Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

מדידת רעילות ב -C. אלגיה

Published: April 30, 2020 doi: 10.3791/61024

Summary

מוצרי העברה שאינם תלויי ATG הקשורים לחזרה מתגלים כתכונות פתוגניים של מחלות מבוססות הרחבה חוזרות. מטרת הפרוטוקול המתואר היא להעריך רעילות הנגרמת על ידי פפטידים אלה באמצעות בחני התנהגות הסלולר מערכת המודל C. אלגיה.

Abstract

ג. אלגיה משמש בדרך כלל למודל מחלות ניווניות הקשורות לגיל הנגרמת על ידי מוטציות התרחבות חוזרות, כגון טרשת Amyotrophic לרוחב (ALS) ומחלת הנטינגטון. לאחרונה, חזרה על הרחבה המכילה RNA הוכח להיות מצע עבור סוג הרומן של תרגום חלבון שנקרא לחזור על-ידי הקשורים לא אוגוסט תלוי (רן) תרגום. בשונה מתרגום קאנוני, תרגום רן אינו דורש התחלה של מפעיל ומתרחש רק כאשר החזרה עולה על אורך הסף. מכיוון שאין להתחיל קודון לקבוע את מסגרת הקריאה, תרגום RAN מתרחשת בכל מסגרות הקריאה מתוך הגיון ואנטי היגיון תבניות RNA המכילות רצף הרחבה חוזרת. לכן, תרגום הראן מרחיב את מספר הפפטידים האפשריים הקשורים למחלות רעילות מאחד לשש. עד כה, התרגום של רן תועד בשמונה שונות של התרחבות ומחלות נוירוניווניות המבוססות על הרחבה. בכל מקרה, פענוח אשר מוצרי ראן רעילים, כמו גם מנגנוני רעילות שלהם, הוא צעד קריטי לקראת הבנה כיצד אלה פפטידים לתרום פתופסיולוגיה המחלה. במאמר זה, אנו מציגים אסטרטגיות כדי למדוד את רעילות של פפטידים RAN במערכת דגם C. אלגיה. ראשית, אנו מתארים הליכים למדידת רעילות של מבני רן על הצמיחה והתנועתיות של התפתחות C. אלגיה. שנית, אנו מפרטים את התשובה למדידת ההשפעות ההתפתחותיות, התלויות בגיל של פפטידים של RAN בתנועתיות. לבסוף, אנו מתארים שיטת רעילות עצבית להערכת ההשפעות של פפטידים בראן על מורפולוגיה של תא העצב. מספר זה מספק הערכה רחבה של רעילות בתלת-המידה של פפטיד, ועשוי להועיל לביצוע מסכי מולקולות גנטיות או קטנות כדי לזהות מנגנוני מחלות או תרפיות.

Introduction

ההתרחבות הבלתי הולמת של רצפים חוזרים DNA הוא הבסיס הגנטי עבור מחלות ניווניות מספר כגון טרשת amyotrophic לרוחב (ALS), דמנציה הפרופנטיסטית (FTD), ו מחלת הנטינגטון (HD)1. בעוד יש מבוססים מודלים סלולריים ובעלי חיים עבור מחלות אלה, מנגנונים המשמשים את התנאים הללו אינם מוגדרים היטב. לדוגמה, HD נגרמת על ידי הרחבות של רצף החזרה של הקאג ברצף הקידוד של החלבון Htt2. כי הקאג מקודד את החומצה האמינית גלוטמין, התרחבות חזרה הקאג התוצאות בהוספה של polyglutamine, או polyglutamine, רצף בתוך htt. מורחבת חלבונים polyglutamine הטופס באורך והגיל מצרפים מזיבי החלבון המשויכים רעילות3,4. למרבה ההפתעה, שני מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי אורכו של רצף polyq הוא לא הנהג העיקרי של התפתחות HD מחלה, מציע כי גורמים בלתי תלויים polyq עשוי גם לתרום למחלה5,6.

אחד אפשרי polyQ המנגנון העצמאי כולל סוג חדש של תרגום חלבון כינה REpeat aSSOCIATED NON-אוג-תלוי (רן) תרגום7. כפי ששמה מרמז, תרגום רן מתרחש רק כאשר קיים רצף חוזר מורחב ואינו דורש התחלה קאנונית. לכן, תרגום רן מתרחש בכל שלושת מסגרות הקריאה של החזרה כדי לייצר שלושה פוליפפטידים ברורים. בנוסף, מכיוון שגנים רבים מייצרים גם תעתיק אנטי-חוש המכיל את ההשלמה ההפוכה של רצף החזרה המורחב, תרגום הראן מתרחש גם בכל שלושת מסגרות הקריאה של התעתיק האנטי-הגיוני. יחד, תרגום רן מרחיב את מספר החלבונים המיוצרים מתוך רצף מורחב חוזר המכיל DNA מ פפטיד אחד עד שישה פפטידים. עד כה, תרגום רן נצפה בלפחות שמונה הפרעות חוזרות שונות של התרחבות8. פפטידים הרצתי נצפו בדגימות המטופל שלאחר המוות ורק במקרים שבהם המטופל נושא חזרה מורחבת9,10. בעוד פפטידים אלה נמצאים בבירור בתאי החולה, תרומתם למחלות פתופסיולוגיה אינה ברורה.

כדי להגדיר טוב יותר את הרעילות הפוטנציאל הקשורים עם הפפטידים RAN, מספר קבוצות הביעו כל פפטיד במערכות מודל שונות, כגון שמרים, זבובים, עכברים, והתרבות רקמות תאים11,12,13,14,15,16. במקום להשתמש ברצף החזרה של הביטוי, מודלים אלה מעסיקים גישה מקודון וריאציה שבה רצף החזרה מסולק, אך רצף חומצת האמינו נשמר. החניכה בתרגום מתרחשת באמצעות ATG קאנונית והפפטיד בדרך כלל מותכות לחלבון פלורסנט ב-N-או C-טרמינוס, שאף אחד מהם אינו מפריע לרעילות ה-RAN. לכן כל אחד מהמבנה מבטא פפטיד בודד. מידול מוצרים שונים של RAN באורגניזם משני עם בחני פשוטה למדוד רעילות הפפטיד של הראן הוא החשוב ביותר כדי להבין כיצד מוצרי RAN שונים של כל מחלה-גרימת התרחבות חוזרת לתרום לתפקוד התאי וניוון המוח.

כמו מערכות מודל אחרות, C. אלגיה מספקת פלטפורמה ניסיונית גמישה ויעילה המאפשרת מחקרים של מנגנוני מחלה חדשים, כגון רעילות של מחלות מסוג RAN. תולעים מציעות מספר תכונות נסיוניות ייחודיות שאינן זמינות כרגע במודלים אחרים של הרעלת פפטיד בראן. ראשית, הג הם שקופים מהלידה עד המוות. זה מאפשר הדמיה פשוטה של ביטוי פפטיד ולוקליזציה של הראן, כמו גם בניתוח vivo של ניוון מוחי בבעלי חיים חיים. שיטות שניות ליצירת מודלים של ביטוי פפטיד בשיטת RAN הם זולים ומהירים. בהינתן מחזור החיים הקצר של שלושה ימים של C. אלגיה, קווים טרנסגניים יציבים המבטא כל פפטיד RAN נתון בצורה מסוימת של סוג תא ניתן לייצר בתוך פחות משבוע. שלישית, פלטי פנוטים פשוטים יכולים להיות משולבים עם שיטות סינון גנטי, כגון מוטזיס כימי או הקרנת RNAi, כדי לזהות במהירות גנים חיוניים של הרעלת פפטיד בראן. לבסוף, תוחלת החיים הקצרה של הג (~ 20 יום) מאפשרת לחוקרים לקבוע את מידת ההזדקנות, שהיא גורם הסיכון הגדול ביותר למחלות התרחבות חוזרות ומחלות, השפעות רעילות מהפפטיד. יחד, שילוב זה של מאפיינים ניסיוניים הוא ללא תחרות בכל מערכת מודל אחרת והוא מציע פלטפורמה רבת עוצמה לחקר רעילות פפטיד בראן.

כאן אנו מתארים מספר שאומר כי למנף את היתרונות הניסיוניים של C. אלגיה כדי למדוד את הרעילות של פפטידים בראן ולזהות מכפילי גנטי של רעילות זו. Codon-מגוון מגוונת ATG-פפטידים רץ מתויגים עם GFP והביע בנפרד בתאי שריר תחת מקדם myo-3 או בנוירונים מוטוריים GABAergic תחת unc-47 יזם. לביטוי בתאי שריר, חשוב כי הפפטידים רץ רעילים מתויגים עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP), או חלבון פלורסנט אחרים (FP) תג כי ניתן לפלח עם וקטור האכלה RNAi. הסיבה לכך היא ביטוי ביטויים רעילים מסוג RAN בדרך כלל חוסם את הצמיחה, עיבוד זנים כאלה ללא קיימא. השימוש gfp (RNAi) מותנית בביטוי פפטיד ביטוי מאפשר מאמץ, צלבים גנטיים, וכו '. עבור assays בעלי חיים אלה יוסרו gfp (RNAi), אשר מאפשר ביטוי של הפפטיד RAN ואת הפנוטיפים כתוצאה מכך. בנוסף לאסטרטגיה המולקולרית לעיצוב מבני ביטוי מגוונים בעלי מגוון של מבנים, אנו מתארים את הנושא למדידת רעילות התפתחותית (הזחל ושיטת הצמיחה), הרעילות לאחר גיל התפתחותי (שיטת שיתוק), ומומים מורפולוגיים (מזנון בטוח).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. יצירת מבנים מגוונים של ביטוי מגוון של פפטיד

  1. עצב את רצף הקידוד הפרטני של מבנה ה-DNA העושה שימוש בקודונים נרדפים כדי לסלק את המבנה הבסיסי של דנ א/RNA, אך לשמר את רצף חומצת האמינו שמעליה.
  2. הזמנת הקודון המותאם אישית באורכי מסחרית באורכים החוזרים הדרושים למחקרים (בדרך כלל 5 – 100 חוזר). כלול אתר הגבלה של HindIII בסוף 5 ' ובאתר הגבלת BamHI בסוף 3 ' כדי להקל על השכפול לתוך וקטורי ביטוי של C. אלגיה , כגון ppd 95.79.
    הערה: אם סינתזה של מבנים גדולים יותר מוכיחה הקשה, רצפים קטנים בנייה לחסום יכול להיות מסונתז ולאחר מכן בנוי לתוך גדול יותר באמצעות אסטרטגיה לימוד כיוונית17.
  3. שיבוט משנה את רצף הפפטיד לתוך וקטור ביטוי C. אלגיה באמצעות שיטות ה-T4 הסטנדרטיות.
  4. שיבוט משנה רצף מקדם ספציפי לסוג תא שנוצר על-ידי ה-PCR לפני רצף הפפטיד של RAN כדי לכונן ביטוי ספציפי לרקמה-פפטיד-GFP.
  5. הכנס את מבנה הפפטיד של ה-RAN לגונאד של מסוג פראי C. אלגיה כדי ליצור זנים טרנסגניים המכילים מערכים כרומוזומלית באמצעות שיטות סטנדרטיות18. עבור סמן שיתוף הזרקה, שריר ספציפי RFP כתבת (myo-3p:: rfp (pCFJ104)) היה מנוצל, למרות סמנים אחרים יכולים להיות מנוצל גם.
  6. שילוב של גן מעבר יציב לתוך הגנום באמצעות שיטות ההקרנה הרגילות של C. אלגיה 19.
  7. אם פפטיד ה-RAN הוא רעיל ובעלי חיים הטרנסגניים לא לשרוד, להאכיל בעלי חיים gfp (RNAi) ביטוי חיידקים pre-הזרקה כדי להשתיק את הביטוי של חלבון רעיל.
    הערה: הסרת בעלי חיים מ- gfp (RNAi) מאפשרת ביטוי פפטיד מסוג RAN לניתוחים פנותאריים באמצעות הספר המתואר להלן.

2. מדידת רעילות התפתחותית של פפטידים RAN בעקבות מבוסס RNAi גן הסתרה: פרוטוקול ניתוח מהירות וידאו

  1. שופכים תקן הצמיחה נמטודות בינונית (ngm) rnai 24 לוחיות עם 1 מ"מ איזופרופיל β-D-1-thioגלאוצד (iptg) ו 25 μg/mL carbenicillin.
  2. פס החוצה שיבוטים האכלה RNAi ב HT115 חיידקים להיבדק על ציר לוריא (LB) + carbenicillin (25 μg/mL) לוחות אגר ולגדל חיידקים ב 37 ° c עבור 24 שעות. כלול וקטור ריק (RNAi) כפקד חיובי עבור רעילות ו- Gfp (rnai) כפקד שלילי.
  3. עבור כל שיבוט, לבחור מושבה אחת לתוך 1 מ ל של LB + carbenicillin מדיה נוזלית ולגדול חיידקים לילה עבור 18 שעות ב 37 ° צ' בעוד רועד ב 250 סיבובים לדקה (RPM).
  4. ספוט ארבע בארות בודדים של NGM RNAI 24 בארות עם 20 μL של התרבויות הבאות בקטריאלי לילה: עמודה 1 בארות = gfp (RNAi); עמודה 2 בארות = (EV) RNAi; עמודות 3 – 6 בארות = RNAi נגד גנים להיבדק. אפשר לחיידקים RNAi לגרום dsRNA הפקה לילה בטמפרטורת החדר (RT).
  5. לבודד ביצים מיום אחד בוגר C. אלגיה מבטאת את השילוב המשולב פפטיד משולב באמצעות השיטה ההיפוכלורית והזרע ~ 30 C. אלגיה ביצים לתוך כל טוב של הצלחת ngm rnai 24 היטב.
  6. מפעיל את 24 הבארות ב -20 ° c במשך 7 ימים.
    הערה: זמן דגירה זה עבור זנים המבטא רעילים C9orf72 RAN dipeptides, כגון PR50 או GR50. זנים אחרים עשויים לדרוש זמני דגירה קצרים כדי למנוע תשישות של מקור מזון חיידקי ורעב לאחר מכן.
  7. רכישת קטעי וידאו משודרים באמצעות לייקה MZ16FA מיקרוסקופ לניתוח סטריאו מצויד במצלמה מונוכרום DFC345FX מחובר למחשב תואם Windows פועל לייקה AF תוכנת רכישת וידאו (גירסה 2.6.0.7266).
    1. לרכוש שני קטעי וידאו משתי בארות נפרדות עבור כל תנאי RNAi באמצעות עקבי רכישת וידאו הגדרות בין בארות. עבור כל וידאו, לרכוש 10 שניות ב 800 x 600 פיקסל ברזולוציה ו 13.16 מסגרות לשנייה (הזמן voxel ממד = 0.076 שניות) באמצעות הגדלה 29.9 X (1.49 הגדרת זום ב-AF תוכנה). הגדר את זמן חשיפת התמונה ל-4 אלפיות שניה. סמן כל וידאו מיד עם המתח, תנאי RNAi ומספר טוב.
  8. לעוור את הניסויים לגנוטיפ המשויכים כל קובץ וידאו על ידי אקראיות הסדר של קטעי וידאו ושינוי שם קטעי וידאו למספרים. שמור קבוצה זו של סרטי וידאו כקובץ חדש. לא לעוור את הניסויים. לאחר השלמת הניתוח
  9. למדוד את ' מרחק שנסע ' ואת אורך של כל חיה עבור 20 בעלי חיים שונים מכל וידאו, בחינת סך של ~ 40 תולעים עבור כל תנאי RNAi.
    1. בתוכנה, בחר את לחצן כלי הביאור, לאחר מכן הכלי לצייר טקסט. לחץ על נקודה במרכז התולעת הנמדדת במסגרת הראשונה של הווידאו וסמן אותה כמספר. העבר את הווידאו לסוף תוך מעקב חזותי של נתיב התנועה של התולעת. במסגרת האחרונה, לחץ על נקודה במרכז התולעת הנמדדת וסמן את המספר המתאים הבא. לאחר מכן, באמצעות הכלי לצייר scalebar, צייר קו מהמספר הראשון למספר השני כדי להקליט את "מרחק שנסע".
    2. ' מרחק שנסע ' הוא המרחק בין שתי נקודות הסנטהאיד. מרחק זה מוצג בסמוך לקו המדידה. הקלט מדידה זו בגיליון אלקטרוני. חזור על מדידה זו עבור 19 תולעים אחרות בווידאו תוך שמירה על כל מדידה בודדת בחלון הניתוח.
  10. ליצור מדידות מבעלי חיים המציגות את התנועה החזקה ביותר כדי להימנע מבחירת בעלי החיים לא מפגין תנועה וממתח את הנתונים לקראת שיתוק. לאחר השלמת המדידות, צלם תמונה של מסגרת הווידאו הסופית המדגימה את כל קווי המדידה כך שניתן יהיה לעקוב אחר הנתונים בחזרה אל בעל החיים שממנו היא נוצרה.
  11. נתח את הנתונים באמצעות גיליון אלקטרוני בעל ארבע עמודות. טור אחד הוא התולעת "מזהה", עמודה שתיים הוא המרחק שנסע/שעה (מהירות).
    1. הזמן של כל וידאו ניתן למצוא על ידי לחיצה ימנית על וידאו מתחת לניסוי וללכת המאפיינים של הווידאו.
  12. לנרמל את מדידת המהירות על ידי מציאת אורך של כל חיה על ידי בחירת כמת, ולאחר מכן סטטיסטיקה על התוכנה. לחיצה על סמל כלי הביאור בתצוגת הווידאו אמורה לאפשר את השימוש בכלי "צייר פוליליין". כלי זה יכול לשמש לאחר מכן לעקוב בחופשיות את C. אלגיה מן הווידאו מקצה הראש עד קצה הזנב. אורך הקו יירשם בסטטיסטיקה.
    1. צלם תמונה של מסגרת הוידיאו הסופית המדגימה את כל הפוליקו המשמש לשינוי גודל ה -C. אלגיה כך שניתן יהיה לעקוב אחר הנתונים בחזרה אל החיה שממנה הם הקורם.
  13. נתח את הנתונים באמצעות הוספת שתי עמודות נוספות לגיליון האלקטרוני. טור שלוש הוא "אורך החיים", והטור הרביעי הוא "המהירות המנורמלת" (אורך מהירות/בעלי חיים). ניתוח נתוני המהירות המנורמלת באמצעות ANOVA בכיוון אחד עם בדיקות שלאחר-הוק לעומת וקטור ריק (RNAi).

3. מדידת רעילות התפתחותית של פפטיד RAN: שיטת הצמיחה

  1. בחר ~ 30 בעלי חיים gravid לתוך מקום 50 μl של פתרון רדמה (10 מ ל של אקונומיקה, 2.5 ml של 10 N naoh, 37.5 ml של dH2O) על gfp (rnai), (EV) rnai, או (גנטי ספציפי) 6 ס מ rnai צלחת.
  2. לאחר 24 שעות, להעביר שישה צאצאים טרנסגניים שזחלו החוצה של האתר ההיפוכלוריט הפתרון ללוח חדש 6 ס"מ rnai זהה התנאים rnai על הצלחת שבה הם היו חשופים לטיפול היפוכלוריט פתרון. שים את הצאצאים האלה (F1) ב 20 ° צ' כדי לצמוח ולהתרבות.
  3. לאחר 24 – 48 h, לבחור 10 בעלי חיים L4 טרנסגניים אל 6 ס מ rnai התאמת התנאים rnai כי בעלי החיים כבר גדל. הניחו לבעלי החיים להטיל ביצים במשך 24 שעות בחממה של 20 ° c.
  4. לאחר 24 שעות, להסיר את החיות למבוגרים ולהשליך אותם. לספור את מספר הביצים ואת הזחלים L1 הניח במהלך 24 המחזור באמצעות מונה כף יד מכנית. . זה הגודל הכולל של הרבייה
  5. במהלך 72 h הבא, לספור את מספר בעלי החיים המגיעים L4 או בשלב מבוגר. , כאשר כל בעל חיים נספר. הסר אותו מהצלחת
  6. לכמת את "אחוז צמיחה" כאחוז של בעלי חיים המגיעים L4 או השלב המבוגר מתוך גודל הגידול הכולל.
  7. בצע מבחן מדויק של 2 x 2 של פישר לעומת וקטור ריק (RNAi) כדי לקבוע אם הצמיחה אחוז הוא משמעותי מבחינה סטטיסטית. הקטגוריות להשוואה הן "צמיחה" (של בעלי חיים שהגיעו לשלב L4 או מבוגר ב 72 h) ו "ללא צמיחה" (גודל הקבוצה הכולל פחות מספר בעלי חיים המגיעים L4 או בשלב מבוגר ב 72 h).

4. התפתחות שיתוק לאחר התפתחותי של מדרסה

  1. שמור על משולבים C. אלגיה הזנים המבטא הראן פפטיד-GFP בשריר על GFP(rnai) על ידי הצבת 4 – 6 טרנסגניים L4's על צלחת 6 ס"מ GFP(rnai) להגדיל את התולעים ב 20 ° c.
  2. אם הניסוי מנצל את RNAi כדי לבדוק את ההשפעות הגנטיות על רעילות בראן להעביר 10 מבוגרים gravid הטרנסגניים מצלחת בלתי מורעב לכל אחד 2 6 ס"מ וקטור ריק(rnai) (שליטה חיובית עבור שיתוק, שלילי שליטה על השפעות גנטיות), gfp ( rnai) (שליטה שלילית לשיתוק, בקרה חיובית עבור אפקטים גנטיים), מיוחד גנטי(למשל, 10 gravid מבוגרים
  3. אם מוטציות משמשות כדי לנתח את ההשפעות הגנטיות על רעילות הפפטיד בראן, מקום 10 gravid WT או בעלי חיים מוטציה המבטא את אותו הגנטי RAN על כל אחד 2 6 ס"מ וקטור ריק(rnai) או Gfp (rnai) צלחות. לגדל את התולעים ב 20 ° צ' עבור 48 h.
  4. בחר 10 סטים של 10 טרנסגניים L4's מן 6 ס מ rnai לוחות ומקום כל להגדיר על 3 ס מ rnai הצלחת (כלומר, n = 100 בעלי חיים עבור כל גנוטיפ). ודא שL4's שנבחרו עבור הסדר כולם כוללים תנועתיות רגילה באופן שטחי. מניחים את הצלחות בתוך שקית אחסון רוכסן לשמור על לחות.
  5. מניחים את הצלחות ארוז עם L4's בחממה 25 ° c.
  6. הסר את בעלי החיים 24 שעות מאוחר יותר מהאינקובטור 25 ° c אחד בכל פעם כדי למזער את כמות הזמן שהם בחוץ ב-RT.
  7. הקש על לוחיות הזיהוי של המיקרוסקופ כדי לבדוק את התנועה. אם החיות לנוע יותר מאשר אורך הגוף, לספור את החיה כמו ניידים ולהעביר אותו לצלחת החדש 3 ס מ RNAi. השתמש באיסוף פלטינה כדי להקיש על התולעים הנותרות על הראש או הזנב. אם בעל החיים נע יותר מאורך הגוף, לספור את החיה כנייד ולהעביר אותו לצלחת החדש 3 ס מ RNAi.
    הערה: אין לחרוג מ -10 תולעים לכל צלחת בעת המעבר. היזהר כדי להימנע מהעברת צאצאים ללוח RNAi החדש, כי האפשרות תלויה בבעלי חיים בגילאי הבאים בלבד.
  8. קבץ את כל התולעים שאינן נעות יחד כך שתנועה של יותר מאורך הגוף יכולה להתגלות בקלות. תן לחיה לפחות דקה אחת להזיז יותר מאורך גוף אחד. אם זה עדיין לא זז, זה משותק, ארוז (כלומר, הזחלים בקעה בתוך אמא), או מת.
  9. בעלי חיים הצנזורה המוצגים, מתייבשות בצידי הצלחת, המעיים מפגינים, מחילה, הופכים לאבודים, או מתים מה, בזמן הגילוי. תולעים משותק נספרות, שמאל על הלוח RNAi הישן, ונמחק.
  10. ציון בעלי החיים לשיתוק בכל יום במשך 5 – 7 ימים כמתואר בשלבים 4.6 – 4.9.
  11. ניתוח נתוני שיתוק באמצעות מבחן בדרגת יומן זהה לזה המשמש לניתוח תוחלת חיים. בניתוח סטטיסטי זה, תולעים נעות הבקיע כמו "חיים", תולעים משותק הם הבקיע כמו "מת", ומת, ארוז, בטן הבלטת, מיובש, מחורץ, או התולעים איבד באופן אחר הבקיע כמו "מצונזרים".
    הערה: בניתוח זה, המספר "אחוז בחיים" מציין את בעלי החיים "אחוז העברת". ההופכי מייצג את "אחוז משותק". השתמש בכלי הניתוח המקוון OASIS (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/) כדי לבצע את הניתוח הסטטיסטי בדירוג יומן הרישום.

5. מדידת תא עצב פתולוגיה: הספק מאוד

  1. הפקת ג ' אלגיה הטרנסגניים מבטאת את הפפטיד של העניין בנוירונים GABAergic באמצעות unc-47 מקדם. כמו כן , לבטא unc-47p:: gfp או unc-47P:: rfp כדי לחשוף את המבנה הסלולר של הנוירונים בגוגא.
  2. בחר 50 בעלי חיים L4 טרנסגניים ומניחים אותם על צלחת 6 ס"מ OP50 על 25 ° c עבור 24 h.
  3. להעביר את החיות 50 טרנסגניים על לוחית חדשה 6 ס"מ OP50 ב 25 ° c עבור 24 שעות.
  4. הפוך רפידות להדמיה עבור הדמיה של בעלי החיים תחת מיקרוסקופ שטח.
    1. הניחו שתי פיסות נייר על גבי שני מגלשות מיקרוסקופ. הצב שקופית מנוקה ללא קלטת באמצע שתי השקופיות המודבקות.
    2. מדבקות ~ 100 μL (ירידה אחת מתוך פיפטה פלסטיק חד פעמי) של 3% agarose מותכת על השקופית האמצעית עם פיפטה חד פעמי העברה סטרילית.
    3. מיד מניחים שקופית נקיה שנייה לאורך טיפת העלה המותכת, כך שהיא נשענת על השקופיות המודבקות ויוצרת שכבה דקה ושלמה של צמח בין השקופיות.
    4. לאחר שהצמח התקרר והתחזק, הסירו בזהירות את שתי השקופיות עם שכבת הצמח ביניהן, מבלי להפריד ביניהן, והניחו אותן בשקית ניילון עם פיסת נייר לחה מתחתיה. הפוך שקופית אחת לכל 10 תולעים להיבדק יחד עם שלוש שקופיות נוספות.
  5. להסיר את c. אלגיה הטרנסגניים מהאינקובטור 25 ° c ולבחור 10 הטרנסגניים c. אלגיה לתוך ירידה של 100 Μl של 10 מילימטר levamisole בשקופית הדיכאון זכוכית. דגירה של 10 דקות או עד שבעלי חיים משותקים.
  6. הוצא זוג שקופיות משקית הפלסטיק והפרד אותם בזהירות. סמן את השקופית עם הצמח עם ה-גנוטיפ והוסף 2 μL של 10 מ"מ לויאמאסole עד אמצע הצמח. להעביר את 10 בעלי חיים לתוך הלבן על כרית agarose. לכסות את בעלי החיים עם שמיכות #1 עובי.
  7. בעלי חיים תמונה שבה הפות מכוונת כך שהיא בצד ימין של החיה. אם הפות הוא בצד שמאל של הראש, המתקשה של הנוירונים מוטוריים יהיה מתחת בעלי חיים ולא בבירור גלוי, מה שהופך את הכמת מדויק קשה. השמט את הקוונפיקציה מבעלי החיים האלה. בכיוון זה, הcommres של הנוירונים המנוע הם הקרובים שמיכות והם גלויים בבירור על המיקרוסקופ הפוך מיקרוסקופ פלואורסצנטית. המחש את תא העצב המבטא GFP עם לייקה DMI4000B הפוך מיקרוסקופ מערכת פלואורסצנטית עם 63 x 1.4 X NA השמן העדשה טבילה ומסנן לייקה L5 GFP (Ex480/40nm; Em527/30nm). אם תא העצב מגדיר אקספרס RFP במקום GFP, לנצל את מסנן לייקה TX2 RFP (Ex560/40nm; Em645/75 ננומטר).
    1. המחש את תא העצב באמצעות המבטא GFP עם מיקרוסקופ הפוך לשדה הפלואורסצנטית עם 63 x 1.4 x NA הנפט טבילה העדשה וערכת מסנן GFP (Ex480/40 ננומטר; Em527/30 ננומטר). אם תא העצב מגדיר RFP אקספרס במקום GFP, להשתמש בחלבון פלורסנט אדום (RFP) מסנן להגדיר (Ex560/40 ננומטר; Em 645/75 nm).
  8. צלם את התולעים בתוך 45 דקות של הצבת שמיכות על התולעים כדי למזער רעילות משתק.
  9. עבור כל תולעת, ספור את מספר ההנפקות הגלויות. ישנם 16 בעלי חיים גלויים בחיות טיפוס פראי. כמו כן, לספור את מספר ה, כי יש חרוזים גדולים (כלומר, blebs) בתוך ה, כמו גם מספר הנפקות כי הם שבורים. כדי לוודא שהמזנון מקולקל, עקבו אחר המזנון מחוט השדרה לחוט הגחון באמצעות התאמת המישור המוקד.
    הערה: כאשר ה -unc-47 p:: הקרינה הפלואורסצנטית של gfp מציגה פער נחשבים שבורים. המזנון השבור בדרך כלל יש bleb משני צדי ההפסקה, עוזר להראות כי הנפקות הוא שבור. תספור את כמות הבלתרים. וההפסקות עבור 20 תולעים
  10. לחשב את החלק של הקשר עם blebs או שברים על המספר הכולל של הנפקות שנצפו עבור כל חיה. ניתן גם למדוד את המספר המוחלט של הנפקות שנספרו לכל בעל חיים (כולל סוג פראי, ברירת מקום ואירועים שבורים).
  11. עבור כל קטגוריה, לחשב את ממוצע ± SD ומבחינה סטטיסטית לנתח עם מבחן t של סטודנט להשוואה בין שתי אוכלוסיות, או ANOVA חד כיוון להשוואות בין 3 אוכלוסיות או יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השתמשנו בספר שמתואר כאן כדי להעריך את ההשפעה של מעצורים גנים שונים על רעילות של dipeptides RAN שנמצאים בחולים ALS עם G4C2 הרחבה חוזרת. באמצעות שיטת הצמיחה כדי למדוד רעילות התפתחותית, ניתחנו את ההשפעות של מוטציות הסתרה גנטית מספר מזוהה הגנום רחב RNAi דכאי מסך של השריר הביע הרעלת PR50-GFP. בעוד הביטוי של PR50-GFP לבדו הביא למעצר גדילה לחלוטין החדירה, אובדן של מוטציות פונקציה במספר גנים דיכאו רעילות התפתחותית PR מ 12-94% (איור 1A).

כמו כן, מדדנו את ההשפעה של הסתרה גנטית ספציפית על התנועתיות ההתפתחותית של בעלי חיים PR50 באמצעות שיטת ניתוח מהירות וידאו. כצפוי, gfp (ב) הביא עלייה גדולה בתנועתיות לעומת וקטור ריק (rnai) עקב עיכוב של ביטוי PR50-gfp. גילינו גם כי RNAi נגד היחידה subasome rnai-7 הביא לעלייה משמעותית PR50 תנועתיות (איור 1b).

ALS, כמו מחלות ניווניות רבות, מתרחשת אצל מבוגרים. לכן, ניתחנו פנוטיפים למבוגרים באמצעות שיתוק תלוי-הגיל. PR50-GFP הציגו עד 80% שיתוק על ידי גיל 5 ימים. עם זאת, RNAi ביים את הגן ללא מוצא -6 התעכב באופן משמעותי, הרומז כי במבוי סתום נדרש עבור רעילות PR50-Gfp (איור 1c). אפקט זה היה ספציפי לקול 6 (RNAi) מכיוון שקול 1 (rnai) לא שינו רעילות PR50-gfp.

חלבונים נוירוניווניות, כגון פפטידים רץ רעילים, מעוצב בדרך כלל בקיר הגוף של C. אלגיה4,20,21,22. עם זאת, חשוב גם לקבוע אם חלבונים RAN לגרום נוירופתולוגיה כאשר מתבטאת ב -C. אלגיה נוירונים, כי רעילות ספציפית לעצב היא תכונה נפוצה של מחלות ניווניות רבות. בדקנו את הרעילות הספציפית לנוירונים. בעזרת הסדר הטוב ביותר ביום 2 מבוגרים, PR50-GFP ביטוי הנוירונים מוטוריים הובילו לעלייה משמעותית בעצב המנוע מוטורי. נוירופתולוגיה זו דוכאה באופן משמעותי על-ידי מוטציה ב-the אינסולין/IGF ה, הומולוג דף דאף-2 כי מעכב את התכונות הרעילות של מספר חלבונים נוירוניווניות23 (איור 2b).

Figure 1
איור 1: Assays להעריך את הרעילות של פפטידים הביע שרירים. (א) הייתהשיטת גידול פפטיד. המוטציות המצוין הצטלבו לתוך drIs34 (myo-3p::P R50-gfp) רקע גנטי תחת תנאים gfp (rnai) . מספרים מעל כל גנוטיפ מציינים את מספר הצאצאים הבקיע לצמיחה. כל ה-גנוסוגים יש p < 0.05 באמצעות המבחן המדויק של פישר לעומת סוג פראי. (ב) ניתוח מהירות וידאו למדידת רעילות פפטיד במהלך הפיתוח. drIs34 (myo-3p::P r50-GFP) בעלי חיים גדלו תחת Gfp (rnai), ריק וקטור (rnai), או rnai-7 (rnai ) תנאים ולאחר מכן הבקיע לתנועתיות כמתואר. המהירות היתה מנורמלת ל- gfp (RNAi) מטופלים בעלי חיים. נתונים המוצגים הם ממוצע ± SD, n = 40 עבור כל גנוטיפ. * *-p < 0.01, * * *-p < 0.001, בכיוון אחד ANOVA עם Tukey לאחר מבחן. (ג) שיתוק מדידה למדידת רעילות גיל התפתחות. drIs34 (myo-3p::P r50-GFP) בעלי חיים גדלו על וקטור ריק (rnai) (' WT '), מוצא -1 (rnai), או מוצא -6 (rnai) ושיתוק הבקיע כמתואר כל 24 h * * *-p < 0.001, מבחן בדרגת היומן עם תיקון שלאחר מבחן בונפררוני לעומת WT. n = 100 בעלי חיים לכל גנוטיפ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שיטת מדידת נוירופתולוגיה של תא מנוע הביע פפטידים בראן. (א) תמונות של למבוגרים ג. אלגיה המבטא unc-47p:: הכתב מנוע בעצב מוטוריים gfp בסוג פראי או unc-47P::P r50-gfp להביע בעלי חיים. התמונות עבור סוג פראי להמחיש המבנה הרגיל מאוד בטוח. תמונות מייצגות ערימות של סדרת Z משוטחים המתקבלות על-ידי מיקרוסקופ שדות פלואורסצנטית. PR50 בעלי חיים להפגין דוגמאות של מקווה שבירה ובלתרים. (ב) התוצאה של דאף -2 (E1370) ב PR50 מחכה בוודאות. נקודות מייצגות את אחוז ההבלתרים של בעל חיים יחיד, עם ממוצע SD הראו. n = 20 בעלי חיים לכל גנוטיפ * *-p < 0.01, ANOVA בכיוון אחד עם הבדיקה שלאחר-הוק של דאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מדווחים על שיטות שניתן להשתמש בהן כדי לעצב את הרעילות של פפטיד המודל בשריר או בנוירונים של ג. אלגיה. בעוד חלבונים נוירוניווניות יש הופעת גיל פנוטיפ בחולים אנושיים, הם יכולים גם להפגין רעילות מנטלית כאשר מתבטאת במערכות מודל. ביטוי יתר יש מגבלות הפרשנות משמעותי, אבל זה גם מספק נקודת התחלה רבת עוצמה עבור מסכי גנטיות או תרופתי מכוון לזהות גנים או תרופות שיכולות להפוך פנוטיפים רעילים. זה חשוב במיוחד בהתחשב ביותר מודלים בעלי חיים מדויקים של מחלות יש או לא פנוטיפ או פנוטיפים חלשים לא מתאים ההקרנה משוחדת גישות24,25,26. ה -C. אס. אס שלנו ניהל מודלים פפטיד ומהווים גישה רבת עוצמה ומשלימה למערכות מודל אחרות של מודלים מסוג ראן, כגון שמרים ודרוזופילה, להבנת המסלולים הסלולריים החשובים לרעילות החלבונים האלה שתוארו לאחרונה.

רעילות מותנית של פפטידים בהבעת שרירים
הרעלת פפטיד של מדידת RAN דורש תקופת מרדף לחיסול ההשפעות של gfp (RNAi). עם זאת, הזמן בין הסרה של gfp (RNAi) ואת הופעתה של פנוטיפים יכולים להיות עקביים אם הטיפול לא נלקח בדיוק בזמן ייזום של ניסויים, מבחר של בעלי חיים מבוים, משמרות טמפרטורה, וכו '. כאשר הפכנו להיות מנוסים יותר עם מספר זה, התזמון והחדירה של פנוטיפים בעלי פפטיד בראן הפך לעקבי יחסית. אחד השלבים הקריטיים ביותר בספר זה הוא שינוי נאות של בעלי חיים עד 25 ° c. ללא משמרת זו, פפטידים בראן מציגים רעילות חלשה באופן משמעותי. עם זאת, בעלי חיים לא יכולים לצמוח בהתמדה ב -25 ° c משום שהם אינם גדלים ומתרבים, ככל הנראה בשל ביטוי בסיסי גבוה יותר של הפפטיד בראן. זה לא כמו המצב של שמרים או דרוזופילה שבו זנים המבטא פפטידים רץ רעילים נשמרים תחת תנאים מתירני (כלומר, טמפרטורה נמוכה) אבל אז השתנה בחריפות לתנאים מגבילים (כלומר, טמפרטורה גבוהה יותר) לפני הערך13,15 כדי לשפר את הביטוי פפטיד. במערכות ביטויים מותנים כאלה, מצבים גנטיים המשפרים או מדכאים רעילות עלולים לנבוע משינויים ברמות הביטויים הפפטיד. כדי לקבוע אם מודיפיקטורי גנטי של מפעל הרעילות באמצעות פפטיד באמצעות שינויים ברמות הביטוי הטרנסגנטית, אנו לוקחים שתי גישות. ראשית, רבים של זנים הטרנסגניים שלנו לבטא כתבת RFP שנייה תחת השליטה של מקדם אותו המשמש לכונן ביטוי של הפפטיד בראן. שינויים בפעילות היזם הגורמות לביטויים מופחתים או מוגברים של מערכת ה-RAN לגרום להפחתת או הגדלה דומה ברמות RFP. אנו מחשיבים מוטציות או מצבים RNAi שמשנים באופן משמעותי רמות RNAI לפעול באופן לא ספציפי. שנית, אנו מבצעים PCR כמותי ובלוקטים מערביים כדי לקבוע אם הרמות של ה-mRNA של הפפטיד או חלבון משתנים בין התנאים. עם זאת, מבוסס על זיהוי של פפטידים RAN יכול לפעמים להוכיח קשה או בלתי אפשרי, כמו שאנחנו ואחרים הבחנו עם C9orf72 הנגזרות PR50-GFP. במקרים כאלה, אנו מכמת ברמות vivo GFP כדי לקבוע אם הביטוי חלבון הוא שונה בין התנאים השווים.

רעילות התפתחותית: יתרונות ומגבלות
ביטוי יתר בכפייה של פפטידים של ראן רעיל בשריר מוביל לעתים קרובות למעצר התפתחותי בג. בעוד זה ברור לא לחקות את המחלה האנושית פתולוגיה, הוא מספק נקודת התחלה רבת עוצמה עבור מסכי מדכא גנטיים, כי דכאי רעילות RAN מזוהים בקלות כמו בעלי חיים לצמוח ולהתרבות בהעדר של gfp (RNAi). חלק מדכאי יקל על הצמיחה עקב צמצום הביטוי הטרנסגנטי. כדי להבדיל בין אפשרויות אלה, אנו כוללים בדרך כלל כתבת RFP שנייה המונעת על ידי אותו יזם בתוך זן הטרנסגניים של הפפטיד שלנו. דכאי כי להפחית או להשתיק ביטוי טרנזגנטי יופיע גם רמות ביטוי RFP מופחת. מצד שני, דכאי כי התערוכה הרגילה או מוגבה RFP רמות סביר לתפקד באמצעות הפחתה של ביטוי טרנזגנטי. בדומה לשימוש בצמיחה שמרים או מורפולוגיה עין של העיניים13,15,27, גישות אלה, בעוד לא בדיוק היבטים מידול של המחלה בבני אדם, לספק כלי הקרנה רבת עוצמה עבור הזיהוי הראשוני של מכפילי המקורי של הראן.

רעילות פוסט-התפתחותית (שיתוק): יתרונות ומגבלות
היתרון של השיתוק הוא שמספר גדול יחסית של בעלי חיים (50-100) ניתן למדוד עם כלים הנמצאים בכל מעבדת תולעים. שיתוק הוא גם פנוטיפ חמור אשר מזוהה בקלות. המגבלה העיקרית של מעשה זה היא שהיא חסרת רגישות לפגמים בתנועה שאינם גורמים לשיתוק מוחלט. פגמים כאלה עשויים לדרוש גישות רגישות וכמותיים יותר למדידה, כגון מהלך החבטה או התנועה הקנטית שאומרת28. יש לבצע שיתוק כעיוור לגנוטיפ, אם יש לנקוט בטיפול ולדאוג לכך שתולעים לא עוברות כל סוג אחר של מתח (למשל, זיהום, רעב), שיכול להשפיע באופן משמעותי על תוצאות הטיפול. ג. אלאנים המבטאים נוגדנים בראן רעיל לפעמים לא מצליחים להפגין פנוטיפים חזקים לשיתוק. זה סביר להניח בשל השפעות מתמשכות של gfp (RNAi) המשך לדכא את הביטוי פפטיד. במקרים אלה, אם לא נתבונן בשיתוק משמעותי (> 10%) בבעלי חיים שליטה וקטורית (RNAi) ריקה לאחר יום 2, אנחנו בדרך כלל לסיים את השיטת וליזום שכפול נוסף. שינוי אחד של היכולת הזאת יכול לכלול את השימוש במערכות inducible מסוימות של ביטויים בעלי פפטיד. מערכת הביטויים הinducible היחידה הנפוצה ביותר עבור C. אלגיה היא מקדם הלם החום. עם זאת, הלם החום הנדרש יכול לגרום לתגובות לחץ שעלולות להשפיע על רעילות של החלבונים. היישום העתידי של מערכות אחרות של ביטויים מותנים, כגון מערכת העזר-inducible degron (סיוע)29, יכול לשפר באופן משמעותי את היכולת שלנו ללמוד רעילות פפטיד.

ניוון שטוח/מספק משוב: יתרונות ומגבלות
תא העצב המוטורי מייצג את האקסון של תא אחד של מנוע העובר בין מיתרי העצבים הגגאים והגהים. להתיר ושבירה ניתן לזהות בקלות בתוך מבודדים, המאפשר נוירוניוון להיות כמותית במהירות בחיות חיים (איור 2). בעוד בחינת בעלי החיים, חשוב שהם לא לווסת ב levamisole למשך תקופה ממושכת של זמן זה יכול לגרום למוות בעלי חיים מוקדמת, אשר מוביל בצורה עצבית ושבירה בהיעדר כל פפטיד מסיבי. במקרים מסוימים, הנפקות הן מנוונת לחלוטין ואינן נראות עוד. לכן, הם לא יכולים להיות הבקיע עבור תכונות נוירופתעיות, כי היכולות שלנו מודד את האחוזים של הליכי שבור או לחלוטין מתוך המספר הכולל של הנפקות שנצפו. במקרים אלה, היכולת המימיבה עשויה להמעיט בערך השפעת הפפטיד של הראן.

לסיכום, הכתוב המתואר במאמר זה שימושי למדידת רעילות הנגרמת על ידי פפטידים RAN בג. באמצעות gfp (RNAi) כדי לווסת את הביטוי של החלבונים מאפשר הפנוטיפים פוסט התפתחותי להיות נצפתה. הגישות שלנו ניתן להתאים בקלות כדי לבצע מסכי גנטיות בקנה מידה גדול עבור דכאי או משפרי רעילות. הספק המשני, כגון שיטת השיתוק והבחינה הפסיכומטרית, יכולים לאשר שהרעילות מודדקת לאחר פיתוח מנטלית ובדיקה אם מנגנון הדיכוי שימור בנוירונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

NIH R21NS107797

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile CELLTREAT Scientific Products 50-202-036 Nematode growth plates and RNAi
AGAR GRANULATED 2KILOGRAM BD DIAGNOSTIC SYSTEMS DF0145070 Nematode growth plates and RNAi
AGAROSE ULTRAPURE LIFE TECHNOLOGIES 16500500 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
CARBENICILLIN 5G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP26485 Nematode growth plates and RNAi
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK THERMO SCI ERIE 12542B Imaging for commissure assay
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242952008 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK THERMO SCI ERIE 125485C Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides THERMO SCI ERIE 12-550-15 Imaging for commissure assay
Gibco Bacto Peptone  Gibco  DF0118-17-0 Nematode growth plates and RNAi
HALOCARBON OIL 700 SIGMA-ALDRICH INC H8898-50ML Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
IPTG BIOTECH 10G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP162010 Nematode growth plates and RNAi
Leica Advanced Fluorescence imaging software Leica Microsystems LAS-AF Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay
Leica Immersion type N (Oil) W NUHSBAUM INC NC9547002 Imaging for commissure assay
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR THERMO SCI ACROS ORGANICS AC187870100 Imaging for commissure assay
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242956003 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains

PETRI DISH, 60X15MM,500/CS
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC FB0875713A Nematode growth plates and RNAi
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS CORNING LIFE SCIENCES DL 87721 Nematode growth plates and RNAi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
  2. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  3. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  5. Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
  6. Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
  7. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
  8. Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
  9. Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
  10. Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
  11. Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
  12. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877 (2016).
  13. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  14. Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
  15. Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
  16. Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).
  17. Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).
  18. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  19. Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
  20. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).
  21. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  22. Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
  23. Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).
  24. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  25. Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
  26. O'Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
  27. Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
  28. Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
  29. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).

Tags

ביולוגיה סוגיה 158 ניוון שכליות ALS מחלת הנטינגטון C9orf72 פרוטאוטוקסיניטי חזרה על הפרעות התרחבות
מדידת רעילות ב <em>-C. אלגיה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N.,More

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans. J. Vis. Exp. (158), e61024, doi:10.3791/61024 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter