Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

Optogenetic manipulering av nevronal aktivitet for å modulere atferd i fritt bevegelige mus

doi: 10.3791/61023 Published: October 27, 2020

Summary

Med optogenetisk manipulering av spesifikke nevronale populasjoner eller hjerneregioner, kan atferd endres med høy temporal og romlig oppløsning hos fritt bevegelige dyr. Ved å bruke forskjellige optogenetiske verktøy i kombinasjon med kronisk implanterte optiske fibre, kan en rekke nevronale modulasjoner og atferdstesting utføres.

Abstract

Optogenetisk modulering av nevronale kretser i fritt bevegelige mus påvirker akutt og langsiktig oppførsel. Denne metoden er i stand til å utføre manipulasjoner av enkeltnevroner og regionspesifikt senderutløsning, opptil hele nevronale kretser i sentralnervesystemet, og tillater direkte måling av atferdsutfall. Nevroner uttrykker optogenetiske verktøy via en injeksjon av virale vektorer som bærer DNA av valget, for eksempel Channelrhodopsin2 (ChR2). Lys bringes inn i spesifikke hjerneregioner via kroniske optiske implantater som avsluttes rett over målområdet. Etter to uker med utvinning og riktig verktøyuttrykk, kan mus gjentatte ganger brukes til atferdstester med optogenetisk stimulering av nevronene av interesse.

Optogenetisk modulering har en høy temporal og romlig oppløsning som kan oppnås med høy cellespesifisitet, sammenlignet med de vanlige metodene som kjemisk eller elektrisk stimulering. Lyset skader ikke nevronalt vev og kan derfor brukes til langsiktige eksperimenter, samt for flere atferdseksperimenter i en mus. Mulighetene for optogenetiske verktøy er nesten ubegrenset og muliggjør aktivering eller deaktivering av hele nevroner, eller til og med manipulering av en bestemt reseptortype for lys.

Resultatene av slike atferdseksperimenter med integrert optogenetisk stimulering visualiserer direkte endringer i atferd forårsaket av manipulasjonen. Oppførselen til samme dyr uten lysstimulering som baseline er en god kontroll for induserte endringer. Dette gir en detaljert oversikt over nevronale typer eller nevrotransmittersystemer som er involvert i spesifikk atferd, for eksempel angst. Plastisiteten til nevronale nettverk kan også undersøkes i detalj gjennom langsiktig stimulering eller atferdsobservasjoner etter optisk stimulering. Optogenetikk vil bidra til å opplyse nevronal signalering i flere typer nevrologiske sykdommer.

Introduction

Moduleringen av nevronale kretser i sentralnervesystemet og deres atferdsmessige resultater er viktig for å forstå hvordan hjernen fungerer, spesielt i psykiatriske sykdommer og kognitive oppgaver som læring og hukommelse. Med optogenetikk kan enkeltceller eller cellepopulasjoner opptil hele kretser moduleres av lys. Vanlige optogenetiske verktøy som Channelrhodopsin2 (ChR2) eller Archaerhodopsin (Arch) er i stand til å aktivere eller dempe nevroner, eller øke eller hemme senderutgivelse ved axonterminaler som projiserer til distinkte hjerneregioner1,,2,,3,,4. Arch må imidlertid brukes nøye da det ble vist at aktiveringen ved presynaptiske terminaler øker spontan senderutgivelse5. Arch er en ytre utbedring protonpumpe som endrer pH-verdien inne i cellen. Dette alkaliske miljøet induserer kalsiumtilstrømning og forbedrer senderutgivelsen5. For å spesifikt modulere intracellulære signalveier, kan reseptor chimeras består av et lettaktiverbart optogenetisk verktøy, for eksempel rhodopsin eller kjegle opsin, sammen med en tilstrekkelig G-protein komponertreseptor, opprettes 6,7,8. Mengden og variasjonen av optogenetiske verktøy tilgjengelig har økt betydelig i løpet av det siste tiåret9.

Formålet med optogenetikk er å manipulere nevronale kretser under oppførsel. Optogenetikk muliggjør for eksempel måling av akutte atferdsendringer som endringer i angstatferd. Optogenetiske verktøy leveres inn i målområder av hjernen via virale vektorer. Ved hjelp av spesielle arrangører og enhancers, eller Cre-loxP-systemet, kan celletype spesifisitet sikres for uttrykk for optogenetiske verktøy (Figur 1A). Det er flere genmodifiserte muselinjer som uttrykker enzymet Cre-Recombinase i bestemte celletyper bare. For eksempel uttrykker Nex-Cre-mus Cre-Recombinase i pyramidale nevroner i cortex og hippocampus under kontroll av Nex-promotor10. Dette enzymet er i stand til å invertere DNA-sekvenser, som er flankert av loxP-sidene11. Følgelig kan DNA-sekvensen av et dobbelt-floxed optogenetisk verktøy, som er invertert og flankert av loxP-sider, bare transkriberes av nevroner som har Cre-Recombinase, men ikke av andre nevronaletyper 12,13. Når det gjelder Nex-Cre-mus, vil det optogenetiske verktøyet utelukkende uttrykkes i pyramidale nevroner. Lysstimulering av visse hjerneregioner oppnås deretter via kronisk implantasjon av optiske fibre rett over interesseområdet. Dyr kan deretter bli kombinert med en passende lyskilde og fritt oppføre seg i nesten alle slags atferdstester.

Figure 1
Figur 1: Injeksjon og implantasjon. A) Cre-loxP system for ChR2-YFP. Dobbel floxed optogenetic verktøyet er pakket i en adeno assosiert virus (AAV) for injeksjon i hjernevevet. B) Skytten visning av virusinjeksjon og implantasjon av et optisk nevronalt grensesnitt inn i / over IL-regionen av mPFC. Injeksjon og implantasjon ble gjort ovenfra. Alle områder av interesse, IL, BLA og DRN, vises. C) Detaljert visning av den implanterte optiske fiberen, hylsen og lyskilden. D) Spredning av blå og rød laserlysstimulering i grå materie hjernevev fra en 200 μm lysfiber (Yizhar et al. 2011). Blått lys sprer seg, maksimalt 0, 5 mm inn i vevet, rødt lys ca 1 mm. Fargekoding: rød 50%, gul 10%, grønn 5%, blå 1% hvis lyset når dette området. E) Koronar visning av ensidig implantasjon rett over venstre IL med en 200 μm optisk fiber. IL-regionen har en bredde på 0,25 mm på hver halvkule og en dybde på 0, 2 mm. Blå og røde lyspærer er boarder av 5% lys spredning og overføres fra Yizhar et al til riktig størrelse. LoxP: locus av X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: gul fluorescerende protein; dflox: dobbel floxed; IL: infralimbic cortex; BLA: basolateral amygdala; DRN: dorsal raphe kjerner; PrL: prelimbic region. Dette tallet er endret fra Berg 201948. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Optogenetic tilnærminger benyttes som det muliggjør både høy temporal og romlig oppløsning14 og celletype spesifikk modulasjon. I tillegg er det mulig å gjentatte ganger bruke implantert enhet uten videre behandling. Etter en stereotaktisk kirurgi, hvor injeksjonen av et adeno-assosiert virus som bærer det optogenetiske verktøyet og implantasjonen av den optiske fiberen utføres, kan musene komme seg i to uker. Vi har valgt en gjenopprettingstid på bare 2 uker, fordi dette er nok tid til å komme seg fra operasjonen og for viruset å uttrykke. Etter hvert som atferdseksperimentene etterfølges av immunohistokjemi, må vi sørge for at mus ikke blir for gamle under forsøket; ellers reduseres vevskvaliteten. De viser ingen åpenbare atferdsmessige funksjonsnedsettelse fra implantatet og engasjerer seg i typisk buratferd. Selvfølgelig er implantasjonen ledsaget av en betydelig kirurgisk lesjon; Derfor overvåkes musene intensivt. Etter operasjonen må mus være enkelt plassert, da gruppehusmus har en tendens til å skade hverandres friske sår og implantater. Imidlertid har boligforhold en stor innvirkning på angstnivået til hannmus, da enkelthusmus viser lavere angstnivåer15 og generelt mindre depressive symptomer16.

Kjemisk eller elektrisk manipulering av hjernekretser mangler den høye celletypen spesifisitet av optogenetikk og har en lavere temporal og romlig oppløsning14,,17,,18. Avhengig av det eksperimentelle spørsmålet kan elektrisk eller kjemisk stimulering ha forskjellige fordeler. Når du passerer fiberterminaler i en bestemt region må også stimuleres, elektrisk stimulering er den beste metoden. Kjemisk stimulering er et godt valg for når senderspesifikke reseptorer i en hel region skal aktiveres av agonister. En annen stor fordel med optogenetikk sammenlignet med kjemisk eller elektrisk stimulering er at endogene, nevroner ikke er følsomme for lys, noe som unngår forekomsten av bivirkninger19. Faktisk kan høye lysintensiteter indusere varmeeffekter8,20, men på grunn av riktige kontrollgrupper kan atferdseffektene på grunn av optogenetisk manipulasjon elimineres.

Undersøke gnageratferd, spesielt med hensyn til psykiatriske sykdommer, har sterkt forbedret seg med optogenetikk hos fritt bevegelige dyr, da det muliggjør direkte modulering av enkeltreseptorer opp til bestemtecellepopulasjoner 21 ogkretser 22. Muligheten til å måle de akutte effektene av slike modulasjoner, samt de langsiktige atferdseffektene etter en definert tid23 eller etter kronisk stimulering24,gir en bred fleksibilitet av eksperimentelle design og gir svært detaljert innsikt i hjernekretser. Lysstimulering kan brukes til å modulere nevroner som ligger på injeksjonsstedet til det optogenetiske verktøyet. Når både injeksjon og implantasjon adresserer samme hjerneregion, kan cellelegemer og ryggprojisering av aksler av prinsippnevroner og interneuroner i denne regionen målrettes3,,6,,8. Imidlertid kan lysfiberen også implanteres i et område forskjellig fra den injiserte. I dette tilfellet kan lysstimulering modulere senderutløsning ved axonterminaler i projeksjonsområder i den injiserte regionen25,,26,,27.

I studien her brukes optogenetikk i kombinasjon med eksperimenter for å analysere angstrelatert oppførsel. Angstrelaterte psykiatriske sykdommer påvirker mer enn en tredjedel av verdensbefolkning 28,29,30 og forårsaker en høy økonomiskbyrde 31. De berørte lider av en følelse av opphisselse, spenning og bekymring etterfulgt av unngåelsesatferd32,33. Disse kronisk forekommende negative følelser, som hovedsakelig fokuserer på fremtidigehendelser 34, forstyrrer sterkt pasientens daglige liv. Vanlige behandlinger som benzodiazepiner eller selektive serotoninreopptakshemmere (SSRI) er bare vellykkede hos noen av pasientene. En stor mengde mennesker reagerer ikke på behandlingen i det hele tatt35, som viser at mekanismen som ligger til grunn for slike sykdommer ennå ikke er fullt ut forstått. Den mediale prefrontal cortex (mPFC) er kjent for å spille en viktig rolle i utviklingen og manifestasjonen av angst21,25,27,36,37,38. Spesielt kan overaktivering av den infralimbic cortex (IL) regionen i mPFC være en del av angstrelatertelidelser 39,40. Eksempeleksperimentet som er beskrevet her, kan bidra til å forstå hvordan modulasjoner i IL-regionen i mPFC påvirker angstatferd. I tillegg kan utviklingen av nye terapeutiske strategier for angstrelaterte psykiatriske sykdommer også potensielt støttes.

2-6 måneder gamle mannlige Nex-Cre mus brukes til å uttrykke ChR2 spesielt i pyramidale nevroner innenfor IL-regionen av mPFC41. Nex-Cre mus har en C57Bl/6 bakgrunn og uttrykke enzymet Cre-recombinase spesielt i pyramidale nevroner. Under en stereotaktisk kirurgi injiseres dobbelt floxed ChR2-DNA inn i IL-regionen via adeno-tilknyttede virale vektorer. Det optiske implantatet er plassert rett over interesseområdet (figur 1B) og implantatet er festet med tannsement. Kontrolldyr får en injeksjon av dobbel floxed tdTomato-DNA i samme region for å etterligne cellespesifikt uttrykk.

Dyr er gruppe-plassert til operasjonsdagen og etterpå er enkelt plassert for å unngå skader fra andre mus. Mus er plassert i individuelle ventilerte bur (IVC) stativer i TypI-L bur for enkelthus mus. Den lyse mørke syklusen følger en 12:12 h rytme, lysfasen starter kl 10. Alle atferdseksperimenter utføres i den mørke fasen, som ligner den aktive fasen av gnagere. Vann og standard matpellets er tilgjengelig ad libitum. Etter to uker med utvinning, som sikrer et tilstrekkelig uttrykk for ChR2 i pyramidale nevroner, brukes mus til atferdseksperimenter.

Open Field (OF) er en 50 cm x 50 cm kvadrert labyrint med sandblåste 40 cm høye vegger. Bakken er delt i 16 firkanter hvor de indre 4 representerer sentrum. Den målte virkemåten er: 1) tid brukt i midten, 2) antall midtoppføringer og 3) total avstand flyttet. I løpet av dette eksperimentet er det 4 studier på totalt 20 minutter. I forsøk 1 og 3 oppstår ingen lysstimulering, og i forsøk 2 og 4 utføres en stimulering på 20 Hz med 5 ms lyspuls og 1 mW lysintensitet på 473 nm (figur 2A). I de senere studiene ble det tatt hensyn til boligen til testområdet, men bruk av sham-injiserte kontrolldyr indikerer hvordan habituation uttrykkes.

Barnes Maze er et eksperiment for læring og hukommelse. Det er en sirkulær plattform som er 92 cm i diameter og inneholder 20 likeverdige hull rundt omkretsen. 19 av hullene er lukket og under ett hull presenteres en escape box. I 4 påfølgende dager har mus 4 treningsforsøk for å lære plasseringen av escape-boksen. På den femtedagen fjernes rømningsboksen, og mus testes på hvor mye tid de trenger for å finne riktig hull. Den målte virkemåten er: 1) Tid til escape box / riktig hull er funnet, 2) Antall målbesøk og feil, og 3) Avstand flyttet til i escape-boksen. Lysstimuleringen i ulike grupper gjøres enten under oppkjøp eller konsolidering, som finner sted på treningsdagene 1-4, eller under henting på testdagen, som er dag 5 (figur 2D).

Figure 2
Figur 2: Atferdseksperimenter med optogenetiske protokoller. A) Skjematisk tegning av Open Field-eksperimentet med den tilsvarende lysstimuleringsprotokollen. C) Skjematisk tegning av Elevated-Plus Maze-eksperimentet med den tilsvarende lysstimuleringsprotokollen. D) Skjematisk tegning av Barnes Maze-eksperimentet med den tilsvarende lysstimuleringsprotokollen. EPM: Forhøyet pluss labyrint; AV: Åpent felt; BM: Barnes Labyrint Test. Dette tallet er endret fra Berg 201948. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For optogenetisk stimulering må lysintensiteten og frekvensen tilpasses det optogenetiske verktøyet og nevronale typen som er under etterforskning. Lavest mulig lysintensitet bør brukes for å unngå skade på vevet, da flere studier har vist at det er mulige varmeeffekter på grunn av sterk lysintensitet8,20. For ChR2 brukes ofte en 20 Hz stimulering med 5 ms lyspuls2. Siden ChR2 er ganske lysfølsom, er 1 mW lysintensitet tilstrekkelig. Lysstimuleringsprotokollen veksler mellom lys av og på forsøk for å måle atferdsendringer direkte. De eksterne romforholdene for atferdseksperimenter bør forbli stabile for hele gruppen av dyr. Viktige forhold å vurdere er støyen (husk at enhetene selv kan lage støy), lukten (rengjør alltid atferdsoppsettene med etanol), lysintensiteten og eksperimentereren. Eksperimentereren bør alltid være den samme personen. I tillegg bør tiden på dagen for eksperimentene være den samme for alle dyr i en gruppe, noen timer etter starten av den mørke fasen i anlegget foretrekkes.

Målet med dette eksperimentet er å øke eksitasjon / hemming (E / I) forholdet i IL-regionen gjennom sterk aktivering av eksitatoriske pyramidale nevroner. Et forbedret E/I-forhold i denne spesielle cortex-regionen er kjent for å øke angstnivået hosmus 40,,42,,43,,44.

Protocol

Prosedyrer som involverer dyrefag er godkjent av det institusjonelle dyreforskningsanlegget og "Senatorin für Wissenschaft, Gesundheit und Verbraucherschutz" ved Universitetet i Bremen (#146)

1. Fremstilling av det optiskeimplantatet 9 (figur 1C)

  1. Plasser en keramisk ferrule flat side opp i en benk skrustikke.
  2. Strip kappen av en 200 μm diameter glassfiber med et fiberstrippingsverktøy og kutt 2-3 cm lange stykker med en keramisk fiberskriver.
  3. Legg glassfiberstykket i den keramiske gløden med et jevnt overheng på begge sider.
  4. Legg en dråpe superlim på den flate siden av den keramiske ferrule med en injeksjon kanula.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her.
  5. Ta pre-implantatet ut av benken skrustikke og på den runde siden av den keramiske ferrule, kutte glassfiber så kort som mulig med keramisk fiber skriver.
  6. Plasser pre-implantatet på en ferrule polering puck og polere den runde siden på 4 forskjellige poleringspapir, ved å tegne en åtte 20 ganger per papir (30 μm grus, 6 μm grus, 1 μm grus, og til slutt 0,02 μm grus).
  7. Ta pre-implantatet ut av ferrule polering puck og kutte glassfiber på den flate siden av keramiske ferrule til lengden som trengs for implantasjon. Begynn å måle lengden bak utstående superlim.
    1. For en jevn skjæreflate bare skrape glassfiber 2-3 ganger og deretter bryte den.
      MERK: Bruk musehjerneatlaset fra Paxinos og Franklin45 til å beregne lengden på implantatet. Implantatet må ende rett over interesseområdet, og tykkelsen på skallen skal inkluderes i lengdeberegningen. For å stimulere IL-regionen har glassfiberen en lengde på 1,8 mm (figur 3).

Figure 3
Figur 3: Mus hjerneatlas (Paxinos og Franklin) med representativ lengde på implantatet for å nå IL-regionen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Desinfiser det ferdige implantatet i 10 minutter i etanol og la det lufttørke før implantasjon.

2. Injeksjon og implantasjon

  1. Transporter en enkelt mus til operasjonsrommet og vei den. Påfør anestesi med en intraperitoneal (i.p.) injeksjon av Ketamin/Xylazin (Ketamin 0,12 mg/g, Xylazin 0,01 mg/g).
    1. Fest musen med venstre hånd og slå den på ryggen med hodet holdt lavt.
    2. Målrett mot venstre nedre kvadrant av magen med sprøyten og gå inn i injeksjonskantulaen 1 cm under huden.
    3. Injiser anestesi i en langsom og konstant bevegelse i bukhulen.
    4. Plasser musen tilbake i buret og vent til den når en dyp tilstand av anestesi.
      MERK: Dybden av anestesi kan bestemmes av fravær av blinkende og mellom-tærne reflekser.
  2. Plasser musen på en varmeplate og fest hodet i en stereotaktisk ramme. Fest nesen og tennene foran, og ørene på begge sider.
    MERK: Hodet må være rett på venstre høyre- og rostral-caudal-aksen for å sikre korrekte stereotaktiske koordinater.
  3. Påfør analgesi med 2 mg/kg Carprofen subkutant inn i baksiden av musen og påfør ugjennomsiktig øyesalve på begge øynene for å beskytte dem mot tørking.
  4. Fukt håret på hodebunnen med et vått papirhåndkle og klipp det av med saks. Pass på å fjerne alt løst hår med det våte papirhåndkleet. For å desinfisere hodebunnen, bruk en bomullspinne og ta opp 0,5 ml tinktur som inneholder jod (Betaisodona 100 mg/ml Povidon jod og 11 mg/ml jod) og la det lufttørke.
    MERK: I stedet for saks kan også en elektrisk klippemaskin brukes til riktig hårfjerning.
  5. Løft hodebunnen over interesseområdet med en pinsett og kutt 1 cm langs midtlinjen. Bruk to pinsett til å skyve huden til side for å eksponere skallen. Pass også på å fjerne den tynne huden over skallen og la den eksponerte skallen tørke.
  6. Grov skallen for senere implantasjon.
    1. Påfør en 2 mm x 2 mm dråpe fosforsyre (37 %) fra klebesettet (f.eks. Optibond) på skallen, fordel det med spissen av sprøyten og la det tre i kraft i 15 s.
    2. Fjern all syre med en bomullspinne og skyll skallen med 1 ml 0,9% NaCl to ganger.
    3. Tørk skallen med en bomullspinne og trykkluft.
      Forsiktig: Fosforsyre er farlig og må fjernes helt for å unngå vevsskader.
  7. Beregn F-faktoren for individuelle koordinater.
    1. Plasser en glasskana i stereotaktisk ramme og finn den rett over bregma.
    2. Null koordinatsystemet og flytt glasskanaen til lambda.
    3. BeregnF-faktor 46 med følgende formel:
      Equation 1
    4. Multipliser F-faktoren med koordinatene fra musehjerneatlaset for å justere dem til den enkelte musen.
  8. Bor et hull i skallen til injeksjon.
    1. Bruk de justerte koordinatene til å finne plasseringen på skallen rett over strukturen av interesse og markere den ved hjelp av spissen av en injeksjons canula ved å skrape den over beinoverflaten.
    2. Bruk injeksjons kanula til å bore et hull i skallen på det markerte stedet ved å rotere kanulaen på stedet. Hvis blodet lekker ut av burr hullet, skyll med 1 ml på 0,9% NaCl og tørk skallen etterpå.
  9. Ta opp virusløsningen i glasskanaen.
    1. Plasser en dråpe på 100 μL på 0,9 % NaCl på skallen og et stykke parafilm (1 cm x 1 cm) på toppen, steril side opp.
    2. Plasser 1-2 μL virusoppløsning på parafilmen og senk tuppen av glasskanaen inn i den.
    3. Koble glasskanulaen til en sprøyte, påfør minimalt med trykk og vent til virusoppløsningen tas opp av kanylen (i løpet av sekunder).
      MERK: Det er viktig å stoppe påføringen av undertrykk, før luft plukkes opp i kanula. Derfor vil det alltid være en liten rest av virusløsningen.
  10. Injiser virusløsningen i interesseområdet.
    1. Plasser den virusfylte glasskanaen over burrhullet.
    2. Senk kanulaen langsomt ned i burrhullet og null z-koordinaten når spissen av kanulaen er på skallens nivå.
    3. Senk kanulaen forsiktig til injeksjonsstedets laveste posisjon.
    4. Fokuser kikkerten på menisken av virusløsning i kanula.
    5. Påfør en liten mengde positivt trykk med sprøyten til menisken senkes marginalt.
    6. La viruset spre seg i 2-3 min før du flytter glasskanulaen oppover til neste posisjon.
    7. Påfør virusløsningen hver 200-300 μm i hele interesseområdet.
    8. Fjern glasskanaen veldig sakte og kast den etter den endelige injeksjonen.
  11. Forbered skallen for implantasjon med vedheftssettet (f.eks. OptibondTMFL).
    1. Tørk skallen med trykkluft.
    2. Påfør 5 μL primer (f.eks. Optibond, 1-30% (etanol, silissyre, glyserinfosfatdimetakrylat, 2-(2-(Methacryloyloxy)ethoxycarbonyl)benzoesäure, 2-Hydroxyethylmethacrylat)) med tilsvarende pinne og la den tørke i 15 s.
    3. Påfør 5 μL binding (f.eks. Optibond, 15-20% 2-Hydroxyethylmethacrylat + 1-2% Alkalihexafluorosilikat(Na)) med samme pinne og herd den i 20 s med UV-lys (420-480 nm).
      MERK: Det er viktig at skallen er tørr og at primeren og bindingen påføres i et veldig tynt lag.
      Forsiktig: Ikke se direkte inn i UV-lyset, da UV-lys kan skade øynene.
  12. Plasser implantatet rett over interesseområdet.
    1. Fest implantatet i den tilsvarende holderen.
    2. Tørk skallen med trykkluft.
    3. Plasser tuppen av glassfiberen rett over burr hullet og senk den forsiktig.
    4. Slutt å senke implantatet når den gjenværende pæren av superlim berører skallen. Ikke utøve press på skallen!
      MERK: Hvis injeksjonen og implantasjonen utføres i forskjellige regioner (f.eks. dorsal raphe og hippocampus),bor alle nødvendige hull etter påføring av fosforsyre, men før 2-komponenten vedheft, følg deretter instruksjonene som tidligere beskrevet (trinn 2.8-2.14).
  13. Fiks implantatet.
    1. Sjekk om skallen fortsatt er helt tørr.
    2. Påfør flytende tannsement (f.eks Gradia direkte flo) rundt implantatet og i området rundt og herd i 20 s med UV-lys (420-480 nm).
      MERK: Mengden tannsement avhenger av det frie skalleområdet. Hele skallen skal dekkes av tannsement.
    3. Påfør to lag med sement og fyll helt det frie og tørkede hodeskalleområdet. Herd hvert lag med UV-lys (420-480 nm).
  14. Fullfør operasjonen.
    1. Påfør 0,5 g jodsalve (Betaisodona 100 mg/ml povidonjod og 11 mg/ml jod) ved hele såret.
    2. Injiser 0,1 ml glukose oppløst i 0,9 % NaCl subkutant i nakken for rask gjenoppretting.
    3. Slipp nesen og ørefikseringen, ta musen inn i et nytt bur og plasser den under en varmelampe for å unngå tap av kroppsvarme.
    4. Når musen våkner, ta den med tilbake til anlegget.
    5. Sjekk helsestatusen minst en gang om dagen. Ta nødvendige tiltak hvis mus viser dårlige konstitusjoner (f.eks. sørg for postoperativ analgesi med Carprofen opptil 3 dager hvis mus viser tegn på smerte).
      MERK: Etter to uker med utvinning kan mus brukes til atferdseksperimenter.

3. Sette opp et nytt eksperiment (Eksempel ChR2 stimulering og åpent felt)

  1. Pulser
    1. Programmer pulseren (f.eks. Prizmatix) for lysstimulering.
    2. Åpne programvaren, og velg USB COM-porten som lyskilden er koblet til.
    3. Velg Velg driftsmodus (3) | Utfør pulssekvens etter utløser HØY, og stopp deretter når LOW lar en ekstern programvare styre lyskilden.
    4. Programmer lysprotokollen. For en 20 Hz stimulering med 5 ms lyspuls: velg TI = 23 ms, P1D = 5 ms, P1I = 22 ms og P2D = 0 ms.
    5. Trykk startsekvens. Denne statusen forblir til eksperimentene er fullført.
      MERK: Pulserprogramvaren (Prizmatix Pulser) må lanseres før videosporingsprogramvaren; ellers vil videosporingsprogramvare ikke kunne gjenkjenne enheten.
  2. Programvare for videosporing (f.eks. Ethovision XT)
    1. Opprett et nytt eksperiment fra en forhåndsdefinert mal.
      1. Åpne programvaren, gå til Fil ,velg Ny fra mal. Velg Bruk en forhåndsdefinert mal.
      2. Velg Live tracking og velg kameraet ved å trykke på Kilde og bekrefte den tilkoblede Basler GenICam.
        MERK: Det levende bildet av kameraet vises nå i vinduet øverst til høyre.
      3. Trykk neste og velg dyret som skal registreres (Gnagere, Mus).
      4. Trykk Neste og velg arenamalen Åpne felt, firkantet. Velg sonemalen Senter, Kantlinje, Hjørner og bekreft med Neste.
      5. Bekreft 1 emne som skal spores med Neste.
      6. Velg Midtpunkt, nesepunkt og halebase og bekreft dyrefargen sammenlignet med bakgrunnen som mørkere med Neste.
      7. Bekreft den anbefalte samplingsfrekvensen på 12,5 med Neste, og fullfør trinnet.
      8. Gi eksperimentet et passende navn, og velg et sted du vil lagre.
    2. Definer de eksperimentelle innstillingene.
      1. Gå til Oppsett og Eksperimentelle innstillinger. Velg Midtpunkt, nesepunkt og halebasedeteksjon som Sporede funksjoner.
      2. Velg Bruk av maskinvare for prøvekontroll, og gå til Innstillinger.
      3. Velg Noldus USB-IO-boks og bekreft med Ok.
      4. Velg Egendefinert maskinvare som enhetstype på TTL-porten, som er koblet til pulserenheten, og bekreft med Ok.
    3. Definer arenainnstillingene.
      1. Gå til Arenainnstillinger, og velg Arenainnstillinger 1.
        MERK: Kameraet åpner nå automatisk et bakgrunnsbilde.
      2. Bekreft bildet med Grab.
      3. Tilpass de forhåndsdefinerte sonene til den virkelige arenaen ved å endre størrelsen. Bruk pilen og de to symbolene til høyre. Hvis noen soner er unødvendige, sletter du dem.
      4. Trykk på 1. Tegn Skala for å kalibrere og trekk en linje fra det ene hjørnet av labyrinten til den andre. Angi lengden på den virkelige avstanden i cm.
      5. Gjenta det for den andre aksen.
    4. Test om lysstimuleringen fungerer.
      1. Gå til Arena - Hardware Mapping, og velg Test på den grå linjen.
      2. Velg Kommandoutgang 1 Høy, og trykk test.
        MERK: Det skal være lys fra enden av den optiske fiberen. Når du velger Utgang 1 Lav og Test, bør stimuleringen stoppe.
    5. Definer innstillingene for prøvekontroll for 20 minutter med eksperiment. Sett prøveversjoner Off1, On1, Off2 og On2 til hver være 5 minutter lang.
      1. Gå til Innstilling for prøvekontroll, og velg Spor varighet 30 minutter.
      2. Klargjør hovedregelen ved å justere betingelsen: Tid til 20 minutter ved å velge Innstillinger og endre 30 til 20 minutter. Bekreft med Ok.
        MERK: Betingelsen for startsporet skal være når motivet er på arena i 2 sekunder. På den måten vil systemet automatisk begynne å spore når musen er i arenaen.
      3. Opprett en underregel for lysstimuleringen: Gå til Strukturer, mer og velg Underregel.
      4. Gi det et navn som lysstimuleringsprotokoll.
      5. Plasser den under hovedregelen og spre ut de to boksene ved å velge det blå området med musekursen.
      6. Gå til Betingelser, Tid og gi det et navn som lys på 1.
      7. Juster tilstand er oppfylt etter 5 minutter. Bekreft med Ok.
      8. Plasser boksen rett bak Regel start-boksen i underregelen ved å trekke den til den svarte linjen.
      9. Gå til Handling | Tilpasset maskinvare og navngi den: lys PÅ 1.
      10. Velg Handling for å utføre som Utgang 1 Høy og bekreft med Ok.
      11. Plasser boksen rett bak Betingelse-boksen.
        MERK: Nå etter 5 minutter av forsøket skal lysstimuleringen starte.
      12. Gjenta trinnene for å definere tidsbetingelsen Etter 5 minutter og handlingen Utgang 1 Lav for å stoppe lysstimuleringen etter ytterligere 5 minutter.
      13. Gjenta trinnene igjen for å programmere et annet lys av og lys På prøve.
      14. til Strukturer | Underregelreferanse, og kontroller at referansen tilhører den riktige underregelen.
      15. Velg Start forhold som Uten forsinkelse og Stopp forhold som Utfør én gang per startbetingelse. Bekreft med Ok.
      16. Plasser referanseboksen mellom handlingsboks 1 og betingelsesboks 2 i hovedregelen, og tegn en linje fra Handling - start spor til referanse .
        MERK: Nå starter hovedregelen direkte underregelen etter at du har startet sporet.
    6. Definer gjenkjenningsinnstillingene for å vise systemet hva det skal spore.
      1. Gå til Gjenkjenningsinnstillinger, og velg Gjenkjenningsinnstillinger 1.
      2. Plasser en testmus i arenaen, og velg Automatisk oppsett.
      3. Velg Gnager som dyretype og bruk museforbannelsen til å tegne en boks rundt musen i arenaen. Bekreft resultatene OK? spørsmålet med Ja.
    7. Definer prøvelisten for alle eksperimentelle dyr som skal spores.
      1. Gå til Prøveliste og planlegg alle dyr for å registrere i dag: Velg Legg til prøveversjoner, og velg et tall.
      2. Velg alle betingelsene som er definert før for hver mus.
      3. Navngi Animal-ID og behandlingen riktig for senere å forenkle analysen.
        MERK: Animal-ID er irrelevant for systemet og bare viktig for senere dataanalyse av eksperimentereren. Grupperingen i behandlings- og kontrollgruppen er viktig for at systemet skal kunne gruppere og hvordan man sammenligner alle sporene i senere analysetrinn.
    8. Gå til Oppkjøp og start med eksperimentet.

4. Open Field eksperiment (angst)

  1. Ta den eksperimentelle musen til atferdsrommet rett før eksperimentet for å sikre et riktig nivå av angst.
    MERK: Atferdseksperimentene bør utføres i den mørke fasen når musene er våkne, og alltid i samme tidsluke for å sikre sammenlignbarhet.
  2. Par musen via en hylse til lyskilden ved å trykke den forsiktig på rutenettet av buret.
  3. Plasser den i et ventebur med friskt kull i 10 min for å bli akklimatisert til lyskabelen.
  4. Start oppkjøpet ved å trykke på Start-knappen i videosporingsprogramvaren (f.eks. Ethovision XT).
  5. Overfør musen fra venteburet til venstre øvre hjørne av det åpne feltet. Fjern armen innen 2 sekunder for å unngå å spore en arm i stedet for musen.
  6. La det visuelle feltet av musen under eksperimentet og holde seg rolig.
  7. Etter 20 minutter, når eksperimentet er ferdig, fjern musen fra labyrinten, koble fra lyskabelen og legg den tilbake i hjemmeburet.
  8. Ta musen tilbake til anlegget.

5. Barnes Maze (læring)

  1. Ta alle eksperimentelle mus inn i atferdsrommet rundt 1 time før eksperimentet.
  2. Forbered Barnes Maze ved å lukke alle hull unntatt ett, der en escape box er plassert. Plasser en vegg av kartong i midten av plattformen, som er startområdet for musen.
  3. Koble én mus til lyskilden (hylse på en lyskabel) ved begge implantatene.
  4. Plasser musen rett inn i midten av Barnes Maze i veggen av kartongen, som hindrer musen fra å løpe rundt før eksperimentet starter.
  5. Trykk start i videosporingsprogramvaren (f.eks. Ethovision XT) og fjern esken.
    MERK: Programvaren sporer musen til riktig hull er nådd, men vær forberedt på å stoppe prøveversjonen manuelt bare i tilfelle programvaren ikke gjenkjenner hullovergangen.
  6. Ta musen ut av labyrinten og fjern tilkoblingen til lyskabelen.
    MERK: Hvis dette er en treningsdag med flere forsøk per mus, lar du musen stå på venterommet ved siden av atferdsrommet til neste treningsøkt starter. Hvis dette var testdagen med bare en testprøve per mus, ta musen tilbake til anlegget.

6. Dataanalyse (Eksempel åpne feltdata med 4 utstående forsøk)

  1. Programvare for videosporing (f.eks. Ethovision XT)
    1. Definer eksperimentelle grupper og prøveversjoner i dataprofilen.
      1. Gå til Dataprofiler til venstre, og velg Behandlet kontra kontroll.
      2. Gå til Nesting i det nye vinduet midt til venstre, og velg Prøvekontrolltilstand.
      3. Velg tilstandsintervallet fra elementhandlingen: start Spor til elementhandlingen: lyset går PÅ 1.
      4. Plasser Nesting-boksen mellom Filterboksbehandling og den tilsvarende resultatboksen.
        MERK: Dette definerte intervallet er Off1, som beskriver de første 2,5 minuttene av eksperimentet der det ikke er lysstimulering til stede.
      5. Gjenta trinnene for intervaller On1 (fra element Handling: lyset lyser 1 til elementet Handling: lyset slukkes 1), Off2 (fra elementet Handling: lys slukkes 1 til elementlyset lyser 2) og On2 (fra elementet Handling: lyset lyser 2 til elementet Handling: stoppspor).
      6. Gjenta de fire intervallene for kontrollfiltergruppen.
        MERK: Hver hekkeboks trenger sin egen resultatboks med navnene Off1, On1, Off2, On2. Nå er både behandlings- og kontrollgruppen delt inn i 4 forskjellige lysstimuleringsstudier som analyseres separat.
    2. Definer parameterne som skal analyseres i analyseprofilen.
      1. Gå til Analyseprofiler til venstre, og velg I soner.
      2. Velg den avhengige variabelen i sonen, og velg Midtstill som sone.
      3. Dobbeltklikk på I midten og velg et av de valgte punktene og velg bare i midten.
      4. Før du forlater vinduet, går du til Prøvestatistikk og velger Frekvens, Kumulativ varighet og ventetid til først.
      5. Legg til den avhengige variabelavstanden som er flyttet.
        MERK: I gruppestatistikk velger duom du vil bruke standardfeilen eller standardavviket som feil. Med denne profilen er dataene for Tid brukt i midten, Midtstille oppføringer og Total avstand flyttet tilgjengelig.
    3. Trekke ut data
      1. Gå til Resultater, og velg Statistikk og diagrammer.
      2. Trykk Beregn for å se de analyserte dataene.
        MERK: Prøvestatistikken gir informasjon om hver enkelt mus- og gruppestatistikk analyserer gjennomsnittet og feilen for begge gruppene, delt inn i 4 forsøk med tilsvarende barplott.
      3. Trykk Eksporter data og velg prøvestatistikken og plasseringen du vil lagre.
        MERK: De eksporterte dataene lagres som en Excel-fil og med individuelle verdier for hver mus. I denne Excel-filen bidrar Animal-ID til å identifisere musene.
      4. Gå til Heatmap Visualization og trykk Plot Heatmaps.
      5. Velg Forsøk til høyre for å se individuelle varmekart for hver mus og prøveperiode.
      6. Gjør et høyreklikk på musen og eksport varmekart som bilder.
  2. Plotting
    1. Åpne regnearkfilen på datamaskinen og beregn midler og standardfeil (SEM) for alle 4 prøveversjoner i hver målte tilstand og gruppe.
    2. Generer grafer i et statistikkprogram (f.eks. Sigma Plot).
      1. Kopier midler og SEM til riktig rekkefølge fra regnearkfilen til Sigma Plot. Radene må inneholde dataene for Off1, On1 etc. og kolonnene inneholder prøve, gjennomsnitt og SEM som hoder.
      2. Velg alle tre kolonnene, og gå til Opprett graf.
      3. Merk Stolpe-boksen, og velg ugrupperte stolper med feil (øvre rad, tredje boks).
      4. Bekreft med Fullfør for å åpne en ny grafside.
      5. Merk hele grafen, og gå deretter til Hjem, merk Av graph-boksen til venstre og trykk Eksporter. Velg en målmappe, og velg MetaFile (*.wmf) som format.
        MERK: .wmf-formatet kan behandles senere i en grafisk programvare som CorelDraw.
    3. Beregn statistikk for innhentede data.
      1. Kopier rådata fra regnearket (Off1, On1 etc.) til enkeltkolonner i Sigma Plot.
      2. Merk kolonnene du vil sammenligne, og gå til Analyse, velg t-test og trykk Kjør.
      3. Bekreft dataformatet Raw med Neste, og kjør testen med Fullfør.

Representative Results

Målet med denne protokollen er å måle endringer i oppførselen til genmodifiserte mus under et optogenetisk eksperiment. Optogenetic manipulasjon er gjort ved injeksjon av en adeno assosiert viral vektor. Lysstimulering i fritt bevegelige mus er mulig via implantasjon av en lett fiber rett over interesseområdet.

I figur 4presenteres resultatene av et optogenetisk eksperiment. En sterk aktivering av eksiatoriske pyramidale nevroner i IL-regionen via ChR2 økte angstrelatert oppførsel i det åpne feltet. ChR2 ble injisert i IL-regionen av mPFC i Nex-Cre mus for uttrykk i pyramidale nevroner (figur 4A). Under to angsttester stimuleres Open Field (figur 4B,C) og Novelty-Suppressed Feeding test (Figur 4F, G), ChR2 med blått lys og aktiverer pyramidale nevroner. Som kontroll fikk en annen gruppe mus en injeksjon av fluorofortdTomato i stedet for ChR2 (figur 4D,G). I et slikt eksperiment er angst definert som unngåelse av det lysere sentrale området. Mus viser en iboende unngåelse av åpne områder fordi de er engstelige for rovdyr.

I Open Field-eksperimentet, vist i figur 4B,utførte mus 4 studier på 5 minutter hver. I forsøk 1 og 3 oppstod ingen lysstimulering (Off1,2) og i forsøk 2 og 4 ble det ikke utført blå lysstimulering med 20 Hz (5 ms lyspuls) og 1 mW intensitet (On1,2). Varmekartene viser at i den eksperimentelle gruppen var midtvarighet forskjellig mellom Off og On-forsøk. Under lysstimulering forblir mus fortrinnsvis i grensesonen. Kontroll dyr foretrekker også grensen, men endrer ikke sin oppførsel ved lysstimulering. I figur 4Cvises de viktigste atferdsmålingene under Open Field-eksperimentet for den eksperimentelle gruppen. Hvis dataene besto Shapiro-Wilk-testen for normalitet, ble statistikken gjort med en uavhengig to-tailed t-test. Hvis normalitetstesten mislyktes, ble Mann-Whitney-Rank Sum-testen brukt som ikke-parametrisk alternativ. For slike eksperimenter ble en sammenligning i gruppen valgt for å undersøke om lysstimulering direkte kan endre angstatferd over tid, uavhengig av baseline angst for eksperimentelle og kontrollere dyr. Sentervarigheten gikk betydelig ned i begge lysstimuleringsforsøkene, noe som indikerer økte angstnivåer. Den totale avstanden flyttet ble ikke endret, noe som viser at lokomotorisk oppførsel ikke ble påvirket. Antallet senteroppføringer ble økt, men ikke signifikant. I figur 4Dvises dataene for kontrollgruppen. Kontrolldyr viste ingen atferdsendringer mellom av- og på-studier i noen av de analyserte parametrene, noe som viser at lysstimulering eller implantasjon ikke forårsaket de observerte effektene. I sum viser denne testen økt angst under lysstimulering av IL pyramidale nevroner via ChR2.

I figur 5vises dataene for et mislykket optogenetisk eksperiment for Elevated-Plus Maze. Under Elevated-Plus Maze-eksperimentet, som presenteres i figur 5A,fullførte mus 6 studier på 3 minutter hver. I forsøk 1, 3 og 5 ble det ikke utført lysstimulering (Off1, Off2, Off3) og i forsøk 2, 4 og 6 ble det ikke utført lysstimulering med 20 Hz (5 ms lyspuls) og 1 mW intensitet (On1, On2, On3). I disse eksemplariske resultatene var lengden på den optogenetiske protokollen og konstruksjonen av labyrinten i seg selv ikke egnet for den transgene muselinjen. I figur 5Bkan det ses, at flere mus gled av labyrinten med sine bakpoter eller til og med falt ned. Da dette skjedde, fikk mus en ny sjanse til å utføre EPM en dag senere. Hvis de falt ned igjen, ble de ekskludert fra analyse. Når mus gled av flere ganger, men klarte å holde seg på labyrinten, ble data analysert normalt. Likevel må dataene tolkes svært nøye og kontrollere dyr får større betydning. Nex-Cre-mus hadde motoriske vanskeligheter med å holde seg på de smale åpne armene. For å unngå dette, ville små vegger, med en høyde på 1 cm, ha bidratt til et sikkert grep av bakpotene på armene på labyrinten. Både varmekartene og grafene viser at eksperimentelle, så vel som kontrollmus, begynte å unngå de åpne armene fra studie 2 (On1) på (figur 5C-E). Tiden på de åpne armene er betydelig redusert for begge grupper, som er de åpne arm oppføringer. Analysere den eksperimentelle gruppen bare innhentet data som impliserer en stor anxiogen effekt av lysstimuleringen, da tiden på den åpne armen og åpne armoppføringer reduseres betydelig under On1-studien. Men når du sammenligner disse dataene med kontrollgruppen, som viser samme oppførsel, blir det klart at den observerte oppførselen ikke medieres av optogenetisk stimulering, men ved å unngå de åpne armene generelt på grunn av habituation til labyrinten. Disse dataene understreker viktigheten av en riktig kontrollgruppe for å skille mellom atferdseffekter mediert av optogenetisk stimulering og mulig atferdstilpasning. Disse dataene belyser også viktigheten av å tilpasse et eksperimentelt oppsett på riktig måte for å passe den spesifikke mousselinjen og eksperimentelle spørsmålet.

For å validere og styrke innsamlede atferdsdata fjernes hjerner av mus etter det siste forsøket for å kontrollere for riktig injeksjon og implantasjon (figur 6). Hjernen er fast i 4% paraformaldehyd og fjernet fra skallen. Hjernen er dehydrert i 30% sukrose i 1-2 dager og kryosliced etterpå. De 40 μm tykke koronale hjerneskivene vaskes og monteres på superfrostmålsklier med et monteringsmedium som inneholder DAPI, som flekker cellekjerner. Dette gjør det mulig å identifisere målområder i koronale skiver. Fluorescens av YFP-koden eller tdTomato selv indikerer plasseringen av virusinjeksjonen. I figur 6B presenteres de eksemplariske injeksjonsstedene til ChR2-YFP til venstre (gul) og tdTomato til høyre (rød). Ved hjelp av en mal, tilpasset fra Paxinos og Franklin45 mus hjerneatlas, kan IL-regionen identifiseres. I begge lysbildene uttrykkes det optogenetiske verktøyet i IL-regionen, men også i tilstøtende hjerneregioner. For en riktig tolkning konsulteres spredning av blått lys i hjernevev8 (figur 1D, E). Det kan ses at det blå lyset vil nå DP-regionen under IL med bare mindre enn 5% av den første 1 mW lysintensiteten på fiberspissen (Blå linje i figur 1D)8. I tillegg kan liten mengde lys gå oppover til PrL-regionen på grunn av bakspyende47. Følgelig kan man si at IL-regionen er opplyst sterkest, men tilstøtende regioner som DP og PrL-regionen kan også stimuleres litt. Derfor er IL-celle spesifikk stimulering ikke garantert, og immunohistokjemisk analyse av de tilstøtende regionene bør utføres, for å se om aktiviteten til PrL- og DP-celler moduleres via lys. I figur 6C visesen annen viktig kontroll: spesifisiteten til Nex-Cre-muselinjen. Via antistofffarging mot de to celletypene i IL-regionen, glutamatergiske prinsippnevroner og GABAergic interneurons, kan det ses, at ChR2-YFP-uttrykket bare forekommer i glutamatergiske nevroner og ikke med GABAergic.

Alt i alt viser våre eksperimenter at med optogenetisk manipulasjon under atferdstesting, kan endringer i angstrelatert atferd observeres. Ved å bruke mer enn én test for samme oppførsel, kan en pålitelig konklusjon trekkes. I tillegg bekrefter immunohistokjemisk analyse de oppnådde dataene. Våre eksperimenter tyder på at den spesifikke aktiveringen av pyramidale nevroner i den infralimbic cortex økte angstrelatert oppførsel i visse analyser.

Figure 4
Figur 4: Optogenetisk aktivering av IL pyramidale nevroner øker angstatferd. Lysstimulering under eksperimenter: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulering. A) Skjematisk tegning av injeksjons- og implantasjonsstedet for ChR2-YFP eller tdTomato inn i IL. Under forsøket aktiveres pyramidale nevroner i IL-regionen av mPFC av ChR2. Saggital hjerneskiver tilpasset fra Paxinos og Franklin mus hjerneatlas, saggital: lateral o,6. B) Open Field labyrint med lysstimulering protokoll (20 min med 4x5 min vekslende Off og På forsøk; venstre) og varmekart over eksemplariske ChR2-injisert (EXP) og tdTomato-injisert (CT) mus i alle 4 studier av eksperimentet (høyre). EXP dyr tilbringer mindre tid i sentrum av OF når stimulert med blått laserlys. For CT-dyr varierer ikke tiden i sentrum mellom lys av og på-forsøk. C) Gruppedata for EXP-dyr i OF, n=11. Mus tilbringer betydelig mindre tid i sentrum av OF når stimulert med blått lys (Off1 39.49±6.9 s, On1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p = 0.033, *; Off1:On2, MWRS, p = 0049, *). Distanse flyttet påvirkes ikke (Av1 2703,09±292,65 cm, On1 3113,4±491,15 cm, Off2 3331,86 ±482,62 cm, On2 3082,17±658,61 cm). # av sentrum oppføringer reduseres med tiden, men viser ingen signifikante forskjeller (Av 1 22,36±3,78, On1 18,45±3,95, Off2 17,36±1,99, On2 13,27±2,64). D) Gruppedata for CT-dyr i OF, n=15. Tid mus tilbringer i sentrum av OF, avstanden flyttet, # av midtoppføringer endres ikke mellom lys På og Av forsøk (Tid i sentrum Off116.73±2.65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Avstand Avslag1 3399,69±296,77 cm, On1 3210,6±446,9 cm, Off2 3030.28±513.83 cm, On2 2955±617.7 cm; Antall senteroppføringer Off1 14,2±1,98, On1 13,6±2,02, Off2 10,8±1,88, On2 11,67±2,5). CT-mus viser signifikant høyere baseline angst (Off1 EXP:CT, MWRS, p=0,005, **). Verdier er ±S.E.M. * indikerer signifikante forskjeller (s≤0,05), ** indikerer signifikante forskjeller (p≤0,01). t-test alltid to-tailed, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; IL: infralimbic cortex; BLA: basolateral amygdala; DRN: dorsal raphe kjerner; AV: Åpent felt; CT: kontroll dyr; EXP: eksperimentelt dyr; L: lys. Dette tallet er endret fra Berg et al. 2019, PLoS One43 og fra Berg 201948. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: EPM-eksperiment viste ikke atferdseffekter hos Nex-Cre-mus. Lysstimulering under eksperimenter: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulering. A) Elevated-Plus Maze med lysstimuleringsprotokoll (18 min, 6x3 min, vekslende off og on-forsøk). B) Gruppedata for musene som "slip off" er inkludert i dataene, totalt n = 23. Nex-Cre mus hadde en tendens til å skli ut av den åpne armen med sine ryggpoter, uavhengig av eksperimentell gruppe (venstre). Bare mus som bodde på labyrinten for alle 6 studier ble vurdert i senere analyser. Slip off's i den første Off1 fasen er grunn til senere unngåelse av de åpne armene (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Sektordiagram (høyre) viser mus som faller fra labyrinten i løpet av 18 min med 42,42%. Bare 57,57% fullførte eksperimentet. C) Varme kart over eksemplariske EXP og CT mus i alle 6 studier av eksperimentet. Begge gruppene viser en nedgang i varigheten av åpen arm etter Off1-studien. D) Gruppedata for EXP-dyr i EPM, n=12. Tiden i de åpne armene gikk betydelig ned i løpet av de to første studiene og stadig etterpå (Off1 73.91±12.22 s, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p = 0,041, *). Avstanden som flyttes påvirkes ikke (Av1 679,96±71,63 cm, On1 712,24±112,82 cm, Av2 717,49±97,39 cm, On2 782,51±81,11 cm, Off3 722,11±68,60 cm, On3 663,90±106,57 cm). Mengden åpne armoppføringer reduseres betydelig fra Off1 til On1 og forblir deretter konstant (Off1 8,08±1,08, On1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Off1:On1, t-test, p = 0,002, **). Tiden brukt i midten av EPM reduseres langs forsøk, men viser ingen signifikant forskjell fra Off to On-studien (Off1 41.71±5.34 s, On1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E) Gruppedata for CT-dyr i EPM, n=11. CT-data viser de samme signifikante reduksjonene som EXP-data, noe som indikerer at eksperimentet ikke har fungert som det skal (Tid i åpne armer Off1 86,92±12,74 s, On1 33,78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p =0.009, **; Avstand Avslag1 705.11±88.36 cm, On1 789.45±77.53 cm, Av2 724,74±80,49 cm, On2 676,57±111,99 cm, Av3 716,99±132,47 cm, On3 663.03±132.46 cm; Åpne arm oppføringer Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MWRS, p = 0,01, *; Tid brukt i sentrum Off1 35.89 s, On1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). Verdier er ± S.E.M. * indikerer signifikante forskjeller (s≤0,05), ** indikerer signifikante forskjeller (p≤0,01). t-test er alltid to-tailed, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; EPM: Forhøyet pluss labyrint; CT: kontroll dyr; EXP: eksperimentelt dyr; OA: åpne armer. Dette tallet er endret fra Berg et al. 2019, PLoS One43 og fra Berg 201948. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Injeksjonssiden av ChR2 og tdTomato i IL- og Nex-Cre-spesifisiteten. A)Skjematisk tegning av implantasjonsstedet på koronar hjerneskiver ved AP + 1,66 mm, ml 0,3 mm, DV -1,8 mm, med ensidig injeksjon og implantasjon (tilpasset fra mushjerneatlas, Paxinos og Franklin, Bregma +1,54 mm). B) Eksemplariske injeksjonssteder for ChR2-YFP (venstre, gul) og tdTomato (høyre, rød) fusjonert med DAPI-fargede cellekjerner (blå) i Nex-Cre-mus. Vektstangen 1 mm. Innsetter viser høy forstørrelse av IL-regionen. Vektstangen 150 μm. Hvite bokser angir plasseringen av innsetter. C) Øverste rad: konfokale bilder av venstre IL-regionen i en Nex-Cre-mus farget med CamKII som markør for glutamatergiske nevroner (blå), og ChR2-YFP (gul) eller Gad67 som markør for GABAergic nevroner (grønn), av en Nex-Cre mus. Nederste rad: colocalization av ChR2-YFP (gul) med CamKII (venstre, blå), men ikke med Gad67 (høyre, grønn), viser spesifisitet av Nex-Cre mus for glutamatergic nevroner. Vektstangen 50 μm. PrL: prelimbic cortex; IL: infralimbic cortex; DP: dorsal peduncular cortex. Dette tallet er endret fra Berg et al. 2019, PLoS One43 og fra Berg 201948. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Å bruke lys til å manipulere nevronal signalisering har vært den metoden for valg i nesten ett tiår nå. Siden 2005, antall publiserte artikler om utvikling av nye optogenetic verktøy4,6,8,14,49,50,51 og studier der slike verktøy benyttes til å undersøke hjernen kretser21,23,40,43,52, høyt økt. På den ene siden, med det enorme mangfoldet av injiserbare optogenetiske verktøy, implantasjonsvarianter, transgene muselinjer og atferdseksperimenter, er muligheten for eksperimenter mangfoldig og ubegrenset. På den annen side er muligheten til å gjøre feil ved valg av eksperimentelle forhold svært høy og eksperimentene er så spesifikke, at ofte er sammenlignbarheten med andre studier vanskelig.

Kritiske trinn
Et viktig kritisk trinn i denne protokollen er riktig planlegging. Valget av optogenetic verktøyet bør matche det vitenskapelige spørsmålet. Er det bare nødvendig å manipulere den generelle aktiviteten til en nevron eller synapse? Deretter kommersielt gitt verktøy som ChR221,,25,,27 og Arch37 er et godt valg. Men bortsett fra det, hvis en spesiell nevrotransmitter system eller en enkelt reseptor bør manipuleres, en individuell reseptor chimera er ofte bedre valg3,6. Flere reseptor chimeras med GPCRs, den såkalte Opto-XRs, og retningslinjer for å produsere dem er allerede tilgjengelig4,50. Annet enn valg av optogenetiske verktøy, er muselinjen i kombinasjon med atferdseksperimentet også kritisk. Ulike bakgrunnsstammer, som for eksempel C57Bl/6 og BALB/cByJ, viser forskjellige atferdsfenotyper i noen henseender53,,54. C57Bl/6-mus har lav baseline angst og kan brukes til anxiogen manipulasjon, mens BALB/cByJ viser høyere angstnivåer og er derfor mer følsomme for anxiolytiske legemidler. I tillegg kan de transgene variantene av disse bakgrunnsstammene også variere i fenotypen48. Med en riktig kombinasjon av spesifikke arrangører i forbindelse med et optogenetisk verktøy og transgen muselinje, kan nesten alle ønskede cellepopulasjoner målrettes.

Et kritisk skritt under operasjonen er rettet mot riktig plassering. Ved hjelp av musen hjerneatlas, riktige koordinater for fremre-bakre aksen, og mediale-lateral akse, og dybden av strukturen kan etableres45. I virkeligheten har hver hodeskalle en litt annen form og størrelse. Dermed er F-faktor46 for å justere stereotaktiske koordinater ganske viktig, som er riktig nese- og ørefiksering under stereotaktisk kirurgi. Hvis musens hode er vippet, vil injeksjons canulaen ikke klare å målrette mot ønsket interesseområde.

I tillegg er diameteren på injeksjons canula også kritisk. Hvis det er for lite, kan ingen virus slippes ut i vevet, hvis det er for bredt, vil kanulaen lekke virusløsning på vei til interesseområdet. Hvis den implanterte optiske fiberen avsluttes rett over målområdet, spiller virusuttrykket i cortex-områdene ovenfor ingen rolle. Men hvis implantatet er plassert over andre regioner for å stimulere axon terminaler, aksonene i øvre cortex regioner vil også bli aktivert av lys og forfalske innhentet data. Som et eksempel: IL-regionen og den prelimbic (PrL) regionen begge projisere til basal amygdala55,56 menhar helt forskjellige funksjoner og roller i modulering av angst26,57. Hvis implantatet er plassert over amygdala for å aktivere axon terminaler fra IL-regionen, og under injeksjon virusoppløsningen ble også plassert i PrL på grunn av feil injeksjon kanula, risikoen for også å aktivere axon terminaler fra PrL er svært høy.

Under utarbeidelsen av skallen for fiksering av implantatet, er den sparsomme bruken av primer og binding avgjørende for en pålitelig og holdbar fiksering. Hvis 2-komponent vedheftssystemet ikke påføres tynt, kan tannsementen løsne fra skallen etter et par dager eller uker. I tillegg må skallen også tørkes helt før du fikser implantatet, da ellers vil sementen ikke festes riktig til skallen.

Kritiske trinn finnes også i atferdsdelen av denne protokollen. For det første er byggingen av labyrinten svært viktig. I hvert atferdsoppsett finnes det flere varianter i litteraturen om størrelse og form, samt for selve prosedyren58,,59,,60. Det er viktig å velge en variant som gjør dataene sammenlignbare og reproduserbare. Også spesielle krav til brukte muselinjer bør tas i betraktning43,48. I de representative dataene for EPM kan det ses at flere Nex-Cre-mus falt fra labyrinten eller gled av flere ganger (Figur 2b). For disse musene ville en labyrint med en liten vegg rundt de åpne armene ha vært et bedre alternativ.

For det andre er det viktig å holde alle eksterne romforholdkonstante 61, ellers ville forskjellige grupper av mus ikke være sammenlignbare i det hele tatt. I denne forbindelse er det svært viktig å velge tidspunktet for eksperimentet som en hvor det eksperimentelle oppsettet er ledig og eksperimentereren alltid er tilstede. Videre bør hendelser i bygningen, for eksempel byggearbeid, testing av systemer (brannalarm) eller rengjøringsdagen til museanlegget, vurderes for å unngå interferens med de oppnådde dataene.

Til slutt er håndtering og boforhold avgjørende for atferdseksperimenter. Når en implantasjon utføres, må mus være enkelt plassert på grunn av risikoen for skade fra andre mus. For å sikre god sammenligning mellom grupper og en lav feil i én gruppe, må hver mus ha samme burstørrelse og berikelse. For angstrelaterte eksperimenter har enkeltboliger noen fordeler som singe housed mannlige mus viser en lavere baseline angst nivå, mindre variasjon i deres angstnivå, og mindre depressive-lignende symptomer15,16. Gruppehus hannmus kan sterkt variere i angstnivået på grunn av hierarki blant musene. Foruten huset er en konstant og lik håndtering av alle mus og grupper også viktig. Å gripe musen for å koble den lette fiberen på implantatet er veldig stressende. Derfor må denne prosedyren være den samme for hver mus, noe som betyr samme teknikk og samme eksperimenterer. Videre må habituation tid i venteburet, som er ment å roe musen ned fra stressende tilkoblingsprosedyre, også ha like forhold i varighet, søppel og posisjon til labyrinten. Håndteringen i museanlegget er også avgjørende for senere atferdsytelse. Eksperimentelle og kontrollerende dyr bør ikke rengjøres på forskjellige dager eller av forskjellige mennesker, da dette også er stressende for mus. I tillegg bør rengjøringsdagen ikke være den eksperimentelle dagen for å unngå forskjeller i atferd.

Feilsøking
Det er flere problemer som kan oppstå under protokollen. For eksempel kan boring av en helhet i skallen under stereotaktisk kirurgi skade blodårene. Vanligvis oppstår sterk blødning, spesielt over bregma og lambda. Hvis dette skjer, ikke prøv å stoppe blødningen med bomullpinner som de har en tendens til å utvide enda mer blødning ut av fartøyet på grunn av deres absorbens, i stedet, skyll direkte med NaCl.

Det kan også hende at trykkinjeksjonen av virusoppløsningen ikke virker. I dette tilfellet kan det være at parafilm, en scab fra burr hullet eller hjernevev, tetter spissen av kanula. I dette tilfellet fjerner du kanulaen sakte ut av hjernen uten å endre x- eller y-aksen og bruker en pinsett for å fjerne 1-2 mm av den fremre delen av kanulaspissen. Før du senker kanula igjen, test for funksjonalitet ved å bruke liten mengde trykk for å se om viruset kommer ut av kanulaspissen. For å unngå forstoppelse, senk kanulaen med konstant hastighet og ikke stopp bevegelsen før den dypeste dybden på injeksjonssiden er nådd. Hvis for mye av kanulaspissen fjernes og diameteren er for stor, vil kanulaen skade vevet og risikoen for å bruke viruset samtidig vil bli økt. Sørg derfor for at bare den tette delen av spissen fjernes nøye.

Under atferdseksperimentet kan oppsettet av eksperimentet i videosporingsprogramvaren (f.eks. Ethovision XT) forårsake problemer. Hvis for eksempel lyseffekten ikke fungerer som den skal, kan dette skyldes flere grunner. Pulser må åpnes, programmeres og startes før Ethovision XT åpnes. Maskinvaren må velges riktig i "Eksperimentell oppsett" (trinn 3.2.2.4). Hvis feil IO-Box, eller noe annet enn "Kostymemaskinvare" er valgt, kan ikke Pulser-enheten styres av Ethovision. Hvis testen av lyseffekten er vellykket, men den programmerte lysprotokollen i "Innstillinger for prøvekontroll" ikke fungerer under anskaffelsen, kan underregelen eller underregelreferansen være plassert feil eller betingelsene og handlingene er uklare. For eksempel: tilhører referansen den riktige underregelen? Er referansen programmert riktig (f.eks. hvor ofte utføres underregelen)?

I tillegg kan det hende at under "deteksjonsinnstillinger" dyret er tilstrekkelig sporet, men under oppkjøpet er det prøver der motivet ikke er funnet. I dette tilfellet, sjekk om belysningen i eksperimentelle rommet ble endret, eller om noe produsert uønskede skygger i labyrinten. Hele bunnen av labyrinten må ha samme farge, da innstillingen bare vil fungere for en bestemt kombinasjon. Hvis forskjellige bunnfarger eller skygger av en eller annen grunn ikke kan unngås, definerer du deteksjonsinnstillingen i den mørkeste delen av labyrinten.

Hvis du vil endre eventuelle innstillinger etter anskaffelsen av de første dyrene, må du ikke bruke disse endringene i de allerede brukte innstillingene. Dupliser dem for å justere dem. Dette betyr også at den allerede registrerte prøveversjonen ikke er gyldig lenger for dataanalyse. I et slikt tilfelle registrerer du alle dyr for denne eksperimentelle gruppen med de opprinnelige innstillingene, og opprett et nytt eksperiment etterpå hvor de innspilte videoene analyseres i stedet for live sporing. I dette "fra video" eksperimentet kan flere innstillinger brukes til analyse uten å miste sammenlignbarhet mellom dyr eller til og med data.

Begrensninger og fremtidige applikasjoner
Denne metoden for å manipulere atferd med optogenetikk i fritt bevegelige dyr inkluderer også begrensninger. Under operasjonen er nærheten til de to implantatene begrenset. For dobbel implantasjon må avstanden mellom de to implantatene minimalt være bredden på apparatet for å holde implantatet. Apparatet må senke det andre implantatet ned i burrhullet, mens de første implantatene allerede er festet. En løsning for dette kan være en vinklet implantasjon, hvor tuppene av glassfiberen kan være svært nær mens de keramiske ferlene over skallen har størreavstand 23,,55,,56,,57,,62,,63. En ulempe med en vinklet implantasjon er lyset som sprer seg. Når fiberspissen skrås i stedet for rett over, er det stimulerte området forskjellig. Ved to målregioner i umiddelbar nærhet må den endrede posisjonen til lysstimuleringen vurderes.

Under atferdseksperimentet kan byggingen av labyrinten forstyrre den optiske kabelen som er koblet til dyret. Noen atferdstester, for eksempel den lyse mørke boksen, inneholder et innendørs område64,,65og andre labyrinter inneholder rom som musen må gå inn i. Slike eksperimenter kan ikke utføres med dette oppsettet. Et trådløst system kan også være et alternativ22,26,66. Men heldigvis kan noen labyrinter, som Barnes Maze, ordnes på en slik måte, at musene er i stand til å gå inn i de relevanterommene 67.

Foruten de med lukkede soner, kan labyrinter som er for brede forårsake også problemer. Jo større området av labyrinten, jo lenger kabelen må være for å tillate dyret å gå til alle posisjoner i labyrinten. Det må tas hensyn til at dyret ikke er i stand til å tråkke på kabelen eller ta det og bite det. En løsning for det kan være en konstruksjon som ruller opp overflødig kabel. En ulempe er at dra for å rulle ut kabelen er vanskelig for mus. Denne løsningen passer bedre for rotter. Et annet mulig alternativ kan være å gjøre lysstimuleringen på forhånd, i stedet for under forsøket, er dette selvfølgelig bare mulig hvis en langsiktig effekt på grunn av lysstimuleringen oppstår23.

Sammenligning med eksisterende/alternative metoder
Alternative metoder ville være kjemisk eller elektrisk stimulering underatferd 8,18. Kjemiske agonister eller antagonister er i stand til å aktivere eller dempe nevroner via spesifikke reseptorer og kan også manipulere enkelt nevrotransmittersystemer38,68. På den ene siden er reseptorspesifisiteten ganske høy for kjemikalier, fordi spesifikk agonist eller antagonist bare aktiverer visse reseptorer39. På den annen side er spesifisiteten for reseptorundertyper av samme nevrotransmittergruppe ofte utilstrekkelig. De fleste kjemikalier binder seg til minst to undertyper med ulike sannsynligheter69. I tillegg kan kjemikalier ikke skille mellom nevronale celletyper så lenge de har de samme reseptortypene. Utover dette er timelig og romlig oppløsning dårlig for kjemiske manipulasjoner i forhold til optogenetikk. Agonister eller antagonister administreres ofte oralt35 eller via systemiske injeksjoner57,,70. Hvis infusjonen av kjemikaliet gjøres direkte i hjernevevet, vises effektene raskere enn med orale applikasjoner, men fortsatt på en langsommere tidsskala enn med lysstimulering. Som administrerte kjemikalier diffuse i hjernen og er ikke spesifikke for nevronale typer eller hjerneregioner, manipulering av spesifikke hjernekretser det ikke mulig.

Elektrisk stimulering har en høyere temporal oppløsning enn kjemiskstimulering 9,,14. Spredningen i nevronalt vev er mindre enn med kjemisk stimulering, og romlig oppløsning er bedre enn med kjemisk stimulering. Elektrisk stimulering mangler imidlertid muligheten til å spesifikt adressere forskjellige nevronale celletyper eller reseptortyper, da hver nevron i nærheten av elektroden vil reagere på den elektriske stimuleringen.

Alternative metoder for atferden i fritt bevegelige mus er for eksempel elektrofysiologiske opptak i hjerneskiver, hvor enkeltnevroner eller aksoner kan moduleres med optogenetikk og fremkalte effekter kan måles via opptak avelektroder 6,,71. In vitro eksperimenter tilbyr muligheten til å undersøke molekylær og cellulær basis av optogenetiske stimuleringer, men har begrensningen at iboende tilkobling og innspill fra andre hjerneregioner mangler. Et annet alternativ er å bruke optogenetic i forbindelse med multiphoton imaging1,72. I dette tilfellet har mus hodet fast og kan bedøves eller være våken for å løse enkle oppgaver.

For å utføre et vellykket optogenetisk eksperiment, er et bredt spekter av verktøy og applikasjoner tilgjengelige i dag. Valg av optogenetiske verktøy og atferdsmessig oppsett er avgjørende for å svare på spesifikke forskningsspørsmål. Hvis den rette kombinasjonen av verktøy og eksperimenter er valgt, tillater optogenetikk en enestående, grundig undersøkelse av nevronale kretser med høy temporal og romlig oppløsning. Dette vil bidra til å forstå og utvikle nye terapeutiske strategier for psykiatriske sykdommer og kognisjon.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Stor takk til Prof Klaus-Armin Narve og Dr. Sandra Goebbels (Max-Plank-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Tyskland) for vennlig å gi Nex-Cre mus. Vi takker også vårt videoteam Yunus Dikici og Ruben Wiesner for opptak og behandling av JoVE-videoen for denne artikkelen. I tillegg, stor takk til Kristin Claussen for hennes voice-over og Kimberly Anne Go for korrekturlesing av manuskriptet.

De presenterte resultatene ble oppnådd ved Ruhr-universitetet i Bochum og videoen ble spilt inn ved Universitetet i Bremen.

Dette arbeidet ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 122679504 - SFB 874 og DFG MA 4692/3-2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamin Sigma-Aldrich K2753-64 Anestasia
20 % Glucose AlleMan Pharma Injection s.c. for fast recovery
Behavioral mazes Costum made Measure anxiety
Bepanthen Bayer Ophthalmic oinment
Betaisodona Monodipharma Sterilant containing iodine
Betaisodona Monodipharma Iodine oinment
Binocular Olympus SZ52, 110AL0.62x WD160 Surgery
Ceramic ferrules Thorlabs CFLC230-10 Implant
Ceramic Fiber Scribe Thorlabs CSW12.5 Cutting of the glass fiber
Channelrhodopsin2-YFP virus Penn Vector Core Addgene 20298 Optogenetic tool
Compressed air Kontakt Chemie Druckluft 67 Drying of the skull
Coordinate system Stoelting Stereotactic coordinates for the surgery
Correl Draw Graphical software version 13
Cryoslicer MICROM HM500OM Production of brain slices for staining
Ethovision XT 14 Noldus Software for behavioral tracking
Exel Statistical Software
Ferrule Polishing Puck Thorlabs D50-F Polishing implants round side
Fiber Patch Cord dual Prizmatix Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation
Fiber Patch Cord single Prizmatix Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm Cable, which is connected with the implant via a sleeve
Fiber Stripping Tool Thorlabs T06S13 Stripping glass fiber for implant
Filter paper VWR European 516-0300 Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test
Food pellets Mühle Levers Höveler Nagerfutter Nutrition for the mice
Glass pipettes Harvard Apparatus GC150-10 Injection pipettes
Gradia direct-Flo Henry Schein 103322 Fluid dental cementum
Heating lamp efbe-Schott/Phillips R95E Prevent the mice from cooling after the surgery
Heating plate Stoelting Integrated into coordinate system
Injection canula Braun 100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20 All injections and to bore hole into the skull
Litter T 1350 Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test
Mouse cages Zoonlab 405 cm^2 Single housing for experiments
Optibond FL Kerr 26684E Preparation of the skull for implantation
Optical glass fiber Thorlabs FT200EMT Light fiber for implant
Optogenetics-LED.STSI Prizmatix Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R Perfusion of mice to remove the brains
Polishing sheet 0.02 µm grit Thorlabs LFCF Polishing implants round side
Polishing sheet 1 µm grit Thorlabs LF1D Polishing implants round side
Polishing sheet 30 µm grit Thorlabs LF30D Polishing implants round side
Polishing sheet 6 µm grit Thorlabs LF6D Polishing implants round side
Pulser Software Prizmatix Software for light device control
Rimadyl-Carprofen Zoetis Analgesia
Sigma Plot Software for statistics
Sleeve Thorlabs FT200EMT Connection of implant and light cable
SodiumCloride (NaCl) Braun 3570410 Rinsing of the skull
Superglue Pattex Henkel To Fix the glass fiber in the ferrule
td-Tomato virus Penn Vector Core Addgene 51503 Optogenetic tool
UV light KoQGHJ wireless, 1200 mW/cm^2 Polymeration lamp for dental cementum
Xylavet-Xylazin cp pharma Anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chow, B. Y., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature Letters. 463, 98-102 (2010).
  2. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
  3. Spoida, K., Masseck, O. A., Deneris, E. S., Herlitze, S. Gq/5-HT2c receptor signals activate a local GABAergic inhibitory feedback circuit to modulate serotonergic firing and anxiety in mice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 111, 6479-6484 (2014).
  4. Kleinlogel, S. Optogenetic user's guide to Opto-GPCRs modified GPCRs. Frontiers in Bioscience. 21, 794-805 (2016).
  5. Mahn, M., Prigge, M., Ron, S., Levy, R., Yizhar, O. Biophysical constraints of optogenetic inhibition at presynaptic terminals. Nature Neuroscience. 19, 554-556 (2016).
  6. Masseck, O. A., et al. Vertebrate Cone Opsins Enable Sustained and Highly Sensitive Rapid Control of Gi/o Signaling in Anxiety Circuitry. Neuron. 81, 1263-1273 (2014).
  7. Oh, E., Maejima, T., Liu, C., Deneris, E., Herlitze, S. Substitution of 5-HT 1A Receptor signaling by a light-activated G protein-coupled receptor. Journal of Biological Chemistry. 285, 30825-30836 (2010).
  8. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in Neural Systems. Neuron Primer. 71, 9-34 (2011).
  9. Masseck, O. A. A Guide to Optogenetic Applications, With special Focus on Behavioral and In Vivo Electrophysiological Experiments. HandboOk of In Vivo Neural Plasticity Techniques - A Systems Neuroscheince Approach to the Neural Basis of Memory and Cognition. Manahan-Vaughan, D. Academic Press. 557 (2019).
  10. Goebbels, S., et al. Genetic Targeting of Principal Neurons in Neocortex and Hippocampus of NEX-Cre Mice. Genesis. 611-621 (2006).
  11. Yang, Y. S., Hughes, T. E. Cre Stoplight: A red/green fluorescent reporter of Cre recombinase expression in living cells. Biotechniques. 31, 1036-1041 (2001).
  12. Schnütgen, F., et al. A directional strategy for monitoring Cre-mediated recombination at the cellular level in the mouse. Nature Biotechnology. 21, 562-565 (2003).
  13. Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  14. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 268-273 (2011).
  15. Palanza, P., Gioiosa, L., Parmigiani, S. Social stress in mice: Gender differences and effects of estrous cycle and social dominance. Physiology and Behavior. 73, 411-420 (2001).
  16. Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415, 197-201 (2001).
  17. Masseck, O. A., Rubelowski, J. M., Spoida, K., Herlitze, S. Light- and drug-activated G-protein-coupled receptors to control intracellular signalling. Experimental Physiology. 96, 51-56 (2011).
  18. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4, (2007).
  19. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature Article. 446, 633-639 (2007).
  20. Owen, S. F., Liu, M. H., Kreitzer, A. C. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nature Neuroscience. 22, 1061-1065 (2019).
  21. Hare, B. D., et al. Optogenetic stimulation of medial prefrontal cortex Drd1 neurons produces rapid and long-lasting antidepressant effects. Nature Communication. 10, 1-12 (2019).
  22. Allsop, S. A., Vander Weele, C. M., Wichmann, R., Tye, K. M. Optogenetic insights on the relationship between anxiety-related behaviors and social deficits. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 1-14 (2014).
  23. Fuchikami, M., et al. Optogenetic stimulation of infralimbic PFC reproduces ketamine's rapid and sustained antidepressant actions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 8106-8111 (2015).
  24. Correia, P. A., et al. Transient inhibition and long-term facilitation of locomotion by phasic optogenetic activation of serotonin neurons. Elife. 6, 1-26 (2017).
  25. Felix-Ortiz, A. C., Burgos-Robles, A., Bhagat, N. D., Leppla, C. A., Tye, K. M. Bidirectional modulation of anxiety-related and social behaviors by amygdala projections to the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 321, 197-209 (2016).
  26. Marek, R., Xu, L., Sullivan, R. K. P., Sah, P. Excitatory connections between the prelimbic and infralimbic medial prefrontal cortex show a role for the prelimbic cortex in fear extinction. Nature Brief Communication. (2018).
  27. Parfitt, G. M., et al. Bidirectional Control of Anxiety-Related Behaviors in Mice: Role of Inputs Arising from the Ventral Hippocampus to the Lateral Septum and Medial Prefrontal Cortex. Neuropsychopharmacology. 42, 1715-1728 (2017).
  28. Bandelow, B., Michaelis, S. Epidemiology of anxiety disorders in the 21st century. Dialogues in Clinical Neuroscience. 17, 327-335 (2015).
  29. Kessler, R. C., et al. Lifetime Prevalence and Age-of-Onset Distributions of DSM-IV Disorders in the National Comorbidity Survey Replication. Archives of General Psychiatry. 62, 593-602 (2005).
  30. Kessler, R. C., Petukhova, M., Sampson, N. A., Zaslavsky, A. M., Wittchen, H. U. Twelve-month and lifetime prevalence and lifetime morbid risk of anxiety and mood disorders in the United States. International Journal of Methods Psychiatric Research. 21, 169-184 (2014).
  31. Andlin-Sobocki, P., Wittchen, H. U. Cost of anxiety disorders in Europe. European Journal of Neurology. 12, 39-44 (2005).
  32. Forster, G. L., Novick, A. M., Scholl, J. L., Wall, M. J. The Role of the Amygdala in Anxiety Disorders. Intech. 61-102 (2012).
  33. Liberzon, I. Neural circuits in anxiety and stress disorders a focused review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 11, 115-126 (2015).
  34. Sylvers, P., Lilienfeld, S. O., LaPrairie, J. L. Differences between trait fear and trait anxiety: Implications for psychopathology. Clinical Psychology Review. 31, 122-137 (2011).
  35. Daws, L. C., Koek, W., Mitchell, N. C. Revisiting Serotonin Reuptake Inhibitors and the Therapeutic Potential of 'Uptake-2' in Psychiatric Disorders. ACS Chemical Neuroscience. 4, 16-21 (2013).
  36. Felix-Ortiz, A. C., et al. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron Report. 79, 658-664 (2013).
  37. Padilla-Coreano, N., et al. Direct Ventral Hippocampal-Prefrontal Input Is Required for Anxiety-Related Neural Activity and Behavior. Neuron Article. 89, 857-866 (2016).
  38. Lisboa, S. F., Stecchini, M. F., Corrêa, F. M. A., Guimarães, F. S., Resstel, L. B. M. Different role of the ventral medial prefrontal cortex on modulation of innate and associative learned fear. Neuroscience. 171, 760-768 (2010).
  39. Bi, L. L., et al. Enhanced excitability in the infralimbic cortex produces anxiety-like behaviors. Neuropharmacology. 72, 148-156 (2013).
  40. Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature Article. 477, 171-178 (2011).
  41. Goebbels, S., et al. Genetic Targeting of Principal Neurons in Neocortex and Hippocampus of NEX-Cre Mice. Genesis. 44, 611-621 (2006).
  42. Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/ inhibition in key neural systems. Genes, Brain and Behavior. 2, 255-267 (2003).
  43. Berg, L., Eckardt, J., A, M. O. Enhanced activity of pyramidal neurons in the infralimbic cortex drives anxiety behavior. PLoS One. 14, 1-19 (2019).
  44. Meunier, C. N. J., Amar, M., Lanfumey, L., Hamon, M., Fossier, P. 5-HT1A receptors direct the orientation of plasticity in layer 5 pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex. Neuropharmacology. 71, 37-45 (2013).
  45. Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2, Academic Press. (2004).
  46. Gore, B. B., Soden, M. E., Zweifel, L. S. Manipulating gene expression in projection-specific neuronal populations using combinatorial viral approaches. Current Protocols in Neuroscience. 435, 1-6 (2014).
  47. Stujenske, J. M., Spellman, T., Gordon, J. A. Modeling the Spatiotemporal Dynamics of Light and Heat Propagation for InVivo Optogenetics. Cell Report. 12, 525-534 (2015).
  48. Berg, L. Imbalance of excitation and inhibition within the prefrontal cortex supports anxiety behavior. Ruhr-University Bochum. Doctoral dissertation (2019).
  49. Boyden, E. S. A history of optogenetics: The development of tools for controlling brain circuits with light. F1000 Biology Reports. 3, 1-12 (2011).
  50. Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
  51. Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7, 12-23 (2012).
  52. Covington, H. E., et al. Antidepressant Effect of Optogenetic Stimulation of the Medial Prefrontal Cortex. Journal of Neuroscience. 30, 16082-16090 (2010).
  53. Lepicard, E. M., Joubert, C., Hagneau, I., Perez-Diaz, F., Chapouthier, G. Differences in anxiety-related behavior and response to diazepam in BALB/cByJ and C57BL/6J strains of mice. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 67, 739-748 (2000).
  54. Schmidt, M. V., Müller, M. B. Animal models of anxiety. Elsevier. 3, 369-374 (2006).
  55. Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic Encoding of Fear Extinction in mPFC-amygdala Circuits. Neuron Article. 80, 1491-1507 (2013).
  56. Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527, 179-185 (2015).
  57. Suzuki, S., et al. The infralimbic and prelimbic medial prefrontal cortices have differential functions in the expression of anxiety-like behaviors in mice. Behavioural Brain Research. 304, 120-124 (2016).
  58. Carola, V., D'Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134, 49-57 (2002).
  59. Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: A review. European Journal of Pharmacology. 463, 3-33 (2003).
  60. Tye, K. M., et al. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature Letter. 471, 358-362 (2011).
  61. Bouwknecht, J. A., et al. Differential effects of exposure to low-light or high-light open-field on anxiety-related behaviors: Relationship to c-Fos expression in serotonergic and non-serotonergic neurons in the dorsal raphe nucleus. Brain Research Bulletin. 72, 32-43 (2007).
  62. Overstreet, D. H., Knapp, D. J., Angel, R. A., Navarro, M., Breese, G. R. Reduction in repeated ethanol-withdrawal-induced anxiety-like behavior by site-selective injections of 5-HT1A and 5-HT2C ligands. Psychopharmacology. 187, Berlin. 1-12 (2006).
  63. Takahashi, A., et al. Glutamate Input in the Dorsal Raphe Nucleus As a Determinant of Escalated Aggression in Male Mice. Journal of Neuroscience. 35, 6452-6463 (2015).
  64. Klemenhagen, K. C., Gordon, J. A., David, D. J., Hen, R., Gross, C. T. Increased Fear Response to Contextual Cues in Mice Lacking the 5-HT1A Receptor. Neuropsychopharmacology. 31, 101-111 (2006).
  65. Ramos, A. Animal models of anxiety: do I need multiple tests. Trends in Pharmacological Science. 29, 493-498 (2008).
  66. Isosaka, T., et al. Htr2a-Expressing Cells in the Central Amygdala Control the Hierarchy between Innate and Learned Fear. Cell. 163, 1153-1164 (2015).
  67. Regev, L., Goshen, I. Employing Optogenetics in Memory Research. Optogenetics: A Roadmap. 219-256 (2017).
  68. Shah, A. A., Sjovold, T., Treit, D. Inactivation of the medial prefrontal cortex with the GABA A receptor agonist muscimol increases open-arm activity in the elevated plus-maze and attenuates shock-probe burying in rats. Brain Research. 1028, 112-115 (2004).
  69. Knight, A. R., et al. Pharmacological characterisation of the agonist radioligand binding site of 5-HT2A, 5-HT2B and 5-HT2C receptors. Naunyn-Schmiedebergs Archiv of Pharmacology. 370, 114-123 (2004).
  70. Graeff, F. G., Viana, M. B., Mora, P. O. Dual Role of 5-HT in Defense and Anxiety. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21, 791-799 (1997).
  71. Cheriyan, J., Sheets, P. L. Altered Excitability and Local Connectivity of mPFC-PAG Neurons in a Mouse Model of Neuropathic Pain. Journal of Neuroscience. 38, 4829-4839 (2018).
  72. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
Optogenetic manipulering av nevronal aktivitet for å modulere atferd i fritt bevegelige mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (164), e61023, doi:10.3791/61023 (2020).More

Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (164), e61023, doi:10.3791/61023 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter