Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Optogenetisk manipulation av neuronal aktivitet för att modulera beteende i fritt rörliga möss

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61023
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Biology and Chemistry, Synthetic Biology, University of Bremen, 2Advanced Fluorescence Microscopy, Faculty of Biology and Biotechnology, Ruhr-Universität Bochum

Summary

Med optogenetisk manipulation av specifika neuronala populationer eller regioner hjärnan, beteende kan ändras med hög tidsmässiga och rumsliga upplösning i fritt rörliga djur. Genom att använda olika optogenetiska verktyg i kombination med kroniskt implanterade optiska fibrer kan en mängd neuronal modulationer och beteendetestning utföras.

Abstract

Optogenetiska modulering av neuronal kretsar i fritt rörliga möss påverkar akut och långsiktigt beteende. Denna metod är i stånd att utföra manipulationer av enstaka nervceller och region-specifika sändare release, upp till hela neuronala kretsar i centrala nervsystemet, och möjliggör direkt mätning av beteendemässiga resultat. Nervceller uttrycker optogenetiska verktyg via en injektion av virala vektorer som bär DNA val, såsom Channelrhodopsin2 (ChR2). Ljus förs in i specifika hjärnregioner via kroniska optiska implantat som slutar direkt över målregionen. Efter två veckors återhämtning och korrekt verktyg-uttryck, möss kan upprepade gånger användas för beteendemässiga tester med optogenetisk stimulering av nervceller av intresse.

Optogenetiska modulation har en hög tidsmässig och rumslig upplösning som kan åstadkommas med hög cell specificitet, jämfört med de vanliga metoder som kemisk eller elektrisk stimulering. Ljuset skadar inte neuronal vävnad och kan därför användas för långsiktiga experiment samt för flera beteendeexperiment i en mus. Möjligheterna med optogenetiska verktyg är nästan obegränsade och möjliggör aktivering eller ljuddämpning av hela nervceller, eller till och med manipulering av en specifik receptortyp av ljus.

Resultaten av sådana beteendeexperiment med integrerad optogenetisk stimulering visualiserar direkt förändringar i beteende som orsakas av manipulationen. Beteendet hos samma djur utan ljusstimulering som en baslinje är en bra kontroll för inducerade förändringar. Detta möjliggör en detaljerad översikt av neuronala typer eller signalsubstanssystem som är involverade i specifika beteenden, såsom ångest. Den plasticitet av neuronala nätverk kan också undersökas i stor detalj genom långsiktig stimulering eller beteendemässiga observationer efter optisk stimulering. Optogenetik kommer att bidra till att upplysa neuronal signalering i flera typer av neurologiska sjukdomar.

Introduction

Moduleringen av neuronala kretsar i centrala nervsystemet och deras beteendemässiga resultat är viktiga för att förstå hur hjärnan fungerar, särskilt vid psykiatriska sjukdomar och kognitiva uppgifter som inlärning och minne. Med optogenetik kan enstaka celler eller cellpopulationer upp till hela kretsar moduleras av ljus. Vanliga optogenetiska verktyg som Channelrhodopsin2 (ChR2) eller Archaerhodopsin (Arch) kan aktivera eller tysta nervceller, eller öka eller hämma sändarutgåvan vid axonterminaler som projicerar till distinkta hjärnregioner1,2,3,4. Dock måste Arch användas försiktigt eftersom det visades att dess aktivering vid presynaptiska terminaler ökar spontan sändare release5. Arch är en utåt rättande protonpump som ändrar pH-värdet inuti cellen. Denna alkaliska miljö inducerar kalciumtillströmningen och förbättrar sändarutgåvan5. För att specifikt modulera intracellulära signalvägar, receptor chimeras består av ett ljus aktiveras optogenetiskt verktyg, såsom rhodopsin eller kon opsin, i samband med en adekvat G-protein kopplade receptor, kan skapas6,7,8. Mängden och variationen av optogenetiska verktyg som finns har ökat betydligt under det senaste decenniet9.

Syftet med optogenetik är att manipulera neuronal kretsar under beteende. Optogenetik möjliggör till exempel mätning av akuta beteendeförändringar såsom förändringar i ångestbeteende. Optogenetiska verktyg levereras till målregioner i hjärnan via virala vektorer. Med hjälp av särskilda tillskyndare och förstärkare, eller Cre-loxP-systemet, kan man säkerställa celltypsspecialitet för uttrycket av optogenetiska verktyg (Figur 1A). Det finns flera genetiskt modifierade muslinjer som uttrycker enzymet Cre-Recombinase i specifika celltyper endast. Till exempel, Nex-Cre möss uttrycka Cre-Rekombinas i pyramidala nervceller i cortex och hippocampus under kontroll av Nex-promotor10. Detta enzym är kompetent att invertera DNA-ordnar, som flankeras av loxP-sidor11. Följaktligen kan DNA-sekvensen av en dubbel-floxed optogenetiska verktyg, som är inverterad och flankerad av loxP sidor, endast transkriberas av nervceller som besitter Cre-Rekombinas, men inte av andra neuronala typer12,13. När det gäller Nex-Cre-möss kommer det optogenetiska verktyget enbart att uttryckas i pyramidala nervceller. Ljusstimulering av vissa hjärnregioner uppnås sedan via kronisk implantation av optiska fibrer direkt ovanför den region av intresse. Djur kan sedan kopplas till en lämplig ljuskälla och fritt bete sig i nästan alla typer av beteendemässiga tester.

Figure 1
Bild 1: Injektion och implantation. A) Cre-loxP-system för ChR2-YFP. Dubbel floxed optogenetiska verktyget är förpackad i en adeno associerade virus (AAV) för injektion i hjärnvävnaden. B) Sagittal syn på virusinjektionen och implantationen av ett optiskt neuronalt gränssnitt in i/ovanför IL-regionen i mPFC. Injektion och implantation gjordes ovanifrån. Alla regioner av intresse, IL, BLA och DRN, visas. C) Detaljerad vy över den implanterade optiska fibern, hylsan och ljuskällan. D) Spridning av blå och röd laserljusstimulering i grå substans hjärnvävnad från en 200 μm ljusfiber (Yizhar et al. 2011). Blått ljus sprider sig, vid maximum, 0,5 mm in i vävnaden, rött ljus ca 1 mm. Färgkodning: röd 50%, gul 10%, grön 5%, blå 1% om ljus når detta område. E) Koronal syn på den ensidiga implantationen direkt ovanför vänster IL med en optisk fiber på 200 μm. IL-regionen har en bredd på 0,25 mm på varje halvklot och ett djup på 0,2 mm. Blå och röda glödlampor är boarder av 5% ljus spridning och överförs från Yizhar et al till rätt storlek. LoxP: locus av X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: gult fluorescerande protein; dflox: dubbel floxed; IL: infralimbic cortex; BLA: basolateral amygdala; DRN: dorsala raphe kärnor; PrL: prelimbic region. Denna siffra har ändrats från Berg 201948. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Optogenetiska tillvägagångssätt utnyttjas eftersom det möjliggör både hög tidsmässig och rumslig upplösning14 och celltyp specifik modulering. Dessutom är det möjligt att upprepat använda den implanterade enheten utan ytterligare behandling. Efter en stereotaktisk kirurgi, där injektionen av ett adeno-associerat virus som bär på det optogenetiska verktyget och implantationen av den optiska fibern utförs, kan möss återhämta sig i två veckor. Vi har valt en återhämtningstid på endast 2 veckor, eftersom detta är tillräckligt med tid att återhämta sig från operationen och för viruset att uttrycka. Eftersom beteendeexperimenten följs av immunohistokemi måste vi se till att möss inte blir för gamla under experimentet; annars minskas vävnadskvaliteten. De visar inga uppenbara beteendemässiga funktionsnedsättningar från implantatet och engagera sig i typiska bur beteende. Naturligtvis är implantationen åtföljd av en betydande kirurgisk lesion; därför övervakas mössen intensivt. Efter operationen måste möss enstaka inhysas, eftersom grupphusmöss tenderar att skada varandras färska sår och implantat. Men bostadsförhållanden har en stor inverkan på ångestnivån hos manliga möss, som enda inrymt möss visar lägre ångest nivåer15 och i allmänhet mindre depressiva-liknande symtom16.

Kemisk eller elektrisk manipulation av hjärnkretsar saknar optogenetikens höga celltypssärkalitet och har en lägre tidsmässig och rumslig upplösning14,17,18. Beroende på den experimentella frågan kan elektrisk eller kemisk stimulering ha olika fördelar. När passerar fiber terminaler i en specifik region måste också stimuleras, elektrisk stimulering är den bästa metoden. Kemisk stimulering är ett bra val för när sändarspecifika receptorer i en hel region ska aktiveras av agonister. En annan stor fördel med optogenetik jämfört med kemisk eller elektrisk stimulering är att endogent, nervceller är inte känsliga för ljus, som undviker förekomsten av biverkningar19. Faktum är att höga ljusintensiteter kan inducera värmeeffekter8,20, men på grund av rätt kontrollgrupper, de beteendemässiga effekter på grund av optogenetisk manipulation kan elimineras.

Undersökande gnagare beteende, särskilt i fråga om psykiatriska sjukdomar, har kraftigt förbättrats med optogenetik i fritt rörliga djur, eftersom det möjliggör direkt modulering av enstaka receptorer upp till specifika cellpopulationer21 och kretsar22. Möjligheten att mäta de akuta effekterna av sådana modulationer, liksom de långsiktiga beteendeeffekterna efter en definierad tid23 eller efter kroniskstimulering 24, möjliggör en bred flexibilitet av experimentella konstruktioner och ger mycket detaljerade insikter i hjärnkretsar. Ljusstimulering kan användas för att modulera nervceller som finns vid injektionsstället för det optogenetiska verktyget. När både injektion och implantation adress samma hjärnregionen, cell organ och tillbaka projicera axons av princip nervceller och interneurons i denna region kan riktas3,6,8. Men, den lätta fibern kan också implanteras i en region som skiljer sig från den injicerade. I detta fall kan ljusstimulering modulera sändarutgåva vid axonterminaler i projektionsområdena i den injicerade regionen25,26,27.

