Summary
Este artigo apresenta um método eficiente para realizar isquemia miocárdica e subsequente reperfusão crônica em ratos usando uma abordagem minimamente invasiva. Além disso, a função hemodinâmica ventricular esquerda dos ratos é avaliada por ecocardiografia e métodos cardíacos de trabalho isolados.
Abstract
O infarto do miocárdio (MI) continua sendo o principal contribuinte para a morbidade e mortalidade em todo o mundo. Portanto, a pesquisa sobre o tema é obrigatória. Um procedimento de indução MI fácil e altamente reprodutível é necessário para obter mais informações e melhor compreensão das mudanças patológicas subjacentes. Este procedimento também pode ser usado para avaliar os efeitos ou potência de tratamentos novos e promissores (como drogas ou intervenções) em MI agudo, remodelagem subsequente e insuficiência cardíaca (HF). Após a intubação e preparação pré-operatória do animal, foi realizado um protocolo anestésico com isoflurano, e o procedimento cirúrgico foi realizado rapidamente. Utilizando uma abordagem minimamente invasiva, a artéria descendente anterior esquerda (LAD) foi localizada e ocluída por uma ligadura. A oclusão pode ser realizada agudamente para posterior reperfusão (isquemia/lesão por reperfusão). Alternativamente, o navio pode ser ligado permanentemente para investigar o desenvolvimento de MI crônico, remodelagem ou HF. Apesar das armadilhas comuns, as taxas de abandono são mínimas. Vários tratamentos, como o condicionamento isquêmico remoto, podem ser examinados para seu potencial cardioprotetor pré, peri e pós-operatório. A recuperação pós-operatória foi rápida, pois a anestesia era precisamente controlada e a duração da operação era curta. A analgesia pós-operatória foi administrada por três dias. O procedimento minimamente invasivo reduz o risco de infecção e inflamação. Além disso, facilita a recuperação rápida. As medições de "coração de trabalho" foram realizadas ex vivo e permitiram o controle preciso da pré-carga, pós-carga e fluxo. Este procedimento requer equipamentos específicos e treinamento para o desempenho adequado. Este manuscrito fornece uma introdução detalhada passo a passo para a realização dessas medições.
Introduction
Embora a incidência esteja continuamente diminuindo, o infarto agudo do miocárdio (MI) ainda é o principal contribuinte para a morbidade e mortalidade em todo o mundo1. Há restrições na avaliação da eficácia de tratamentos potenciais como medicamentos ou procedimentos cirúrgicos que previnem e tratem MI aguda. Antes que seus efeitos possam ser examinados em humanos, esses tratamentos devem ser testados para riscos com antecedência, incluindo exames in vivo em animais. Não há melhor oportunidade de estudar uma patologia do que em condições in vivo. Portanto, a indução de MI em ratos ou camundongos e até mesmo grandes modelos animais (suínos ou ovinos) permite a investigação de alterações de curto (agudo) e longo prazo (crônicas) devido à isquemia nas artérias coronárias e no miocárdio circundante, bem como alterações sistêmicas devido à função cardíaca prejudicada. O tamanho do infarto era anteriormente o principal objetivo, mas mais recentemente os processos subsequentes de remodelagem cardíaca em lesão aguda de MI ou isquemia/reperfusão, bem como em insuficiência cardíaca consecutiva (HF) tornaram-se de grande interesse. Portanto, é necessário um método comparável e facilmente reprodutível para alcançar resultados consistentes.
Embora o uso da crio-ablação para ganhar MI tenha sido relatado2, nosso método se baseia em outros estudos nos quais os investigadores ocluem a artéria descendente anterior esquerda (LAD) por uma única ligadura de ponto. Em comparação com os procedimentos (hemi-)sternotomia, a abordagem minimamente invasiva que será apresentada neste artigo, permite uma recuperação pós-operatória mais rápida e reduz significativamente o tempo de operação. Um passo comum de outros procedimentos cirúrgicos é a elevação do coração do tórax para realizar o ponto cardíaco3. A abordagem deste método torna este passo desnecessário. Dependendo do protocolo, dois procedimentos diferentes podem ser realizados: uma oclusão temporária usando um torniquete para induzir isquemia/reperfusão ao longo de um tempo definido; ou uma oclusão permanente da artéria fixando a ligadura. O sucesso da oclusão pode ser avaliado com eletrocardiograma (ECG) e as alterações macroscópicas no ventrículo esquerdo (LV), bem como sua paling.
