجموعة عامل تصفية التحكم.
         ملاحظة: كل مربع تداخل يحتاج مربع النتيجة الخاصة به مع أسماء Off1 On1، Off2، On2. الآن كل من مجموعة العلاج والتحكم تنقسم إلى 4 تجارب تحفيز الضوء المختلفة التي يتم تحليلها بشكل منفصل.
   2. حدد المعلمات التي سيتم تحليلها في ملف تعريف التحليل.
      1. انتقل إلى ملفات تعريف التحليل على اليسار وحدد في المناطق.
      2. حدد المنطقة المتغير التابع وحدد الوسط كمنطقة.
      3. انقر نقراً مزدوجاً على In Center واختر أي من النقاط المحددة واختر فقط في المركز.
      4. قبل مغادرة النافذة انتقل إلى "إحصائيات المحاكمة" وحدد التكرار والمدة التراكمية والتكد من وقت الوصول إلى أولاً.
      5. إضافة نقل مسافةالمتغير التابع .
         ملاحظة: في "إحصائيات المجموعة"،اختر ما إذا كنت تريد استخدام الخطأ القياسي أو الانحراف المعياري كخطأ. باستخدام هذا الملف، تتوفر بيانات الوقت الذي تم إنفاقه في إدخالات المركز و"مركز" و"إجمالي المسافة التي تم نقلها".
   3. استخراج البيانات
      1. انتقل إلى النتائج وحدد الإحصائيات والمخططات.
      2. اضغط على حساب لرؤية البيانات التي تم تحليلها.
         ملاحظة: توفر إحصائيات التجربة معلومات حول كل ماوس واحد وإحصاءات المجموعة يحلل الوسط والخطأ لكل من المجموعتين، مقسمة إلى 4 تجارب مع شريط المقابلة.
      3. اضغط على تصدير البيانات وحدد إحصائيات الإصدار التجريبي والموقع الذي سيتم حفظه.
         ملاحظة: يتم حفظ البيانات المصدرة كملف Excel مع قيم فردية لكل الماوس. في هذا الملف إكسيل الحيوان معرف يساعد على تحديد الفئران.
      4. انتقل إلى تصور خريطة الحرارة والصحافة خريطة الأرض Heatmaps.
      5. حدد المحاكمات على اليمين لرؤية خرائط الحرارة الفردية لكل ماوس ومحاكمة.
      6. القيام بزر الماوس الأيمن على الماوس وتصدير heatmaps كصور.
2. التامر
   1. افتح ملف جدول البيانات على الكمبيوتر واحسب الوسيلة والأخطاء القياسية (SEM) لجميع التجارب 4 في كل حالة وقياس مجموعة.
   2. توليد الرسوم البيانية في برنامج الإحصاءات (على سبيل المثال، سيجما مؤامرة).
      1. نسخ الوسيلة و SEM في الترتيب الصحيح من ملف جدول البيانات إلى سيجما مؤامرة. يجب أن تحتوي الصفوف على بيانات Off1 و On1 وما إلى ذلك وتحتوي الأعمدة على الإصدار التجريبي و الوسط و SEM كرؤساء.
      2. حدد الأعمدة الثلاثة جميعها ثم انتقل إلى إنشاء رسم بياني.
      3. حدد مربع شريط واختر أشرطة غير مجمعة مع الخطأ (الصف العلوي، المربع الثالث).
      4. تأكيد مع الانتهاء لفتح صفحة رسم بياني جديدة.
      5. قم بتسمية الرسم البياني بالكامل، ثم انتقل إلى الصفحة الرئيسية، وحدد مربع الرسم البياني على اليسار واضغط على تصدير. حدد مجلد الوجهة واختر ملف التعريف (*.wmf) كتنسيف.
         ملاحظة: يمكن معالجة تنسيق .wmf لاحقاً في برنامج رسومي مثل CorelDraw.
   3. حساب إحصائيات البيانات التي تم الحصول عليها.
      1. نسخ البيانات الخام من جدول البيانات (Off1 ، On1 الخ) في أعمدة واحدة من مؤامرة سيغما.
      2. وضع علامة على الأعمدة للمقارنة والذهاب إلى التحليل، واختر اختبار t واضغط على تشغيل.
      3. تأكيد تنسيق البيانات الخام مع التالي وتشغيل الاختبار مع إنهاء.

Representative Results

الهدف من هذا البروتوكول هو قياس التغيرات في سلوك الفئران المعدلة وراثيا خلال تجربة optogenetic. يتم التلاعب Optogenetic عن طريق حقن ناقل فيروسية المرتبطة adeno. تحفيز الضوء في الفئران تتحرك بحرية من الممكن عن طريق زرع الألياف الخفيفة مباشرة فوق المنطقة ذات الاهتمام.

في الشكل 4، يتم عرض نتائج تجربة optogenetic. زيادة تنشيط قوي من الخلايا العصبية الهرمية مثير في المنطقة IL عبر ChR2 السلوك المتصلة بالقلق في مجال مفتوح. تم حقن ChR2 في منطقة IL من mPFC في الفئران Nex-Cre للتعبير في الخلايا العصبية الهرمية (الشكل 4A). خلال اثنين من اختبارات القلق، في الميدان المفتوح (الشكل 4B,C) واختبار التغذية جديد قمعها (الشكل 4F,G),ChR2 حفز مع الضوء الأزرق وينشط الخلايا العصبية الهرمية. والسيطرة، مجموعة أخرى من الفئران تلقى حقنة من الفلوروور tdTomato بدلا من ChR2 (الشكل 4D,G). في مثل هذه التجربة، يتم تعريف القلق على أنه تجنب المنطقة الوسطى الأكثر إشراقا. تظهر الفئران تجنبًا جوهريًا للمناطق المفتوحة لأنها حريصة على الحيوانات المفترسة.

في تجربة الحقل المفتوح، كما هو موضح في الشكل 4B،نفذت الفئران 4 تجارب من 5 دقائق لكل من هذه التجارب. في التجارب 1 و 3 لم يحدث أي تحفيز الضوء (Off1،2) وفي التجارب 2 و 4، تم إجراء تحفيز الضوء الأزرق مع 20 هرتز (5 مللي ثانية نبض الضوء) وكثافة 1 ميغاواط (On1، 2). وتظهر خرائط الحرارة أنه في المجموعة التجريبية، اختلفت مدة المركز بين التجارب Off and On. خلال تحفيز الضوء، تبقى الفئران بشكل تفضيلي في المنطقة الحدودية. الحيوانات التحكم أيضا تفضل الحدود، ولكن لا تغيير سلوكهم على التحفيز الضوء. في الشكل 4C، يتم عرض القياسات السلوكية الرئيسية خلال تجربة الحقل المفتوح للمجموعة التجريبية. إذا اجتازت البيانات اختبار شابيرو ويلك لعادته الطبيعية ، فقد تم إجراء الإحصاءات باختبار t مستقل ذي ذيلين. وإذا فشل اختبار الحالة الطبيعية، فإن اختبار "سوم" من رتبة مان - ويتني قد استخدم كبديل غير محوري. لهذه الأنواع من التجارب، تم اختيار مقارنة ضمن مجموعة للتحقيق إذا كان التحفيز الضوئي يمكن أن يغير مباشرة سلوك القلق مع مرور الوقت، مستقلة عن القلق الأساسي للحيوانات التجريبية والسيطرة. انخفضت مدة المركز بشكل كبير خلال كل من تجارب التحفيز الضوئي ، مما يشير إلى زيادة مستويات القلق. لم يتم تغيير المسافة الإجمالية التي تم نقلها، مما يدل على أن السلوك الحركي لم يتأثر. تمت زيادة عدد إدخالات المركز، وإن لم يكن بشكل ملحوظ. في الشكل 4D، يتم عرض بيانات مجموعة التحكم. لم تظهر الحيوانات التحكم أي تغييرات سلوكية بين إيقاف والتجارب على أي من المعلمات تحليلها، تبين أن التحفيز الضوء أو زرع لم يسبب الآثار الملاحظة. باختصار, هذا الاختبار يظهر زيادة القلق أثناء التحفيز الضوء من الخلايا العصبية هرمية IL عبر ChR2.

في الشكل 5، تظهر بيانات تجربة optogenetic غير ناجحة للمتاهة مرتفعة زائد. خلال تجربة المتاهة المرتفعة ، والتي يتم تقديمها في الشكل 5A، أكملت الفئران 6 تجارب من 3 دقائق لكل منها. في التجارب 1, 3 و 5 لم يتم إجراء أي تحفيز الضوء (Off1, Off2, Off3) وفي التجارب 2, 4 و 6, تم إجراء تحفيز الضوء الأزرق مع 20 هرتز (5 مللي ثانية نبض الضوء) وكثافة 1 كيلوواط (On1, On2, On3). في هذه النتائج المثالية ، لم يكن طول البروتوكول optogenetic وبناء المتاهة نفسها مناسبًا لخط الفأر المعدلة وراثياً. في الشكل 5B، يمكن أن ينظر إليه ، أن العديد من الفئران انزلقت من المتاهة مع الكفوف الخلفية أو حتى سقطت. عندما حدث هذا، حصلت الفئران فرصة ثانية لأداء EPM بعد يوم واحد. وإذا سقطوا مرة أخرى، فإنهم مستبعدون من التحليل. عندما انزلقت الفئران عدة مرات لكنها تمكنت من البقاء في المتاهة ، تم تحليل البيانات بشكل طبيعي. ومع ذلك، يجب تفسير البيانات بعناية فائقة والسيطرة على الحيوانات الحصول على أهمية أكبر. فئران Nex-Cre واجهت صعوبات حركية للبقاء على الذراعين المفتوحين الضيقين. لتجنب هذا، والجدران الصغيرة، مع ارتفاع 1 سم، قد ساعدت على عقد آمن من الكفوف الخلفية على ذراعي المتاهة. كل من heatmaps والرسوم البيانية تبين أن التجريبية ، فضلا عن الفئران التحكم ، وبدأت في تجنب الأذرع المفتوحة من المحاكمة 2 (On1) على (الشكل 5C - E). ويقل الوقت على الذراعين المفتوحين بشكل كبير لكلا المجموعتين، وكذلك إدخالات الذراع المفتوحة. تحليل المجموعة التجريبية فقط الحصول على البيانات التي تنطوي على تأثير كبير للقلق من التحفيز الضوء، والوقت على الذراع المفتوحة وفتح إدخالات الذراع انخفضت بشكل كبير خلال محاكمة On1. ومع ذلك، عند مقارنة هذه البيانات إلى مجموعة التحكم، والتي تظهر نفس السلوك، يصبح من الواضح أن السلوك الملاحظ لا يتم توسطه من قبل التحفيز optogenetic، ولكن عن طريق تجنب الذراعين المفتوحة بشكل عام بسبب التعود على المتاهة. تؤكد هذه البيانات على أهمية مجموعة التحكم المناسبة للتمييز بين التأثيرات السلوكية التي يتوسطها التحفيز البصري والتكيُّف السلوكي المحتمل. أيضا، هذه البيانات تلقي الضوء على أهمية تكييف بشكل صحيح الإعداد التجريبية لتتناسب مع خط موس محددة والسؤال التجريبي.

للتحقق من صحة وتعزيز البيانات السلوكية التي تم جمعها ، تتم إزالة أدمغة الفئران بعد التجربة الأخيرة للتحكم في الحقن والزرع الصحيحين (الشكل 6). يتم إصلاح الأدمغة في 4٪ شبهformaldehyde وإزالتها من الجمجمة. الأدمغة المجففة في السكروز 30٪ لمدة 1-2 أيام وتكد بعد ذلك. يتم غسل شرائح الدماغ الإكللية سميكة 40 ميكرومتر وتركيبها على الشرائح الهدف superfrost مع المتوسطة المتصاعدة التي تحتوي على DAPI، الذي يلطخ نواة الخلية. وهذا يتيح تحديد المناطق المستهدفة في الشرائح التاجية. الفلوريسنس من YFP-tag أو tdTomato نفسها يشير إلى موقع حقن الفيروس. في الشكل 6B يتم عرض مواقع الحقن المثالية من ChR2-YFP على اليسار (أصفر)، و tdTomato على اليمين (الأحمر). وبمساعدة قالب، مقتبس من أطلس دماغ الماوس في باكسينوس وفرانكلين^45، يمكن تحديد منطقة IL. في كلا الشرائح، يتم التعبير عن الأداة البصرية في منطقة IL، ولكن أيضا في مناطق الدماغ المجاورة. للحصول على تفسير صحيح، يتم استشارة انتشار الضوء الأزرق في أنسجة الدماغ⁸ (الشكل 1D, E). ويمكن ملاحظة أن الضوء الأزرق سيصل إلى منطقة موانئ دبي تحت IL مع أقل من 5٪ فقط من 1 كيلوواط كثافة الضوء الأولي في طرف الألياف (الخط الأزرق في الشكل 1D)⁸. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن كمية صغيرة من الضوء يذهب إلى أعلى إلى منطقة PrL بسبب تشتت الظهر⁴⁷. وبالتالي يمكن للمرء أن يقول أن المنطقة IL هو الأكثر أضاءت بقوة، ولكن المناطق المجاورة مثل منطقة موانئ دبي و PrL قد يكون أيضا حفز قليلا. ولذلك، لا يضمن التحفيز خلية IL محددة وينبغي إجراء التحليل المناعية الكيميائية للمناطق المجاورة، لمعرفة ما إذا كان نشاط خلايا PRL وDP يتم تحويرها عن طريق الضوء. في الشكل 6C، يتم عرض عنصر تحكم هام آخر: خصوصية خط الماوس Nex-Cre. عبر جسم مضاد تلطيخ ضد نوعين من الخلايا في المنطقة IL, الجلوتاماتية المبدأ العصبية وجابارجيورون, يمكن أن ينظر إليه, أن التعبير ChR2-YFP يحدث فقط في الخلايا العصبية الجلوتاتية وليس مع GABAergic منها.

الكل في الكل، تجاربنا تبين أنه مع التلاعب optogenetic أثناء الاختبار السلوكي، يمكن ملاحظة التغيرات في السلوك ذات الصلة بالقلق. باستخدام أكثر من اختبار واحد لنفس السلوك، يمكن استخلاص استنتاج موثوق بها. وبالإضافة إلى ذلك، يؤكد التحليل المناعي الكيميائي البيانات التي تم الحصول عليها. تجاربنا تشير, أن التنشيط محددة من الخلايا العصبية الهرمية في القشرة الفراية زيادة السلوك المتصلة بالقلق في بعض المقايسات.

الشكل 4: تنشيط Optogenetic من الخلايا العصبية الهرمية IL يزيد من سلوك القلق. تحفيز الضوء أثناء التجارب: 473 نانومتر، 1 ميغاواط، 20 هرتز التحفيز. A)الرسم التخطيطي لحقن وزرع موقع لChr2-YFP أو tdTomato في IL. أثناء التجربة، يتم تنشيط الخلايا العصبية الهرمية في المنطقة IL من mPFC بواسطة ChR2. شرائح الدماغ Saggital مقتبسة من Paxinos وفرانكلين ماوس أطلس الدماغ, saggital: الجانبي o, 6. ب) فتح متاهة الميدان مع بروتوكول تحفيز الضوء (20 دقيقة مع 4x5 دقيقة بالتناوب خارج وعلى التجارب; اليسار) وخرائط الحرارة من نموذجي ChR2-حقن (EXP) وtomato حقن (CT) الفئران في جميع التجارب 4 من التجربة (يمين). EXP الحيوانات قضاء وقت أقل في وسط OF عندما حفزت مع ضوء الليزر الأزرق. بالنسبة للحيوانات المقطعية، لا يختلف الوقت الذي يقضيه في المركز بين Light Off و On Trials. C)بيانات المجموعة لحيوانات EXP في OF، n = 11. الفئران تنفق وقتا أقل بكثير في وسط OF عندما حفز مع الضوء الأزرق (Off1 39.49±6.9 s، On1 19.87±4.47 ق، Off2 28.13±8.55 ق، On2 23.42±9.32 s، Off1:On1، t-test، p = 0.033، *؛ Off1: On2, MWRS, p= 0,049, *). لا تتأثر المسافة المنتقلة (Off1 2703.09±292.65 سم، On1 3113.4±491.15 سم، Off2 3331.86 ±482.62 سم، On2 3082.17±658،61 سم). # من إدخالات مركز انخفاض مع الوقت، ولكن لا تظهر أي اختلافات كبيرة (إيقاف 1 22.36±3.78، On1 18.45±3.95، Off2 17.36±1.99، On2 13.27±2.64). D)بيانات المجموعة لحيوانات CT في OF، n = 15. الوقت الذي تقضيه الفئران في وسط OF، المسافة انتقلت ، # من إدخالات مركز لا يتغير بين الضوء وخارج التجارب (الوقت في مركز Off116.73±2.65 ق ، On1 16.02±1.89 ق ، Off2 12.02±1.76 ق ، On2 13.04±2.58 s ؛ المسافة 1 3399.69±296.77 سم، On1 3210.6±446.9 سم، Off2 3030.28±513.83 سم، On2 2955±617.7 سم؛ # من مركز الإدخالات Off1 14.2±1.98، On1 13.6±2.02، Off2 10.8±1.88، On2 11.67±2.5). تظهر فئران CT قلقًا خط أساسًا أعلى بشكل ملحوظ (Off1 EXP:CT، MWRS، p=0.005، **). القيم هي متوسطة±S.E.M. * تشير إلى اختلافات كبيرة (p≤0.05)، ** تشير إلى اختلافات كبيرة (p≤0.01). t-اختبار دائما اثنين الذيل, MWRS: مان ويتني اختبار سوم رتبة; IL: القشرة اللافراعية; BLA: اللوزة البصينية; DRN: ناوية الظهرية رابي؛ من: حقل مفتوح; CT: الحيوانات السيطرة؛ EXP: تجريبي؛ L: ضوء. تم تعديل هذا الرقم من Berg et al. 2019، PLoS One⁴³ ومن Berg 2019⁴⁸. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: فشلت تجربة EPM في إظهار التأثيرات السلوكية في فئران Nex-Cre. تحفيز الضوء أثناء التجارب: 473 نانومتر، 1 ميغاواط، 20 هرتز التحفيز. أ) المتاهة المرتفعة مع بروتوكول تحفيز الضوء (18 دقيقة، 6x3 دقيقة، بالتناوب خارج وعلى التجارب). B)يتم تضمين بيانات المجموعة للفئران التي "زلة قبالة" في البيانات، إجمالي n = 23. كان لدى الفئران Nex-Cre ميلًا للانزلاق من الذراع المفتوحة بكفوها الخلفية ، مستقلة عن المجموعة التجريبية (يسار). فقط الفئران التي بقيت على المتاهة لجميع التجارب 6 تم النظر في التحليلات اللاحقة. زلة قبالة في المرحلة الأولى Off1 هي سبب لتجنب في وقت لاحق من الأسلحة المفتوحة (Off1 EXP 1.63±0.6، CT 2.2±0.79، Off2+3 EXP 0.125±0.125، CT 0±0، On1+2+3 EXP 0.625±0.26، CT 0.1±0.1). يظهر المخطط الدائري (يمين) الفئران التي تسقط من المتاهة خلال 18 دقيقة مع 42.42٪. فقط 57.57% أنهوا التجربة C) خرائط الحرارة من EXP المثالي و الفئران CT في جميع التجارب 6 من التجربة. تظهر كلتا المجموعتين انخفاضًا في مدة الذراع المفتوحة بعد تجربة Off1. D)بيانات المجموعة لحيوانات EXP في EPM، n= 12. الوقت الذي يقضيه في الأسلحة المفتوحة انخفض بشكل ملحوظ خلال أول اثنين من التجارب وبعد ذلك باستمرار (Off1 73.91±12.22 ق ، On1 36.15±14.65 ق ، Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1: On1, t-test, p=0,041, *). لا تتأثر المسافة التي تم نقلها (Off1 679.96±71.63 سم، On1 712.24±112.82 سم، Off2 717.49±97.39 سم، On2 782.51±81.11 سم، Off3 722.11±68.60 سم، On3 663.90±106.57 سم). كمية إدخالات الذراع المفتوحة يقلل بشكل ملحوظ من Off1 إلى On1 ثم يبقى ثابت (Off1 8.08±1.08، On1 3.33±0.76، Off2 2.16±0.69، On2 2.91±1.09، Off3 1.73±0.75، On3 1.73±.66. Off1: On1، t-test، p= 0.002، **). الوقت الذي يقضيه في مركز EPM ينخفض على طول التجارب ولكن لا يظهر فرقا كبيرا من خارج إلى محاكمة على (Off1 41.71±5.34 ق ، On1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E)بيانات المجموعة لحيوانات CT في EPM، n= 11. تظهر بيانات CT نفس الانخفاضات الكبيرة مثل بيانات EXP ، مما يشير إلى أن التجربة لم تعمل بشكل صحيح (الوقت في أذرع مفتوحة Off1 86.92±12.74 s ، On1 33.78±14.38 s ، Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p=0.009, **; المسافة 1 705.11±88.36 سم، On1 789.45±77.53 سم، Off2 724.74±80.49 سم، On2 676.57±111.99 سم، Off3 716.99±132.47 سم، On3 663.03±132.46 سم؛ فتح إدخالات الذراع Off1 7.09±1، On1 3.72±1.17، Off2 1.45±0.47، On2 1.36±0.58، Off3 0.91±0.43، Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MWRS, p=0.01, *; قضاء الوقت في مركز Off1 35.89 ق، On1 29.25±3.96 ق، Off2 22.17±3.58 ق، On2 15.9±2.57 s، Off3 13.86±4.2 s، On3 16.89±5.75 s). القيم هي متوسطة ± تشير S.E.M* إلى اختلافات كبيرة (p≤0.05)، ** تشير إلى اختلافات كبيرة (p≤0.01). t-اختبار هو دائما اثنين الذيل، MWRS: مان ويتني اختبار رتبة سوم; EPM: متاهة مرتفعة زائد; CT: الحيوانات السيطرة؛ EXP: تجريبي؛ الزراعة العضوية: أذرع مفتوحة. تم تعديل هذا الرقم من Berg et al. 2019، PLoS One⁴³ ومن Berg 2019⁴⁸. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: جانب الحقن من ChR2 و tdTomato في IL و Nex-Cre خصوصية. A)الرسم التخطيطي لموقع الزرع على شرائح الدماغ الإكليلية في AP + 1.66 mm, mL 0.3 mm, DV -1.8 mm, مع الحقن والزرع من جانب واحد (مقتبس من أطلس دماغ الماوس, Paxinos و Franklin, Bregma +1.54 mm). ب)مواقع حقن مثالية من ChR2-YFP (يسار، أصفر) و tdTomato (اليمين والأحمر) اندمجت مع خلايا DAPI الملون النوى (الأزرق) في الفئران Nex-Cre. شريط مقياس 1 مم. Insets تظهر التكبير عالية من منطقة IL. مقياس شريط 150 μm. تشير المربعات البيضاء إلى موقع الـ insets. C) الصف العلوي: صور من منطقة IL اليسرى من ماوس Nex-Cre ملطخة بكامكي كعلامة للخلايا العصبية الجلوتاتيكية (الأزرق)، و ChR2-YFP (أصفر) أو Gad67 كعلامة للخلايا العصبية GABAergic (الأخضر)، من فأرة Nex-Cre. الصف السفلي: الكولوكية من ChR2-YFP (الأصفر) مع CamKII (اليسار والأزرق)، ولكن ليس مع Gad67 (يمين، أخضر)، مما يدل على خصوصية الفئران Nex-Cre للخلايا العصبية الجلوتاطة. مقياس شريط 50 μm. PrL: قشرة بريليمبي; IL: القشرة اللافراعية; DP: القشرة الدونكية الظهرية. تم تعديل هذا الرقم من Berg et al. 2019، PLoS One⁴³ ومن Berg 2019⁴⁸. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

استخدام الضوء للتلاعب إشارات الخلايا العصبية كان الأسلوب المفضل لما يقرب من عقد واحد الآن. منذ عام 2005، عدد المقالات المنشورة حول تطوير أدوات optogenetic جديدة^{4،,6،,8،,14،,49،,50،,51} والدراسات حيث تستخدم هذه الأدوات للتحقيق في دوائر الدماغ^{21،23،40،43،52}، زيادة عالية. فمن ناحية، مع التنوع الهائل للأدوات البصرية القابلة للحقن، ومتغيرات الزرع، وخطوط الماوس المعدلة وراثيا، والتجارب السلوكية، فإن إمكانية إجراء التجارب متعددة وغير محدودة. من ناحية أخرى ، فإن إمكانية حدوث أخطاء في اختيار الظروف التجريبية عالية جدًا والتجارب محددة جدًا ، لدرجة أن إمكانية المقارنة مع الدراسات الأخرى غالبًا ما تكون صعبة.

خطوات هامة
إحدى الخطوات الهامة الهامة لهذا البروتوكول هي التخطيط السليم. اختيار أداة optogenetic ينبغي أن تتطابق مع المسألة العلمية. هل من الضروري فقط التلاعب بالنشاط العام للخلايا العصبية أو المشبك؟ ثم الأدوات المقدمة تجاريا مثل ChR2^21،25،27 و³⁷ آرتش هي خيار جيد. ولكن بصرف النظر عن ذلك، إذا كان ينبغي التلاعب واحد نظام الناقل العصبي الخاص أو حتى مستقبل واحد، وchimra مستقبلات الفردية وغالبا ما يكون الخيار الأفضل^3،6. العديد من الألحان مستقبلات مع GPCRs، ما يسمى Opto-XRs، والمبادئ التوجيهية لإنتاجها متاحة بالفعل^4،50. بخلاف اختيار أدوات optogenetic ، خط الماوس في تركيبة مع التجربة السلوكية هو أيضا أمر بالغ الأهمية. سلالات خلفية مختلفة، مثل على سبيل المثال C57Bl/6 و BALB/cByJ، وعرض الأنماط الظاهرية السلوكية المختلفة في بعض النواحي^53،54. C57Bl/6 الفئران لديها قلق خط الأساس منخفضة ويمكن استخدامها للتلاعب المزيل للمهينات، في حين أن BALB/cByJ تظهر مستويات أعلى من القلق وبالتالي فهي أكثر حساسية للأدوية المزيلة للقلق. بالإضافة إلى ذلك، قد تختلف المتغيرات المعدلة وراثيا من هذه السلالات الخلفية أيضا في النمط الظاهري⁴⁸. مع مزيج مناسب من المروجين محددة جنبا إلى جنب مع أداة optogenetic وخط الماوس المعدلة وراثيا، تقريبا كل السكان الخلايا المطلوبة يمكن أن تستهدف.

هناك خطوة حاسمة أثناء الجراحة هي استهداف الموقع الصحيح. مع مساعدة من أطلس الدماغ الماوس، يمكن إنشاء إحداثيات مناسبة للمحور الأمامي الأمامي، والمحور الجانبي الوسيط، وعمق الهيكل⁴⁵. في الواقع، كل جمجمة لها شكل وحجم مختلف قليلا. وهكذا، فإن عامل^F-46 لضبط إحداثيات stereotactic مهم جدا، كما هو الصحيح الأنف والأذن التثبيت أثناء جراحة مجسمة. إذا كان رأس الماوس مائلة، فإن حقن canula تفشل في استهداف المنطقة المطلوبة من الفائدة.

بالإضافة إلى ذلك، قطر كانولا الحقن هو أيضا أمر بالغ الأهمية. إذا كان صغيرا جدا، لا يمكن إطلاق أي فيروس في الأنسجة، إذا كان واسع جدا، فإن ال canula تسرب حل الفيروس في طريقها إلى المنطقة ذات الاهتمام. إذا الألياف البصرية المزروعة ينتهي مباشرة فوق المنطقة المستهدفة، والتعبير عن الفيروس في المناطق القشرة أعلاه لا يهم. ولكن إذا تم وضع الغرسة فوق المناطق الأخرى لتحفيز محطات المحاور، سيتم تنشيط محاور عصبية مناطق القشرة العليا أيضًا عن طريق الضوء وتزوير البيانات التي تم الحصول عليها. على سبيل المثال: المنطقة IL ومنطقة prelimbic (PrL) على حد سواء المشروع إلى ال amygdala القاعدية^55,56 ولكن لديها وظائف وأدوار مختلفة تماما في تعديل القلق^26,57. إذا تم وضع الزرع فوق اللوزة لتنشيط محطات أكسون من منطقة IL، وخلال حقن الفيروس تم وضع حل أيضا في برل بسبب حقن القنبل خطأ، وخطر أيضا تفعيل محطات محور عصبي من برل مرتفع جدا.

أثناء إعداد الجمجمة لتثبيت الزرع ، فإن الاستخدام المتفرق للعميات والسندات أمر بالغ الأهمية لتثبيت موثوق ودائم. إذا لم يتم تطبيق نظام التصاق مكونين، فقد ينفصل أسمنت الأسنان عن الجمجمة بعد بضعة أيام أو أسابيع. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تجفف الجمجمة تمامًا قبل تحديد الزرع ، وإلا لن يعلق الأسمنت بشكل صحيح على الجمجمة.

توجد أيضاً خطوات هامة في الجزء السلوكي من هذا البروتوكول. أولاً، إن بناء المتاهة مهم جداً. في كل الإعداد السلوكي، توجد عدة أنواع في الأدب فيما يتعلق بالحجم والشكل، وكذلك للإجراء نفسه^58،59،60. من المهم اختيار متغير يجعل البيانات قابلة للمقارنة وقابلة للتكرار. أيضا ، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار الاحتياجات الخاصة لخطوط الماوس المستخدمة^43،48. في البيانات التمثيلية لEPM يمكن أن ينظر إلى أن العديد من الفئران Nex-Cre سقطت من المتاهة أو انزلقت عدة مرات(الشكل 2b). بالنسبة لهذه الفئران، كانت متاهة ذات جدار صغير حول الذراعين المفتوحة ستكون بديلاً أفضل.

ثانيا، من المهم للحفاظ على جميع ظروف الغرفة الخارجية ثابتة^61،وإلا مجموعات مختلفة من الفئران لن تكون قابلة للمقارنة على الإطلاق. في هذا الصدد ، من المهم جدا اختيار وقت التجربة باعتبارها واحدة حيث الإعداد التجريبي شاغرة والمجرب هو دائما. وعلاوة على ذلك، ينبغي النظر في الأحداث في المبنى، مثل أعمال البناء، أو اختبار أي أنظمة (إنذار الحريق) أو يوم تنظيف مرفق الماوس، وذلك لتجنب التداخل مع البيانات التي تم الحصول عليها.

وأخيراً، فإن ظروف التعامل والسكن أمران حاسمان بالنسبة للتجارب السلوكية. عند إجراء عملية زرع، يجب أن تكون الفئران وحيدة بسبب خطر الإصابة من الفئران الأخرى. لضمان قابلية جيدة للمقارنة بين المجموعات وخطأ منخفض داخل مجموعة واحدة، كل فأرة تحتاج إلى أن يكون لها نفس حجم القفص والإثراء. للتجارب المتعلقة بالقلق، السكن واحد لديه بعض المزايا كما singe الفئران الذكور يضم تظهر مستوى القلق خط الأساس أقل، وأقل تباين في مستوى القلق، وأقل أعراض الاكتئاب مثل^15،16. مجموعة يضم الفئران الذكور قد تختلف بشدة في مستوى القلق بسبب التسلسل الهرمي بين الفئران. إلى جانب السكن ، والتعامل المستمر والمتساوي لجميع الفئران والمجموعات مهم أيضا. الاستيلاء على الماوس من أجل ربط الألياف الخفيفة على الزرع هو مرهقة للغاية. لذلك، يجب أن يكون هذا الإجراء نفسه لكل ماوس، بمعنى نفس الأسلوب ونفس المجرب. وعلاوة على ذلك، فإن الوقت المعتاد في قفص الانتظار، الذي يهدف إلى تهدئة الماوس من إجراء الاتصال المجهدة، يحتاج أيضا إلى ظروف متساوية في المدة والقمامة والموقف إلى المتاهة. معالجة داخل مرفق الماوس أيضاً أمر بالغ الأهمية للأداء السلوكي في وقت لاحق. لا ينبغي تنظيف الحيوانات التجريبية والتحكم فيها في أيام مختلفة أو من قبل أشخاص مختلفين ، لأن هذا أيضًا مرهق للفئران. بالإضافة إلى ذلك، لا ينبغي أن يكون يوم التنظيف يوم تجريبي لتجنب الاختلافات في السلوك.

استكشاف الاخطاء
هناك العديد من المشاكل التي قد تحدث أثناء البروتوكول. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي حفر كامل في الجمجمة أثناء الجراحة المجسمة إلى تلف الأوعية الدموية. عادة، يحدث نزيف قوي، وخاصة فوق البريغما و لامدا. إذا حدث هذا، لا تحاول وقف النزيف مع العصي القطن لأنها تميل إلى تمديد نزيف أكثر من وعاء بسبب امتصاصها، بدلا من ذلك، شطف مباشرة مع NaCl.

ويمكن أن يحدث أيضا أن حقن الضغط من حل الفيروس لا يعمل. في هذه الحالة، يمكن أن يكون أن البارا فيلم، وهو جرب من ثقب بور أو أنسجة الدماغ، انسداد غيض من المظلة. في هذه الحالة، قم بإزالة الـ canula ببطء من الدماغ دون تغيير محور س أو ص واستخدم ملاقط لإزالة 1-2 مم من الجزء الأمامي من طرف الـ canula. قبل خفض الـ canula مرة أخرى، اختبر الوظيفة عن طريق تطبيق كمية صغيرة من الضغط لمعرفة ما إذا كان الفيروس يخرج من طرف الـ canula. لتجنب الإمساك، قم بخفض الـ canula بسرعة ثابتة ولا تتوقف عن الحركة حتى يتم الوصول إلى أعمق عمق من جانب الحقن. إذا تم إزالة الكثير من طرف الـ canula وكان القطر كبيرًا جدًا ، فإن الـ canula سيتلف الأنسجة وسيزداد خطر تطبيق الفيروس في وقت واحد. وبالتالي، تأكد من أن يتم إزالة الجزء المسدود فقط من طرف بعناية.

أثناء التجربة السلوكية، قد يسبب إعداد التجربة في برنامج تتبع الفيديو (على سبيل المثال، Ethovision XT) مشاكل. إذا كان الناتج الضوئي لا يعمل بشكل صحيح، على سبيل المثال، يمكن أن يرجع ذلك إلى عدة أسباب. يجب فتح برنامج Pulser وبرمجته وبدء تشغيله قبل فتح Ethovision XT. يجب تحديد الجهاز بشكل صحيح في "الإعداد التجريبي" (الخطوة 3.2.2.4). إذا تم تحديد الخطأ IO-Box، أو أي شيء آخر غير "أجهزة الأزياء"، لا يمكن التحكم في جهاز Pulser بواسطة Ethovision. إذا كان اختبار إخراج الضوء ناجحاً، ولكن بروتوكول الضوء المبرمج في "إعدادات التحكم التجريبية" لا يعمل أثناء عملية الاكتساب، قد تكون القاعدة الفرعية أو مرجع القاعدة الفرعية موجود بشكل غير صحيح أو الشروط والإجراءات غير واضحة. على سبيل المثال: هل المرجع ينتمي إلى القاعدة الفرعية الصحيحة؟ هل تمت برمجة المرجع بشكل صحيح (مثلاً، كم مرة يتم تنفيذ القاعدة الفرعية)؟

بالإضافة إلى ذلك، قد يحدث أنه أثناء "إعدادات الكشف" يتم تتبع الحيوان بشكل كاف، ولكن أثناء الاستحواذ هناك عينات حيث لم يتم العثور على الموضوع. في هذه الحالة ، تحقق مما إذا كانت الإضاءة في الغرفة التجريبية قد تغيرت ، أو إذا كان أي شيء ينتج ظلالًا غير مرغوب فيها داخل المتاهة. الجزء السفلي بأكمله من المتاهة يجب أن يكون نفس اللون، كما الإعداد سوف تعمل فقط لمزيج واحد محدد. إذا كان لأي سبب من الأسباب ألوان أسفل مختلفة أو الظلال لا يمكن تجنبها، وتحديد الإعداد الكشف في الجزء أحلك من المتاهة.

لتغيير أية إعدادات بعد الحصول على الحيوانات الأولى، لا تقم بتطبيق هذه التغييرات في الإعدادات المستخدمة بالفعل. قم بتكرارها لضبطها. وهذا يعني أيضا أن التجربة المسجلة بالفعل غير صالحة بعد الآن لتحليل البيانات. في مثل هذه الحالة، تسجيل جميع الحيوانات لهذه المجموعة التجريبية مع الإعدادات الأصلية، وخلق تجربة جديدة بعد ذلك حيث يتم تحليل أشرطة الفيديو المسجلة بدلا من التتبع الحي. في هذه التجربة "من الفيديو"، يمكن استخدام العديد من الإعدادات للتحليل دون فقدان إمكانية المقارنة بين الحيوانات أو حتى البيانات.

القيود والتطبيقات المستقبلية
هذه الطريقة من التلاعب السلوك مع optogenetics في الحيوانات تتحرك بحرية ويشمل أيضا القيود. خلال الجراحة ، يتم تقييد القرب من الغرستين. لزرع مزدوج، يجب أن تكون المسافة بين يزرع اثنين الحد الأدنى من عرض الجهاز لعقد زرع. يحتاج الجهاز إلى خفض الزرع الثاني في حفرة البور ، في حين أن الغرسات الأولى ثابتة بالفعل. قد يكون الحل لهذا زرع الزاوية ، حيث يمكن أن تكون نصائح من الألياف الزجاجية قريبة جدا في حين أن خيوط السيراميك فوق الجمجمة لها مسافة أكبر^{23،55،56،57،62،63}. عيب زرع الزاوية هو انتشار الضوء. عندما يتم مائلة تلميح الألياف بدلا من من مباشرة أعلاه، والناحية حفز مختلفة. في حالة وجود منطقتين مستهدفتين على مقربة، يجب النظر في تغيير موضع تحفيز الضوء.

خلال التجربة السلوكية، قد تتداخل عملية بناء المتاهة مع الكابل البصري المتصل بالحيوان. بعض الاختبارات السلوكية، مثل مربع فاتح الظلام، تحتوي على منطقة داخلية^64و65، وغيرها من متاهات تحتوي على المقصورات التي يحتاج الماوس إلى الدخول. لا يمكن إجراء مثل هذه التجارب مع هذا الإعداد. بدلا من ذلك ، قد يكون نظام لاسلكي خيار^22،26،66. ولكن لحسن الحظ بعض متاهات، مثل متاهة بارنز، يمكن ترتيب في مثل هذه الطريقة، أن الفئران قادرة على دخول المقصورات ذات الصلة⁶⁷.

بالإضافة إلى تلك التي مع المناطق المغلقة، يمكن أن متاهات واسعة جداً يسبب مشاكل أيضا. كلما كانت مساحة المتاهة أكبر، كلما كان الكابل أطول للسماح للحيوان بالذهاب إلى كل موقع في المتاهة. يجب الحرص على أن الحيوان غير قادر على خطوة على الكابل أو الاستيلاء عليه وعضه. قد يكون الحل لذلك هو البناء الذي يلف الكابل الزائد. وهناك عيب هو أن السحب إلى إلغاء كابل من الصعب على الفئران. هذا الحل يناسب الجرذان بشكل أفضل. ويمكن أن يكون خيار آخر ممكن للقيام التحفيز الضوء مقدما، بدلا من خلال التجربة، وبطبيعة الحال هذا هو ممكن فقط إذا كان تأثير طويل الأجل بسبب تحفيز الضوء يحدث²³.

مقارنة بالأساليب القائمة/البديلة
وسوف تكون الأساليب البديلة الكيميائية أو الكهربائية التحفيز خلال السلوك^8,18. ناهضات الكيميائية أو الخصوم قادرون على تنشيط أو إسكات الخلايا العصبية عبر مستقبلات محددة ويمكن أيضا التلاعب نظم الناقل العصبي واحد^38,68. من ناحية، وخصوصية مستقبلات عالية جدا للمواد الكيميائية، لأن ناهض معين أو خصم تنشيط فقط مستقبلات معينة³⁹. من ناحية أخرى، فإن خصوصية الأنواع الفرعية مستقبلات من نفس المجموعة العصبية غالباً ما تكون غير كافية. معظم المواد الكيميائية ربط ما لا يقل عن نوعين فرعيين مع احتمالات مختلفة⁶⁹. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن للمواد الكيميائية التمييز بين أنواع الخلايا العصبية طالما أنها تمتلك نفس أنواع المستقبلات. وعلاوة على ذلك، فإن الدقة الزمانية والمكانية ضعيفة بالنسبة للتلاعبات الكيميائية بالمقارنة مع علم الوراثة البصرية. غالبا ما تدار ناهضين أو الخصوم شفويا³⁵ أو عن طريق الحقن الجهازية^57,70. إذا تم ضخ المادة الكيميائية مباشرة في أنسجة الدماغ، تظهر التأثيرات أسرع من التطبيقات الفموية، ولكن لا يزال على مقياس زمني أبطأ من مع تحفيز الضوء. كما تنتشر المواد الكيميائية تدار في الدماغ وليست محددة لأنواع الخلايا العصبية أو مناطق الدماغ, التلاعب في دوائر الدماغ محددة أنه من غير الممكن.

التحفيز الكهربائي له دقة زمنية أعلى من التحفيز الكيميائي^9،14. انتشار داخل في الأنسجة العصبية أقل من مع التحفيز الكيميائي والوضوح المكاني هو أفضل من مع التحفيز الكيميائي. ومع ذلك، التحفيز الكهربائي يفتقر إلى إمكانية معالجة أنواع الخلايا العصبية المختلفة أو أنواع مستقبلات على وجه التحديد، كما كل الخلايا العصبية في القرب من القطب سوف تستجيب للتحفيز الكهربائي.

طرق بديلة للسلوك في بحرية تتحرك الفئران هي على سبيل المثال التسجيلات الكهربائية الفيزيولوجية في شرائح الدماغ، حيث يمكن تعديل الخلايا العصبية أو المحاور واحد مع علم الوراثة البصرية والآثار التي أثارها يمكن قياسها عن طريق تسجيل^{الأقطاب الكهربائية 6،71}. التجارب في المختبر توفر إمكانية التحقيق في الأساس الجزيئي والخلوي للتحفيزات البصرية ولكن لديها قيود على أن الاتصال الجوهري والمدخلات من مناطق الدماغ الأخرى مفقودة. خيار آخر هو استخدام optogenetic بالتزامن مع التصوير متعدد الصور^1،72. في هذه الحالة ، يكون رأس الفئران ثابتًا ويمكن تخديره أو أن يكون مستيقظًا لحل المهام البسيطة.

لإجراء تجربة optogenetic ناجحة، مجموعة واسعة من الأدوات والتطبيقات المتاحة في الوقت الحاضر. اختيار أدوات optogenetic و الضبط السلوكي أمر بالغ الأهمية للإجابة على أسئلة بحثية محددة. إذا تم اختيار المزيج الصحيح من الأدوات والتجارب ، فإن optogenetics يسمح بتحقيق غير مسبوق ومتعمق في الدوائر العصبية ذات الدقة الزمنية والمكانية العالية. وهذا سيساعد على فهم وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة للأمراض النفسية والإدراك.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamin	Sigma-Aldrich	K2753-64	Anestasia
20 % Glucose	AlleMan Pharma		Injection s.c. for fast recovery
Behavioral mazes	Costum made		Measure anxiety
Bepanthen	Bayer		Ophthalmic oinment
Betaisodona	Monodipharma		Sterilant containing iodine
Betaisodona	Monodipharma		Iodine oinment
Binocular	Olympus	SZ52, 110AL0.62x WD160	Surgery
Ceramic ferrules	Thorlabs	CFLC230-10	Implant
Ceramic Fiber Scribe	Thorlabs	CSW12.5	Cutting of the glass fiber
Channelrhodopsin2-YFP virus	Penn Vector Core	Addgene 20298	Optogenetic tool
Compressed air	Kontakt Chemie	Druckluft 67	Drying of the skull
Coordinate system	Stoelting		Stereotactic coordinates for the surgery
Correl Draw			Graphical software version 13
Cryoslicer	MICROM	HM500OM	Production of brain slices for staining
Ethovision XT 14	Noldus		Software for behavioral tracking
Exel			Statistical Software
Ferrule Polishing Puck	Thorlabs	D50-F	Polishing implants round side
Fiber Patch Cord dual	Prizmatix	Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm	Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation
Fiber Patch Cord single	Prizmatix	Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm	Cable, which is connected with the implant via a sleeve
Fiber Stripping Tool	Thorlabs	T06S13	Stripping glass fiber for implant
Filter paper	VWR European	516-0300	Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test
Food pellets	Mühle Levers	Höveler Nagerfutter	Nutrition for the mice
Glass pipettes	Harvard Apparatus	GC150-10	Injection pipettes
Gradia direct-Flo	Henry Schein	103322	Fluid dental cementum
Heating lamp	efbe-Schott/Phillips	R95E	Prevent the mice from cooling after the surgery
Heating plate	Stoelting		Integrated into coordinate system
Injection canula	Braun	100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20	All injections and to bore hole into the skull
Litter		T 1350	Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test
Mouse cages	Zoonlab	405 cm^2	Single housing for experiments
Optibond FL	Kerr	26684E	Preparation of the skull for implantation
Optical glass fiber	Thorlabs	FT200EMT	Light fiber for implant
Optogenetics-LED.STSI	Prizmatix		Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R	Perfusion of mice to remove the brains
Polishing sheet 0.02 µm grit	Thorlabs	LFCF	Polishing implants round side
Polishing sheet 1 µm grit	Thorlabs	LF1D	Polishing implants round side
Polishing sheet 30 µm grit	Thorlabs	LF30D	Polishing implants round side
Polishing sheet 6 µm grit	Thorlabs	LF6D	Polishing implants round side
Pulser Software	Prizmatix		Software for light device control
Rimadyl-Carprofen	Zoetis		Analgesia
Sigma Plot			Software for statistics
Sleeve	Thorlabs	FT200EMT	Connection of implant and light cable
SodiumCloride (NaCl)	Braun	3570410	Rinsing of the skull
Superglue	Pattex Henkel		To Fix the glass fiber in the ferrule
td-Tomato virus	Penn Vector Core	Addgene 51503	Optogenetic tool
UV light	KoQGHJ	wireless, 1200 mW/cm^2	Polymeration lamp for dental cementum
Xylavet-Xylazin	cp pharma		Anesthesia