I studien här används optogenetik i kombination med experiment för att analysera ångestrelaterat beteende. Ångestrelaterade psykiatriska sjukdomar drabbar mer än en tredjedel av världens befolkning28,29,30 och orsakar en hög ekonomisk börda31. De som drabbas lider av en känsla av upphetsning, spänning och oro följt av undvikandebeteende 32,33. Dessa kroniskt förekommande negativa känslor, som huvudsakligen är inriktade på framtida händelser34, starkt störa det dagliga livet för patienter. Vanliga behandlingar som bensodiazepiner eller selektiva serotoninåterupptagshämmare (SSRI) är endast framgångsrika hos några av patienterna. En stor mängd människor svarar inte på behandlingen alls35, visar att den mekanism som ligger bakom sådana sjukdomar är ännu inte helt klarlagt. Den mediala prefrontala cortex (mPFC) är känd för att spela en viktig roll i utvecklingen och manifestation av ångest21,25,27,36,37,38. Specifikt kan överaktiveringen av den infralimbic cortex (IL) regionen i mPFC vara en del av ångest-relaterade sjukdomar39,40. Exemplet experimentet som beskrivs här skulle kunna bidra till att förstå hur modulationer i regionen IL i mPFC påverka ångest beteende. Dessutom kan utvecklingen av nya terapeutiska strategier för ångestrelaterade psykiatriska sjukdomar också potentiellt stödjas.

2-6 månader gamla manliga Nex-Cre möss används för att uttrycka ChR2 specifikt i pyramidala nervceller inom IL regionen av mPFC41. Nex-Cre möss har en C57Bl/6 bakgrund och uttrycka enzymet Cre-rekombinas specifikt i pyramidala nervceller. Under en stereotaktisk kirurgi injiceras dubbel floxed ChR2-DNA i IL-regionen via adeno associerade virala vektorer. Det optiska implantatet placeras direkt ovanför den region av intresse (Figur 1B) och implantatet är fast med tandcement. Kontroll djur får en injektion av dubbel floxed tdTomato-DNA i samma region att efterlikna cell specifika uttryck.

Djur är grupphus fram till operationsdagen och efteråt är enda inrymt för att undvika skador från andra möss. Möss är inhyst i enskilda ventilerade bur (IVC) rack i TypI-L burar för enkelhus möss. Den ljus-mörka cykeln följer en 12:12 h rytm, den ljusfas som börjar vid 10 AM. Alla beteendeexperiment utförs i den mörka fasen, som liknar den aktiva fasen av gnagare. Vatten och standardmatpellets finns ad libitum. Efter två veckors återhämtning, vilket säkerställer ett tillräckligt uttryck av ChR2 i pyramidala nervceller, används möss för beteendeexperiment.

Öppet fält (OF) är en 50 cm x 50 cm i kvadrat labyrint med sandblästrat 40 cm höga väggar. Marken är uppdelad i 16 rutor där den inre 4 representerar centrum. Det uppmätta beteendet är: 1) tid som tillbringas i centrum, 2) antal mittposter och 3) totalt avstånd flyttas. Under detta experiment, det finns 4 försök totalt 20 minuter. I försök 1 och 3 sker ingen ljusstimulering, och i försöken 2 och 4 utförs en 20 Hz-stimulering med 5 ms ljuspuls och 1 mW ljusintensitet på 473 nm (Figur 2A). I de senare försöken beaktades tillvänjning till testområdet, men användningen av skeninsprutade kontrolldjur anger hur tillvänjning uttrycks.

Barnes maze är ett experiment för inlärning och minne. Det är en cirkulär plattform som är 92 cm i diameter och innehåller 20 ekvidsliga hål runt omkretsen. 19 av hålen är stängda och under ett hål presenteras en utrymningsbox. För 4 dagar i följd har möss 4 träningsförsök för att lära sig platsen för utrymningslådan. På den5:e dagen tas utrymningsrutan bort, och möss testas på hur mycket tid de behöver för att hitta rätt hål. Det uppmätta beteendet är: 1) Tid tills utrymningsrutan/rätt hål hittas, 2) Antal målbesök och fel, och 3) Avstånd flyttat tills i utrymningsrutan. Ljusstimuleringen i olika grupper görs antingen under förvärv eller konsolidering, som sker på träningsdagarna 1-4, eller under hämtning på testdagen, som är dag 5 (Figur 2D).

Figure 2
Figur 2: Beteendeexperiment med optogenetiska protokoll. A) Schematisk ritning av Open Field-experimentet med motsvarande ljusstimuleringsprotokoll. C) Schematisk ritning av Elevated-Plus Maze-experimentet med motsvarande ljusstimuleringsprotokoll. D) Schematisk ritning av Barnes Maze-experimentet med motsvarande ljusstimuleringsprotokoll. EPM: Förhöjd-Plus-labyrint; AV: Öppet sätta in; BM: Barnes labyrint test. Denna siffra har ändrats från Berg 201948. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

För optogenetisk stimulering måste ljusintensiteten och frekvensen anpassas till det optogenetiska verktyg och neuronal typ som är under utredning. Lägsta möjliga ljusintensitet bör användas för att undvika skador på vävnaden, eftersom flera studier har visat att det finns möjliga uppvärmningseffekter på grund av stark ljusintensitet8,20. För ChR2 används vanligen en 20 Hz-stimulering med en 5 ms ljuspuls2. Som ChR2 är ganska ljuskänslig, är 1 mW ljusintensitet tillräcklig. Ljusstimuleringsprotokollet växlar mellan ljus från och på försök för att direkt mäta beteendeförändringar. De yttre rumsförhållandena för beteendeexperiment bör förbli stabila för hela gruppen av djur. Viktiga förutsättningar att tänka på är bullret (tänk på att enheterna själva kan göra ljud), lukten (rengör alltid beteendeuppställningarna med etanol), ljusintensiteten och experimentören. Försökspersonen ska alltid vara samma person. Dessutom bör tiden på dagen för experimenten vara densamma för alla djur i en grupp, några timmar efter starten av den mörka fasen i anläggningen är att föredra.

Målet med detta experiment är att öka excitation/ hämning (E / I) förhållandet i IL regionen genom stark aktivering av excitatoriska pyramidala nervceller. En förbättrad E / I-förhållande i denna speciella cortex regionen är känt för att öka ångest nivåer hos möss40,42,43,44.

Protocol

Förfaranden som omfattar djurförsök har godkänts av den institutionella djurforskningsanläggningen och "Senatorin für Wissenschaft, Gesundheit und Verbraucherschutz" vid universitetet i Bremen (#146)

1. Beredning av det optiskaimplantatet 9 ( Figur 1C)

  1. Placera en keramisk ferrule platt sida upp i en bänk ed.
  2. Strip pälsen av en 200 μm diameter glasfiber med en fiber strippning verktyg och skär 2-3 cm långa bitar med en keramisk fiber skrivare.
  3. Placera glasfiberbiten i keramik ferrule med ett jämnt överhäng på båda sidor.
  4. Placera en droppe superlim vid den platta sidan av keramik ferrule med en injektions kanula.
    OBS: Protokollet kan pausas här.
  5. Ta förimplantatet ut ur bänken ar och på den runda sidan av den keramiska ferrule, skär glasfibern så kort som möjligt med den keramiska fibern som är skrivare.
  6. Placera förimplantatet vid en ferrulepoleringspuck och polera den runda sidan på 4 olika polerpapper, genom att dra en åtta 20 gånger per papper (30 μm grus, 6 μm grus, 1 μm grus och äntligen 0,02 μm grus).
  7. Ta förimplantatet ut ur ferrulepoleringspucken och skär glasfibern på den platta sidan av keramik ferrule till den längd som behövs för implantation. Börja mäta längden bakom utskjutande superlim.
    1. För en jämn skäryta skrapa bara glasfibern 2-3 gånger och sedan bryta den.
      OBS: Använd mushjärnatlasen från Paxinos och Franklin45 för att beräkna implantatets längd. Implantatet måste sluta direkt ovanför den region av intresse och tjockleken på skallen bör ingå i längdberäkningen. För att stimulera IL-regionen har glasfibern en längd på 1,8 mm (Figur 3).

Figure 3
Figur 3: Mushjärnatlas (Paxinos och Franklin) med representativ längd på implantatet för att nå IL-regionen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