Outro passo importante antes da cirurgia é a intubação. Enquanto na maioria dos casos, a intubação é realizada via traqueotomia ou por inserção oral do tubo sob visão por uma incisão cutânea na garganta, este protocolo descreve a intubação endotraqueal do animal anestesiado que reduz dificuldades respiratórias ou infecções pós-operatóriamente4,,5. Para evitar complicações pós-operatórias, o ar é removido do tórax através de uma seringa antes de fechar o peito.
A segunda tarefa deste artigo é a avaliação da função hemodinâmica por meio de um modelo experimental de coração de trabalho isolado, como ele é utilizado em outros projetos dentro do nosso instituto6,7. Embora a ecocardiografia, a ressonância magnética cardíaca (RM) e a quantificação invasiva de laços de volume de pressão sejam métodos bem conhecidos e amplamente utilizados para avaliar a função cardíaca in vivo, eles são conhecidos por terem algumas limitações. Abordagens invasivas, como o uso de cateteres para examinar a função global ou parâmetros específicos do coração, são comumente utilizadas e representam o padrão ouro das medidas cardíacas. Em contraste, o aparelho ex vivo working heart raramente é usado devido à sua complexidade e custo. Há muitos aspectos importantes, desde a mistura do perfusato até a canulação adequada do coração, que são cruciais para uma avaliação bem sucedida. O aparelho cardíaco de trabalho isolado foi descrito pela primeira vez por Oskar Langendorff em 18978 e foi modificado ao longo das últimas décadas9. Hoje, existem dois modelos utilizados: o modo Langendorff (LD) e o modo coração de trabalho (WH). Em nosso estudo, o modo LD é usado para aclimatar o coração ao seu novo ambiente (cerca de 15 min). Neste modo, o coração é cânulado através da aorta e as artérias coronárias são perfumadas anterogradely, fornecendo adequadamente o miocárdio. No modo LD, o coração não está realizando nenhum trabalho de volume de pressão. Em contraste, no modo WH, o átrio esquerdo é cânulado através de uma veia pulmonar, através da qual o perfusado entra no átrio esquerdo. O coração então bombeia este perfusato fisiologicamente contra uma carga pós-definida. Ao aumentar a carga posterior ao longo do tempo, a função cardíaca pode ser medida continuamente. Podem ser medidos parâmetros como fluxo coronário, saída cardíaca (CO), volume de avc (SV) e trabalho, fluxo atrial e pressões sistólicas e diastólicas de LV. O impacto de vários tratamentos direta e exclusivamente no coração pode ser investigado6,10. Uma revisão de Liao e Podesser9 apresentou o uso generalizado desse método na avaliação de efeitos farmacológicos sobre a função cardíaca e o metabolismo, bem como na exploração de diversas doenças como MI, HF, obesidade e diabetes.
Em resumo, este protocolo apresenta um método reprodutível para realizar lesões mi ou isquemia miocárdica/reperfusão (MIR) in vivo. Além disso, permite a caracterização da função LV (dis-)em um coração de rato isolado após MI. Este protocolo apresenta uma combinação única de tratamento e análise.
Protocol
O protocolo experimental que entregou os resultados descritos neste artigo foi aprovado pelo Comitê regional de Ética para Experimentos De Animais Laboratoriais da Universidade Médica de Viena e pelo Ministério federal austríaco da Educação, Ciência e Pesquisa (BMWFW-66.009/0023-WF/V/3b/2016). Todos os experimentos estão em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (Publicação NIH nº 85-23, revisado em 1996).
NOTA: São utilizados ratos de 10-12 semanas de idade, sprague Dawley de 250-300 g de peso corporal (BW). Como os seguintes procedimentos e tratamentos são realizados em ambiente estéril de uma sala de cirurgia (OR), use esfregões, luvas, máscaras faciais e capuzes ao manusear animais. Antes de entrar na sala de cirurgia, certifique-se de que as mãos sejam lavadas e desinfetadas. Se a intenção é operar em vários animais em uma sessão cirúrgica, lavar e desinfetar, ou autoclave os instrumentos entre as operações. Essas diretrizes higiênicas são válidas para todos os procedimentos apresentados na seção de protocolo.
