Summary
Dieser Artikel stellt eine effiziente Methode zur Durchführung von Myokard-Ischämie und anschließender chronischer Reperfusion bei Ratten mit einem minimal-invasiven Ansatz dar. Darüber hinaus wird die linksventrikuläre hämodynamische Funktion von Ratten durch Echokardiographie und isolierte Arbeitsherzmethoden beurteilt.
Abstract
Der Myokardinfarkt (MI) ist nach wie vor der Hauptverursacher von Morbidität und Mortalität weltweit. Daher ist die Forschung zu diesem Thema obligatorisch. Ein leichtes und hochreproduzierbares MI-Induktionsverfahren ist erforderlich, um weitere Erkenntnisse und ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden pathologischen Veränderungen zu erhalten. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um die Wirkung oder Wirksamkeit neuer und vielversprechender Behandlungen (als Medikamente oder Interventionen) bei akutem MI, anschließender Umgestaltung und Herzinsuffizienz (HF) zu bewerten. Nach intubation und präoperativer Vorbereitung des Tieres wurde ein Anästhetikum mit Isofluran durchgeführt und der chirurgische Eingriff wurde schnell durchgeführt. Mit einem minimalinvasiven Ansatz wurde die linke vordere absteigende Arterie (LAD) von einer Ligatur lokalisiert und versperrt. Die Okklusion kann bei nachfolgender Reperfusion akut durchgeführt werden (Ischämie/Reperfusionsverletzung). Alternativ kann das Schiff dauerhaft geligat werden, um die Entwicklung von chronischem MI, Umbau oder HF zu untersuchen. Trotz gemeinsamer Fallstricke sind die Abbrecherquoten minimal. Verschiedene Behandlungen wie die ferne ischämische Konditionierung können auf ihr kardioprotektives Potenzial vor-, peri- und postoperativ untersucht werden. Die postoperative Genesung war schnell, da die Anästhesie genau kontrolliert wurde und die Dauer der Operation kurz war. Postoperative Analgesie wurde drei Tage lang verabreicht. Das minimalinvasive Verfahren reduziert das Infektions- und Entzündungsrisiko. Darüber hinaus erleichtert es eine schnelle Erholung. Die "Arbeitsherz"-Messungen wurden ex vivo durchgeführt und ermöglichten eine präzise Steuerung von Vorspannung, Nachlast und Durchfluss. Dieses Verfahren erfordert spezielle Ausrüstung und Schulungen für eine angemessene Leistung. Dieses Manuskript bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Einführung für die Durchführung dieser Messungen.
Introduction
Obwohl die Inzidenz kontinuierlich abnimmt, ist akuter Myokardinfarkt (MI) immer noch der Hauptverursacher von Morbidität und Mortalität weltweit1. Es gibt Einschränkungen bei der Bewertung der Wirksamkeit potenzieller Behandlungen als Medikamente oder chirurgische Verfahren, die akutes MI verhindern und behandeln. Bevor ihre Wirkungen beim Menschen untersucht werden können, müssen diese Behandlungen im Voraus auf Risiken getestet werden, einschließlich In-vivo-Untersuchungen an Tieren. Es gibt keine bessere Gelegenheit, eine Pathologie zu studieren als unter in vivo Bedingungen. Daher ermöglicht die MI-Induktion bei Ratten oder Mäusen und sogar großen Tiermodellen (Schweine oder Schafe) die Untersuchung von kurz-(akuten) und langfristigen (chronischen) Veränderungen aufgrund von Ischämie in den Herzkranzgefäßen und dem umgebenden Myokard sowie systemischen Veränderungen aufgrund einer eingeschränkten Herzfunktion. Infarktgröße war früher das Hauptziel, aber in jüngerer Zeit sind nachfolgende Herzumbauprozesse bei akutem MI oder Ischämie/Reperfusionsverletzungen sowie bei aufeinander folgender Herzinsuffizienz (HF) von großem Interesse geworden. Daher ist eine vergleichbare und leicht reproduzierbare Methode erforderlich, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
Während die Verwendung von Kryo-Ablation, um MI zu gewinnen,2berichtet wurde, baut unsere Methode auf anderen Studien auf, in denen Die Forscher die linke vordere absteigende Arterie (LAD) durch eine einzige Stichligation verschließen. Im Vergleich zu (Hemi-)Sternotomie-Verfahren ermöglicht der minimalinvasive Ansatz, der in diesem Artikel vorgestellt wird, eine schnellere postoperative Genesung und reduziert die Betriebszeit deutlich. Ein häufiger Schritt anderer chirurgischer Eingriffe ist das Abheben des Herzens aus dem Thorax, um den Herzstich3durchzuführen. Der Ansatz dieser Methode macht diesen Schritt überflüssig. Je nach Protokoll können zwei verschiedene Verfahren durchgeführt werden: eine temporäre Okklusion mit einem Tourniquet, um Ischämie/Reperfusion über einen definierten Zeitraum zu induzieren; oder eine dauerhafte Okklusion der Arterie durch Fixierung der Ligatur. Der Erfolg der Okklusion kann mit dem Elektrokardiogramm (EKG) und den makroskopischen Veränderungen im linken Ventrikel (LV) sowie dessen Verblüben bewertet werden.
Ein weiterer wichtiger Schritt vor der Operation ist die Intubation. Während in den meisten Fällen die Intubation über Tracheotomie oder durch orale Insertion der Röhre unter Demsicht durch einen Hautschnitt am Hals durchgeführt wird, beschreibt dieses Protokoll die endotracheale Intubation des anästhesierten Tieres, die Atembeschwerden oder Infektionen postoperativ reduziert4,5. Um postoperative Komplikationen zu vermeiden, wird die Luft aus dem Thorax über eine Spritze entfernt, bevor die Brust geschlossen wird.
Die zweite Aufgabe dieses Artikels ist die Bewertung der hämodynamischen Funktion über ein isoliertes Arbeitsherz-Experimentalmodell, wie es in anderen Projekten innerhalb unseres Instituts6,7verwendet wird. Während Echokardiographie, Kardiale Magnetresonanztomographie (MRT) und invasive Quantifizierung von Druck-Volumen-Schleifen bekannte und weit verbreitete Methoden zur Beurteilung der Herzfunktion in vivo sind, sind sie bekannt, einige Einschränkungen zu haben. Invasive Ansätze, wie z. B. die Verwendung von Kathetern zur Untersuchung der globalen Funktion oder spezifischer Parameter des Herzens, werden häufig verwendet und stellen den Goldstandard von Herzmessungen dar. Im Gegensatz dazu wird der ex vivo arbeitende Herzapparat aufgrund seiner Komplexität und Kosten nur selten verwendet. Es gibt viele wichtige Aspekte, von der Mischung der Perfusate bis zur angemessenen Cannulation des Herzens, die für eine erfolgreiche Bewertung entscheidend sind. Der isolierte Arbeitsherzapparat wurde erstmals 18978 von Oskar Langendorff beschrieben und in den letzten Jahrzehnten umgebaut9. Heute kommen zwei Modelle zum Einsatz: der Langendorff (LD) Modus und der Working Heart (WH) Modus. In unserer Studie wird der LD-Modus verwendet, um das Herz an seine neue Umgebung zu akklimatisieren (ca. 15 min). In diesem Modus wird das Herz über die Aorta kanüliert und die Herzkranzgefäße werden anterogradely durchblutet, wodurch das Myokard ausreichend versorgt wird. Im LD-Modus führt das Herz keine Druckvolumenarbeit durch. Im WH-Modus hingegen wird das linke Atrium über eine Lungenvene kanüliert, durch die die Perfusate in das linke Atrium eintritt. Das Herz pumpt diese Perfusate dann physiologisch gegen eine vordefinierte Nachlast. Durch die Erhöhung der Nachlast im Laufe der Zeit kann die Herzfunktion kontinuierlich gemessen werden. Parameter wie Koronarfluss, Herzleistung (CO), Hubvolumen (SV) und Arbeit, Vorhoffluss und LV-Systol- und Diastolische Drücke können gemessen werden. Die Auswirkungen verschiedener Behandlungen direkt und ausschließlich auf das Herz können untersucht werden6,10. Ein Review von Liao und Podesser9 zeigte die weit verbreitete Anwendung dieser Methode bei der Bewertung pharmakologischer Wirkungen auf die Herzfunktion und den Stoffwechsel sowie bei der Erforschung verschiedener Krankheiten wie MI, HF, Adipositas und Diabetes.
Zusammenfassend stellt dieses Protokoll eine reproduzierbare Methode zur Durchführung von MI- oder Myokard-Ischämie/Reperfusion (MIR)-Verletzung in vivo dar. Darüber hinaus ermöglicht es die Charakterisierung der LV (Dys-)Funktion auf einem isolierten Rattenherz nach MI. Dieses Protokoll stellt eine einzigartige Kombination von Behandlung und Analyse dar.
Protocol
Das Versuchsprotokoll, das die in diesem Artikel beschriebenen Ergebnisse lieferte, wurde von der regionalen Ethikkommission für Labortierexperimente der Medizinischen Universität Wien und dem Bundesministerium für Bildung, Wissenschaft und Forschung (BMWFW-66.009/0023-WF/V/3b/2016) genehmigt. Alle Experimente entsprechen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, veröffentlicht von den US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revidiert 1996).
HINWEIS: Es werden 10 bis 12 Wochen alte männliche Sprague Dawley Ratten mit einem Körpergewicht von 250 bis 300 g (BW) verwendet. Da die folgenden Verfahren und Behandlungen in einer sterilen Umgebung eines Operationssaals (OR) durchgeführt werden, tragen Sie Peelings, Handschuhe, Gesichtsmasken und Kapuzen beim Umgang mit Tieren. Stellen Sie vor dem Betreten des ODER sicher, dass die Hände gewaschen und desinfiziert werden. Wenn die Absicht ist, an mehreren Tieren in einer chirurgischen Sitzung zu operieren, entweder waschen und desinfizieren, oder Autoklav die Instrumente zwischen den Operationen. Diese Hygienerichtlinien gelten für alle im Protokollabschnitt dargestellten Verfahren.
1. Präoperative Präparation und Anästhesie
- Initiieren Sie eine präoperative Anästhesie, indem Sie eine Mischung aus Xylazin (4 mg/kg BW) und Ketamin (100 mg/kg BW) intraperitoneal injizieren.
- Intubieren Sie die Ratten mit einem 14 G-Rohr und einer volumengesteuerten Belüftung mit einer Mischung ausO2,Luft und Isofluran (1 x 2,5 %) mit 75 x 85 Hühanschlägen/min, 100 ml/Hub/BW (Abbildung 1A). Bei Bedarf für eine bessere Sicht beim Intubieren: Xylocain über eine Wattespitze auf den unteren Rachen auftragen, um lokale Entspannung zu erreichen.
- Legen Sie die Ratten auf einen beheizten Operationstisch in eine Supine-Position und fixieren Sie die Vorderbeine mit Klebeband (Abbildung 1B).
- Messen Sie die Rektaltemperatur mit einer Sonde.
HINWEIS: Es sollte zwischen 37,5 bis 38,5 °C gehalten werden. - Rasieren Sie den Thorax und reinigen Sie den Operationsbereich mit antiseptischer Povidon-Jodlösung. Tragen Sie die Augensalbe auf die Ratte auf, um das Trocknen der Augen zu verhindern.
- Verabreichen Sie intraoperative Analgesie durch Intraperitonalinjektion von Piritramid (0,1 ml/kg BW).
- Legen Sie EKG-Sonden subkutan in die Extremitäten des Tieres.
- Überprüfen Sie die Schwanz- und Zehenreflexe, bevor Sie den chirurgischen Eingriff einleiten.
2. Chirurgischer Eingriff zur Induktion der Myokardischämie
- Führen Sie den Hautschnitt mit einem Skalpell durch. Achten Sie darauf, 2 mm parasternal auf dem linken Thorax auf der Ebene des 3. interkostalen Raumes zu starten und fahren Sie mit der vorderen Achsellinie auf der Ebene des 5. interkostalen Raumes fort (Abbildung 1C).
- Ersetzen Sie die oberflächlichen Muskeln sanft, um die Rippen sichtbar zu machen (Abbildung 1D).
- Bei leichten Blutungen verwenden Sie einen Kauter, um das umgebende Gewebe auszulöschen oder zu trennen.
- Führen Sie die Thorakotomie auf der Ebene des 4. interkostalen Raumes durch und setzen Sie einen Retraktor ein, um die Sichtbarkeit des Herzens und der Lunge zu gewinnen (Abbildung 1E). Öffnen Sie die Pleura vorsichtig, um Blutungen zu vermeiden.
- Vorübergehende Sokkludieren der LAD mit einem Tourniquet, um Ischämie/Reperfusion (MIR) über eine definierte Zeit zu induzieren; oder dauerhaft (MI) schließen Sie es, indem Sie 6-7 Knoten mit einer 6-0 Naht machen, um die Ligation zu schließen (Abbildung 1F,G).
HINWEIS: Die rechte Stelle für die Okklusion des LAD befindet sich etwa 2 x 3 mm unter der linken Ohrmuschel am ventralen/linken seitenrand des Herzens. Erfolgreiche Okklusion ist mit EKG-Änderungen (ST-Segment-Höhe) und makroskopischen Veränderungen im LV als Blass verbunden. - Im Falle des Ischämie/Reperfusionsmodells öffnen Sie den LAD durch Entfernen des Tourniquets nach 30 min Okklusion wieder.
- Schließen Sie den Thorax mit drei Single-Button-Nähten mit einer 4-0 Single-Monofilament-Nähte (Abbildung 1H). Vor dem Anziehen der letzten Naht, entfernen Sie restliche Luft aus dem Thorax mit einer 10 ml Spritze, um eine Pneumothorax zu verhindern (Abbildung 1I).
- Positionieren Sie die Muskeln neu und schalten Sie die flüchtige Anästhesie aus.
- Naht die Haut mit einer kontinuierlichen Naht mit einer 4-0 Naht (Abbildung 1J).
- Verabreichen Sie ein antiseptisches Spray, um vor Infektionen und Beißen der Naht durch Ratten zu schützen.
3. Postoperative Behandlungs- und Ausschlusskriterien
- Halten Sie die Ratten auf dem Heiztisch, bis sie aufwachen. Extubieren Sie die Ratten, sobald sie spontan zu atmen beginnen.
- Legen Sie die extubierten Ratten in einen Käfig unter einer Heizlampe, um eine Abkühlung zu verhindern.
- Bringen Sie Ratten unter standardisierten Bedingungen in die Tierhäuser zurück, wenn sie sich wieder normal verhalten.
- Fügen Sie 2 Ampullide und 30 ml 5% Glukose auf 250 ml Wasser für postoperative Analgesie für drei Tage hinzu.
- Überprüfen Sie die Eignung und das Verhalten von Ratten mit der Checkliste und Denkkriterien (Tabelle 1). Beobachten Sie die Tiere zweimal täglich für die folgende Woche, dann zweimal pro Woche.
HINWEIS: In Übereinstimmung mit internationalen Standards alle leidenden Tiere oder Tiere, die bis zu 6 Punkte in der Bewertung mit der Checkliste erhalten, an Tierärzte, um therapiebezogene Entscheidungen zu treffen. Alle Tiere, die 7 oder mehr Punkte erhalten, müssen sofort mit einer Überdosis Ketamin und Xylazin geopfert werden.
| Prüfung | Beobachtung | Ergebnis |
| Körpergewicht | Stabil | 0 |
| 10% Verlust | 4 | |
| 15% Verlust für 48 h | 7 | |
| 18% Verlust | 7 | |
| normal (Mantel flach und glänzend) | 0 | |
| Äußeres Erscheinungsbild | Piloerection | 1 |
| Hämatom | 2 | |
| Hautwunden/Schnitte/Bissspuren | 2 | |
| stark reduzierte Pflege | 4 | |
| (Öffnungen unrein/geklont oder feucht) | 7 | |
| schwere Hautreizungen oder Wunden | 7 | |
| geknickte Haltung >2 h | 7 | |
| signifikante Abdominaldistension (Aszites) | 7 | |
| Verhalten | normal (schlafend, neugierig, soziale Kontakte, Reaktion, wenn berührt) | 0 |
| ungewöhnliches Verhalten, z.B. beeinträchtigte Aktivität | 2 | |
| Selbstisolierung, ausgeprägte Hyperaktivität oder Stereotypien | 4 | |
| Lethargie für <6 h | 4 | |
| Lethargie für 6 h bis 8 h | 7 | |
| apathia >8 h | 7 | |
| Stereotypia unterbrechungsfrei für >10 min. und nach 2 h immer noch bestehend | 7 | |
| Anzeichen von Schmerzen, wenn sie berührt werden | 7 | |
| Automutilation | 7 | |
| Verdauung | Normalen | 0 |
| Durchfall (weicher Kot) | 3 | |
| Durchfall für 72 h oder wässsrige | 7 | |
| blutiger Hocker | 7 |
Tabelle 1: Checkliste und Ausschlusskriterien. Diese Tabelle enthält die zu beachtenden Untersuchungen und die entsprechende Punktzahl. Dementsprechend muss die postoperative Behandlung des Tieres angepasst oder ein Tierarzt konsultiert werden.
4. Echokardiographie-Messungen
HINWEIS: Die Echokardiographie wird in der Regel zweimal durchgeführt, vor der Induktion von MI und vor der Organentnahme.
- Ratten mit einer Mischung aus Xylazin (4 mg/kg BW) und Ketamin (100 mg/kg BW) intraperitoneal injizieren.
- Legen Sie die Ratten in eine Supine-Position auf eine Heizschale. Tragen Sie Echogel auf die Brust auf, was den Ultraschallwellen hilft, besser zu reisen und Signalstörungen reduziert.
- Erhalten Sie parasternale kurze Achsenansichten der LV-Höhle auf der Ebene des Papillenmuskels.
- Führen Sie m-mode Echokardiographie durch, um linksventrikuläre Auswurffraktion und Morphologie zu messen.
5. Organernte (ohne funktionierendes Herz)
- Xylazin (4 mg/kg BW) und Ketamin (100 mg/kg BW) vor der Organernte intraperitoneal verabreichen. Stellen Sie sicher, dass die Reflexe negativ sind.
HINWEIS: Es ist keine Intubation erforderlich, da das Verfahren nicht länger als 1 min dauert. - Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Hautschnitt unter dem Xiphoid zu machen und ihn parallel zu den Rippen auf beiden Seiten mit einer Schere zu verlängern.
- Schneiden Sie die Rippen in der vorderen Achsellinie und greifen Sie das Xiphoid, um die Brust nach oben zu heben (Abbildung 2A).
- Entfernen Sie anatomische oder fibrotische Gewebeverklebungen, indem Sie das Gewebe vorsichtig mit zwei Zangenpaaren zerbrechen.
- Entnahme von Blutproben (zur Blutgasauswertung oder molekularen Analysen) aus der Vena cava inferior mit einer 5 ml Spritze.
- Führen Sie die Exzision des ganzen Herzens auf der Ein- und Auslassebene durch (Abbildung 2B). Fahren Sie ggf. mit der Beurteilung des Arbeitsherzens gemäß Abschnitt 6 fort.
- Organe ernten, in flüssigem Stickstoff schockieren und in -80 °C für weitere molekulare Analysen oder in Formaldehyd für histologische Zwecke lagern.
6. Ex-vivo-hämodynamische Messungen über ein funktionierendes Herzsystem
HINWEIS: Die allgemeine Einrichtung und die Komponenten des Geräts wurden zuvor beschrieben11. Das folgende Protokoll beschreibt den Umgang mit dem Herzen des Tieres und die notwendigen Schritte zur Bewertung der LV-Funktion.
- Anästhetisieren Sie Ratten, wie in Schritt 5.1 beschrieben und injizieren 200 Ie Heparin intravenös (femorale Vene).
- Öffnen Sie den Thorax über einen Schnitt unter dem Zahnbogen mit einem Skalpell und dehnen Ihn mit einer Schere auf beide vorderen Achsellinien aus und heben Sie das Brustbein an.
- Schneiden Sie die großen Gefäße in der Nähe ihres Auslasses oder einlassen sie ins Herz, um sie zu verbrauchen (Abbildung 2B).
- Tauchen Sie das Herz in den eiskalten Krebs-Henseleit-Puffer ein und montieren Sie es auf dem erythrozyten-perfundierten isolierten Herzsystem über die Konservena (Abbildung 3A).
- Beginnen Sie mit dem LD-Modus mit einer konstanten Nachlast von 60 mmHg (Stabilisierungsperiode).
- Wechseln Sie nach 15 min LD-Modus in den WH-Modus. Daher kann das linke Atrium über eine Lungenvene(Abbildung 3B) nulaten. Ändern Sie dann die Strömungsrichtung im System, indem Sie den Clip öffnen, der die Vorhofkanüle okkludiert. Dies führt zu einer Durchblutung des linken Atriums und einem physiologischen Blutfluss im linken Herz11.
- Zeichnen Sie hämodynamische Messungen für 20 min im WH-Modus auf.
- Sammeln Sie Bluttropfen der Herzkranzgefäße mit einer 2 ml Spritze, um den koronaren Fluss (CF, mL/min) alle 5 min zu messen.
HINWEIS: CF wird als Differenz zwischen linkem Atrialflow (LAF) und Aortenstrom (AF) gemessen. - Führen Sie kontinuierliche Messungen von LAF (entspricht Herzleistung) und AF mit einer Durchflusssonde durch.
HINWEIS: Die Sonde wird über das WH-Gerät in das LV eingeführt. Alle Daten werden kontinuierlich registriert. - Wenn das laufende Protokoll anfordert, legen Sie einen High-Fidelity-Katheter retrograd über die Aortenklappe in das LV ein und messen Sie den linken Ventrikel-Systoldruck (LVSP).
- Um die pro Minute ausgeführte Druck-Volumen-Arbeit zu bewerten, berechnen Sie das Hubvolumen als Herzleistung dividiert durch die Herzfrequenz.
- Berechnen Sie die externe Herzarbeit (EHW) nach der folgenden Formel: CO x LVSP (g x min) normalisiert auf Herzgewicht.
Representative Results
Die folgenden Ergebnisse wurden von Pilz et al.6veröffentlicht. Mit diesem präzisen chirurgischen Eingriff kann die kardioprotektive Wirkung der fernen ischämischen Perkonditionierung (RIPerc) untersucht werden. Dies ist eine mögliche neue Behandlung für Patienten mit akutem MI oder MIR und nachfolgendem ventrikulären Umbau, der in vielen Fällen zu aufeinanderfolgenden HF führt. Die Nachahmung der pathophysiologischen Veränderungen von MI/MIR ist ein obligatorischer Schritt bei der Bewertung von Behandlungen, da In-vitro- oder Ex-vivo-Studien nicht die physiologische Umgebung liefern. In diesem Protokoll wurden die Tiere 30 min LAD-Okklusion gefolgt von Reperfusion (d.h. MIR) unterzogen.
Um die Reproduzierbarkeit des Verfahrens zu beweisen, wurden histologische Schnitte und Flecken durchgeführt (Abbildung 4A). Es war klar, dass die fibrotische Narbe bei MIR+RIPerc behandelten Tieren mit der Narbenbildung der Scheintiere vergleichbar war, während der Vergleich der Fibrose zwischen Sham- und MIR-Gruppen signifikant war (Abbildung 4B). Darüber hinaus zeigten MIR+RIPerc-behandelte Tiere eine signifikant reduzierte Fibrose im Vergleich zu MIR-behandelten Tieren. Die repräsentativen histologischen Bilder verdeutlichen jedoch die Wirksamkeit dieses chirurgischen Eingriffs, da der Infarkt explizit in der MIR-Gruppe aufrechterhalten wird (Abbildung 4A). Mit In-vivo-Echographie, Auswurffraktion, LV-Enddiastolund und End-Systol-Durchmesser (LVEDD und LVESD) wurden Messungen gemessen und zeigten eine signifikant reduzierte Herzfunktion aufgrund der MIR-Behandlung, während hämodynamische Parameter durch RIPerc erhalten wurden (Abbildung 4CF). Ex-vivo-Hämodynamische Daten zeigten die Wirksamkeit des Verfahrens, da die MIR-Gruppe signifikante Abnahmen von LVSP, Herzleistung (CO), Schlaganfallvolumen (SV) sowie externer Herzarbeit (EHW) aufwies (Abbildung 5A-G).
Eine Literaturrecherche über diesen chirurgischen Eingriff berichtete keine negativen oder unbefriedigenden Kommentare und Ergebnisse, wenn es angemessen durchgeführt wurde. Dennoch müssen die in der Einleitung und der Diskussion erwähnten Fallstricke vermieden werden, und die Ausbildung ist obligatorisch, um ein stabiles Leistungsniveau zu erreichen und vergleichbare Ergebnisse zu erzielen.
Abbildung 1: Präoperative Vorbereitung und chirurgischer Eingriff. (A) Intubation des Tieres mit einem 14 G Rohr. (B) Supine Positionierung und Desinfektion des Operationsfeldes. (C) Hauteinschnitt (2 mm parasternal auf dem linken Thorax auf Höhe des 3. interkostalen Raumes). Der Schnitt muss die vordere Achsellinie auf Höhe des 5. interkostalen Raumes erreichen. (D) Verdrängen Sie die Muskeln, um die Rippen sichtbar zu machen. (E) Öffnen des Thorax. (F) Permanente Okklusion von LAD mit 6-7 Knoten. (G) Transienter Verschluss von LAD mit einem Tourniquet. (H) Verschluss der Brust nach myokardialer Ischämie und Reperfusion durch Platzieren von drei Einknotennähten um die Rippen. (I) Richtiges Schließen des Thorax. Verwenden Sie eine 10 ml Spritze, um Restluft aus dem Thorax zu entfernen, bevor Sie den letzten Knoten fest fixieren. Dies ist integraler Bestandteil, um einen Pneumothorax zu verhindern. (J) Hautnaht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Organernte. (A) Öffnen Sie die Brust mit subxiphoidalen Schnitten und verlängern Sie sie auf beide mittleren Achsellinien. Weitere Schnitte durch die Rippen werden durchgeführt, um das Heben des Brustbeins zu erleichtern. (B) Exzision des Herzens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Isolierter Herzapparat. (A) Langendorff-Modus. Das Herz wird über die Cannulation der Aorta am WH-Gerät montiert. (B) Arbeitsherz-Modus. Das System kann auf das WH-Modell umgeschaltet werden, um die Herzfunktion durch Cannulating des linken Atriums zu bewerten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Wirkung der fernen ischämischen Konditionierung auf die Narbenbildung, die linksventrikuläre Funktion und den Umbau. (A) Histologische LV-Scheiben, die am Tag 14 nach der myokardischen Reperfusion geerntet werden. (B) Quantifizierte Ergebnisse der Fibrose in Stabdiagrammen. (C) Repräsentative M-Mode-Echokardiogramme. (D) Auswurffraktion (EF) quantifiziert in Balkendiagrammen. (E) LV-Endsystoldurchmesser (LVESD) in Balkendiagrammen quantifiziert. (F) LV Enddiastolischer Durchmesser (LVEDD) quantifiziert in Balkendiagrammen. MIR, Myokard-Ischämie-Reperfusion; RIPerc, remote ischämische Perkonditionierung. Die Daten werden als Mittelwert ausgedrückt. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Nachdruck von Pilz et al.6 mit Genehmigung von Elsevier. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Wirkung von RIPerc auf die hämodynamische Funktion von LV. (A) LV-Systolischer Druck (LVSP), (B) Herzleistung (CO) und (C) Hubvolumen (SV) Ergebnisse wurden aus dem isolierten Arbeitsherz am Tag 14 nach der Myokardreperfusion erzielt. (D) CO wird als Funktion der Nachlast dargestellt; (F) externe Herzarbeit als Funktion der Nachlast, quantifizierte Ergebnisse in Balkendiagramm (E und G). Die Daten werden als Mittelwert -SEM und n = 4–7 pro Gruppe ausgedrückt. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. MIR, Myokardischämie/Reperfusion; RIPerc, remotee ischämische Vorbedingungen; EHW, externe Herzarbeit; SV, Hubvolumen; AUC, Bereich unter der Kurve. Nachdruck von Pilz et al.6 mit Genehmigung von Elsevier. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Die negative Umgestaltung nach dem MI gilt als Schlüsselmechanismus bei der Entwicklung von Herzinsuffizienz. Um die Kontinuität der kardiovaskulären Forschung zu gewährleisten, sollten daher experimentelle Verfahren und Techniken reproduzierbar sein. Ein verständliches und klar definiertes Versuchsprotokoll ist ein grundlegendes Element der Reproduzierbarkeit. Reproduzierbarkeit bezieht sich auf Ergebnisse, die von mehreren Wissenschaftlern wiederholt und im Labor validiert werden. Diese Studie zielte darauf ab, eine semi-minimal-invasive Methode zu präsentieren, um chronische oder re-perfundierte MI zu induzieren und die kardiale hämodynamische Funktion bei Ratten zu bewerten.
Diese Ergebnisse und weitere veröffentlichte Daten zeigen die hohe Wirksamkeit dieser chirurgischen Methode und ihre Bedeutung in der Forschung an MI, Remodeling und HF. Während Ischämie/Reperfusionsverletzungen verwendet werden können, um die Veränderungen im MI mit anschließender Reperfusion zu verstehen, ermöglicht die permanente Okklusion ein besseres Verständnis der kurz- und langfristigen Umbauprozesse des Myokards. Andere chirurgische Ansätze verursachen mehr Gewebeschäden und Tiere weisen ein höheres Risiko für infektionen und Pneumothorax auf, was zu höheren Abbrecherquoten führt. Im Gegensatz dazu zielt dieses Verfahren darauf ab, die Sterblichkeit durch spezifische Verbesserungen in der Einrichtung und Handhabung zu senken. Darüber hinaus zeigen sie Variationen in der fibrotischen Narbenausdehnung aufgrund instabiler LAD-Okklusion.
Unser Protokoll bietet eine einfache Methode für die Intubation, die einer der kritischsten Schritte des gesamten Verfahrens ist. Im Gegensatz zu einigen anderen Publikationen12wird die Tracheotomie in unserem Verfahren nicht durchgeführt. Dies verbessert das Erwachen und die Rehabilitation der Tiere postoperativ, was zur Entwicklung der pathophysiologischen Veränderungen führt, die durch diesen chirurgischen Eingriff beabsichtigt sind, bevor die Tiere postoperativen Messungen unterzogen werden. Offensichtlich, wenn es ein Nicht-Überlebensprotokoll ist, wird tracheotomy unter Sicht durchgeführt und ist daher einfacher durchzuführen. Darüber hinaus ist das Schließen der Tracheotomie in einem Überlebensprotokoll nicht anwendbar. Wenn der Thorax geöffnet wird, ist es obligatorisch, die Lunge zu belüften, um einen Kollaps zu verhindern. Daher werden die Ratten vor dem chirurgischen Eingriff intubiert. Der minimalinvasive Ansatz schneidet weder die Rippen noch das Brustbein, wodurch die Kompaktheit und Stabilität des Thorax erhalten bleibt. Folglich wird die Erholung der Tiere verbessert, und das Risiko einer spontanen Pneumothorax oder Blutung ist relativ gering.
Wie bereits erwähnt, während die Intubation von klarem Vorteil ist, ist es schwierig durchzuführen und kann zu Beginn der Experimente zu einer höheren Abbrecherrate führen. Dieses Problem kann durch Training und etwas anatomisches Wissen gemildert werden. Es ist wichtig, das Rohr im rechten Winkel einzufügen und den Körper des Tieres so lange zu dehnen, bis das Licht durch die Stimmlippen scheint, nach dem das Rohr sanft nach vorne geschoben werden kann. Achten Sie darauf, die Stimmlippen nicht zu schädigen, da dies Schwellungen, nachfolgende Okklusion der Glottis und Erstickung verursachen kann.
Wichtig ist auch, dass der LAD korrekt geligat wird. Das kleine operationschirurgische Fenster, das schnell schlagende Herz und die belüftete Lunge (vermeiden Sie es so weit wie möglich zu berühren, da jeder Kontakt zu Blutungen in der Lunge führen kann) machen das Gefäß nicht deutlich sichtbar. Daher ist anatomisches Wissen unverzichtbar. Die linke Aurikel ist unentbehrlich, um sowohl den gefährdeten Bereich zu standardisieren als auch die Ligation um den LAD zu positionieren. Der Stich muss intramural und nicht transmural im LV durchgeführt werden, da dies zu einer Verringerung des LV-Kammerdurchmessers und des Volumens führen kann, was nicht auf die pathologischen Prozesse zurückzuführen ist. Erfolgreiche Okklusion ist mit Zyanose des gefährdeten Myokardbereichs und Der Erhöhung des ST-Segments auf EKG verbunden. Die Hauptbeschränkung dieses Verfahrens ist die korrekte Positionierung der Naht. Um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen, müssen die Stiche auf dem gleichen Niveau sein und ähnliche Mengen an Gewebe verwenden. Dies erfordert ein hohes Maß an Ausbildung und die unterschiedlichen Gewichte der Tiere müssen berücksichtigt werden. Ein weiterer zu berücksichtigender Punkt ist die angemessene Entfernung des Pneumothorax vor der Schließung des interkostalen Raumes. Wenn dies nicht genau durchgeführt wird, werden die Tiere Schwierigkeiten beim Atmen aufweisen, da die Inflation der linken Lunge durch einen Pneumothorax behindert wird. Wie bereits erwähnt, kann dies durch die Verwendung einer Spritze gemildert werden, um Restluft aus dem Thorax zu entfernen.
Derzeit ist dieses MI-Verfahren eine häufig verwendete Methode, die vergleichbare Ergebnisse und eine hohe Überlebensrate garantiert, wenn die kritischen Schritte mit hoher Präzision durchgeführt werden. Zukünftige Projekte zu verschiedenen Behandlungen, Geräten oder Medikamenten in MI, HF oder Herzumbau können mit dieser minimalinvasiven Technik bewertet werden.
Die WH-Messungen werden, wie bereits erwähnt, nicht häufig verwendet, da ihre Wartung und Handhabung spezifische Ausrüstung und Wissen erfordert. Um repräsentative und vergleichbare Daten zu erhalten, müssen Fallstricke vermieden werden. Die wichtigsten Schritte sind die Montage des Herzens und der Wechsel vom D-Modell in den WH-Modus. Wenn das Herz nicht ausreichend ausgeschnitten wird, kann die Montage schwierig sein, da eine ausreichende Aortengewebelänge erforderlich ist, um das Herz am Gerät zu fixieren. Bald nach der Verbindung mit dem LD-Modus kann die Herzfrequenz aufgrund des Waschens im Kalten Puffer, der Trennung seiner physiologischen Reize im Körper oder der Reperfusion mit Blut von einer anderen Spezies durch das Gerät abnehmen. In solchen Fällen muss ein Herzschrittmacher angewendet werden, um die physiologische Frequenz wiederherzustellen und zu erhalten. Dies gewährleistet vergleichbare Ergebnisse bei allen Tieren. Da das Blutvolumen innerhalb des Geräts ein Vielfaches des physiologischen Volumens bei Ratten ist, werden rinderrote Blutkörperchen in einer Krebs-Henseleit-Puffersuspension verwendet.
Der Wechsel vom LD-Modus in den WH-Modus ist gleichbedeutend mit einem Wechsel von passiver zu aktiver Herzarbeit. Der LD-Modus wird verwendet, um das Herz an seine neue Umgebung zu gewöhnen. Im WH-Modus muss das Herz seine physiologischen Auswurffunktionen ausführen. Daher ist vor der Bewertung eine kurze Anpassungsphase an die neuen Gegebenheiten durch Erhöhung der Nachlast erforderlich.
Ein weiterer kritischer Schritt, der allgemein vergessen wird, ist die angemessene Vorbereitung und Wartung des Geräts und des Perfusaten. Das genaue Volumen jeder Verbindung muss gemischt und die Temperatur innerhalb des Systems gesteuert und eingestellt werden. Dennoch ist das WH eine elegante Methode zur gleichzeitigen Beurteilung von Herzleistung, Schlaganfallvolumen, linksventrikulärem systolischem Druck und koronaren Fluss.
Dieses hochreproduzierbare Verfahren zur Induziert von MI und die vom WH-Gerät erfassten repräsentativen Daten beweisen ihre Fähigkeiten selbst. Der semi-minimalinvasive Ansatz, der Grad der LAD-Okklusion und Intubationsmethode ermöglichen eine schnelle Genesung und geringe Variabilität in Derinfarktgröße. Darüber hinaus liefert die Herzfunktionsanalyse in isolierten Arbeitsherzen wertvolle hämodynamische Ergebnisse.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem Operationstheater-Team und Technikern des Zentrums für Biomedizinische Forschung für ihren Beitrag, ihre technische Hilfe, ihren wertvollen Input und ihre Beratung. Die Projekte werden vom Ludwig Boltzmann Institut, Cluster for Cardiovascular Research (REM-Projekt) gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
| Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
| Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
| Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
| INTUBATION | |||
| Air | |||
| Oxygen (pure) | |||
| Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
| 14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
| PREPARATION | |||
| Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
| Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
| Shaver | |||
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
| Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
| Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
| Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
| Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
| Mensur | MTI | 29-260/25 | |
| Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
| Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
| Needleholder thin | Martin | ||
| Round hook | BT-190 | ||
| Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
| Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
| Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
| Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
| Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
| Surgical scissors | |||
| SUTURES | |||
| PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
| Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
| Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
| COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
| PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
| EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
| Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
| Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
| Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
| Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
| Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
| PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |
References
- WHO. Global Health Estimates 2015: Deaths by Cause, Age, Sex, by Country and by Region, 2000-2015. World Health Organization. , (2016).
- Jaquet, K., et al. Reduction of myocardial scar size after implantation of mesenchymal stem cells in rats: what is the mechanism. Stem Cells and Development. 14 (3), 299-309 (2005).
- Liu, P., Xu, B., Cavalieri, T. A., Hock, C. E. Age-related difference in myocardial function and inflammation in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion. Cardiovascular Research. 56 (3), 443-453 (2002).
- Kolk, M. V. V., et al. LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments. (32), e1438 (2009).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery. Journal of Visualized Experiments. (150), e59591 (2019).
- Pilz, P. M., et al. Remote ischemic perconditioning attenuates adverse cardiac remodeling and preserves left ventricular function in a rat model of reperfused myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 285, 72-79 (2019).
- Santer, D., et al. In vivo and ex vivo functional characterization of left ventricular remodelling after myocardial infarction in mice. ESC Heart Failure. 2 (3), 171-177 (2015).
- Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugetierherzen II. Über den Einfluss von Wärme und Kälte auf das Herz der warmblütigen Tiere. Pflügers Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 66 (67-68), 355-400 (1897).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
- Podesser, B. K., et al. The erythrocyte-perfused "working heart" model: hemodynamic and metabolic performance in comparison to crystalloid perfused hearts. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 9-15 (1999).
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