  1. Desinficera det färdiga implantatet i 10 minuter i etanol och låt det lufttorka innan implantation.

2. Injektion och implantation

  1. Transportera en enda mus till operationsrummet och väg den. Applicera anestesi med en intraperitoneal (i.p.) injektion av Ketamin/Xylazin (Ketamin 0,12 mg/g, Xylazin 0,01 mg/g).
    1. Fixa musen med vänster hand och vrid den på ryggen med huvudet lågt.
    2. Rikta in den vänstra nedre kvadranten av buken med sprutan och gå in i injektionskanten 1 cm under huden.
    3. Injicera anestesi i en långsam och konstant rörelse i bukhålan.
    4. Placera tillbaka musen i sin bur och vänta tills den når ett djupt tillstånd av anestesi.
      OBS: Anestesidjupet kan bestämmas av frånvaron av blinkande och mellan-tår reflexer.
  2. Placera musen på en värmeplatta och fixera huvudet i en stereotaktisk ram. Fixa näsan och tänderna i fronten, och öronen på båda sidor.
    OBS: Huvudet måste vara rakt på vänster-höger och rostral-caudal axel för att säkerställa korrekt stereotaktiska koordinater.
  3. Applicera analgesi med 2 mg/kg Carprofen subkutant i musens baksida och applicera ogenomskinlig ögonsalva på båda ögonen för att skydda dem från torkning.
  4. Fukta håret i hårbotten med en våt pappershandduk och skär sedan av det med hjälp av sax. Se till att ta bort allt löst hår med den våta pappershandduken. För att desinficera hårbotten, använd en bomullspinne och ta upp 0,5 mL av en tinktur som innehåller jod (Betaisodona 100 mg/mL Povidon jod och 11 mg/mL jod) och låt den lufttorka.
    OBS: I stället för sax, även en elektrisk clipper kan användas för korrekt hårborttagning.
  5. Höj hårbotten ovanför regionen av intresse med en pincett och skär 1 cm längs mittlinjen. Använd två pincett för att skjuta huden åt sidan för att exponera skallen. Se till att även ta bort den tunna huden ovanför skallen och låt den exponerade skallen torka.
  6. Rugga skallen för senare implantation.
    1. Applicera en 2 mm x 2 mm droppe fosforsyra (37%) från den självhäftande satsen (t.ex., Optibond) på skallen, fördela den med sprutspetsen och låt den träda i kraft i 15 s.
    2. Ta bort all syra med en bomullspinne och skölj skallen med 1 mL på 0,9% NaCl två gånger.
    3. Torka skallen med en bomullspinne och tryckluft.
      Var försiktig: Fosforsyra är farlig och måste avlägsnas helt för att undvika vävnadsskador.
  7. Beräkna F-Factor för enskilda koordinater.
    1. Placera en glaskant i stereotaktisk ram och lokalisera den direkt ovanför bregma.
    2. Nollställ koordinatsystemet och flytta glasarylen till lambda.
    3. Beräkna F-faktorn46 med följande formel:
      Equation 1
    4. Multiplicera F-Factor med koordinaterna från mushjärnatlasen för att justera dem till den enskilda musen.
  8. Borra ett hål i skallen för injektion.
    1. Använd de justerade koordinaterna för att hitta platsen på skallen direkt ovanför intressestrukturen och markera den med hjälp av spetsen på en injektions kanyl genom att skrapa den ovanför benytan.
    2. Använd injektionsbyulan för att borra ett hål i skallen på den markerade platsen genom att rotera kanylen på plats. Om blod läcker ut ur burrhålet, skölj med 1 mL på 0,9% NaCl och torka skallen efteråt.
  9. Ta upp viruslösningen i glasburk.
    1. Placera en droppe på 100 μL på 0,9% NaCl på skallen och en bit parafilm (1 cm x 1 cm) ovanpå, steril sida upp.
    2. Placera 1-2 μL viruslösning på parafilmen och sänk glasburkspetsen i den.
    3. Anslut glasbehållaren till en spruta, applicera minimalt undertryck och vänta tills viruslösningen tas upp av kanylen (inom några sekunder).
      OBS: Det är viktigt att stoppa tillämpningen av undertryck, innan luft plockas upp i kanylen. Därför kommer det alltid att finnas en liten kvarleva av viruslösningen.
  10. Injicera viruslösningen i den region av intresse.
    1. Placera viruset fyllda glas kanula ovanför burr hålet.
    2. Sänk långsamt ner kanylen i gradhålet och nolla z-koordinaten när spetsen på kanylen är i skallens nivå.
    3. Sänk kanylen försiktigt till injektionsställets lägsta läge.
    4. Fokusera kikaren vid menisken av viruslösning inom kanylen.
    5. Applicera en liten mängd positivt tryck med sprutan tills menisken sänks marginellt.
    6. Låt viruset spridas i 2-3 min innan glasburk flyttas uppåt till nästa läge.
    7. Applicera viruslösningen var 200-300 μm i hela intresseområdet.
    8. Ta bort glasbehållaren mycket långsamt och kassera den efter den slutliga injektionen.
  11. Förbered skallen för implantation med adhesionssatsen (t.ex., OptibondTMFL).
    1. Torka skallen med tryckluft.
    2. Applicera 5 μL primer (t.ex., Optibond, 1-30% (Etanol, Silicic syra, Glycerinphosphatdimethacrylat, 2-(2-(Methacryloyloxy)etylcarbonyl)bensoesäure, 2-Koloxietylmetakrylat)) med motsvarande pinne och låt den torka i 15 s.
    3. Applicera 5 μL bond (t.ex., Optibond, 15-20% 2-Hydroxylmetakrylat + 1-2% Alkalihexafluorosilikat(Na)) med samma pinne och bota den för 20 s med UV-ljus (420-480 nm).
      OBS: Det är väsentligt att skallen är torr och att primern och bindningen appliceras i ett mycket tunt lager.
      Var försiktig: Titta inte direkt in i UV-ljuset, eftersom UV-ljus kan skada ögonen.
  12. Placera implantatet direkt ovanför den region av intresse.
    1. Fixera implantatet i motsvarande hållare.
    2. Torka skallen med tryckluft.
    3. Placera glasfiberns spets direkt ovanför burrhålet och sänk den försiktigt.
    4. Sluta sänka implantatet när den återstående glödlampan av superlim vidrör skallen. Utöva inte tryck på skallen!
      OBS: Om injektionen och implantationen görs i olika regioner (t.ex. dorsala raphe och hippocampus), borra alla nödvändiga hål efter applicering av fosforsyra, men före 2-komponenten vidhäftning, följ sedan instruktionerna som tidigare beskrivits (steg 2,8-2.14).
  13. Fixa implantatet.
    1. Kontrollera om skallen fortfarande är helt torr.
    2. Applicera fluid dentalcement (t.ex., Gradia direct flo) runt implantatet och i närområdet och härda för 20 s med UV-ljus (420-480 nm).
      OBS: Mängden tandcement beror på den fria skallen området. Hela skallen ska täckas av tandcement.
    3. Applicera ytterligare två lager cement och fyll helt det fria och torkade skallområdet. Bota varje lager med UV-ljus (420-480 nm).
  14. Avsluta operationen.
    1. Applicera 0,5 g jodsalva (Betaisodona 100 mg/mL povidone jod och 11 mg/mL jod) vid hela såret.
    2. Injicera 0,1 mL glukos upplöst i 0,9% NaCl subkutant i nacken för snabb återhämtning.
    3. Släpp näsan och örat fixering, föra musen i en fräsch bur och placera den under en värmelampa för att undvika förlust av kroppsvärme.
    4. När musen vaknar, ta med den tillbaka in i anläggningen.
    5. Kontrollera dess hälsostatus minst en gång om dagen. Vidta lämpliga åtgärder om möss visar några dåliga konstitutioner (t.ex. säkerställa postoperativ analgesi med Carprofen upp till 3 dagar om möss visar några tecken på smärta).
      OBS: Efter två veckors återhämtning kan möss användas för beteendeexperiment.

3. Inrätta ett nytt experiment (Exempel ChR2 stimulering och Open Field)

  1. Pulser
    1. Programmera pulsern (t.ex. Prizmatix) för ljusstimulering.
    2. Öppna programvaran och välj USB COM-porten som ljuskällan är ansluten till.
    3. Välj Välj driftläge (3) | Utför pulssekvens efter utlösare HÖG, stoppa sedan när LÅG för att tillåta en extern programvara för att styra ljuskällan.
    4. Programmera ljusprotokollet. För en 20 Hz stimulering med 5 ms ljuspuls: välj TI = 23 ms, P1D = 5 ms, P1I = 22 ms och P2D = 0 ms.
    5. Tryck på Startsekvens. Denna status kommer att finnas kvar tills experimenten är färdiga.
      OBS: Pulser-programvaran (Prizmatix Pulser) måste lanseras innan videospårningsprogrammet; annars video spårningsprogram kommer inte att kunna känna igen enheten.
  2. Videospårningsprogram (t.ex. Ethovision XT)
    1. Skapa ett nytt experiment från en i förväg definierad mall.
      1. Öppna programvaran, gå till Arkiv ,välj Ny från mall. Välj Använd en fördefinierad mall.
      2. Välj Live-spårning och välj kameran genom att trycka på Källa och bekräfta den anslutna Basler GenICam.
        OBS: Kamerans livebild kommer nu att visas i fönstret längst upp till höger.
      3. Tryck på Nästa och välj det djur som ska spelas in (Gnagare, Mus).
      4. Tryck på Nästa och välj arenamallen Öppna fältet, kvadrat . Välj zonmallen Center, Border, Hörn och bekräfta med Nästa.
      5. Bekräfta 1 ämne som ska spåras med Nästa.
      6. Välj Center-punkt, nose-point och tail-base och bekräfta djurfärgen jämfört med bakgrunden som mörkare med Nästa.
      7. Bekräfta den rekommenderade provfrekvensen på 12,5 med Nästa och avsluta steget.
      8. Namnge experimentet lämpligt och välj en plats att spara.
    2. Definiera de experimentella inställningarna.
      1. Gå till Installationsprogrammet och Experimentella inställningar. Välj Center-punkt, nos-punkt och svans-bas upptäckt som Tracked funktioner.
      2. Välj Användning av Testkontroll Maskinvara och gå till Inställningar.
      3. Välj Noldus USB-IO-box och bekräfta med Ok.
      4. Välj Anpassad maskinvara som Enhetstyp vid TTL-porten, som har anslutits till pulserenheten, och bekräfta med Ok.
    3. Definiera arenainställningarna.
      1. Gå till Arenainställningar och välj Arenainställningar 1.
        OBS: Kameran kommer nu automatiskt att öppna en bakgrundsbild.
      2. Bekräfta bilden med Grab.
      3. Anpassa de fördefinierade zonerna till den riktiga arenan genom att ändra deras storlek. Använd pilen och de två symbolerna till höger. Om vissa zoner är onödiga tar du bort dem.
      4. Tryck 1. Rita skala till Kalibrera och dra en linje från ett hörn av labyrinten till den andra. Ange längden på den verkliga sträckan i cm.
      5. Upprepa det för den andra axeln.
    4. Testa om ljusstimuleringen fungerar.
      1. Gå till Arena - Hårdvarumappning och välj Testa på den grå stapeln.
      2. Välj Kommandoutgång 1 Hög och tryck på Test.
        OBS: Det ska finnas ljus som avges från änden av den optiska fibern. Vid val av Utgång 1 Låg och Test, ska stimuleringen upphöra.
    5. Definiera inställningarna för utvärderingskontroll för 20 minuters experiment. Ställ försök Off1, On1, Off2 och On2 att vardera vara 5 minuter lång.
      1. Gå till Testkontrollinställning och välj Spåra varaktighet 30 minuter.
      2. Förbered huvudregeln genom att justera Villkor: Tid till 20 minuter genom att välja inställningar och ändra 30 till 20 minuter. Bekräfta med Ok.
        OBS: Villkoret för startspår ska vara när motivet är i arena i 2 sekunder. På så sätt kommer systemet automatiskt att börja spåra när musen är i arenan.
      3. Skapa en underregel för ljusstimuleringen: Gå till Strukturer, mer och välj Underregel.
      4. Ge det ett namn som ljus stimulering protokoll.
      5. Placera den under huvudregeln och sprid ut de två rutorna genom att välja det blå området med mus courser.
      6. Gå till Villkor, Tid och ge det ett namn som ljus på 1.
      7. Adjust Condition uppfylls med efter 5 minuter. Bekräfta med Ok.
      8. Placera rutan direkt bakom rutan Regel begin i underregeln genom att dra den till den svarta linjen.
      9. Gå till Åtgärd | Custom Hardware och namnge det: ljus PÅ 1.
      10. Välj Åtgärd som ska utföras som Utgång 1 Hög och bekräfta med Ok.
      11. Placera lådan direkt bakom rutan Villkor.
        OBS: Nu efter 5 minuter av experimentet ljuset stimulering bör starta.
      12. Upprepa stegen för att definiera tidsvillkoret Efter 5 minuter och åtgärden Utgång 1 Låg för att stoppa ljusstimuleringen efter ytterligare 5 minuter.
      13. Upprepa stegen igen för att programmera en annan lampa Av och ljus Vid provperiod.
      14. Gå till Strukturer | Underregelreferens och kontrollera att referensen hör till rätt underregel.
      15. Välj Startvillkor som Utan fördröjning och Stoppvillkor som Utför en gång per startvillkor. Bekräfta med Ok.
      16. Placera referensrutan mellan åtgärdsruta 1 och villkorsruta 2 i huvudregeln och dra en linje från Åtgärd - startspår till Referensen.
        OBS: Nu startar huvudregeln direkt underregeln efter att ha startat spåret.
    6. Definiera identifieringsinställningarna för att visa systemet vad det ska spåra.
      1. Gå till Identifieringsinställningar och välj Identifieringsinställningar 1.
      2. Placera en testmus i arenan och välj Automatiserad installation.
      3. Välj Gnagare som djurtyp och använd musens förbannelse för att rita en ruta runt musen i arenan. Bekräfta resultaten OK? fråga med Ja.
    7. Definiera försökslistan för alla försöksdjur som ska spåras.
      1. Gå till Försökslista och planera alla djur att spela in idag: Välj lägg till försök och välj ett nummer.
      2. Markera alla de villkor som definierats före för varje mus.
      3. Namnge Animal-ID och behandlingen korrekt för att senare förenkla analysen.
        OBS: Animal-ID är irrelevant för systemet och endast viktigt för senare dataanalysering av experimentören. Gruppingen i Behandlings- och kontrollgrupp är viktig för att systemet ska veta hur man grupperar och hur man jämför alla spår i senare analyseringssteg.
    8. Gå till Förvärv och börja med experimentet.

4. Open Field experiment (ångest)

  1. Ta med den experimentella musen till beteenderummet precis före experimentet för att säkerställa en korrekt nivå av ångest.
    OBS: Beteendeexperimenten ska utföras under den mörka fasen när möss är vakna, och alltid i samma tidslucka för att säkerställa jämförbarhet.
  2. Koppla musen via en hylsa till ljuskällan genom att trycka den försiktigt på gallret i buren.
  3. Placera den i en väntande bur med färsk kull i 10 min för att få acklimatiseras till ljuskabeln.
  4. Starta förvärv genom att trycka på Start-knappen i videospårningsprogrammet (t.ex. Ethovision XT).
  5. Överföra musen från den väntande buren i det vänstra övre hörnet av det öppna fältet. Ta bort armen inom 2 sekunder för att undvika att spåra en arm istället för musen.
  6. Lämna synfältet på musen under experimentet och hålla sig lugn.
  7. Efter 20 minuter, när experimentet är klart, ta bort musen från labyrinten, koppla bort ljuskabeln och sätta tillbaka den i sitt hem bur.
  8. Ta tillbaka musen in i anläggningen.

5. Barnes Maze (lärande)

  1. Ta alla experimentella möss in i beteenderummet runt 1 timme före experimentet.
  2. Förbered Barnes Maze genom att stänga alla hål utom ett, under vilket en utrymningslåda placeras. Placera en vägg av kartong i mitten av plattformen, som är startområdet för musen.
  3. Anslut en mus till ljuskällan (hylsa på en ljuskabel) vid båda implantaten.
  4. Placera musen direkt i mitten av Barnes Maze i väggen av kartong, som hindrar musen från att springa runt innan experimentet startar.
  5. Tryck på Start i videospårningsprogrammet (t.ex. Ethovision XT) och ta bort kartongen.
    OBS: Programvaran spårar musen tills rätt hål nås men var beredd att stoppa rättegången manuellt ifall programvaran inte känner igen hålövergången.
  6. Ta ut musen ur labyrinten och ta bort anslutningen till ljuskabeln.
    OBS: Om detta är en träningsdag med flera försök per mus, lämna musen i väntrummet bredvid beteenderummet tills nästa träningspass startar. Om detta var testdagen med endast en testning rättegång per mus, föra musen tillbaka till anläggningen.

6. Dataanalys (Exempel Open Field data med 4 urskiljbara försök)

  1. Videospårningsprogram (t.ex. Ethovision XT)
    1. Definiera de experimentella grupperna och försöken i dataprofilen.
      1. Gå till Dataprofiler till vänster och välj Behandlad kontra Kontroll.
      2. Gå till Kapsling i det nya fönstret i mitten till vänster och välj Kontrolltillstånd för prövning.
      3. Välj tillståndsintervallet från Elementåtgärden: starta Spår till Elementåtgärden: ljuset går PÅ 1.
      4. Placera Holken Kapsling mellan filterboxen Behandling och motsvarande resultatruta.
        OBS: Detta definierade intervall är Off1, som beskriver de första 2,5 minuterna av experimentet där ingen ljusstimulering förekommer.
      5. Upprepa stegen för intervall On1 (från elementEt Åtgärd: ljus går på 1 till elementet Åtgärd: ljus släcks 1), Av2 (från elementet Åtgärd: ljus släcks 1 till elementet ljus går på 2) och On2 (från elementet Åtgärd: ljus går på 2 till elementet Åtgärd: stoppspår).
      6. Upprepa de 4 intervallen för kontrollfiltergruppen.
        OBS: Varje holk behöver sin egen resultatruta med namnen Off1, On1, Off2, On2. Nu delas både behandlings- och kontrollgruppen in i 4 olika ljusstimuleringsförsök vilka analyseras separat.
    2. Definiera parametrarna som ska analyseras i analysprofilen.
      1. Gå till Analysprofiler till vänster och välj I zoner.
      2. Välj den Beroende variabeln I Zon och välj Center som zon.
      3. Dubbelklicka på I mitten och välj någon av valda punkter och välj bara i mitten.
      4. Innan du lämnar fönstret gå till Testperiod statistik och välj Frekvens, Kumulativ varaktighet och Svarstid till först.
      5. Lägg till den beroende variabel avstånd flyttas.
        OBS: I Gruppstatistik ,välj om standardfelet eller standardavvikelsen ska användas som fel. Med den här profilen är data för Tid som tillbringats i mitten, Centerposter och Total distans flyttad tillgänglig.
    3. Extrahera data
      1. Gå till Resultat och välj Statistik och diagram.
      2. Tryck på Beräkna om du vill se de analyserade data.
        OBS: Rättegången statistik ger information om varje enskild mus och grupp statistik analyserar medelvärdet och fel för båda grupperna, uppdelad i 4 försök med motsvarande bar plot.
      3. Tryck på Exportera data och välj teststatistiken och platsen som ska sparas.
        OBS: De exporterade uppgifterna sparas som en Excel-fil och med individuella värden för varje mus. I denna Excel-fil hjälper Animal-ID att identifiera mössen.
      4. Gå till Heatmap Visualisering och tryck Plot Heatmaps.
      5. Välj Trials till höger för att se enskilda heatmaps för varje mus och försök.
      6. Gör ett högerklick på musen och exportera heatmaps som bilder.
  2. Plottning
    1. Öppna kalkylarksfilen vid datorn och beräkna medel och standardfel (SEM) för alla 4 försök i varje uppmätt skick och grupp.
    2. Generera grafer i ett statistikprogram (t.ex. Sigma Plot).
      1. Kopiera medel och SEM i rätt ordning från kalkylbladsfilen till Sigma Plot. Raderna måste innehålla data för Off1, On1 etc. och kolumnerna innehåller rättegång, medelvärde och SEM som huvuden.
      2. Markera alla tre kolumnerna och gå till Skapa graf.
      3. Markera rutan Stapel och välj ogrupperade staplar med fel (övre raden, tredje rutan).
      4. Bekräfta med Slutför för att öppna en ny grafsida.
      5. Märk hela grafen, gå sedan till Home, välj rutan Graf till vänster och tryck på Exportera. Välj en målmapp och välj MetaFil (*.wmf) som format.
        OBS: Den .wmf format kan bearbetas senare i en grafisk programvara som CorelDraw.
    3. Beräkna statistik för erhållna data.
      1. Kopiera rådata från kalkylbladet (Off1, On1 etc.) till enstaka kolumner av Sigma Plot.
      2. Markera kolumnerna som ska jämföras och gå till Analys, välj t-test och tryck på Kör.
      3. Bekräfta dataformatet Raw med Nästa och kör testet med Slutför.

Representative Results

Syftet med detta protokoll är att mäta förändringar i beteendet hos genetiskt modifierade möss under ett optogenetiskt experiment. Optogenetisk manipulation görs genom injektion av en adeno associerad viral vektor. Ljusstimulering i fritt rörliga möss är möjlig via implantation av en ljusfiber direkt ovanför den region av intresse.

I figur 4presenteras resultaten av ett optogenetiskt experiment. En stark aktivering av excitatoriska pyramidal nervceller i IL regionen via ChR2 ökad ångest-relaterade beteende i det öppna fältet. ChR2 injicerades i IL-regionen i mPFC i Nex-Cre möss för uttryck i pyramidala nervceller (Figur 4A). Under två ångesttester stimuleras Open Field (Figur 4B,C) och testet Novelty-Suppressed Feeding (Figur 4F,G), ChR2 med blått ljus och aktiverar pyramidiska nervceller. Som kontroll fick en annan grupp möss en injektion av fluorophore tdTomato istället för ChR2 (Figur 4D,G). I ett sådant experiment definieras ångest som undvikande av det ljusare centrala området. Möss visar en inneboende undvikande av öppna områden eftersom de är oroliga för rovdjur.

I open field-experimentet, som visas i figur 4B,utförde möss 4 försök på 5 minuter vardera. I försöken 1 och 3 inträffade ingen ljusstimulering (Off1,2) och i försöken 2 och 4 utfördes blå ljusstimulering med 20 Hz (5 ms ljuspuls) och 1 mW-intensitet (On1,2). Heatmapsna visar att, i den experimentella gruppen, den mitterv varaktigheten skilja sig åt mellan Av och På försök. Under ljusstimulering stannar möss företrädesvis i gränszonen. Kontrollera djur föredrar också gränsen, men ändrar inte sitt beteende vid ljusstimulering. I Figur 4Cvisas de huvudsakliga beteendemätningarna under försöket Med öppet fält för försöksgruppen. Om data passerade Shapiro-Wilk testet för normalitet, statistik gjordes med en oberoende två-tailed t-test. Om normalitetstestet misslyckades användes Mann-Whitney-Rank Sum-testet som icke-parametriskt alternativ. För dessa typer av experiment valdes en inom gruppjämförelse för att undersöka om ljusstimulering direkt kan förändra ångestbeteende över tid, oberoende av försöks- och kontrolldjurens baslinjeångest. Centrum varaktighet minskade betydligt under båda ljus stimulering prövningar, vilket indikerar ökad ångest nivåer. Det totala avståndet som flyttades ändrades inte, vilket visar att det rörelsemotoriska beteendet inte påverkades. Antalet centerposter ökades, men inte signifikant. I Figur 4Dvisas kontrollgruppens data. Kontrolldjur visade inte några beteendeförändringar mellan Off och On-försök i någon av de analyserade parametrarna, vilket visar att ljusstimulering eller implantation inte orsakade de observerade effekterna. Sammanfattningsvis visar detta test ökad ångest under ljusstimulering av IL pyramidala nervceller via ChR2.

I figur 5visas data från ett misslyckat optogenetiskt experiment för Elevated-Plus Maze. Under det förhöjda-Plus Maze-experimentet, som presenteras i figur 5A,slutförde möss 6 försök på 3 minuter vardera. I försök 1, 3 och 5 utfördes ingen ljusstimulering (Off1, Off2, Off3) och i försöken 2, 4 och 6 utfördes blå ljusstimulering med 20 Hz (5 ms ljuspuls) och 1 mW-intensitet (On1, On2, On3). I dessa exemplariska resultat var längden på det optogenetiska protokollet och själva labyrintens konstruktion inte lämplig för den transgena muslinjen. I Figur 5B, kan det ses, att flera möss halkade av labyrinten med ryggen tassar eller till och med föll ner. När detta hände, möss fick en andra chans att utföra EPM en dag senare. Om de föll ner igen, var de utestängda från analys. När möss gled av flera gånger men lyckades stanna på labyrinten analyserades data normalt. Trots detta måste uppgifterna tolkas mycket noggrant och kontrolldjur får större betydelse. Nex-Cre möss hade motoriska svårigheter att stanna på den smala öppna armar. För att undvika detta skulle små väggar, med en höjd av 1 cm, ha hjälpt till ett säkert grepp om ryggtassarna på labyrintens armar. Både heatmaps och graferna visar att experimentella, liksom kontrollmöss, började undvika de öppna armarna från försök 2 (On1) på (Figur 5C-E). Tiden på öppna armar minskas betydligt för båda grupperna, liksom de öppna armposterna. Analysera den experimentella gruppen endast erhållna data som antyder en stor ångestogen effekt av ljusstimulering, eftersom tiden på den öppna armen och öppna arm poster minskas avsevärt under On1 rättegången. Men när man jämför dessa data med kontrollgruppen, som visar samma beteende, blir det tydligt att det observerade beteendet inte förmedlas av den optogenetiska stimuleringen, utan genom att undvika de öppna armarna i allmänhet på grund av tillvänjning till labyrinten. Dessa data understryker vikten av en ordentlig kontrollgrupp för att skilja mellan beteendemässiga effekter medierad av optogenetisk stimulering och eventuell beteendemässiga anpassning. Dessutom belyser dessa data vikten av att korrekt anpassa en experimentell inställning för att passa den specifika mousse linjen och experimentell fråga.

För att validera och stärka insamlad beteendedata, avlägsnas hjärnor av möss efter det sista experimentet för att kontrollera för korrekt injektion och implantation (Figur 6). Hjärnor är fast i 4% paraformaldehyd och avlägsnas från skallen. Hjärnor är uttorkade i 30% sackaros i 1-2 dagar och kryoslicerad efteråt. De 40 μm tjocka koronahjärnskivorna tvättas och monteras på superfrost objektiva diabilder med ett monteringsmedium som innehåller DAPI, som fläckar cellkärnor. Detta möjliggör identifiering av målområden i koronaskivorna. Fluorescens av YFP-taggen eller tdTomato själv anger platsen för virusinjektionen. I Figur 6B de föredömliga injektionsställen av ChR2-YFP till vänster (gul), och tdTomato till höger (röd) presenteras. Med hjälp av en mall, anpassad från Paxinos och Franklin45 mus hjärn atlas, il regionen kan identifieras. I båda bilderna uttrycks det optogenetiska verktyget i IL-regionen, men även i angränsande hjärnregioner. För en korrekt tolkning konsulteras spridning av blått ljus i hjärnvävnad8 (Figur 1D,E). Det kan ses att det blå ljuset kommer att nå DP-regionen under IL med endast mindre än 5% av den initiala 1 mW ljusintensiteten vid fiberspetsen (Blå linje i figur 1D)8. Dessutom kan liten mängd ljus gå uppåt till PrL-regionen på grund av back-spridning47. Följaktligen kan man säga att IL-regionen är upplyst den starkast, men angränsande regioner som DP och PrL regionen kan också stimuleras något. Därför är IL-cell specifik stimulering garanteras inte och immunohistochemical analys av de angränsande regionerna bör utföras, för att se om aktiviteten av PrL och DP celler är modulerade via ljus. I figur 6Cvisas en annan viktig kontroll: nex-Cre-muslinjens specificitet. Via antikropp färgning mot de två celltyperna i IL-regionen, glutamatergic princip nervceller och GABAergic interneurons, Det kan ses, att den ChR2-YFP uttryck endast förekommer i glutamatergic nervceller och inte med GABAergic sådana.

Allt som allt visar våra experiment att med optogenetisk manipulation under beteendetestning kunde förändringar i ångestrelaterat beteende observeras. Genom att använda mer än ett test för samma beteende kan man dra en tillförlitlig slutsats. Dessutom bekräftar immunohistokemisk analys erhållna data. Våra experiment tyder på, att den specifika aktiveringen av pyramidala nervceller i infralimbic cortex ökade ångest-relaterade beteende i vissa analyser.

Figure 4
Figur 4: Optogenetisk aktivering av IL pyramidala nervceller ökar ångestbeteende. Ljusstimulering under experiment: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulering. A) Schematisk ritning av injektions- och implantationsstället för ChR2-YFP eller tdTomato in i IL. Under experimentet aktiveras pyramidala nervceller i regionen IL i mPFC av ChR2. Saggital hjärnan skivor anpassade från Paxinos och Franklin mus hjärnan atlas, saggital: lateral o,6. B) Open Field labyrint med ljus stimulering protokoll (20 min med 4x5 min omväxlande Off och På försök; vänster) och värme kartor över exemplariska ChR2-injiceras(EXP) och tdTomato-injiceras (CT) möss i alla 4 försök av experimentet (höger). EXP-djur spenderar mindre tid i centrera av AV NÄR stimuleras med blåttlaserljus. För CT djur, tid som tillbringas i centrum skiljer sig inte mellan ljus Off och På försök. C) Gruppdata för EXP-djur i OF, n=11. Möss tillbringar betydligt mindre tid i mitten av OF när stimuleras med blått ljus (Off1 39,49±6,9 s, On1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p = 0.033, *; Av1:On2, MWRS, p=0,049, *). Flyttad avstånd påverkas inte (Off1 2703.09±292.65 cm, On1 3113.4±491.15 cm, Off2 3331.86 ±482.62 cm, On2 3082.17±658,61 cm). # av center poster minska med tiden, men visar inga betydande skillnader (Off 1 22.36±3.78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D) Gruppdata för CT-djur i OF, n=15. Tidmöss spenderar i centrera av AV, avståndet flyttas, # av mittposter ändras inte mellan ljus På och Av prövningar (Tid i centrum Off116.73±2.65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Avstånd Off1 3399,69±296,77 cm, On1 3210.6±446,9 cm, Off2 3030.28±513.83 cm, On2 2955±617.7 cm; # av mittposter Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). CT-möss uppvisar signifikant högre baslinjeångest (Off1 EXP:CT, MWRS, p=0,005, **). Värden är medelvärde±S.E.M. * ange betydande skillnader (s≤0,05), ** indikerar betydande skillnader (s≤0,01). t-test alltid tvåstjärtad, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; IL: infralimbic cortex; BLA: basolateral amygdala; DRN: dorsala raphe kärnor; AV: Öppet sätta in; CT: kontrolldjur; EXP: försöksdjur; L: ljus. Denna siffra har modifierats från Berg et al. 2019, PLoS One43 och från Berg 201948. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: EPM-experimentet misslyckades med att visa beteendemässiga effekter hos Nex-Cre-möss. Ljusstimulering under experiment: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimulering. A) Förhöjd-Plus Maze med ljus stimulering protokoll (18 min, 6x3 min, omväxlande Off och På prövningar). B) Gruppdata för de möss som "glider av" ingår i data, totalt n=23. Nex-Cre möss hade en tendens att glida av den öppna armen med sina ryggtassar, oberoende av den experimentella gruppen (vänster). Endast möss som stannade på labyrinten för alla 6 försök övervägdes i senare analyser. Slip off's i den första Off1 fasen är orsak till senare undvikande av de öppna armarna (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Cirkeldiagram (höger) visar möss som faller från labyrinten under 18 min med 42,42%. Endast 57,57% avslutade experimentet. C) Värme kartor av exemplariska EXP och CT möss i alla 6 försök av experimentet. Båda grupperna visar en minskning av öppen arm varaktighet efter Off1 rättegången. D) Gruppdata för EXP-djur i EPM, n=12. Tid i öppna armar minskade betydligt under de två första försöken och ständigt efteråt (Off1 73.91±12.22 s, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p=0,041, *). Den förflyttade sträckan påverkas inte (Off1 679.96±71.63 cm, On1 712.24±112.82 cm, Off2 717,49±97,39 cm, On2 782,51±81,11 cm, Off3 722,11±68,60 cm, On3 663,90±106,57 cm). Mängden öppna armposter minskar betydligt från Off1 till On1 och förblir sedan konstant (Off1 8.08±1.08, Den1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Av1:On1, t-test, p=0.002, **). Tiden i mitten av EPM minskar längs försök men visar ingen signifikant skillnad från Off to On trial (Off1 41.71±5.34 s, On1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E) Gruppdata för CT-djur i EPM, n=11. CT-data visar samma signifikanta minskningar som EXP-data, vilket indikerar att experimentet inte har fungerat som det ska (Tid i öppna armar Off1 86,92±12,74 s, On1 33,78±14,38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p=0.009, **; Avstånd Off1 705,11±88,36 cm, On1 789,45±77,53 cm, Off2 724,74±80,49 cm, On2 676,57±111,99 cm, Off3 716,99±132,47 cm, On3 663,03±132,46 cm; Öppna armposter Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Av1:On1, MWRS, p=0.01, *; Tid spendera i centrum Off1 35,89 s, På1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). Värden är medelvärde ± S.E.M. * anger betydande skillnader (s≤0,05), ** indikerar signifikanta skillnader (s≤0,01). t-test är alltid tvåstjärtad, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; EPM: Förhöjd-Plus-labyrint; CT: kontrolldjur; EXP: försöksdjur; OA: öppna armar. Denna siffra har modifierats från Berg et al. 2019, PLoS One43 och från Berg 201948. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Injektionssidan av ChR2 och tdTomato i IL- och Nex-Cre-specificiteten. A) Schematisk ritning av implantationsstället på koronal hjärnskivor vid AP + 1,66 mm, mL 0,3 mm, DV -1,8 mm, med ensidig injektion och implantation (anpassad från mushjärnatlas, Paxinos och Franklin, Bregma +1,54 mm). B) Exemplariska injektionsställen av ChR2-YFP (vänster, gul) och tdTomato (höger, röd) samman med DAPI-färgade cellkärnor (blå) i Nex-Cre möss. Skalstång 1 mm. Insets visar hög förstoring av IL-region. Skala bar 150 μm. Vita rutor anger placering av insets. C) Översta raden: confocal bilder av den vänstra IL regionen av en Nex-Cre mus färgas med CamKII som en markör för glutamatergic nervceller (blå), och ChR2-YFP (gul) eller Gad67 som en markör för GABAergic nervceller (grön), av en Nex-Cre mus. Nedre raden: colocalization av ChR2-YFP (gul) med CamKII (vänster, blå), men inte med Gad67 (höger, grön), som visar specificitet av Nex-Cre möss för glutamaterga nervceller. Skala bar 50 μm. PrL: prelimbic cortex; IL: infralimbic cortex; DP: dorsala peduncular cortex. Denna siffra har modifierats från Berg et al. 2019, PLoS One43 och från Berg 201948. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Discussion

Använda ljus för att manipulera neuronal signalering har varit metoden för val för nästan ett decennium nu. Sedan 2005, antalet publicerade artiklar om utvecklingen av nya optogenetiska verktyg 4,6,8,8,14,49,50,51 och studier där sådana verktyg utnyttjas för att undersöka hjärnkretsar21,23,40,43,52, kraftigt ökat. Å ena sidan, med den enorma mångfalden av injicerbara optogenetiska verktyg, implantationsvarianter, transgena muslinjer och beteendeexperiment, är möjligheten till experiment mångfald och obegränsad. Å andra sidan är möjligheten att göra fel i valet av experimentella förhållanden mycket hög och experimenten är så specifika, att ofta är jämförbarheten med andra studier svår.

Kritiska steg
Ett viktigt kritiskt steg i detta protokoll är korrekt planering. Valet av det optogenetiska verktyget bör matcha den vetenskapliga frågan. Är det bara nödvändigt att manipulera den totala aktiviteten hos en neuron eller synaps? Sedan kommersiellt tillhandahållna verktyg som ChR221,25,27 och Arch37 är ett bra val. Men bortsett från det, om en speciell signalsubstans system eller ens en enda receptor bör manipuleras, en individuell receptor chimera är ofta det bättre valet3,6. Flera receptor chimärer med GPCRs, den så kallade Opto-XRs, och riktlinjer för att producera dem finns redan4,50. Andra än valet av optogenetiska verktyg, muslinjen i kombination med beteendeexperimentet är också kritisk. Olika bakgrundsstammar, som till exempel C57Bl/6 och BALB/cByJ, visar olika beteendemässiga fenotyper i vissa avseenden53,54. C57Bl/6-möss har en låg baslinjeångest och kan användas för ångestdämpande manipulation, medan BALB/cByJ uppvisar högre ångestnivåer och därför är mer känsliga för ångestdämpande läkemedel. Dessutom kan de transgena varianterna av dessa bakgrundsstammar också variera i sin fenotyp48. Med en korrekt kombination av specifika initiativtagare i samband med ett optogenetiskt verktyg och transgen muslinje, kan nästan varje önskad cellpopulation riktas.

Ett kritiskt steg under operation riktar sig till rätt plats. Med hjälp av musen hjärnan atlas, korrekt koordinater för den främre-posterior axeln, och mediala-laterala axeln, och djup av strukturen kan upprättas45. I verkligheten har varje skalle en något annorlunda form och storlek. Således är F-faktor46 för att justera stereotaktiska koordinaterna ganska viktigt, liksom korrekt näsa och öra fixering under stereotaktisk kirurgi. Om musens huvud lutas, kommer injektionsbyulan att misslyckas med att rikta den önskade regionen av intresse.

Dessutom är injektionsbygelns diameter också kritisk. Om den är för liten kan inget virus släppas ut i vävnaden, om den är för bred kommer kanylen att läcka viruslösning på väg till intresseområdet. Om den implanterade optiska fibern upphör direkt över målregionen spelar virusuttrycket i cortexregionerna ovan ingen roll. Men om implantatet placeras över andra regioner för att stimulera axonterminaler, kommer axoner i övre hjärnbarken regioner också aktiveras av ljus och förfalska erhållna data. Som ett exempel: IL-regionen och den prelimba (PrL) regionen både projektet till den basala amygdala55,56 men har helt olika funktioner och roller i moduleringen av ångest26,57. Om implantatet placeras ovanför amygdala för att aktivera axonterminaler från IL-regionen, och under injektionsviruslösningen också placerades i PrL på grund av fel injektionskanula, är risken för att även aktivera axonterminaler från PrL mycket hög.

Under beredningen av skallen för fixering av implantatet är den glesa användningen av primer och bindning avgörande för en tillförlitlig och hållbar fixering. Om 2-komponenten vidhäftningssystemet inte appliceras tunt, kan tandcement lossna från skallen efter ett par dagar eller veckor. Dessutom måste skallen också torkas helt innan implantatet fixeras, eftersom cementen annars inte kommer att fästa ordentligt på skallen.

Kritiska steg finns också i beteendedelen av det här protokollet. Först är byggandet av labyrinten mycket viktigt. I varje beteendemässiga setup, finns flera varianter i litteraturen angående storlek och form, liksom för själva förfarandet58,59,60. Det är viktigt att välja en variant som gör uppgifterna jämförbara och reproducerbara. Också, särskilda krav för utnyttjade muslinjer bör beaktas43,48. I de representativa uppgifterna för EPM kan man se att flera Nex-Cre-möss föll från labyrinten eller halkade av flera gånger (Figur 2b). För dessa möss, en labyrint med en liten vägg runt de öppna armarna skulle ha varit ett bättre alternativ.

För det andra är det viktigt att hålla alla yttrerumsförhållanden konstant 61, annars skulle olika grupper av möss inte vara jämförbara alls. I detta avseende är det mycket viktigt att välja tidpunkten för experimentet som en där den experimentella setup är ledig och experimentören är alltid närvarande. Vidare bör händelser i byggnaden, såsom byggnadsarbeten, provning av eventuella system (brandlarm) eller rengöringsdagen för musanläggningen, övervägas för att undvika störningar i erhållna data.

Slutligen, hantering och bostäder villkor är avgörande för beteendemässiga experiment. När en implantation utförs, möss måste vara singel inrymt på grund av risken för skador från andra möss. För att säkerställa god jämförbarhet mellan grupper och ett lågt fel inom en grupp, måste varje mus ha samma burstorlek och berikning. För ångest-relaterade experiment, enda bostäder har vissa fördelar som singe inrymt manliga möss visar en lägre baslinje ångest nivå, mindre variation i deras ångest nivå, och mindre depressiva-liknande symtom15,16. Grupp inrymt manliga möss kan starkt skilja sig i sin ångest nivå på grund av hierarkin bland mössen. Förutom bostäder, en konstant och lika hantering av alla möss och grupper är också viktigt. Att ta tag i musen för att kunna koppla ihop ljusfibern på implantatet är mycket stressande. Därför måste denna procedur vara densamma för varje mus, vilket betyder samma teknik och samma experimenter. Dessutom måste tillvänjningstiden i vänteburen, som är tänkt att lugna ner musen från det stressiga anslutningsproceduren, också ha lika förhållanden i varaktighet, kull och position till labyrinten. Hanteringen inom musanläggningen är också avgörande för senare beteendeprestanda. Försöks- och kontrolldjur bör inte rengöras på olika dagar eller av olika människor, eftersom detta också är påfrestande för möss. Dessutom bör rengöringsdagen inte vara den experimentella dagen för att undvika skillnader i beteende.

Felsökning
Det finns flera problem som kan uppstå under protokollet. Till exempel, borrning en hel i skallen under stereotaktisk kirurgi kan skada blodkärlen. Vanligtvis uppträder stark blödning, särskilt ovanför bregma och lambda. Om detta händer, försök inte att stoppa blödningen med bomullspinnar eftersom de tenderar att förlänga ännu mer blödning ur kärlet på grund av deras absorbens, istället, direkt skölj med NaCl.

Det kan också hända att tryckinjektionen av viruslösningen inte fungerar. I det här fallet kan det vara så att parafilm, en sårskorpa från burrhålet eller hjärnvävnaden, täpper igen kanylens spets. I detta fall, ta bort kanylen långsamt ut ur hjärnan utan att ändra x- eller y-axeln och använd en pincett för att ta bort 1-2 mm av den främre delen av kanulaspetsen. Innan du sänker kanylen igen, testa för funktionalitet genom att applicera liten mängd tryck för att se om virus kommer ut ur kanulaspetsen. För att undvika förstoppning, sänk kanylen med en konstant hastighet och stoppa inte rörelsen förrän injektionssidans djupaste djup har uppnåtts. Om för mycket av kanylspetsen avlägsnas och diametern är för stor kommer kanylen att skada vävnaden och risken att applicera viruset på en gång kommer att ökas. Se således till att endast den igensatta delen av spetsen avlägsnas försiktigt.

Under beteendeexperimentet kan inställningen av experimentet i videospårningsprogrammet (t.ex. Ethovision XT) orsaka problem. Om ljusutmatningen till exempel inte fungerar som den ska kan detta bero på flera orsaker. Pulser måste öppnas, programmeras och startas innan Ethovision XT öppnas. Maskinvaran behöver väljas korrekt i "Experimental setup" (steg 3.2.2.4). Om fel IO-Box, eller något annat än "Costume Hardware" är valt, kan Pulser-enheten inte styras av Ethovision. Om testet av ljusutgången lyckas, men det programmerade ljusprotokollet i "Inställningar för kontroll av försök" inte fungerar under anskaffningen, kanske underregeln eller underregelreferensen finns felaktigt eller villkoren och åtgärderna är oklara. Till exempel: tillhör referensen rätt underregel? Är referensen korrekt programmerad (t.ex. hur ofta utförs underregeln)?

Dessutom kan det hända att under "detektionsinställningar" djuret spåras tillräckligt, men under förvärvet finns det prover där ämnet inte hittas. I det här fallet, kontrollera om belysningen i experimentrummet var förändrat, eller om något producerade oönskade skuggor i labyrinten. Hela botten av labyrinten måste ha samma färg, eftersom inställningen bara kommer att fungera för en specifik kombination. Om av någon anledning olika botten färger eller skuggor inte kan undvikas, definiera detektionsinställningen i den mörkaste delen av labyrinten.

För att ändra eventuella inställningar efter förvärvet av de första djuren, tillämpa inte dessa ändringar i de redan använda inställningarna. Duplicera dem för att justera dem. Detta innebär också att den redan registrerade rättegången inte är giltig längre för dataanalys. I ett sådant fall, spela in alla djur för denna experimentella grupp med de ursprungliga inställningarna, och skapa ett nytt experiment efteråt där de inspelade videorna analyseras i stället för livespårning. I detta "från video"-experiment kan flera inställningar användas för analys utan att förlora jämförbarheten mellan djur eller ens data.

Begränsningar och framtida tillämpningar
Denna metod att manipulera beteende med optogenetik i fritt rörliga djur inkluderar också begränsningar. Under operationen är närheten till de två implantaten begränsad. För dubbel implantation måste avståndet mellan de två implantaten minimalt vara bredden på apparaten för att hålla implantatet. Apparaten måste sänka det andra implantatet i burrhålet, medan de första implantaten redan är fixerade. En lösning för detta kan vara en vinklad implantation, där glasfiberns spetsar kan vara mycket nära medan de keramiska ferulesna ovanför skallen har störreavstånd 23,55,56,57,62,63. En nackdel med en vinklad implantation är ljuset sprider sig. När fiberspetsen är snedställd istället för rakt ovanifrån är det stimulerade området annorlunda. Vid två målregioner i nära anslutning behöver den ändrade positionen för ljusstimuleringen beaktas.

Under beteendeexperimentet kan labyrintens konstruktion störa den optiska kabeln som är ansluten till djuret. Vissa beteendetester, som den ljus-mörka lådan, innehåller ettinomhusområde 64,65, och andra labyrinter innehåller fack som musen behöver ange. Sådana experiment kan inte utföras med den här inställningen. Alternativt kan ett trådlöst system vara ett alternativ22,26,66. Men lyckligtvis vissa labyrinter, såsom Barnes Maze, kan ordnas på ett sådant sätt, att mössen kan komma in i relevanta fack67.

Förutom de med slutna zoner, labyrinter som är för breda kan orsaka också problem. Ju större område i labyrinten, desto längre kabel måste vara att låta djuret att gå till varje position i labyrinten. Försiktighet måste vidtas att djuret inte kan trampa på kabeln eller ta tag i den och bita den. En lösning för det kan vara en konstruktion som rullar upp den överflödiga kabeln. En nackdel är att dra för att rulla kabeln är svårt för möss. Denna lösning skulle bättre lämpad för råttor. Ett annat möjligt alternativ skulle kunna vara att göra ljusstimuleringen i förväg, istället för under försöket, naturligtvis är detta endast möjligt om en långsiktig effekt på grund av den lätta stimuleringensker 23.

Jämförelse med befintliga/alternativa metoder
Alternativa metoder skulle vara kemisk eller elektrisk stimulering underbeteende 8,18. Kemiska agonister eller antagonister har möjlighet att aktivera eller tysta nervceller via specifika receptorer och kan också manipulera enstaka signalsubstanssystem38,68. På ena sidan är receptor-specificiteten ganska hög för kemikalier, eftersom specifik agonist eller antagonist bara aktiverar vissa receptorer39. Å andra sidan är specificiteten för receptorsubtyper av samma neurotransmittorgrupp ofta otillräcklig. De flesta kemikalier binder till minst två undertyper med olika sannolikheter69. Dessutom, kemikalier kan inte skilja mellan neuronala celltyper så länge de har samma receptortyper. Utöver detta är tidsmässig och rumslig upplösning dålig för kemiska manipulationer i jämförelse med optogenetik. Agonister eller antagonister administreras ofta oralt35 eller via systemiska injektioner57,70. Om infusionen av kemikalien sker direkt i hjärnvävnaden, visas effekter snabbare än med orala tillämpningar, men fortfarande på en långsammare tidsskala än med ljusstimulering. Som de administrerade kemikalierna diffusa i hjärnan och är inte specifika för neuronala typer eller regioner hjärnan, manipulation av specifika hjärnkretsar det inte möjligt.

Elektrisk stimulering har en högre temporal upplösning än kemiskstimulering 9,14. Spridningen inom i neuronal vävnad är mindre än med kemisk stimulering och den rumsliga upplösningen är bättre än med kemisk stimulering. Emellertid, elektrisk stimulering saknar möjlighet att specifikt ta itu med olika neuronala celltyper eller receptortyper, som varje neuron i närheten av elektroden kommer att svara på den elektriska stimulering.

Alternativa metoder till uppförandet i fritt röra möss är for example electrophysiological inspelningar i hjärnsegment, var singel- neurons eller axons kan moduleras med optogenetics och elicited verkställer kan mätas via inspelningelektroder6,71. In vitro-experiment ger möjlighet att undersöka den molekylära och cellulära grunden för optogenetiska stimulering men har den begränsningen att inneboende anslutning och input från andra hjärnregioner saknas. Ett annat alternativ är att använda optogenetisk i samband med multiphotonbildbehandling 1,72. I det här fallet har möss huvudet fast och kan sövas eller vara vaken för att lösa enkla uppgifter.

För att utföra ett framgångsrikt optogenetiskt experiment finns ett brett utbud av verktyg och applikationer nuförtiden. Valet av optogenetiska verktyg och beteendemässiga set-up är avgörande för att besvara specifika forskningsfrågor. Om rätt kombination av verktyg och experiment väljs, optogenetik tillåter en aldrig tidigare skådad, djupgående undersökning av neuronala kretsar med hög tidsmässiga och rumsliga upplösning. Detta kommer att bidra till att förstå och utveckla nya terapeutiska strategier för psykiatriska sjukdomar och kognition.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Stort tack till prof Klaus-Armin Narve och Dr Sandra Goebbels (Max-Plank-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Tyskland) för vänligt tillhandahållaNde Nex-Cre möss. Också, Vi tackar vår video-team Yunus Dikici och Ruben Wiesner för inspelning och bearbetning av JoVE video för den här artikeln. Dessutom, stort tack till Kristin Claussen för hennes voice-over och Kimberly Anne Go för korrekturläsning av manuskriptet.

De presenterade resultaten erhölls vid Ruhr-universitetet i Bochum och videon spelades in vid universitetet i Bremen.

Detta arbete finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen) - Projektnummer 122679504 - SFB 874 och DFG MA 4692/3-2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamin Sigma-Aldrich K2753-64 Anestasia
20 % Glucose AlleMan Pharma Injection s.c. for fast recovery
Behavioral mazes Costum made Measure anxiety
Bepanthen Bayer Ophthalmic oinment
Betaisodona Monodipharma Sterilant containing iodine
Betaisodona Monodipharma Iodine oinment
Binocular Olympus SZ52, 110AL0.62x WD160 Surgery
Ceramic ferrules Thorlabs CFLC230-10 Implant
Ceramic Fiber Scribe Thorlabs CSW12.5 Cutting of the glass fiber
Channelrhodopsin2-YFP virus Penn Vector Core Addgene 20298 Optogenetic tool
Compressed air Kontakt Chemie Druckluft 67 Drying of the skull
Coordinate system Stoelting Stereotactic coordinates for the surgery
Correl Draw Graphical software version 13
Cryoslicer MICROM HM500OM Production of brain slices for staining
Ethovision XT 14 Noldus Software for behavioral tracking
Exel Statistical Software
Ferrule Polishing Puck Thorlabs D50-F Polishing implants round side
Fiber Patch Cord dual Prizmatix Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation
Fiber Patch Cord single Prizmatix Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm Cable, which is connected with the implant via a sleeve
Fiber Stripping Tool Thorlabs T06S13 Stripping glass fiber for implant
Filter paper VWR European 516-0300 Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test
Food pellets Mühle Levers Höveler Nagerfutter Nutrition for the mice
Glass pipettes Harvard Apparatus GC150-10 Injection pipettes
Gradia direct-Flo Henry Schein 103322 Fluid dental cementum
Heating lamp efbe-Schott/Phillips R95E Prevent the mice from cooling after the surgery
Heating plate Stoelting Integrated into coordinate system
Injection canula Braun 100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20 All injections and to bore hole into the skull
Litter T 1350 Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test
Mouse cages Zoonlab 405 cm^2 Single housing for experiments
Optibond FL Kerr 26684E Preparation of the skull for implantation
Optical glass fiber Thorlabs FT200EMT Light fiber for implant
Optogenetics-LED.STSI Prizmatix Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R Perfusion of mice to remove the brains
Polishing sheet 0.02 µm grit Thorlabs LFCF Polishing implants round side
Polishing sheet 1 µm grit Thorlabs LF1D Polishing implants round side
Polishing sheet 30 µm grit Thorlabs LF30D Polishing implants round side
Polishing sheet 6 µm grit Thorlabs LF6D Polishing implants round side
Pulser Software Prizmatix Software for light device control
Rimadyl-Carprofen Zoetis Analgesia
Sigma Plot Software for statistics
Sleeve Thorlabs FT200EMT Connection of implant and light cable
SodiumCloride (NaCl) Braun 3570410 Rinsing of the skull
Superglue Pattex Henkel To Fix the glass fiber in the ferrule
td-Tomato virus Penn Vector Core Addgene 51503 Optogenetic tool
UV light KoQGHJ wireless, 1200 mW/cm^2 Polymeration lamp for dental cementum
Xylavet-Xylazin cp pharma Anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chow, B. Y., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature Letters. 463, 98-102 (2010).
  2. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
  3. Spoida, K., Masseck, O. A., Deneris, E. S., Herlitze, S. Gq/5-HT2c receptor signals activate a local GABAergic inhibitory feedback circuit to modulate serotonergic firing and anxiety in mice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 111, 6479-6484 (2014).
  4. Kleinlogel, S. Optogenetic user's guide to Opto-GPCRs modified GPCRs. Frontiers in Bioscience. 21, 794-805 (2016).
  5. Mahn, M., Prigge, M., Ron, S., Levy, R., Yizhar, O. Biophysical constraints of optogenetic inhibition at presynaptic terminals. Nature Neuroscience. 19, 554-556 (2016).
  6. Masseck, O. A., et al. Vertebrate Cone Opsins Enable Sustained and Highly Sensitive Rapid Control of Gi/o Signaling in Anxiety Circuitry. Neuron. 81, 1263-1273 (2014).
  7. Oh, E., Maejima, T., Liu, C., Deneris, E., Herlitze, S. Substitution of 5-HT 1A Receptor signaling by a light-activated G protein-coupled receptor. Journal of Biological Chemistry. 285, 30825-30836 (2010).
  8. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in Neural Systems. Neuron Primer. 71, 9-34 (2011).
  9. Masseck, O. A. A Guide to Optogenetic Applications, With special Focus on Behavioral and In Vivo Electrophysiological Experiments. HandboOk of In Vivo Neural Plasticity Techniques - A Systems Neuroscheince Approach to the Neural Basis of Memory and Cognition. Manahan-Vaughan, D. , Academic Press. 557 (2019).
  10. Goebbels, S., et al. Genetic Targeting of Principal Neurons in Neocortex and Hippocampus of NEX-Cre Mice. Genesis. , 611-621 (2006).
  11. Yang, Y. S., Hughes, T. E. Cre Stoplight: A red/green fluorescent reporter of Cre recombinase expression in living cells. Biotechniques. 31, 1036-1041 (2001).
  12. Schnütgen, F., et al. A directional strategy for monitoring Cre-mediated recombination at the cellular level in the mouse. Nature Biotechnology. 21, 562-565 (2003).
  13. Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  14. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 268-273 (2011).
  15. Palanza, P., Gioiosa, L., Parmigiani, S. Social stress in mice: Gender differences and effects of estrous cycle and social dominance. Physiology and Behavior. 73, 411-420 (2001).
  16. Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415, 197-201 (2001).
  17. Masseck, O. A., Rubelowski, J. M., Spoida, K., Herlitze, S. Light- and drug-activated G-protein-coupled receptors to control intracellular signalling. Experimental Physiology. 96, 51-56 (2011).
  18. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4, (2007).
  19. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature Article. 446, 633-639 (2007).
  20. Owen, S. F., Liu, M. H., Kreitzer, A. C. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nature Neuroscience. 22, 1061-1065 (2019).
  21. Hare, B. D., et al. Optogenetic stimulation of medial prefrontal cortex Drd1 neurons produces rapid and long-lasting antidepressant effects. Nature Communication. 10, 1-12 (2019).
  22. Allsop, S. A., Vander Weele, C. M., Wichmann, R., Tye, K. M. Optogenetic insights on the relationship between anxiety-related behaviors and social deficits. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 1-14 (2014).
  23. Fuchikami, M., et al. Optogenetic stimulation of infralimbic PFC reproduces ketamine's rapid and sustained antidepressant actions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 8106-8111 (2015).
  24. Correia, P. A., et al. Transient inhibition and long-term facilitation of locomotion by phasic optogenetic activation of serotonin neurons. Elife. 6, 1-26 (2017).
  25. Felix-Ortiz, A. C., Burgos-Robles, A., Bhagat, N. D., Leppla, C. A., Tye, K. M. Bidirectional modulation of anxiety-related and social behaviors by amygdala projections to the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 321, 197-209 (2016).
  26. Marek, R., Xu, L., Sullivan, R. K. P., Sah, P. Excitatory connections between the prelimbic and infralimbic medial prefrontal cortex show a role for the prelimbic cortex in fear extinction. Nature Brief Communication. , (2018).
  27. Parfitt, G. M., et al. Bidirectional Control of Anxiety-Related Behaviors in Mice: Role of Inputs Arising from the Ventral Hippocampus to the Lateral Septum and Medial Prefrontal Cortex. Neuropsychopharmacology. 42, 1715-1728 (2017).
  28. Bandelow, B., Michaelis, S. Epidemiology of anxiety disorders in the 21st century. Dialogues in Clinical Neuroscience. 17, 327-335 (2015).
  29. Kessler, R. C., et al. Lifetime Prevalence and Age-of-Onset Distributions of DSM-IV Disorders in the National Comorbidity Survey Replication. Archives of General Psychiatry. 62, 593-602 (2005).
  30. Kessler, R. C., Petukhova, M., Sampson, N. A., Zaslavsky, A. M., Wittchen, H. U. Twelve-month and lifetime prevalence and lifetime morbid risk of anxiety and mood disorders in the United States. International Journal of Methods Psychiatric Research. 21, 169-184 (2014).
  31. Andlin-Sobocki, P., Wittchen, H. U. Cost of anxiety disorders in Europe. European Journal of Neurology. 12, 39-44 (2005).
  32. Forster, G. L., Novick, A. M., Scholl, J. L., Wall, M. J. The Role of the Amygdala in Anxiety Disorders. Intech. , 61-102 (2012).
  33. Liberzon, I. Neural circuits in anxiety and stress disorders a focused review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 11, 115-126 (2015).
  34. Sylvers, P., Lilienfeld, S. O., LaPrairie, J. L. Differences between trait fear and trait anxiety: Implications for psychopathology. Clinical Psychology Review. 31, 122-137 (2011).
  35. Daws, L. C., Koek, W., Mitchell, N. C. Revisiting Serotonin Reuptake Inhibitors and the Therapeutic Potential of 'Uptake-2' in Psychiatric Disorders. ACS Chemical Neuroscience. 4, 16-21 (2013).
  36. Felix-Ortiz, A. C., et al. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron Report. 79, 658-664 (2013).
  37. Padilla-Coreano, N., et al. Direct Ventral Hippocampal-Prefrontal Input Is Required for Anxiety-Related Neural Activity and Behavior. Neuron Article. 89, 857-866 (2016).
  38. Lisboa, S. F., Stecchini, M. F., Corrêa, F. M. A., Guimarães, F. S., Resstel, L. B. M. Different role of the ventral medial prefrontal cortex on modulation of innate and associative learned fear. Neuroscience. 171, 760-768 (2010).
  39. Bi, L. L., et al. Enhanced excitability in the infralimbic cortex produces anxiety-like behaviors. Neuropharmacology. 72, 148-156 (2013).
  40. Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature Article. 477, 171-178 (2011).
  41. Goebbels, S., et al. Genetic Targeting of Principal Neurons in Neocortex and Hippocampus of NEX-Cre Mice. Genesis. 44, 611-621 (2006).
  42. Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/ inhibition in key neural systems. Genes, Brain and Behavior. 2, 255-267 (2003).
  43. Berg, L., Eckardt, J., A, M. O. Enhanced activity of pyramidal neurons in the infralimbic cortex drives anxiety behavior. PLoS One. 14, 1-19 (2019).
  44. Meunier, C. N. J., Amar, M., Lanfumey, L., Hamon, M., Fossier, P. 5-HT1A receptors direct the orientation of plasticity in layer 5 pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex. Neuropharmacology. 71, 37-45 (2013).
  45. Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2, Academic Press. (2004).
  46. Gore, B. B., Soden, M. E., Zweifel, L. S. Manipulating gene expression in projection-specific neuronal populations using combinatorial viral approaches. Current Protocols in Neuroscience. 435, 1-6 (2014).
  47. Stujenske, J. M., Spellman, T., Gordon, J. A. Modeling the Spatiotemporal Dynamics of Light and Heat Propagation for InVivo Optogenetics. Cell Report. 12, 525-534 (2015).
  48. Berg, L. Imbalance of excitation and inhibition within the prefrontal cortex supports anxiety behavior. Ruhr-University Bochum. , Doctoral dissertation (2019).
  49. Boyden, E. S. A history of optogenetics: The development of tools for controlling brain circuits with light. F1000 Biology Reports. 3, 1-12 (2011).
  50. Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
  51. Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7, 12-23 (2012).
  52. Covington, H. E., et al. Antidepressant Effect of Optogenetic Stimulation of the Medial Prefrontal Cortex. Journal of Neuroscience. 30, 16082-16090 (2010).
  53. Lepicard, E. M., Joubert, C., Hagneau, I., Perez-Diaz, F., Chapouthier, G. Differences in anxiety-related behavior and response to diazepam in BALB/cByJ and C57BL/6J strains of mice. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 67, 739-748 (2000).
  54. Schmidt, M. V., Müller, M. B. Animal models of anxiety. Elsevier. 3, 369-374 (2006).
  55. Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic Encoding of Fear Extinction in mPFC-amygdala Circuits. Neuron Article. 80, 1491-1507 (2013).
  56. Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527, 179-185 (2015).
  57. Suzuki, S., et al. The infralimbic and prelimbic medial prefrontal cortices have differential functions in the expression of anxiety-like behaviors in mice. Behavioural Brain Research. 304, 120-124 (2016).
  58. Carola, V., D'Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134, 49-57 (2002).
  59. Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: A review. European Journal of Pharmacology. 463, 3-33 (2003).
  60. Tye, K. M., et al. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature Letter. 471, 358-362 (2011).
  61. Bouwknecht, J. A., et al. Differential effects of exposure to low-light or high-light open-field on anxiety-related behaviors: Relationship to c-Fos expression in serotonergic and non-serotonergic neurons in the dorsal raphe nucleus. Brain Research Bulletin. 72, 32-43 (2007).
  62. Overstreet, D. H., Knapp, D. J., Angel, R. A., Navarro, M., Breese, G. R. Reduction in repeated ethanol-withdrawal-induced anxiety-like behavior by site-selective injections of 5-HT1A and 5-HT2C ligands. Psychopharmacology. 187, Berlin. 1-12 (2006).
  63. Takahashi, A., et al. Glutamate Input in the Dorsal Raphe Nucleus As a Determinant of Escalated Aggression in Male Mice. Journal of Neuroscience. 35, 6452-6463 (2015).
  64. Klemenhagen, K. C., Gordon, J. A., David, D. J., Hen, R., Gross, C. T. Increased Fear Response to Contextual Cues in Mice Lacking the 5-HT1A Receptor. Neuropsychopharmacology. 31, 101-111 (2006).
  65. Ramos, A. Animal models of anxiety: do I need multiple tests. Trends in Pharmacological Science. 29, 493-498 (2008).
  66. Isosaka, T., et al. Htr2a-Expressing Cells in the Central Amygdala Control the Hierarchy between Innate and Learned Fear. Cell. 163, 1153-1164 (2015).
  67. Regev, L., Goshen, I. Employing Optogenetics in Memory Research. Optogenetics: A Roadmap. , 219-256 (2017).
  68. Shah, A. A., Sjovold, T., Treit, D. Inactivation of the medial prefrontal cortex with the GABA A receptor agonist muscimol increases open-arm activity in the elevated plus-maze and attenuates shock-probe burying in rats. Brain Research. 1028, 112-115 (2004).
  69. Knight, A. R., et al. Pharmacological characterisation of the agonist radioligand binding site of 5-HT2A, 5-HT2B and 5-HT2C receptors. Naunyn-Schmiedebergs Archiv of Pharmacology. 370, 114-123 (2004).
  70. Graeff, F. G., Viana, M. B., Mora, P. O. Dual Role of 5-HT in Defense and Anxiety. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21, 791-799 (1997).
  71. Cheriyan, J., Sheets, P. L. Altered Excitability and Local Connectivity of mPFC-PAG Neurons in a Mouse Model of Neuropathic Pain. Journal of Neuroscience. 38, 4829-4839 (2018).
  72. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).

Tags

Beteende Optogenetik Möss Optisk fiber Virus Injection Implantation Ångest Beteende Öppet Fält Nyhet-Undertryckta-Utfodring Barnes Maze
Optogenetisk manipulation av neuronal aktivitet för att modulera beteende i fritt rörliga möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. … More

Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (164), e61023, doi:10.3791/61023 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter