Optogenetische manipulatie van neuronale activiteit om gedrag te moduleren in vrij bewegende muizen

Summary

Met optogenetische manipulatie van specifieke neuronale populaties of hersengebieden kan gedrag worden gewijzigd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie bij vrij bewegende dieren. Door het gebruik van verschillende optogenetische tools in combinatie met chronisch geïmplanteerde optische vezels, kan een verscheidenheid aan neuronale modulaties en gedragstesten worden uitgevoerd.

Abstract

Optogenetische modulatie van neuronale circuits in vrij bewegende muizen beïnvloedt acuut en langdurig gedrag. Deze methode is in staat om manipulaties van enkele neuronen en regio-specifieke zender release uit te voeren, tot hele neuronale circuits in het centrale zenuwstelsel, en maakt de directe meting van gedragsresultaten. Neuronen drukken optogenetische instrumenten uit via een injectie van virale vectoren die het DNA van keuze dragen, zoals Channelrhodopsin2 (ChR2). Licht wordt gebracht in specifieke hersengebieden via chronische optische implantaten die eindigen direct boven het doelgebied. Na twee weken herstel en de juiste tool-expressie, muizen kunnen herhaaldelijk worden gebruikt voor gedragstests met optogenetische stimulatie van de neuronen van belang.

Optogenetische modulatie heeft een hoge temporele en ruimtelijke resolutie die kan worden bereikt met een hoge celspecificiteit, in vergelijking met de veelgebruikte methoden zoals chemische of elektrische stimulatie. Het licht is niet schadelijk voor neuronale weefsel en kan daarom worden gebruikt voor langdurige experimenten en voor meerdere gedragsexperimenten in een muis. De mogelijkheden van optogenetische instrumenten zijn bijna onbeperkt en maken de activering of uitschakeling van hele neuronen mogelijk, of zelfs de manipulatie van een specifiek receptortype door licht.

De resultaten van dergelijke gedragsexperimenten met geïntegreerde optogenetische stimulatie visualiseert direct veranderingen in gedrag veroorzaakt door de manipulatie. Het gedrag van hetzelfde dier zonder lichtstimulatie als basislijn is een goede controle voor geïnduceerde veranderingen. Dit maakt een gedetailleerd overzicht van neuronale types of neurotransmitter systemen die betrokken zijn bij specifieke gedrag, zoals angst. De plasticiteit van neuronale netwerken kan ook tot in detail worden onderzocht door middel van langdurige stimulatie of gedragswaarnemingen na optische stimulatie. Optogenetica zal helpen om neuronale signalering te verlichten in verschillende soorten neurologische ziekten.

Introduction

De modulatie van neuronale circuits in het centrale zenuwstelsel en hun gedragsresultaten zijn belangrijk om te begrijpen hoe de hersenen werken, vooral in psychiatrische ziekten en cognitieve taken zoals leren en geheugen. Met optogenetica kunnen de enige cellen of de celbevolking tot gehele kringen door licht worden gemoduleerd. Gemeenschappelijke optogenetische instrumenten zoals Channelrhodopsin2 (ChR2) of Archaerhodopsine (Arch) zijn in staat om neuronen te activeren of te dempen, of het vrijkomen van zenders te verhogen of te remmen bij axonterminals die projecteren op verschillende hersengebieden^1,,2,,3,4. Arch moet echter zorgvuldig worden gebruikt, omdat werd aangetoond dat de activering ervan bij presynaptische terminals de spontane zenderrelease^{verhoogt 5}. Arch is een naar buiten corrigerende protonpomp die de pH-waarde in de cel verandert. Dit alkalische milieu induceert calciuminstroom en verbetert de zender release⁵. Om specifiek intracellulaire signaleringstrajecten te moduleren, kunnen receptorchimera's die bestaan uit een lichtactiverend optogenetisch gereedschap, zoals rhodopsine of kegelopsine, in combinatie met een adequate G-eiwit gekoppelde receptor, worden gemaakt^6,7,8. De hoeveelheid en variatie van beschikbare optogenetische gereedschappen is de afgelopen tien jaar aanzienlijk toegenomen^.

Het doel van optogenetica is om neuronale circuits te manipuleren tijdens gedrag. Optogenetica maakt bijvoorbeeld het meten van acute gedragsveranderingen mogelijk, zoals veranderingen in angstgedrag. Optogenetische hulpmiddelen worden geleverd in doelgebieden van de hersenen via virale vectoren. Met behulp van speciale promotors en versterkers, of het Cre-loxP-systeem, kan celtype specificiteit worden gewaarborgd voor de expressie van optogenetische instrumenten(figuur 1A). Er zijn verschillende genetisch gemodificeerde muislijnen die het enzym Cre-Recombinase alleen in specifieke celtypen uitdrukken. Bijvoorbeeld, Nex-Cre muizen uitdrukken de Cre-Recombinase in piramidale neuronen in de cortex en de hippocampus onder de controle van de Nex-promotor¹⁰. Dit enzym is in staat om DNA-sequenties om te keren, die worden geflankeerd door loxP kanten¹¹. Bijgevolg kan de DNA-sequentie van een dubbel floxed optogenetic tool, die wordt omgekeerd en geflankeerd door loxP kanten, alleen worden getranscribeerd door neuronen die de Cre-Recombinasebezitten, maar niet door andere neuronale types^12,13. In het geval van Nex-Cre muizen zal het optogenetische gereedschap uitsluitend worden uitgedrukt in piramidale neuronen. Lichtstimulatie van bepaalde hersengebieden wordt dan bereikt via chronische implantatie van optische vezels direct boven het gebied van belang. Dieren kunnen dan worden gekoppeld aan een geschikte lichtbron en zich vrij gedragen in bijna allerlei gedragstesten.

Figuur 1: Injectie en implantatie. A) Cre-loxP systeem voor ChR2-YFP. Dubbele floxed optogenetic tool is verpakt in een adeno geassocieerd virus (AAV) voor injectie in het hersenweefsel. B) Sagitttal view of the virus injection and implantation of an optical neuronal interface into/above the IL region of the mPFC. Injectie en implantatie werden gedaan van bovenaf. Alle regio's van belang, IL, BLA en DRN, worden getoond. C) Gedetailleerde weergave van de geïmplanteerde glasvezel, mouw en lichtbron. D) Verspreiding van blauwe en rode laserlichtstimulatie in grijsstof hersenweefsel van een lichtvezel van 200 μm (Yizhar et al. 2011). Blauw licht verspreidt zich maximaal 0,5 mm in het weefsel, rood licht ongeveer 1 mm. Kleurcodering: rood 50%, geel 10%, groen 5%, blauw 1% als het licht dit gebied bereikt. E) Coronale weergave van de eenzijdige implantatie direct boven de linker IL met een 200 μm optische vezel. Het IL-gebied heeft een breedte van 0,25 mm per halfrond en een diepte van 0,2 mm. Blauwe en rode lampen zijn de boarder van 5% licht verspreiden en worden overgebracht van Yizhar et al. naar de juiste grootte. LoxP: locus van X-over P1; ChR2: Channelrhodopsine; YFP: geel fluorescerend eiwit; dflox: dubbel gevlobbel; IL: infralimbic cortex; BLA: basolaterale amygdala; DRN: dorsale raphe kernen; PrL: prelimbic regio. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Berg 2019⁴⁸. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Optogenetische benaderingen worden gebruikt omdat het zowel hoge temporele als ruimtelijke resolutie¹⁴ en celtypespecifieke modulatie mogelijk maakt. Bovendien is het mogelijk om het geïmplanteerde apparaat herhaaldelijk te gebruiken zonder verdere behandeling. Na een stereotactische operatie, waarbij de injectie van een adeno-geassocieerd virus met het optogenetische gereedschap en de implantatie van de optische vezel wordt uitgevoerd, kunnen muizen twee weken herstellen. We hebben gekozen voor een hersteltijd van slechts 2 weken, omdat dit genoeg tijd is om te herstellen van de operatie en voor het virus om uit te drukken. Aangezien de gedragsexperimenten worden gevolgd door immunohistochemie, moeten we ervoor zorgen dat muizen niet te oud worden tijdens het experiment; anders wordt de weefselkwaliteit verlaagd. Ze tonen geen duidelijke gedragsstoornissen van het implantaat en nemen deel aan typisch kooigedrag. Natuurlijk gaat de implantatie gepaard met een aanzienlijke chirurgische laesie; daarom worden de muizen intensief gemonitord. Na de operatie moeten muizen alleenstaand zijn, omdat groepsmuizen elkaars verse wonden en implantaten hebben verwond. Echter, huisvestingsomstandigheden hebben een grote invloed op het angstniveau van mannelijke muizen, als single gehuisvest muizen tonen lagere angstniveaus¹⁵ en in het algemeen minder depressieve-achtige symptomen¹⁶.

Chemische of elektrische manipulatie van hersencircuits ontbreekt de hoge cel type specificiteit van optogenetica en hebben een lagere temporele en ruimtelijke resolutie^14,17,18. Afhankelijk van de experimentele vraag kan elektrische of chemische stimulatie verschillende voordelen hebben. Bij het passeren van glasvezelterminals in een specifieke regio moet ook worden gestimuleerd, elektrische stimulatie is de beste methode. Chemische stimulatie is een goede keuze voor wanneer zenderspecifieke receptoren in een hele regio door agonisten moeten worden geactiveerd. Een ander groot voordeel van optogenetica in vergelijking met chemische of elektrische stimulatie is dat endogene, neuronen zijn niet gevoelig voor licht, die het optreden van bijwerkingen^{vermijdt 19}. Inderdaad, hoge lichtintensiteiten kunnen leiden tot verwarmingseffecten^8,20, maar als gevolg van de juiste controlegroepen kunnen de gedragseffecten als gevolg van optogenetische manipulatie worden geëlimineerd.

Het onderzoeken van knaagdiergedrag, vooral met betrekking tot psychiatrische ziekten, is sterk verbeterd met optogenetica bij vrij bewegende dieren, omdat het de directe modulatie van enkele receptoren tot specifieke celpopulaties²¹ en circuits²²mogelijk maakt. De mogelijkheid om de acute effecten van dergelijke modulaties te meten, evenals de gedragseffecten op lange termijn na een bepaalde tijd²³ of na chronische stimulatie^24,maakt een brede flexibiliteit van experimentele ontwerpen mogelijk en biedt zeer gedetailleerde inzichten in hersencircuits. Lichtstimulatie kan worden gebruikt om neuronen op de injectieplaats van het optogenetische gereedschap te moduleren. Wanneer zowel de injectie als de implantatie hetzelfde hersengebied aanpakken, kunnen cellichamen en rugprojecterende axonen van principiële neuronen en interneuronen in deze regio worden gericht op^3,6,8. Echter, de lichtvezel kan ook worden geïmplanteerd in een andere regio dan de geïnjecteerde. In dit geval kan lichtstimulatie het vrijkomen van zenders moduleren bij axonterminals in projectiegebieden van het geïnjecteerde gebied^25,26,27.

In de studie hier wordt optogenetica gebruikt in combinatie met experimenten om angstgerelateerd gedrag te analyseren. Angstgerelateerde psychiatrische ziekten treffen meer dan een derde van de wereldbevolking^28,29,30 en veroorzaken een hoge economische last³¹. De getroffenen hebben last van een gevoel van opwinding, spanning en zorgen, gevolgd door vermijdingsgedrag^32,33. Deze chronisch voorkomende negatieve emoties, die vooral gericht zijn op toekomstige gebeurtenissen³⁴, sterk interfereren met het dagelijks leven van patiënten. Gemeenschappelijke behandelingen zoals benzodiazepines of selectieve serotonine heropname remmers (SSRIs) zijn alleen succesvol bij sommige van de patiënten. Een groot aantal mensen reageert helemaal niet op de behandeling³⁵, waaruit blijkt dat het mechanisme dat aan dergelijke ziekten ten grondslag ligt nog niet volledig is begrepen. Het is bekend dat de mediale prefrontale cortex (mPFC) een belangrijke rol speelt bij de ontwikkeling en manifestatie van angst^{21,25,27,36,37,38}. Met name de overactivering van het infralimbic cortex (IL) gebied in het mPFC kan deel uitmaken van angstgerelateerde aandoeningen^39,40. Het hier beschreven voorbeeldexperiment kan helpen om te begrijpen hoe modulaties in het IL-gebied van het mPFC angstgedrag beïnvloeden. Bovendien kan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor angstgerelateerde psychiatrische ziekten mogelijk ook worden ondersteund.

2-6 maanden oude mannelijke Nex-Cre muizen worden gebruikt om ChR2 specifiek uit te drukken in piramidale neuronen binnen de IL regio van de mPFC⁴¹. Nex-Cre muizen hebben een C57Bl/6 achtergrond en drukken het enzym Cre-recombinase specifiek uit in piramidale neuronen. Tijdens een stereotactische operatie wordt dubbel floxed ChR2-DNA via adeno-geassocieerde virale vectoren in het IL-gebied geïnjecteerd. Het optische implantaat wordt direct boven het interessegebied(figuur 1B)geplaatst en het implantaat wordt gefixeerd met tandcement. Controledieren krijgen een injectie met dubbel floxed tdTomato-DNA in dezelfde regio om celspecifieke expressie na te bootsen.

Dieren zijn groepshuis tot de dag van de operatie en daarna zijn single gehuisvest om verwondingen van andere muizen te voorkomen. Muizen zijn ondergebracht in individuele geventileerde kooi (IVC) rekken in TypI-L kooien voor eenpersoonsmuizen. De licht-donkere cyclus volgt een 12:12 uur ritme, de lichtfase vanaf 10 uur. Alle gedragsexperimenten worden uitgevoerd in de donkere fase, die lijkt op de actieve fase van knaagdieren. Water en standaard voedsel pellets zijn beschikbaar ad libitum. Na twee weken herstel, wat zorgt voor een voldoende expressie van ChR2 in piramidale neuronen, worden muizen gebruikt voor gedragsexperimenten.

Het Open Field (OF) is een 50 cm x 50 cm kwadraat doolhof met gezandstraalde 40 cm hoge muren. De grond is verdeeld in 16 vierkanten waar de binnenste 4 het centrum vertegenwoordigen. Het gemeten gedrag is: 1) tijd doorgebracht in het centrum, 2) aantal middelste inzendingen, en 3) totale afstand verplaatst. Tijdens dit experiment zijn er 4 proeven in totaal 20 minuten. In proeven 1 en 3 treedt geen lichtstimulatie op en in proeven 2 en 4 wordt een 20 Hz-stimulatie met 5 ms lichtpuls en 1 mW lichtintensiteit van 473 nm uitgevoerd(figuur 2A). In de latere proeven werd rekening gehouden met gewenning aan het testgebied, maar het gebruik van met schijn geïnjecteerde bestrijdingsdieren geeft aan hoe gewenning wordt uitgedrukt.

De Barnes Maze is een experiment voor leren en geheugen. Het is een cirkelvormig platform met een diameter van 92 cm en bevat 20 gelijke gaten rond de omtrek. 19 van de gaten zijn gesloten en onder één gat wordt een vluchtdoos voorgesteld. Gedurende 4 opeenvolgende dagen hebben muizen 4 trainingsproeven om de locatie van de escape box te leren. Op de^5e dag wordt de escape box verwijderd en worden muizen getest op hoeveel tijd ze nodig hebben om het juiste gat te vinden. Het gemeten gedrag is: 1) Tijd tot de vluchtdoos/correct gat wordt gevonden, 2) Aantal doelbezoeken en fouten, en 3) De afstand bewogen tot in het vluchtvak. De lichtstimulatie in verschillende groepen gebeurt tijdens de verwerving of consolidatie, die plaatsvinden op de trainingsdagen 1-4, of tijdens het ophalen op de testdag, die dag 5 is (Figuur 2D).

Figuur 2: Gedragsexperimenten met optogenetische protocollen. A) Schematische tekening van het Open Veld-experiment met het bijbehorende lichtstimulatieprotocol. C) Schematische tekening van het Elevated-Plus Doolhof experiment met het bijbehorende lichtstimulatieprotocol. D) Schematische tekening van de Barnes Maze experimenteren met de bijbehorende lichtstimulatie protocol. EPM: Elevated-Plus Doolhof; VAN: Open veld; BM: Barnes Maze Test. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Berg 2019⁴⁸. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Voor optogenetische stimulatie moeten de lichtintensiteit en frequentie worden aangepast aan het optogenetische gereedschap en het neuronale type dat wordt onderzocht. De laagst mogelijke lichtintensiteit moet worden gebruikt om schade aan het weefsel te voorkomen, aangezien verschillende studies hebben aangetoond dat er mogelijke verwarmingseffecten zijn als gevolg van een sterke lichtintensiteit^8,20. Voor ChR2 wordt een 20 Hz stimulatie met een 5 ms lichtpuls vaak gebruikt². Omdat ChR2 vrij lichtgevoelig is, is 1 mW lichtintensiteit voldoende. Het lichtstimulatieprotocol wisselt af tussen licht uit en op proeven om gedragsveranderingen direct te meten. De externe ruimtevoorwaarden voor gedragsexperimenten moeten stabiel blijven voor de hele groep dieren. Belangrijke omstandigheden om te overwegen zijn het lawaai (houd er rekening mee dat apparaten zelf geluid kunnen maken), de geur (reinig altijd de gedragsopstellingen met ethanol), de lichtintensiteit en de onderzoeker. De experimentator moet altijd dezelfde persoon zijn. Bovendien moet het tijdstip van de experimenten hetzelfde zijn voor alle dieren in één groep, een paar uur na het begin van de donkere fase in de faciliteit heeft de voorkeur.

Het doel van dit experiment is het verhogen van de excitatie/remming (E/I) verhouding in het IL-gebied door sterke activering van excitatory piramidale neuronen. Een verbeterde E/I-verhouding in dit speciale cortexgebied is bekend dat het de angstniveaus bij muizen^{verhoogt 40,42,43,44}.

Protocol

Procedures voor dierproeven zijn goedgekeurd door de instellingsdieronderzoeksfaciliteit en de "Senatorin für Wissenschaft, Gesundheit und Verbraucherschutz" aan de Universiteit van Bremen (#146)

1. Bereiding van het optische implantaat⁹ (figuur 1C)

1. Plaats een keramische ferrule platte kant omhoog in een bankvise.
2. Strip de vacht van een glasvezel met een diameter van 200 μm met een vezel strippen en snijd 2-3 cm lange stukken met een keramische vezel scribe.
3. Plaats het stuk glasvezel in de keramische ferrule met een gelijkmatige overhang aan beide zijden.
4. Plaats een druppel superlijm aan de vlakke kant van de keramische ferrule met een injectie canula.
   LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
5. Haal het voorimplantaat uit de bankvise en snijd aan de ronde kant van de keramische ferrule de glasvezel zo kort mogelijk met de keramische vezel.
6. Plaats het voorimplantaat op een ferrule polijstende puck en polijst de ronde zijde op 4 verschillende polijstpapieren, door een acht 20 keer per papier te tekenen (30 μm grit, 6 μm grit, 1 μm grit en uiteindelijk 0,02 μm grit).
7. Haal het pre-implantaat uit de ferrule polijstp puck en snijd de glasvezel aan de vlakke kant van de keramische ferrule tot de lengte die nodig is voor implantatie. Begin met het meten van de lengte achter uitstekende superlijm.
   1. Voor een gelijkmatig snijden oppervlak gewoon krassen op de glasvezel 2-3 keer en dan breken.
      OPMERKING: Gebruik de muishersenenatlas van Paxinos en Franklin⁴⁵ om de lengte van het implantaat te berekenen. Het implantaat moet direct boven het interessegebied eindigen en de dikte van de schedel moet in de lengteberekening worden opgenomen. Om het IL-gebied te stimuleren, heeft de glasvezel een lengte van 1,8 mm (figuur 3).

Figuur 3: Muishersenenatlas (Paxinos en Franklin) met representatieve lengte van het implantaat om het IL-gebied te bereiken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

8. Desinfecteer het afgewerkte implantaat gedurende 10 minuten in ethanol en laat het drogen voor de implantatie.

2. Injectie en implantatie

1. Vervoer een enkele muis naar de chirurgische kamer en weeg hem. Breng anesthesie aan met een intraperitoneale injectie (i.p.) van Ketamine/Xylazine (Ketamine 0,12 mg/g, Xylazine 0,01 mg/g).
   1. Bevestig de muis met de linkerhand en draai hem op zijn rug met het hoofd laag gehouden.
   2. Richt het linker onderste kwadrant van de buik met de spuit en voer de injectie canula 1 cm onder de huid.
   3. Injecteer anesthesie in een langzame en constante beweging in de buikholte.
   4. Plaats de muis terug in zijn kooi en wacht tot hij een diepe staat van anesthesie bereikt.
      OPMERKING: De diepte van anesthesie kan worden bepaald door de afwezigheid van knipperende en tussen-tenen reflexen.
2. Plaats de muis op een verwarmingsplaat en bevestig het hoofd in een stereotactisch frame. Bevestig de neus en tanden aan de voorkant, en de oren aan beide zijden.
   OPMERKING: Het hoofd moet recht op de linker-rechter- en rostral-caudal-as zijn om de juiste stereotactische coördinaten te garanderen.
3. Breng analgesie met 2 mg/kg Carprofen onderhuids aan in de achterkant van de muis en breng ondoorzichtige oogzalf op beide ogen aan om ze te beschermen tegen drogen.
4. Bevochtig het haar op de hoofdhuid met een natte papieren handdoek en snijd het af met een schaar. Zorg ervoor dat u al het losse haar te verwijderen met de natte papieren handdoek. Om de hoofdhuid te desinfecteren, gebruik dan een katoenen stok en neem 0,5 mL van een tinctuur met jodium (Betaisodona 100 mg/mL Povidon jodium en 11 mg/mL jodium) en laat het de lucht drogen.
   LET OP: In plaats van een schaar kan ook een elektrische tondeuse worden gebruikt voor een goede ontharing.
5. Verhoog de hoofdhuid boven het gebied van belang met een pincet en snijd 1 cm langs de middellijn. Gebruik twee pincet om de huid opzij te duwen om de schedel bloot te leggen. Zorg ervoor dat u ook de dunne huid boven de schedel verwijdert en de blootgestelde schedel laat drogen.
6. Ruw de schedel voor latere implantatie.
   1. Breng een druppel fosforzuur van 2 mm x 2 mm (37%) aan van de lijmkit (bijvoorbeeld Optibond) op de schedel, verdeel het met de punt van de spuit en laat het 15 s van kracht worden.
   2. Verwijder al het zuur met een katoenen stok en spoel de schedel met 1 mL van 0,9% NaCl twee keer.
   3. Droog de schedel met een katoenen stok en perslucht.
      Let op: Fosforzuur is gevaarlijk en moet volledig worden verwijderd om weefselschade te voorkomen.
7. Bereken de F-Factor voor individuele coördinaten.
   1. Plaats een glazen canula in het stereotactische frame en lokaliseer deze direct boven bregma.
   2. Nul het coördinatensysteem en verplaats de glazen canula naar lambda.
   3. Bereken de F-factor⁴⁶ met de volgende formule:
      
   4. Vermenigvuldig de F-Factor met de coördinaten van de muishersenenatlas om ze aan te passen aan de individuele muis.
8. Boor een gat in de schedel voor injectie.
   1. Gebruik de aangepaste coördinaten om de locatie op de schedel direct boven de structuur van de rente te vinden en markeer deze met behulp van de punt van een injectiekanula door het boven het botoppervlak te krabben.
   2. Gebruik de injectie canula om een gat in de schedel te boren op de gemarkeerde locatie door het draaien van de canula ter plaatse. Als er bloed uit het braamgat lekt, spoel dan af met 1 mL van 0,9% NaCl en droog de schedel daarna.
9. Neem de virusoplossing op in de glazen canula.
   1. Plaats een druppel van 100 μL van 0,9% NaCl op de schedel en een stuk parafilm (1 cm x 1 cm) bovenop, steriele zijde omhoog.
   2. Plaats 1-2 μL virusoplossing op de parafilm en verlaag de punt van de glazen canula erin.
   3. Sluit de glazen canula aan op een spuit, breng minimale negatieve druk aan en wacht tot de virusoplossing door de canule (binnen enkele seconden) wordt opgenomen.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de toepassing van negatieve druk te stoppen, voordat lucht wordt opgepikt in de canula. Daarom zal er altijd een klein overblijfsel van het virus oplossing.
10. Injecteer de virusoplossing in de regio van belang.
    1. Plaats het virus gevulde glazen canula boven het braamgat.
    2. Laat de canula langzaam in het braamgat zakken en nul de z-coördinaat wanneer het puntje van de canula zich op het niveau van de schedel bevindt.
    3. Laat de canula voorzichtig zakken naar de laagste stand van de injectieplaats.
    4. Richt de verrekijker op de meniscus van virusoplossing in de canula.
    5. Breng een kleine hoeveelheid positieve druk met de spuit totdat de meniscus marginaal wordt verlaagd.
    6. Laat het virus zich 2-3 min verspreiden voordat u de glazen canula naar boven naar de volgende positie verplaatst.
    7. Breng de virusoplossing elke 200-300 μm toe in de hele regio van belang.
    8. Verwijder de glazen canula heel langzaam en gooi het na de laatste injectie weg.
11. Bereid de schedel voor op implantatie met de hechtingskit (bijvoorbeeld Optibond^TMFL).
    1. Droog de schedel met perslucht.
    2. Breng 5 μL primer aan (bijv. Optibond, 1-30% (Ethanol, Silicic acid, Glycerinphosphatdimethacrylat, 2-(2-(Methacryloyloxy)ethoxycarbonyl)benzoesäure, 2-Hydroxyethylmethacrylat)) met de bijbehorende stok en laat het drogen voor 15 s.
    3. Breng 5 μL binding aan (bijvoorbeeld Optibond, 15-20% 2-Hydroxyethylmethacrylat + 1-2% Alkalihexafluorosilikat(Na)) met dezelfde stok en genees het voor 20 s met UV-licht (420-480 nm).
       LET OP: Het is essentieel dat de schedel droog is en dat de primer en binding in een zeer dunne laag worden aangebracht.
       Let op: Kijk niet direct naar het UV-licht, omdat UV-licht schadelijk kan zijn voor de ogen.
12. Plaats het implantaat direct boven het interessegebied.
    1. Bevestig het implantaat in de overeenkomstige houder.
    2. Droog de schedel met perslucht.
    3. Plaats de punt van de glasvezel direct boven het braamgat en laat het voorzichtig zakken.
    4. Stop met het verlagen van het implantaat wanneer de resterende lamp van superlijm raakt de schedel. Oefen geen druk uit op de schedel!
       OPMERKING: Als de injectie en implantatie worden gedaan in verschillende regio's (bijvoorbeeld rug raphe en hippocampus),boor alle nodige gaten na het aanbrengen van fosforzuur, maar vóór de 2-component hechting, volg dan de instructies zoals eerder beschreven (stap 2.8-2.14).
13. Repareer het implantaat.
    1. Controleer of de schedel nog helemaal droog is.
    2. Breng vloeibaar tandcement (bijvoorbeeld Gradia direct flo) rond het implantaat en in de omgeving aan en moet 20 s met UV-licht (420-480 nm) gebruiken.
       OPMERKING: De hoeveelheid tandcement is afhankelijk van het vrije schedelgebied. De hele schedel moet worden bedekt met tandcement.
    3. Breng nog twee lagen cement aan en vul het vrije en gedroogde schedelgebied volledig. Genees elke laag met UV-licht (420-480 nm).
14. Maak de operatie af.
    1. Breng 0,5 g jodiumzalf (Betaisodona 100 mg/mL povidone jodium en 11 mg/mL jodium) aan bij de hele wond.
    2. Injecteer 0,1 mL glucose opgelost in 0,9% NaCl onderhuids in de nek voor snel herstel.
    3. Laat de neus- en oorfixatie los, breng de muis in een verse kooi en plaats deze onder een verwarmingslamp om verlies van lichaamswarmte te voorkomen.
    4. Als de muis wakker wordt, breng hem dan terug naar de faciliteit.
    5. Controleer ten minste eenmaal per dag de gezondheidstoestand. Neem passende maatregelen als muizen slechte constitutie vertonen (zorg bijvoorbeeld voor postoperatieve analgesie met Carprofen tot 3 dagen als muizen tekenen van pijn vertonen).
       OPMERKING: Na twee weken herstel kunnen muizen worden gebruikt voor gedragsexperimenten.

3. Het opzetten van een nieuw experiment (Voorbeeld ChR2 stimulatie en Open Field)

1. Pulser
   1. Programmeer de pulser (bijv. Prizmatix) voor lichtstimulatie.
   2. Open de software en selecteer de USB COM-poort waarop de lichtbron is aangesloten.
   3. Selecteer bewerkingsmodus kiezen (3) | Voer pulssequentie uit na trigger HIGH en stop wanneer LOW een externe software toestaat om de lichtbron te bedienen.
   4. Programmeer het lichtprotocol. Voor een stimulatie van 20 Hz met 5 ms lichtpuls: kies TI = 23 ms, P1D = 5 ms, P1I = 22 ms en P2D = 0 ms.
   5. Druk op Startvolgorde. Deze status blijft bestaan totdat de experimenten zijn voltooid.
      OPMERKING: De pulser software (Prizmatix Pulser) moet worden gelanceerd voordat de video tracking software; anders kan videotrackingsoftware het apparaat niet herkennen.
2. Videotrackingsoftware (bijvoorbeeld Ethovision XT)
   1. Maak een nieuw experiment op basis van een vooraf gedefinieerde sjabloon.
      1. Open de software, ga naar Bestand,kies Nieuw uit Sjabloon. Selecteer Een vooraf gedefinieerde sjabloon toepassen.
      2. Kies Live tracking en selecteer de camera door op Bron te drukken en bevestig de verbonden Basler GenICam.
         LET OP: Het live beeld van de camera wordt nu weergegeven in het venster rechtsboven.
      3. Druk op Next en kies het dier dat moet worden opgenomen (Knaagdieren, Muis).
      4. Druk op Volgende en selecteer de arenasjabloon Open veld, vierkant. Selecteer de zonesjabloon Center, Border, Corners en bevestig met Volgende.
      5. Bevestig 1 onderwerp dat moet worden bijgehouden met Volgende.
      6. Selecteer Center-point, nose-point en tail-base en bevestig de dierlijke kleur in vergelijking met de achtergrond als donkerder met Volgende.
      7. Bevestig de aanbevolen steekproefsnelheid van 12,5 met Volgende en voltooi de stap.
      8. Geef het experiment de juiste naam en kies een locatie die u wilt opslaan.
   2. Definieer de experimentele instellingen.
      1. Ga naar Installatie en Experimentele Instellingen. Kies Center-point, nose-point en tail-base detectie als Tracked features.
      2. Selecteer Proefbeheerhardware gebruiken en ga naar Instellingen.
      3. Selecteer Noldus USB-IO box en bevestig met Ok.
      4. Kies Aangepaste hardware als apparaattype op de TTL-poort, die is aangesloten op het pulserapparaat, en bevestig met Ok.
   3. Definieer de arena-instellingen.
      1. Ga naar Arena-instellingen en selecteer Arena-instellingen 1.
         OPMERKING: De camera opent nu automatisch een achtergrondafbeelding.
      2. Bevestig de afbeelding met Grab.
      3. Pas de vooraf gedefinieerde zones aan de echte arena aan door hun grootte te veranderen. Gebruik de pijl en de twee symbolen aan de rechterkant. Als sommige zones overbodig zijn, verwijdert u ze.
      4. Druk op 1. Teken schaal om te kalibreren en trek een lijn van de ene hoek van het doolhof naar de andere. Voer de lengte van de werkelijke afstand in cm.
      5. Herhaal dat voor de andere as.
   4. Test of de lichtstimulatie werkt.
      1. Ga naar Arena - Hardware Mapping en selecteer Testen op de grijze balk.
      2. Selecteer Command Output 1 High en druk op Test.
         OPMERKING: Er moet licht worden uitgezonden vanaf het einde van de glasvezel. Bij het selecteren van Output 1 Laag en Testmoet de stimulatie stoppen.
   5. Definieer de instellingen voor proefbesturingselementen voor 20 minuten experiment. Stel proeven Off1, On1, Off2 en On2 in om elk 5 minuten lang te zijn.
      1. Ga naar Proefbesturingselementinstelling en selecteer De duur van 30 minuten bijhouden.
      2. Bereid de hoofdregel voor door de voorwaarde aan te passen: Tijd tot 20 minuten door Instellingen te selecteren en 30 tot 20 minuten te wijzigen. Bevestig met Ok.
         LET OP: De voorwaarde voor startbaan moet zijn wanneer het onderwerp is in arena voor 2 seconden. Op die manier zal het systeem automatisch beginnen met het bijhouden wanneer de muis zich in de arena bevindt.
      3. Maak een subregel voor de lichtstimulatie: Ga naar Structuren, meer en selecteer Subregel.
      4. Geef het een naam, zoals licht stimulatie protocol.
      5. Plaats het onder de hoofdregel en spreid de twee vakken door het blauwe gebied met de muis courser te selecteren.
      6. Ga naar Voorwaarden, Tijd en geef het een naam als licht op 1.
      7. Voorwaarde aanpassen wordt na 5 minuten opgevangen. Bevestig met Ok.
      8. Plaats het vak direct achter het vak Regel Begin van de subregel door het naar de zwarte lijn te trekken.
      9. Ga naar actie | Aangepaste hardware en noem het: licht AAN 1.
      10. Selecteer Actie om uit te voeren als Uitvoer 1 Hoog en bevestig met Ok.
      11. Plaats de doos direct achter de condition box.
          LET OP: Nu na 5 minuten van het experiment moet de lichtstimulatie beginnen.
      12. Herhaal de stappen om de tijdvoorwaarde te definiëren Na 5 minuten en de actie Output 1 Low om de lichtstimulatie na nog eens 5 minuten te stoppen.
      13. Herhaal de stappen opnieuw om een ander licht Uit en licht op proef te programmeren.
      14. Ga naar structuren | Subregelverwijzing en controleer of de verwijzing tot de juiste subregel behoort.
      15. Kies Voorwaarden starten als Zonder vertraging en Voorwaarden stoppen als Eenmaal uitvoeren per startvoorwaarde. Bevestig met Ok.
      16. Plaats het referentievak tussen actievak 1 en voorwaardevak 2 van de hoofdregel en teken een lijn uit Actie - begintrack naar de verwijzing.
          OPMERKING: Nu wordt de hoofdregel direct gestart met de subregel na het starten van de track.
   6. Definieer de detectie-instellingen om het systeem te laten zien wat het moet bijhouden.
      1. Ga naar Detectie-instellingen en selecteer Detectie-instellingen 1.
      2. Plaats een testmuis in de arena en selecteer Geautomatiseerde installatie.
      3. Kies Knaagdier als diertype en gebruik de muis curser om een doos rond de muis in de arena te tekenen. Bevestig de resultaten OK? vraag met Ja.
   7. Definieer de proeflijst voor alle proefdieren die moeten worden gevolgd.
      1. Ga naar proeflijst en plan alle dieren om vandaag nog op te nemen: Selecteer Proefversies toevoegen en selecteer een getal.
      2. Selecteer alle voorwaarden die voor elke muis zijn gedefinieerd.
      3. Noem de Animal-ID en de Behandeling correct om de analyse later te vereenvoudigen.
         OPMERKING: De Animal-ID is niet relevant voor het systeem en alleen belangrijk voor latere gegevensanalyse door de onderzoeker. De groepering in de groep Behandeling en Controle is belangrijk voor het systeem om te weten hoe te groeperen en hoe alle tracks te vergelijken in latere analysestappen.
   8. Ga naar Acquisitie en begin met het experiment.

4. Open Veld experiment (angst)

1. Breng de experimentele muis naar de gedragsruimte vlak voor het experiment om een goed niveau van angst te garanderen.
   OPMERKING: De gedragsexperimenten moeten worden uitgevoerd tijdens de donkere fase wanneer muizen wakker zijn, en altijd in hetzelfde tijdslot om vergelijkbaarheid te garanderen.
2. Koppel de muis via een mouw aan de lichtbron door hem voorzichtig op het rooster van de kooi te drukken.
3. Plaats het in een wachtkooi met vers strooisel gedurende 10 minuten om te wennen aan de lichtkabel.
4. Begin met acquisitie door op de startknop in de videotrackingsoftware (bijvoorbeeld Ethovision XT) te drukken.
5. Breng de muis vanuit de wachtkooi naar de linker bovenhoek van het open veld. Verwijder de arm binnen 2 seconden om te voorkomen dat het bijhouden van een arm in plaats van de muis.
6. Verlaat het gezichtsveld van de muis tijdens het experiment en blijf kalm.
7. Na 20 minuten, wanneer het experiment is voltooid, verwijder de muis uit het doolhof, koppel de lichtkabel los en zet hem terug in zijn kooi.
8. Breng de muis terug naar de faciliteit.

5. Barnes Maze (leren)

1. Breng alle experimentele muizen naar de gedragsruimte ongeveer 1 uur voor het experiment.
2. Bereid het Barnes Maze voor door alle gaten behalve één te sluiten, waaronder een escape box wordt geplaatst. Plaats een muur van karton in het midden van het platform, dat is het startgebied voor de muis.
3. Sluit bij beide implantaten één muis aan op de lichtbron (mouw op een lichtkabel).
4. Plaats de muis direct in het midden van de Barnes Maze in de muur van karton, die voorkomt dat de muis rond te rennen voordat het experiment begint.
5. Druk op Start in de videotrackingsoftware (bijvoorbeeld Ethovision XT) en verwijder de doos.
   OPMERKING: De software volgt de muis totdat het juiste gat is bereikt, maar wees bereid om de proef handmatig te stoppen voor het geval de software de overgang van het gat niet herkent.
6. Haal de muis uit het doolhof en verwijder de verbinding met de lichtkabel.
   OPMERKING: Als dit een trainingsdag is met meerdere proeven per muis, laat de muis dan in de wachtkamer naast de gedragsruimte tot de volgende trainingssessie begint. Als dit de testdag was met slechts één testproef per muis, breng de muis dan terug naar de faciliteit.

6. Gegevensanalyse (Voorbeeld open veldgegevens met 4 te onderscheiden proeven)

1. Videotrackingsoftware (bijvoorbeeld Ethovision XT)
   1. Definieer de experimentele groepen en proeven in het gegevensprofiel.
      1. Ga naar gegevensprofielen aan de linkerkant en kies Behandeld versus controle.
      2. Ga naar Nesten in het nieuwe venster links en selecteer Proefbesturingselementstatus.
      3. Kies het statusinterval in de actie Element: start Track to the Element Action: light goes ON 1.
      4. Plaats het nestkastje tussen de behandeling van het filtervak en het bijbehorende resultaatvak.
         OPMERKING: Dit gedefinieerde interval is Off1, dat de eerste 2,5 minuten van het experiment beschrijft waar geen lichtstimulatie aanwezig is.
      5. Herhaal de stappen voor intervallen On1 (van element Actie: licht gaat op 1 naar het element Action: licht gaat uit 1), Off2 (van het element Action: licht gaat uit 1 naar het element licht gaat aan 2)en On2 (van het element Actie: licht gaat op 2 naar het element Actie: stoptrack).
      6. Herhaal de 4 intervallen voor de controlefiltergroep.
         LET OP: Elke nestkast heeft een eigen resultaatvak nodig met de namen Off1, On1, Off2, On2. Nu zijn zowel de behandeling als de controlegroep verdeeld in 4 verschillende lichtstimulatieproeven die afzonderlijk worden geanalyseerd.
   2. Definieer de parameters die u moet analyseren in het analyseprofiel.
      1. Ga naar Analyseprofielen aan de linkerkant en selecteer In zones.
      2. Selecteer de afhankelijke variabele in zone en selecteer Centrum als zone.
      3. Dubbelklik op In het midden en kies een van de geselecteerde punten en selecteer alleen in het midden.
      4. Ga voordat u het venster verlaat naar Proefstatistieken en selecteer Frequentie, Cumulatieve duur en Latentie eerst.
      5. Voeg de verplaatste afhankelijkevariabele afstand toe .
         OPMERKING: Kies in groepsstatistiekenof u de standaardfout of standaarddeviatie als fout wilt gebruiken. Met dit profiel zijn de gegevens beschikbaar voor tijd die in het midden wordt doorgebracht, Center-items en Totale verplaatste afstand.
   3. Gegevens extraheren
      1. Ga naar Resultaten en selecteer Statistieken en Grafieken.
      2. Druk op Berekenen om de geanalyseerde gegevens te bekijken.
         OPMERKING: De proefstatistieken geven informatie over elke muis- en groepsstatistieken analyseert het gemiddelde en de fout voor beide groepen, verdeeld in 4 proeven met de bijbehorende balkplot.
      3. Druk op Gegevens exporteren en selecteer de proefstatistieken en de locatie die u wilt opslaan.
         OPMERKING: De geëxporteerde gegevens worden opgeslagen als een Excel-bestand en met afzonderlijke waarden voor elke muis. In dit Excel-bestand helpt de Animal-ID de muizen te identificeren.
      4. Ga naar Heatmap Visualisatie en druk op Plot Heatmaps.
      5. Selecteer Rechtsversies om individuele heatmaps voor elke muis en proef te bekijken.
      6. Klik met de rechtermuisknop op de muis en exporteer heatmaps als afbeeldingen.
2. Plotten
   1. Open het spreadsheetbestand op de computer en bereken de middelen en standaardfouten (SEM) voor alle 4 de proeven in elke gemeten toestand en groep.
   2. Grafieken genereren in een statistiekenprogramma (bijvoorbeeld Sigma Plot).
      1. Kopieer de middelen en SEM in de juiste volgorde van het spreadsheetbestand naar Sigma Plot. De rijen moeten de gegevens voor Off1, On1 etc. bevatten en de kolommen bevatten trial, mean en SEM als hoofden.
      2. Selecteer alle drie de kolommen en ga naar Grafiek maken.
      3. Selecteer het vak Balk en kies niet-gegroepeerde balken met fout (bovenste rij, derde vak).
      4. Bevestig met Voltooien om een nieuwe grafiekpagina te openen.
      5. Label de hele grafiek, ga dan naar Start,selecteer het vak Grafiek aan de linkerkant en druk op Exporteren. Selecteer een doelmap en kies MetaFile (*.wmf) als indeling.
         OPMERKING: De .wmf-indeling kan later worden verwerkt in een grafische software zoals CorelDraw.
   3. Gegevens berekenen voor verkregen gegevens.
      1. Kopieer ruwe gegevens uit de spreadsheet (Off1, On1 etc.) naar enkele kolommen van Sigma Plot.
      2. Markeer de kolommen om te vergelijken en ga naar Analyse,kies t-test en druk op Uitvoeren.
      3. Bevestig de gegevensindeling Raw met Volgende en voer de test uit met Voltooien.

Representative Results

Het doel van dit protocol is om veranderingen in het gedrag van genetisch gemodificeerde muizen te meten tijdens een optogenetisch experiment. Optogenetische manipulatie wordt gedaan door injectie van een adeno geassocieerde virale vector. Lichtstimulatie bij vrij bewegende muizen is mogelijk via implantatie van een lichtvezel direct boven het bezienswaardighedengebied.

In figuur 4worden de resultaten van een optogenetisch experiment gepresenteerd. Een sterke activering van excitatory piramidale neuronen in de IL regio via ChR2 verhoogde angst-gerelateerd gedrag in het Open Veld. ChR2 werd geïnjecteerd in het IL-gebied van het mPFC in Nex-Cre muizen voor expressie in piramidale neuronen(figuur 4A). Tijdens twee angsttests, het Open Field (Figuur 4B,C) en de Novelty-Suppressed Feeding test (Figuur 4F,G), wordt ChR2 gestimuleerd met blauw licht en activeert piramidale neuronen. Als controle kreeg een andere groep muizen een injectie van de fluorofofoever tdTomato in plaats van ChR2 (figuur 4D,G). In een dergelijk experiment wordt angst gedefinieerd als het vermijden van het helderdere centrale gebied. Muizen vertonen een intrinsieke vermijding van open gebieden omdat ze bang zijn voor roofdieren.

In het experiment Open Veld, weergegeven in figuur 4B,voerden muizen 4 proeven van elk 5 minuten uit. In de proeven 1 en 3 trad geen lichtstimulatie op (Off1,2) en in de proeven 2 en 4 werd blauwe lichtstimulatie met 20 Hz (5 ms lichtpuls) en 1 mW-intensiteit uitgevoerd (On1,2). De heatmaps laten zien dat in de experimentele groep de centrumduur verschilde tussen Uit en Op proeven. Tijdens lichtstimulatie blijven muizen bij voorkeur in het grensgebied. Controledieren geven ook de voorkeur aan de grens, maar veranderen hun gedrag niet bij lichtstimulatie. In figuur 4Cworden de belangrijkste gedragsmetingen tijdens het Experiment Open Veld getoond voor de experimentele groep. Als de gegevens geslaagd voor de Shapiro-Wilk test voor normaliteit, statistieken werden gedaan met een onafhankelijke twee-tailed t-test. Als de normaliteitstest mislukte, werd de Mann-Whitney-Rank Sum-test gebruikt als niet-parametrisch alternatief. Voor dit soort experimenten werd gekozen voor een binnengroepsvergelijking om te onderzoeken of lichtstimulatie het angstgedrag in de loop van de tijd direct kan veranderen, onafhankelijk van de basisangst van experimentele en controledieren. De centrumduur daalde aanzienlijk tijdens beide lichtstimulatieproeven, wat wijst op verhoogde angstniveaus. De totale verplaatste afstand werd niet gewijzigd, waaruit blijkt dat het bewegingsgedrag niet werd beïnvloed. Het aantal middelste inzendingen werd verhoogd, hoewel niet significant. In figuur 4Dworden de gegevens van de controlegroep weergegeven. Controledieren vertoonden geen gedragsveranderingen tussen Uit en Op proeven in een van de geanalyseerde parameters, waaruit bleek dat lichtstimulatie of implantatie niet de waargenomen effecten heeft veroorzaakt. Kortom, deze test toont verhoogde angst tijdens lichtstimulatie van IL piramidale neuronen via ChR2.

In figuur 5worden de gegevens van een mislukt optogenetisch experiment weergegeven voor het Elevated-Plus Doolhof. Tijdens het Elevated-Plus Maze-experiment, dat wordt gepresenteerd in figuur 5A,voltooiden muizen 6 proeven van elk 3 minuten. In de proeven 1, 3 en 5 werd geen lichtstimulatie uitgevoerd (Off1, Off2, Off3) en in de proeven 2, 4 en 6 werd blauw lichtstimulatie met 20 Hz (5 ms lichtpuls) en 1 mW intensiteit uitgevoerd (On1, On2, On3). In deze voorbeeldige resultaten waren de lengte van het optogenetische protocol en de constructie van het doolhof zelf niet geschikt voor de transgene muislijn. In Figuur 5B, kan worden gezien, dat verschillende muizen gleed uit het doolhof met hun rugpoten of zelfs naar beneden viel. Toen dit gebeurde, muizen kreeg een tweede kans om de EPM uit te voeren een dag later. Als ze weer naar beneden vielen, werden ze uitgesloten van analyse. Toen muizen meerdere keren uitgleed, maar erin slaagden om op het doolhof te blijven, werden de gegevens normaal geanalyseerd. Niettemin moeten de gegevens zeer zorgvuldig worden geïnterpreteerd en worden de controledieren belangrijker. Nex-Cre muizen hadden motorische problemen om op de smalle open armen te blijven. Om dit te voorkomen, kleine muren, met een hoogte van 1 cm, zou hebben geholpen voor een veilige greep van de achterpoten op de armen van het doolhof. Zowel de heatmaps als de grafieken laten zien dat experimentele, evenals controlemuizen, begonnen met het vermijden van de open armen van proef 2 (On1) op (Figuur 5C-E). De tijd op de open armen is aanzienlijk afgenomen voor beide groepen, net als de open arm inzendingen. Het analyseren van de experimentele groep alleen verkregen gegevens impliceert een groot anxigeen effect van de lichtstimulatie, als tijd op de open arm en open arm ingangen zijn aanzienlijk verminderd tijdens de On1 proef. Echter, bij het vergelijken van deze gegevens met de controlegroep, die hetzelfde gedrag vertonen, wordt het duidelijk dat het waargenomen gedrag niet wordt bemiddeld door de optogenetische stimulatie, maar door het vermijden van de open armen in het algemeen als gevolg van gewenning aan het doolhof. Deze gegevens onderstrepen het belang van een goede controlegroep om onderscheid te maken tussen gedragseffecten die worden bemiddeld door optogenetische stimulatie en mogelijke gedragsaanpassing. Ook werpt deze gegevens licht op het belang van het goed aanpassen van een experimentele setup aan de specifieke mousselijn en experimentele vraag.

Om verzamelde gedragsgegevens te valideren en te versterken, worden de hersenen van muizen verwijderd na het laatste experiment om de juiste injectie en implantatie te controleren(figuur 6). Hersenen zijn vastgesteld in 4% paraformaldehyde en verwijderd uit de schedel. Hersenen zijn uitgedroogd in 30% sacharose gedurende 1-2 dagen en cryosliced daarna. De 40 μm dikke coronale hersenplakjes worden gewassen en gemonteerd op superfrost objectieve glijbanen met een montagemedium met DAPI, dat celkernen bevlekt. Dit maakt de identificatie van doelgebieden in de coronale plakjes mogelijk. Fluorescentie van de YFP-tag of tdTomato zelf geeft de locatie van de virusinjectie aan. In figuur 6B worden de voorbeeldige injectieplaatsen van ChR2-YFP aan de linkerkant (geel) en tdTomato aan de rechterkant (rood) gepresenteerd. Met behulp van een sjabloon, aangepast aan de Paxinos en Franklin⁴⁵ muis hersenatlas, kan de IL-regio worden geïdentificeerd. In beide dia's wordt het optogenetische gereedschap uitgedrukt in het IL-gebied, maar ook in aangrenzende hersengebieden. Voor een goede interpretatie wordt de verspreiding van blauw licht in hersenweefsel geraadpleegd⁸ (Figuur 1D,E). Men kan zien dat het blauwe licht de DP-regio onder de IL zal bereiken met slechts minder dan 5% van de initiële 1 mW-lichtintensiteit bij de vezelpunt (Blauwe lijn in figuur 1D)⁸. Bovendien kan kleine hoeveelheid licht omhoog gaan naar de PrL-regio als gevolg van back-scattering⁴⁷. Bijgevolg kan men zeggen dat de IL-regio het sterkst wordt verlicht, maar aangrenzende regio's zoals de DP- en PrL-regio kunnen ook enigszins worden gestimuleerd. Daarom is il-celspecifieke stimulatie niet gegarandeerd en moet immunohistochemische analyse van de aangrenzende gebieden worden uitgevoerd om te zien of de activiteit van PrL- en DP-cellen via licht wordt gemoduleerd. In figuur 6Cwordt een andere belangrijke controle getoond: de specificiteit van de Nex-Cre muislijn. Via antilichaam kleuring tegen de twee celtypen in het IL-gebied, glutamatergic principe neuronen en GABAergic interneurons, kan worden gezien, dat de ChR2-YFP-expressie alleen voorkomt in glutamatergic neuronen en niet met GABAergic degenen.

Al met al tonen onze experimenten aan dat met optogenetische manipulatie tijdens gedragstesten veranderingen in angstgerelateerd gedrag kunnen worden waargenomen. Door meer dan één test voor hetzelfde gedrag te gebruiken, kan een betrouwbare conclusie worden getrokken. Bovendien bevestigt immunohistochemische analyse de verkregen gegevens. Onze experimenten suggereren, dat de specifieke activering van piramidale neuronen in de infralimbic cortex toegenomen angst-gerelateerd gedrag in bepaalde testen.

Figuur 4: Optogenetische activering van IL piramidale neuronen verhoogt angstgedrag. Lichtstimulatie tijdens experimenten: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulatie. A) Schematische tekening van injectie- en implantatieplaats voor ChR2-YFP of tdTomato in de IL. Tijdens het experiment worden piramidale neuronen in het IL-gebied van het mPFC geactiveerd door ChR2. Saggital brain slices aangepast van de Paxinos en Franklin muis hersenen atlas, saggital: laterale o,6. B) Open Field doolhof met licht stimulatie protocol (20 min met 4x5 min afwisselend Off en Op proeven; links) en warmtekaarten van voorbeeldige ChR2-geïnjecteerd (EXP) en tdTomato geïnjecteerd (CT) muizen in alle 4 proeven van het experiment (rechts). EXP dieren besteden minder tijd in het centrum van de OF wanneer gestimuleerd met blauw laserlicht. Voor CT-dieren verschilt de tijd die in het centrum wordt doorgebracht niet tussen licht uit en op proeven. C) Groepsgegevens voor EXP-dieren in het OF, n=11. Muizen besteden aanzienlijk minder tijd in het midden van de OF wanneer gestimuleerd met blauw licht (Off1 39.49±6,9 s, On1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p = 0.033, *; Off1:On2, MWRS, p=0,049, *). Afstand verplaatst wordt niet beïnvloed (Off1 2703.09±292,65 cm, On1 3113.4±491.15 cm, Off2 3331.86 ±482.62 cm, On2 3082.17±658,61 cm). # van het centrum inzendingen afnemen met de tijd, maar tonen geen significante verschillen (Off 1 22.36±3.78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D) Groepsgegevens voor CT-dieren in het OF, n=15. De muizen van de tijd besteden in het centrum van VAN, de verplaatste afstand, # van middelste ingangen verandert niet tussen lichte Aan- en Uit-proeven (Tijd in het midden Off116.73±2,65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Afstand Off1 3399,69±296,77 cm, On1 3210,6±446,9 cm, Off2 3030,28±513,83 cm, Op2 2955±617,7 cm; # van het centrum ingangen Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). CT-muizen vertonen aanzienlijk hogere baseline angst (Off1 EXP:CT, MWRS, p=0.005, **). Waarden zijn gemiddelde±S.E.M. * wijzen op significante verschillen (p≤0,05), ** wijzen op significante verschillen (p≤0,01). t-test altijd twee-tailed, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; IL: infralimbic cortex; BLA: basolaterale amygdala; DRN: dorsale raphe kernen; VAN: Open veld; CT: controledieren; EXP: proefdier; L: licht. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Berg et al. 2019, PLoS One⁴³ en van Berg 2019⁴⁸. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: EPM-experiment heeft geen gedragseffecten bij Nex-Cre-muizen laten zien. Lichtstimulatie tijdens experimenten: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulatie. A) Elevated-Plus Doolhof met lichtstimulatie protocol (18 min, 6x3 min, afwisselend Off en Op proeven). B) Groepsgegevens voor de muizen die "uitglijden" worden opgenomen in de gegevens, totaal n=23. Nex-Cre muizen hadden de neiging om met hun rugpoten van de open arm af te glijden, onafhankelijk van de experimentele groep (links). Alleen muizen die voor alle 6 de proeven in het doolhof bleven, werden in latere analyses meegenomen. Slip off's in de eerste Off1 fase zijn reden voor latere vermijden van de open armen (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0,79, Off2+3 EXP 0,125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0,625±0,26, CT 0,1±0.1). Pie grafiek (rechts) toont muizen vallen uit het doolhof tijdens de 18 min met 42,42%. Slechts 57,57% maakte het experiment af. C) Heat kaarten van voorbeeldige EXP en CT muizen in alle 6 proeven van het experiment. Beide groepen vertonen een afname van de open armduur na de Off1-proef. D) Groepsgegevens voor EXP-dieren in de EPM, n=12. De tijd doorgebracht in de open armen aanzienlijk gedaald tijdens de eerste twee proeven en voortdurend daarna (Off1 73.91±12.22 s, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p=0.041, *). De verplaatste afstand wordt niet beïnvloed (Off1 679.96±71,63 cm, On1 712.24±112,82 cm, Off2 717,49±97,39 cm, On2 782,51±81,11 cm, Off3 722,11±68,60 cm, On3 663,90±106,57 cm). Het aantal open armingangen daalt aanzienlijk van Off1 naar On1 en blijft dan constant (Off1 8.08±1.08, On1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Off1:On1, t-test, p=0.002, **). De tijd doorgebracht in het centrum van de EPM vermindert langs proeven, maar toont geen significant verschil van Off naar On trial (Off1 41.71±5.34 s, On1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E) Groepsgegevens voor CT-dieren in de EPM, n=11. CT-gegevens tonen dezelfde significante dalingen als EXP-gegevens, wat aangeeft dat het experiment niet goed heeft gewerkt (Tijd in open armen Off1 86,92±12,74 s, On1 33,78±14,38 s, Off2 18.01±11,61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p=0.009, **; Afstand Off1 705,11±88,36 cm, Op1 789,45±77,53 cm, Off2 724,74±80,49 cm, On2 676,57±111,99 cm, Off3 716,99±132,47 cm, On3 663,03±132,46 cm; Open arm inzendingen Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MWRS, p=0.01, *; Tijd doorbrengen in het centrum Off1 35.89 s, On1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). Waarden zijn gemiddelde ± S.E.M. * wijzen op significante verschillen (p≤0,05), ** wijzen op significante verschillen (p≤0,01). t-test is altijd twee-tailed, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; EPM: Elevated-Plus Doolhof; CT: controledieren; EXP: proefdier; OA: open armen. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Berg et al. 2019, PLoS One⁴³ en van Berg 2019⁴⁸. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Injectiezijde van ChR2 en tdTomato in de IL- en Nex-Cre-specificiteit. A) Schematische tekening van de implantatieplaats op coronale hersenplakken bij AP + 1,66 mm, mL 0,3 mm, DV -1,8 mm, met eenzijdige injectie en implantatie (aangepast van muishersenenatlas, Paxinos en Franklin, Bregma +1,54 mm). B) Voorbeeldige injectieplaatsen van ChR2-YFP (links, geel) en tdTomato (rechts, rood) samengevoegd met DAPI gekleurde celkernen (blauw) in Nex-Cre muizen. Schaalbalk 1 mm. Insets tonen een hoge vergroting van de IL-regio. Schaalbalk 150 μm. Witte vakken geven de locatie van insetsaan . C) Bovenste rij: confocale beelden van de linker IL-regio van een Nex-Cre muis bevlekt met CamKII als een marker voor glutamatergic neuronen (blauw), en ChR2-YFP (geel) of Gad67 als een marker voor GABAergic neuronen (groen), van een Nex-Cre muis. Onderste rij: colocalisatie van ChR2-YFP (geel) met CamKII (links, blauw), maar niet met Gad67 (rechts, groen), met specificiteit van Nex-Cre muizen voor glutamatge neuronen. Schaalbalk 50 μm. PrL: prelimbic cortex; IL: infralimbic cortex; DP: dorsale pedunculaire cortex. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Berg et al. 2019, PLoS One⁴³ en van Berg 2019⁴⁸. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Met behulp van licht te manipuleren neuronale signalering is de methode van keuze voor bijna een decennium nu. Sinds 2005, het aantal gepubliceerde artikelen over de ontwikkeling van nieuwe optogenetische instrumenten^{4,6,8,14,49,50,51} en studies waar dergelijke instrumenten worden gebruikt om hersencircuits²¹,^23,,40,^43,,52te onderzoeken , sterk toegenomen. Aan de ene kant, met de enorme diversiteit aan injecteerbare optogenetische instrumenten, implantatie varianten, transgene muislijnen en gedragsexperimenten, de mogelijkheid voor experimenten is spruitstuk en onbeperkt. Aan de andere kant is de mogelijkheid om fouten te maken bij het kiezen van experimentele omstandigheden zeer hoog en de experimenten zijn zo specifiek, dat vaak de vergelijkbaarheid met andere studies moeilijk is.

Kritieke stappen
Een belangrijke belangrijke stap van dit protocol is een goede planning. De keuze van het optogenetische instrument moet overeenkomen met de wetenschappelijke vraag. Is het alleen nodig om de algehele activiteit van een neuron of synaps te manipuleren? Dan commercieel geleverde tools zoals ChR2^21,25,27 en Arch³⁷ zijn een goede keuze. Maar afgezien van dat, als een speciale neurotransmitter systeem of zelfs een enkele receptor moet worden gemanipuleerd, een individuele receptor chimaera is vaak de betere keuze^3,6. Verschillende receptor chimaera's met GPCRs, de zogenaamde Opto-XRs, en richtlijnen om ze te produceren zijn al beschikbaar^4,50. Naast de keuze van optogenetische gereedschappen is de muislijn in combinatie met het gedragsexperiment ook van cruciaal belang. Verschillende achtergrondstammen, zoals bijvoorbeeld C57Bl/6 en BALB/cByJ, vertonen in sommige opzichten verschillende gedragsfenotypes^53,54. C57Bl/6 muizen hebben een lage baseline angst en kunnen worden gebruikt voor anxiogene manipulatie, terwijl BALB/cByJ hogere angstniveaus vertoont en daarom gevoeliger is voor anxiolytische geneesmiddelen. Bovendien kunnen de transgene varianten van deze achtergrondstammen ook variëren in hun fenotype^48. Met een goede combinatie van specifieke promotors in combinatie met een optogenetisch gereedschap en transgene muislijn, kan bijna elke gewenste celpopulatie worden gericht.

Een kritieke stap tijdens de operatie is gericht op de juiste locatie. Met behulp van de muis hersenatlas, de juiste coördinaten voor de voorste-achterste as, en mediale-laterale as, en diepte van de structuur kan worden vastgesteld⁴⁵. In werkelijkheid heeft elke schedel een iets andere vorm en grootte. Zo is de F-factor⁴⁶ om de stereotactische coördinaten aan te passen heel belangrijk, net als de juiste neus- en oorfixatie tijdens stereotactische chirurgie. Als het hoofd van de muis wordt gekanteld, zal de injectiekanula niet het gewenste gebied van belang richten.

Bovendien is de diameter van de injectie canula ook van cruciaal belang. Als het te klein is, kan er geen virus in het weefsel worden vrijgegeven, als het te breed is, zal de canula virusoplossing lekken op weg naar het gebied van belang. Als de geïmplanteerde optische vezel eindigt direct boven het doelgebied, de virusexpressie in de cortex regio's hierboven maakt niet uit. Maar als het implantaat boven andere regio's wordt geplaatst om axonterminals te stimuleren, zullen de axonen van de bovenste cortexgebieden ook worden geactiveerd door licht en verkregen gegevens vervalsen. Als voorbeeld: De IL-regio en de prelimbic (PrL) regio beide project aan de basale amygdala⁵⁵,^56, maar hebben volledig verschillende functies en rollen in de modulatie van angst^26,57.^, Als het implantaat boven de amygdala wordt geplaatst om axonterminals uit het IL-gebied te activeren en tijdens de injectievirusoplossing ook in de PrL is geplaatst vanwege de verkeerde injectieconula, is het risico op het activeren van axonterminals vanuit de PrL zeer hoog.

Tijdens de voorbereiding van de schedel voor de fixatie van het implantaat is het schaarse gebruik van primer en binding cruciaal voor een betrouwbare en duurzame fixatie. Als het 2-component adhesiesysteem niet dun wordt aangebracht, kan het tandcement na een paar dagen of weken loskomen van de schedel. Bovendien moet de schedel ook volledig worden gedroogd voordat het implantaat wordt bevestigd, omdat het cement anders niet goed aan de schedel wordt bevestigd.

Er bestaan ook kritieke stappen in het gedragsgedeelte van dit protocol. Ten eerste is de bouw van het doolhof erg belangrijk. In elke gedragsopstelling, bestaan verscheidene varianten in de literatuur betreffende grootte en vorm, evenals voor de procedure zelf^58,59,60. Het is belangrijk om een variant te kiezen die de gegevens vergelijkbaar en reproduceerbaar maakt. Ook moeten speciale eisen voor gebruikte muislijnen in aanmerking worden genomen^43,48. In de representatieve gegevens voor de EPM is te zien dat verschillende Nex-Cre muizen uit het doolhof vielen of meerdere keren weggleden(figuur 2b). Voor deze muizen zou een doolhof met een kleine muur rond de open armen een beter alternatief zijn geweest.

Ten tweede is het van cruciaal belang om alle externe kameromstandigheden constant te houden⁶¹, anders zouden verschillende groepen muizen helemaal niet vergelijkbaar zijn. In dit verband is het erg belangrijk om de tijd van het experiment te kiezen als een waar de experimentele setup vacant is en de experimentator altijd aanwezig is. Bovendien moeten gebeurtenissen in het gebouw, zoals bouwwerkzaamheden, het testen van systemen (brandalarm) of de reinigingsdag van de muizeninstallatie, worden overwogen om interferentie met de verkregen gegevens te voorkomen.

Tot slot zijn behandelings- en huisvestingscondities cruciaal voor gedragsexperimenten. Wanneer een implantatie wordt uitgevoerd, moeten muizen alleen worden gehuisvest vanwege het risico op letsel van andere muizen. Om een goede vergelijkbaarheid tussen groepen en een lage fout binnen één groep te garanderen, moet elke muis dezelfde kooigrootte en verrijking hebben. Voor angst-gerelateerde experimenten, enkele huisvesting heeft een aantal voordelen als singe gehuisvest mannelijke muizen tonen een lagere baseline angst niveau, minder variatie in hun angst niveau, en minder depressieve-achtige symptomen^15,16. Groepshuis mannelijke muizen kunnen sterk verschillen in hun angstniveau vanwege hiërarchie tussen de muizen. Naast de behuizing is ook een constante en gelijke behandeling van alle muizen en groepen belangrijk. Het grijpen van de muis om de lichtvezel op het implantaat aan te sluiten is zeer stressvol. Daarom moet deze procedure voor elke muis hetzelfde zijn, wat dezelfde techniek en dezelfde experimentator betekent. Bovendien moet de gewenningstijd in de wachtkooi, die bedoeld is om de muis te kalmeren van de stressvolle verbindingsprocedure, ook gelijke omstandigheden hebben in duur, strooisel en positie aan het doolhof. De behandeling binnen de muisfaciliteit is ook van cruciaal belang voor latere gedragsprestaties. Experimentele en controledieren mogen niet op verschillende dagen of door verschillende mensen worden gereinigd, omdat dit ook stressvol is voor muizen. Bovendien mag de reinigingsdag niet de experimentele dag zijn om verschillen in gedrag te voorkomen.

Probleemoplossing
Er kunnen verschillende problemen optreden tijdens het protocol. Bijvoorbeeld, het boren van een geheel in de schedel tijdens de stereotactische operatie kan schade aan bloedvaten. Meestal treedt sterke bloedingen op, vooral boven bregma en lambda. Als dit gebeurt, probeer niet om het bloeden te stoppen met katoenen stokken als ze de neiging om nog meer bloeden uit het vat uit te breiden vanwege hun absorptievermogen, in plaats daarvan, direct spoelen met NaCl.

Het kan ook gebeuren dat de druk injectie van het virus oplossing niet werkt. In dit geval kan het zijn dat parafilm, een korst van het braamgat of hersenweefsel, het puntje van de canula verstopt. Verwijder in dit geval de canula langzaam uit de hersenen zonder de x- of y-as te veranderen en gebruik een pincet om 1-2 mm van het voorste deel van de canulapunt te verwijderen. Voordat u de canula opnieuw verlaagt, test u op functionaliteit door een kleine hoeveelheid druk toe te passen om te zien of het virus uit de canulatip komt. Om constipatie te voorkomen, verlaagt u de canula met een constante snelheid en stopt u de beweging niet totdat de diepste diepte van de injectiezijde is bereikt. Als te veel van de canulapunt wordt verwijderd en de diameter te groot is, zal de canula weefsel beschadigen en wordt het risico om het virus in één keer toe te passen verhoogd. Zorg er dus voor dat alleen het verstopte deel van de tip zorgvuldig wordt verwijderd.

Tijdens het gedragsexperiment kan de opzet van het experiment in de videotrackingsoftware (bijvoorbeeld Ethovision XT) problemen veroorzaken. Als de lichtopbrengst bijvoorbeeld niet goed werkt, kan dit om verschillende redenen zijn. De Pulser moet worden geopend, geprogrammeerd en gestart voordat Ethovision XT wordt geopend. De hardware moet correct worden geselecteerd in de "Experimentele setup" (stap 3.2.2.4). Als de verkeerde IO-Box, of iets anders dan "Kostuum Hardware" is geselecteerd, kan het Pulser-apparaat niet worden bediend door Ethovision. Als de test van de lichtopbrengst succesvol is, maar het geprogrammeerde lichtprotocol in 'Proefbesturingsinstellingen' niet werkt tijdens de acquisitie, kan de subregel- of subregelverwijzing onjuist worden gelokaliseerd of zijn de voorwaarden en acties onduidelijk. Bijvoorbeeld: behoort de verwijzing tot de juiste subregel? Is de verwijzing correct geprogrammeerd (bijvoorbeeld hoe vaak wordt de subregel uitgevoerd)?

Bovendien kan het voorkomen dat het dier tijdens "detectie-instellingen" adequaat wordt gevolgd, maar tijdens de overname zijn er monsters waarbij het onderwerp niet wordt gevonden. Controleer in dit geval of de verlichting in de experimentele ruimte is gewijzigd of dat er iets ongewenste schaduwen in het doolhof heeft opgeleverd. De hele onderkant van het doolhof moet dezelfde kleur hebben, omdat de instelling slechts voor één specifieke combinatie werkt. Als om welke reden dan ook verschillende bodemkleuren of schaduwen niet kunnen worden vermeden, definieert u de detectie-instelling in het donkerste deel van het doolhof.

Als u instellingen wilt wijzigen na de verwerving van de eerste dieren, past u deze wijzigingen niet toe in de reeds gebruikte instellingen. Dupliceer ze om ze aan te passen. Dit betekent ook dat de reeds geregistreerde proef niet meer geldig is voor data-analyse. In een dergelijk geval, neem alle dieren voor deze experimentele groep met de oorspronkelijke instellingen, en maak een nieuw experiment daarna waar de opgenomen video's worden geanalyseerd in plaats van live tracking. In dit "van video" experiment kunnen verschillende instellingen worden gebruikt voor analyse zonder verlies van vergelijkbaarheid tussen dieren of zelfs gegevens.

Beperkingen en toekomstige toepassingen
Deze methode van het manipuleren van gedrag met optogenetica in vrij bewegende dieren bevat ook beperkingen. Tijdens de operatie is de nabijheid van de twee implantaten beperkt. Voor dubbele implantatie moet de afstand tussen de twee implantaten minimaal de breedte van het apparaat zijn om het implantaat vast te houden. Het apparaat moet het tweede implantaat in het braamgat laten zakken, terwijl de eerste implantaten al zijn gefixeerd. Een oplossing hiervoor zou een schuine implantatie kunnen zijn, waarbij de uiteinden van de glasvezel zeer dichtbij kunnen zijn, terwijl de keramische ferules boven de schedel grotere afstand²³,^{55,56,,,57,,62,,63}hebben . Een nadeel van een schuine implantatie is het licht dat zich verspreidt. Wanneer de vezeltip schuin is in plaats van van recht boven, is het gestimuleerde gebied anders. In het geval van twee doelgebieden in de nabijheid moet de veranderde positie van de lichtstimulatie in overweging worden genomen.

Tijdens het gedragsexperiment kan de constructie van het doolhof de optische kabel die op het dier is aangesloten, verstoren. Sommige gedragstests, zoals de licht-donkere doos, bevatten een binnengebied^64,,65, en andere doolhoven bevatten compartimenten die de muis moet invoeren. Dergelijke experimenten kunnen niet worden uitgevoerd met deze setup. Als alternatief kan een draadloos systeem een optie^22,,26,66zijn. Maar gelukkig kunnen sommige doolhoven, zoals het Barnes Maze, zo worden ingericht dat de muizen in staat zijn om de relevante compartimenten⁶⁷binnen te komen.

Naast die met gesloten zones, doolhoven die te breed zijn kan ook problemen veroorzaken. Hoe groter het gebied van het doolhof, hoe langer de kabel moet zijn om het dier naar elke positie in het doolhof te laten gaan. Er moet voor worden gezorgd dat het dier niet op de kabel kan stappen of het kan grijpen en bijten. Een oplossing daarvoor zou een constructie kunnen zijn die de redundante kabel oprolt. Een nadeel is dat de sleep om de kabel uit te rollen moeilijk is voor muizen. Deze oplossing zou beter geschikt zijn voor ratten. Een andere mogelijke optie zou kunnen zijn om de lichtstimulatie van tevoren te doen, in plaats van tijdens het experiment, is dit natuurlijk alleen haalbaar als een langetermijneffect als gevolg van de lichtstimulatie optreedt²³.

Vergelijking met bestaande/alternatieve methoden
Alternatieve methoden zouden chemische of elektrische stimulatie zijn tijdens gedrag^8,18. Chemische agonisten of antagonisten zijn in staat om neuronen te activeren of te zwijgen via specifieke receptoren en kunnen ook enkele neurotransmittersystemen^38,68manipuleren. Aan de ene kant is de receptor-specificiteit vrij hoog voor chemische stoffen, omdat specifieke agonist of antagonist alleen bepaalde receptoren^{activeren 39}. Aan de andere kant is de specificiteit voor receptorsubtypes van dezelfde neurotransmittergroep vaak onvoldoende. De meeste chemische stoffen binden zich aan ten minste twee subtypen met verschillende waarschijnlijkheden⁶⁹. Bovendien kunnen chemische stoffen geen onderscheid maken tussen neuronale celtypen zolang ze dezelfde receptortypen bezitten. Buiten dit, is de tijdelijke en ruimteresolutie slecht voor chemische manipulaties in vergelijking met optogenetica. Agonisten of antagonisten worden vaak mondeling^{toegediend 35} of via systemische injecties^57,70. Als de infusie van de chemische stof direct in het hersenweefsel wordt gedaan, verschijnen de effecten sneller dan bij orale toepassingen, maar nog steeds op een langzamere tijdschaal dan met lichte stimulatie. Als de toegediende chemische stoffen diffuus in de hersenen en zijn niet specifiek voor neuronale types of hersengebieden, manipulatie van specifieke hersencircuits is het niet mogelijk.

Elektrische stimulatie heeft een hogere temporele resolutie dan chemische stimulatie^9,14. De verspreiding binnen in neuronale weefsel is minder dan met chemische stimulatie en de ruimtelijke resolutie is beter dan met chemische stimulatie. Elektrische stimulatie mist echter de mogelijkheid om specifiek verschillende neuronale celtypen of receptortypen aan te pakken, omdat elk neuron in de nabijheid van de elektrode zal reageren op de elektrische stimulatie.

Alternatieve methoden voor het gedrag in vrij bewegende muizen zijn bijvoorbeeld elektrofysiologische opnames in hersensegmenten, waarbij enkele neuronen of axonen kunnen worden gemoduleerd met optogenetica en ontlokte effecten kunnen worden gemeten via het opnemen van elektroden^6,71. In vitro experimenten bieden de mogelijkheid om de moleculaire en cellulaire basis van optogenetische stimulaties te onderzoeken, maar hebben de beperking dat intrinsieke connectiviteit en input uit andere hersengebieden ontbreekt. Een andere optie is het gebruik van optogenetica in combinatie met multiphoton imaging^1,72. In dit geval hebben muizen hun hoofd gefixeerd en kunnen ze verdoofd worden of wakker zijn om eenvoudige taken op te lossen.

Om een succesvol optogenetisch experiment uit te voeren, zijn er tegenwoordig een breed scala aan tools en toepassingen beschikbaar. De selectie van optogenetische tools en de gedragsopbouw is cruciaal om specifieke onderzoeksvragen te beantwoorden. Als de juiste combinatie van gereedschappen en experimenten wordt gekozen, maakt optogenetica een ongekend, diepgaand onderzoek mogelijk van neuronale schakelingen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie. Dit zal helpen om nieuwe therapeutische strategieën voor psychiatrische ziekten en cognitie te begrijpen en te ontwikkelen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamin	Sigma-Aldrich	K2753-64	Anestasia
20 % Glucose	AlleMan Pharma		Injection s.c. for fast recovery
Behavioral mazes	Costum made		Measure anxiety
Bepanthen	Bayer		Ophthalmic oinment
Betaisodona	Monodipharma		Sterilant containing iodine
Betaisodona	Monodipharma		Iodine oinment
Binocular	Olympus	SZ52, 110AL0.62x WD160	Surgery
Ceramic ferrules	Thorlabs	CFLC230-10	Implant
Ceramic Fiber Scribe	Thorlabs	CSW12.5	Cutting of the glass fiber
Channelrhodopsin2-YFP virus	Penn Vector Core	Addgene 20298	Optogenetic tool
Compressed air	Kontakt Chemie	Druckluft 67	Drying of the skull
Coordinate system	Stoelting		Stereotactic coordinates for the surgery
Correl Draw			Graphical software version 13
Cryoslicer	MICROM	HM500OM	Production of brain slices for staining
Ethovision XT 14	Noldus		Software for behavioral tracking
Exel			Statistical Software
Ferrule Polishing Puck	Thorlabs	D50-F	Polishing implants round side
Fiber Patch Cord dual	Prizmatix	Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm	Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation
Fiber Patch Cord single	Prizmatix	Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm	Cable, which is connected with the implant via a sleeve
Fiber Stripping Tool	Thorlabs	T06S13	Stripping glass fiber for implant
Filter paper	VWR European	516-0300	Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test
Food pellets	Mühle Levers	Höveler Nagerfutter	Nutrition for the mice
Glass pipettes	Harvard Apparatus	GC150-10	Injection pipettes
Gradia direct-Flo	Henry Schein	103322	Fluid dental cementum
Heating lamp	efbe-Schott/Phillips	R95E	Prevent the mice from cooling after the surgery
Heating plate	Stoelting		Integrated into coordinate system
Injection canula	Braun	100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20	All injections and to bore hole into the skull
Litter		T 1350	Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test
Mouse cages	Zoonlab	405 cm^2	Single housing for experiments
Optibond FL	Kerr	26684E	Preparation of the skull for implantation
Optical glass fiber	Thorlabs	FT200EMT	Light fiber for implant
Optogenetics-LED.STSI	Prizmatix		Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R	Perfusion of mice to remove the brains
Polishing sheet 0.02 µm grit	Thorlabs	LFCF	Polishing implants round side
Polishing sheet 1 µm grit	Thorlabs	LF1D	Polishing implants round side
Polishing sheet 30 µm grit	Thorlabs	LF30D	Polishing implants round side
Polishing sheet 6 µm grit	Thorlabs	LF6D	Polishing implants round side
Pulser Software	Prizmatix		Software for light device control
Rimadyl-Carprofen	Zoetis		Analgesia
Sigma Plot			Software for statistics
Sleeve	Thorlabs	FT200EMT	Connection of implant and light cable
SodiumCloride (NaCl)	Braun	3570410	Rinsing of the skull
Superglue	Pattex Henkel		To Fix the glass fiber in the ferrule
td-Tomato virus	Penn Vector Core	Addgene 51503	Optogenetic tool
UV light	KoQGHJ	wireless, 1200 mW/cm^2	Polymeration lamp for dental cementum
Xylavet-Xylazin	cp pharma		Anesthesia