1. Preparação pré-operatória e anestesia
- Inicie a anestesia pré-operatória injetando uma mistura de xilazina (4 mg/kg BW) e cetamina (100 mg/kg BW) intraperitoneally.
- Entubar os ratos com tubo de 14 G e ventilação controlada por volume com uma mistura de O2, ar e isoflurane (1-2,5%) a 75-85 tacadas/min, 100 mL/stroke/BW(Figura 1A). Se necessário, para uma melhor visão enquanto entuba: aplique Xylocain através de uma ponta de algodão-lã na faringe inferior para obter relaxamento local.
- Coloque os ratos em uma mesa de operação aquecida em uma posição supina e fixe os membros dianteiros com fita(Figura 1B).
- Meça a temperatura retal com uma sonda.
NOTA: Deve ser mantido entre 37,5-38,5 °C. - Raspe o tórax e limpe a área de operação com solução antisséptica de iodo povidone. Aplique pomada ocular no rato para evitar a secagem dos olhos.
- Administre a analgesia intraoperatória injetando piritramida (0,1 mL/kg BW) intraperitoneally.
- Coloque as sondas ECG subcutâneas nas extremidades do animal.
- Verifique os reflexos da cauda e do dedo do pé antes de iniciar o procedimento cirúrgico.
2. Procedimento cirúrgico-indução de isquemia miocárdica
- Realize incisão cutânea usando um bisturi. Certifique-se de iniciar 2 mm parasternal no tórax esquerdo ao nível do 3º espaço intercostal e continuar até a linha axilar anterior ao nível do 5º espaço intercostal(Figura 1C).
- Substitua os músculos superficiais suavemente para tornar as costelas visíveis(Figura 1D).
- No caso de hemorragia menor, use um cauter para obliterar ou desconectar o tecido circundante.
- Realize a toracotomia ao nível do 4º espaço intercostal e insira um retrátil para ganhar visibilidade do coração e do pulmão(Figura 1E). Abra cuidadosamente a pleura para evitar sangramento.
- Oclui temporariamente o LAD usando um torniquete para induzir isquemia/reperfusão (MIR) durante um tempo definido; ou permanentemente (MI) oclui-lo fazendo 6-7 nós usando uma sutura 6-0 para fechar a ligadura(Figura 1F,G).
NOTA: O local direito para oclusão do LAD está localizado cerca de 2-3 mm abaixo do aurículo esquerdo na margem lateral ventral/esquerda do coração. A oclusão bem-sucedida está associada a alterações de ECG (elevação do segmento ST) e mudanças macroscópicas no LV como paling. - No caso do modelo isquemia/reperfusão, reabra o LAD com a remoção do torniquete após 30 min de oclusão.
- Feche o tórax com três suturas de botão único usando uma sutura monofilament 4-0(Figura 1H). Antes de apertar a última sutura, remova qualquer ar residual do tórax com uma seringa de 10 mL para evitar um pneumotórax(Figura 1I).
- Reposicione os músculos e desligue a anestesia volátil.
- Suturar a pele com uma sutura contínua utilizando uma sutura 4-0(Figura 1J).
- Administre um spray antisséptico para proteger contra infecções e mordidas da sutura por ratos.
3. Critérios de tratamento pós-operatório e exclusão
- Mantenha os ratos na mesa de aquecimento até que acordem. Extubar os ratos assim que começarem a respirar espontaneamente.
- Coloque os ratos extubados em uma gaiola sob uma lâmpada de aquecimento para evitar que esfriem.
- Devolva ratos para as casas de animais em condições padronizadas quando começarem a se comportar normalmente novamente.
- Adicione 2 ampolas de piritramida e 30 mL de 5% de glicose a 250 mL de água para analgesia pós-operatória por três dias.
- Verifique o condicionamento físico e comportamento dos ratos com os critérios de checklist e exclusão(Tabela 1). Observe os animais duas vezes por dia durante a semana seguinte, depois duas vezes por semana.
NOTA: De acordo com as normas internacionais, apresentar animais em sofrimento, ou animais que ganhem até 6 pontos na avaliação com a lista de verificação, aos veterinários para tomar decisões relacionadas à terapia. Todos os animais que ganham 7 ou mais pontos devem ser imediatamente sacrificados com uma overdose de cetamina e xilazina.
| Exame | Observação | Pontuação |
| Peso corporal | Estável | 0 |
| Perda de 10% | 4 | |
| Perda de 15% por 48 h | 7 | |
| Perda de 18% | 7 | |
| normal (casaco plano e brilhante) | 0 | |
| Aparência externa | piloerection | 1 |
| Hematoma | 2 | |
| feridas de pele/cortes/marcas de mordidas | 2 | |
| limpeza severamente reduzida | 4 | |
| (orifícios impuros/coagulados ou úmidos) | 7 | |
| irritações graves da pele ou feridas | 7 | |
| postura curvada >2 h | 7 | |
| distensão abdominal significativa (ascites) | 7 | |
| Comportamento | normal (dormir, curioso, contatos sociais, reação quando tocado) | 0 |
| comportamento incomum, por exemplo, atividade prejudicada | 2 | |
| auto-isolamento, hiperatividade pronunciada ou estereotipia | 4 | |
| letargia para <6 h | 4 | |
| letargia por 6 h a 8 h | 7 | |
| apathia >8 h | 7 | |
| estereotipo ininterrupto para >10 min. e ainda persistir após 2 h | 7 | |
| sinais de dor quando tocado | 7 | |
| automutilação | 7 | |
| Digestão | Normal | 0 |
| diarreia (fezes macias) | 3 | |
| diarreia por 72 h ou aguada | 7 | |
| fezes sangrenta | 7 |
Tabela 1: Critérios de lista de verificação e exclusão. Esta tabela contém os exames que devem ser observados e o escore correspondente. Assim, o tratamento pós-operatório do animal deve ser adaptado, ou um veterinário deve ser consultado.
4. Medições de ecocardiografia
NOTA: A ecocardiografia é geralmente realizada duas vezes, antes da indução de MI e antes da colheita dos órgãos.
- Injete ratos com uma mistura de xilazina (4 mg/kg BW) e cetamina (100 mg/kg BW) intraperitoneally.
- Coloque os ratos em uma posição supina em uma bandeja de aquecimento. Aplique gel de eco no peito, o que ajuda as ondas de ultrassom a viajar melhor e reduz as interferências de sinal.
- Obtenha vistas parasterais de eixo curto da cavidade LV ao nível do músculo papilar.
- Realize a ecocardiografia do modo M para medir a fração de ejeção ventricular esquerda e a morfologia.
5. Colheita de órgãos (sem coração de trabalho)
- Administrar xilazina (4 mg/kg BW) e cetamina (100 mg/kg BW) intraperitoneally antes da colheita de órgãos. Certifique-se de que os reflexos são negativos.
NOTA: Não é necessária intubação, pois o procedimento não dura mais de 1 min. - Use um bisturi para fazer uma incisão da pele sob o xiphoide e estenda-o paralelamente às costelas de ambos os lados usando uma tesoura.
- Corte as costelas na linha axilar frontal e pegue o xifoide para levantar o peito para cima(Figura 2A).
- Remova as aderências dos tecidos anatômicos ou fibrosos rompendo cuidadosamente o tecido com dois pares de fórceps.
- Pegue amostras de sangue (para avaliação de gás sanguíneo ou análises moleculares) da veia cava inferior com uma seringa de 5 mL.
- Realize a excisão de todo o coração no nível de entrada e saída(Figura 2B). Se necessário, prossiga com a avaliação cardíaca de trabalho, conforme descrito na seção 6.
- Órgãos de colheita, choque congelá-los em nitrogênio líquido e armazenar em -80 °C para novas análises moleculares, ou em formaldeído para fins histológicos.
6. Medições hemodinâmicas ex vivo através de um sistema cardíaco funcionando
NOTA: A configuração geral e os componentes do aparelho foram descritos anteriormente11. O protocolo a seguir descreve o manuseio do coração do animal e as etapas necessárias para avaliar a função LV.
- Anestesiar ratos conforme descrito na etapa 5.1 e injetar 200 UI de heparina por via intravenosa (veia femoral).
- Abra o tórax através de uma incisão sob o arco costal com um bisturi e estenda-o a ambas as linhas axilares anteriores com uma tesoura e eleve o esterno.
- Corte os grandes vasos perto de sua tomada ou entrada para o coração para extivá-lo(Figura 2B).
- Mergulhe o coração no tampão Krebs-Henseleit gelado e monte-o no sistema cardíaco isolado eritrócito através da canulação da aorta(Figura 3A).
- Comece com o modo LD com uma carga constante de 60 mmHg (período de estabilização).
- Após 15 minutos do modo LD, mude para o modo WH. Portanto, cannulate o átrio esquerdo através de uma veia pulmonar(Figura 3B). Em seguida, mude a direção de fluxo no sistema abrindo o clipe que oclui a cânula atrial. Isso resulta em uma perfusão do átrio esquerdo e um fluxo sanguíneo fisiológico no coração esquerdo11.
- Registo hemodinâmico de registro por 20 minutos no modo WH.
- Coletar gotas de sangue das coronárias com uma seringa de 2 mL para medir o fluxo coronário (CF, mL/min) a cada 5 minutos.
NOTA: A CF é medida como a diferença entre o fluxo atrial esquerdo (LAF) e o fluxo aórtico (AF). - Realizar medições contínuas de LAF (equivalente à saída cardíaca) e AF com uma sonda de fluxo.
NOTA: A sonda é inserida através do aparelho WH no LV. Todos os dados são continuamente registrados. - Se o protocolo em curso solicitar, insira um cateter de alta fidelidade retrógradamente através da válvula aórtica no LV e meça a pressão sistólica do ventrículo esquerdo (LVSP).
- Para avaliar o trabalho de pressão-volume realizado por minuto, calcule o volume do curso como saída cardíaca dividida pela frequência cardíaca.
- Calcular o trabalho cardíaco externo (EHW) de acordo com a seguinte fórmula: CO x LVSP (g x m/min) normalizada ao peso cardíaco.
Representative Results
Os seguintes resultados foram publicados por Pilz et al.6. Com este procedimento cirúrgico preciso, pode-se investigar o efeito cardioprotetor do percondicionamento isquêmico remoto (RIPerc). Trata-se de um novo tratamento potencial para pacientes que sofrem de MI ou MIR agudos e posterior remodelação ventricular, o que, em muitos casos, leva a uma TRF consecutiva. Imitar as alterações fisiofológicas do MI/MIR é um passo obrigatório na avaliação de tratamentos como estudos in vitro ou ex vivo não fornecem o ambiente fisiológico. Neste protocolo, os animais foram submetidos a 30 min de oclusão lad seguida de reperfusão (ou seja, MIR).
Para comprovar a reprodutibilidade do procedimento, foram realizados cortes histológicos e manchas(Figura 4A). Ficou claro que a cicatriz fibrosa em animais tratados mir+RIPerc era comparável com a formação de cicatrizes dos animais Sham, enquanto a comparação da fibrose entre os grupos Sham e MIR foi significativa(Figura 4B). Além disso, os animais tratados com MIR+RIPerc apresentaram significativa redução da fibrose em comparação com os animais tratados com MIR. No entanto, as imagens histológicas representativas esclarecem a potência deste procedimento cirúrgico, uma vez que o infarto é explicitamente sustentado no grupo MIR (Figura 4A). Utilizando echografia in vivo, fração de ejeção, diâmetros pós-diatólicos e sistólicos finais (LVEDD e LVESD) foram medidos e apresentaram função cardíaca significativamente reduzida devido ao tratamento de MIR, enquanto parâmetros hemodinâmicos foram preservados pelo RIPerc (Figura 4C−F). Os dados hemodinâmicos ex vivo mostraram a eficácia do procedimento, pois o grupo MIR apresentou quedas significativas no LVSP, na saída cardíaca (CO), no volume de derrame (SV) e no trabalho cardíaco externo (EHW) (Figura 5A−G).
Uma pesquisa biblioda sobre este procedimento cirúrgico não relatou comentários e resultados negativos ou insatisfatórios quando foi realizado adequadamente. No entanto, as armadilhas mencionadas na introdução e a discussão precisam ser evitadas e o treinamento é obrigatório para adquirir um nível estável de desempenho e obter resultados comparáveis.
Figura 1: Preparação pré-operatória e procedimento cirúrgico. (A) Intubação do animal utilizando um tubo de 14 G. (B) Posicionamento supino e desinfecção do campo cirúrgico. (C) Incisão de pele (2 mm parasternal no tórax esquerdo ao nível do 3º espaço intercostal). A incisão deve atingir a linha axilar anterior ao nível do 5º espaço intercostal. (D) Deslocar os músculos para tornar as costelas visíveis. (E)Abertura do tórax. (F) Oclusão permanente de LAD usando 6-7 nós. (G) Oclusão transitória de LAD usando um torniquete. (H) Fechamento do baú após isquemia miocárdica e reperfusão colocando três suturas de nó único ao redor das costelas. (I)Fechamento adequado do tórax. Use uma seringa de 10 mL para remover qualquer ar residual do tórax antes de fixar o último nó firmemente. Isso é essencial para evitar um pneumotórax. (J)Sutura de pele. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Colheita de órgãos. (A) Abra o peito com cortes sub-xiphoidal e estenda-os a ambas as linhas do axilar médio. Outros cortes nas costelas são realizados para facilitar o levantamento do esterno. (B)Excisão do coração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aparelho cardíaco isolado. (A) Modo Langendorff. O coração é montado no aparelho WH através de cannulação da aorta. (B) Modo coração de trabalho. O sistema pode ser alternado para o modelo WH para avaliar a função cardíaca, cânulando o átrio esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeito do condicionamento isquêmico remoto na formação da cicatriz, função ventricular esquerda e remodelagem. (A) Fatias de LV histológicas colhidas no dia 14 pós-reperfusão pós-miocárdio. (B) Resultados quantificados de fibrose em gráficos de barras. (C) Ecocardiogramas de modo M representativos. (D) Fração de ejeção (EF) quantificada em gráficos de barras. (E) Diâmetro sistólico final lv (LVESD) quantificado em gráficos de barras. (F) Diâmetro de LV-diastólica final (LVEDD) quantificado em gráficos de barras. MIR, isquemia miocárdica-reperfusão; RIPerc, percondicionamento isquêmico remoto. Os dados são expressos como média ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Reimpresso de Pilz et al.6 com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeito do RIPerc na função hemodinâmica LV. (A) A pressão sistólica lv (LVSP), (B) saída cardíaca (CO) e (C) volume de derrame (SV) foram obtidos do coração de trabalho isolado no dia 14 de reperfusão pós-miocárdio. (D) O CO é retratado em função da pós-carga; (F) trabalho cardíaco externo em função da pós-carga, resultados quantificados em gráfico de barras(E e G). Os dados são expressos como média ± SEM e n = 4-7 por grupo. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. MIR, isquemia/reperfusão miocárdica; RIPerc, pré-condicionamento isquêmico remoto; EHW, trabalho cardíaco externo; SV, volume de traçado; AUC, área sob a curva. Reimpresso de Pilz et al.6 com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
A remodelagem adversa pós-MI é considerada um mecanismo-chave no desenvolvimento da insuficiência cardíaca. Portanto, para garantir a continuidade da pesquisa cardiovascular, procedimentos experimentais e técnicas devem ser reprodutíveis. Um protocolo experimental compreensível e claramente definido é um elemento fundamental da reprodutibilidade. A reprodutibilidade refere-se a resultados que podem ser repetidos por vários cientistas e são validados em laboratórios. Este estudo teve como objetivo apresentar um método semi-minimamente invasivo para induzir mi crônica ou re-perfumada e avaliar a função hemodinâmica cardíaca em ratos.
Esses resultados e dados posteriores publicados mostram a alta potência deste método cirúrgico e sua importância na pesquisa sobre MI, remodelagem e HF. Embora a lesão de isquemia/reperfusão possa ser usada para entender as mudanças no MI com a reperfusão subsequente, a oclusão permanente permite uma maior compreensão dos processos de remodelação de curto e longo prazo do miocárdio. Outras abordagens cirúrgicas causam mais danos teciduais e os animais apresentam maiores riscos de desenvolver infecções e pneumotórax, resultando em maiores taxas de abandono. Em contrapartida, este procedimento visa reduzir a mortalidade por melhorias específicas na configuração e manuseio. Além disso, eles mostram variações na expansão da cicatriz fibrosa devido à oclusão instável do LAD.
Nosso protocolo fornece um método fácil de intubação, que é uma das etapas mais críticas de todo o procedimento. Ao contrário de várias outras publicações12,a traqueotomia não é realizada em nosso procedimento. Isso potencializa o despertar e a reabilitação dos animais pós-operatóriamente, levando ao desenvolvimento das alterações fisiodicosiológicas que se destinam a este procedimento cirúrgico antes que os animais sejam submetidos a medições pós-operatórias. Obviamente, se for um protocolo de não sobrevivência, a traqueotomia é realizada sob visão e, portanto, é mais fácil de realizar. Além disso, o fechamento da traqueotomia em um protocolo de sobrevivência não é aplicável. Se o tórax for aberto, é obrigatório ventilar o pulmão para evitar o colapso. Portanto, os ratos são entubados antes do procedimento cirúrgico. A abordagem minimamente invasiva não corta as costelas ou esterno, mantendo assim a compactação e estabilidade do tórax. Consequentemente, a recuperação dos animais é melhorada, e o risco de pneumotórax espontâneo ou sangramento é relativamente baixo.
Como mencionado acima, embora a intubação seja de clara vantagem, é difícil de realizar e pode causar uma taxa de abandono maior no início dos experimentos. Esse problema pode ser mitigado com treinamento e algum conhecimento anatômico. É importante inserir o tubo no ângulo reto e esticar o corpo do animal até que a luz brilhe através dos lábios vocais após o qual o tubo pode ser suavemente empurrado para a frente. Tome cuidado para não prejudicar os lábios vocais, pois isso pode causar inchaço, subsequente oclusão dos glottis e sufocamento.
Também é importante que o LAD esteja ligado corretamente. A pequena janela cirúrgica, o coração batendo rápido e o pulmão ventilado (evite tocá-lo tanto quanto possível, pois cada contato pode resultar em sangramento no pulmão) tornam o vaso não claramente visível. Portanto, o conhecimento anatômico é indispensável. A auricle esquerda é indispensável para ajudar a padronizar tanto a área em risco quanto para posicionar a ligadura em torno do LAD. O ponto precisa ser realizado intramuricamente, não transmuricamente na LV, pois isso pode causar uma redução do diâmetro da câmara lv e do volume que não se deve aos processos patológicos. A oclusão bem sucedida está associada à cianose da área do miocárdio em risco e elevação do segmento ST no ECG. A principal limitação deste procedimento é o posicionamento correto da sutura. Para alcançar resultados comparáveis, os pontos devem estar no mesmo nível e precisam usar quantidades semelhantes de tecido. Isso requer um alto nível de treinamento e os diferentes pesos dos animais devem ser considerados. Outro ponto a considerar é a remoção adequada do pneumotórax antes do fechamento do espaço intercostal. Se isso não for realizado com precisão, os animais apresentarão dificuldades para respirar, pois a inflação do pulmão esquerdo será prejudicada por um pneumotórax. Como mencionado acima, isso pode ser mitigado usando uma seringa para remover qualquer ar residual do tórax.
Atualmente, este procedimento MI é um método comumente utilizado que garante resultados comparáveis e uma alta taxa de sobrevivência se as etapas críticas forem realizadas com alta precisão. Projetos futuros sobre diversos tratamentos, dispositivos ou medicamentos em MI, HF ou remodelagem cardíaca podem ser avaliados realizando essa técnica minimamente invasiva.
As medidas wh são, como mencionado acima, não comumente utilizadas, pois sua manutenção e manuseio exigem equipamentos e conhecimentos específicos. Para adquirir dados representativos e comparáveis, devem ser evitadas armadilhas. Os passos mais críticos são a montagem do coração e a mudança do modelo D para o modo WH. Se o coração não for extirpado adequadamente, a montagem pode ser difícil, pois é necessário comprimento suficiente do tecido aórtico para fixar o coração no aparelho. Logo após a conexão ao modo LD, a frequência cardíaca pode diminuir devido à lavagem em tampão frio, à desconexão de seus estímulos fisiológicos no corpo ou à reperfusão com o sangue de outra espécie pelo aparelho. Nesses casos, um marca-passo deve ser aplicado tanto para restaurar quanto para preservar a frequência fisiológica. Isso garante resultados comparáveis em todos os animais. Como o volume sanguíneo dentro do aparelho é um múltiplo do volume fisiológico em ratos, são utilizados glóbulos vermelhos bovinos em uma suspensão baseada em tampão Krebs-Henseleit.
A mudança do modo LD para o modo WH é sinônimo de mudança de trabalho cardíaco passivo para ativo. O modo LD é usado para acostumar o coração ao seu novo ambiente. No modo WH, o coração deve executar suas funções de ejeção fisiológica. Portanto, uma pequena fase de adaptação às novas circunstâncias é necessária antes da avaliação, aumentando a carga posterior.
Outro passo crítico que é comumente esquecido é a preparação e manutenção adequadas do aparelho e do perfusado. O volume preciso de cada composto deve ser misturado e a temperatura dentro do sistema deve ser controlada e ajustada. No entanto, o WH é um método elegante para avaliar a produção cardíaca, o volume do derrame, a pressão sistólica ventricular esquerda e o fluxo coronário simultaneamente.
Este procedimento altamente reprodutível para induzir o MI e os dados representantes adquiridos pelo aparelho WH estão provando sua própria capacidade. A abordagem semi-minimamente invasiva, o nível de método de oclusão e intubação lad facilitam a recuperação rápida e baixa variabilidade no tamanho do infarto. Além disso, a análise da função cardíaca em corações de trabalho isolados proporcionam resultados hemodinâmicos valiosos.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem à equipe de teatro da operação e aos técnicos do Centro de Pesquisa Biomédica pela contribuição, assistência técnica, valiosa contribuição e assessoria. Os projetos são financiados pelo Instituto Ludwig Boltzmann, Cluster for Cardiovascular Research (projeto REM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
| Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
| Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
| Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
| INTUBATION | |||
| Air | |||
| Oxygen (pure) | |||
| Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
| 14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
| PREPARATION | |||
| Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
| Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
| Shaver | |||
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
| Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
| Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
| Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
| Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
| Mensur | MTI | 29-260/25 | |
| Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
| Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
| Needleholder thin | Martin | ||
| Round hook | BT-190 | ||
| Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
| Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
| Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
| Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
| Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
| Surgical scissors | |||
| SUTURES | |||
| PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
| Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
| Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
| COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
| PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
| EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
| Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
| Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
| Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
| Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
| Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
| PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |
References
- WHO. Global Health Estimates 2015: Deaths by Cause, Age, Sex, by Country and by Region, 2000-2015. World Health Organization. , (2016).
- Jaquet, K., et al. Reduction of myocardial scar size after implantation of mesenchymal stem cells in rats: what is the mechanism. Stem Cells and Development. 14 (3), 299-309 (2005).
- Liu, P., Xu, B., Cavalieri, T. A., Hock, C. E. Age-related difference in myocardial function and inflammation in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion. Cardiovascular Research. 56 (3), 443-453 (2002).
- Kolk, M. V. V., et al. LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments. (32), e1438 (2009).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery. Journal of Visualized Experiments. (150), e59591 (2019).
- Pilz, P. M., et al. Remote ischemic perconditioning attenuates adverse cardiac remodeling and preserves left ventricular function in a rat model of reperfused myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 285, 72-79 (2019).
- Santer, D., et al. In vivo and ex vivo functional characterization of left ventricular remodelling after myocardial infarction in mice. ESC Heart Failure. 2 (3), 171-177 (2015).
- Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugetierherzen II. Über den Einfluss von Wärme und Kälte auf das Herz der warmblütigen Tiere. Pflügers Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 66 (67-68), 355-400 (1897).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
- Podesser, B. K., et al. The erythrocyte-perfused "working heart" model: hemodynamic and metabolic performance in comparison to crystalloid perfused hearts. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 9-15 (1999).
- Kiss, A., et al. Argon preconditioning enhances postischaemic cardiac functional recovery following cardioplegic arrest and global cold ischaemia. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 54 (3), 539-546 (2018).
- Kiss, A., et al. Vagal nerve stimulation reduces infarct size via a mechanism involving the alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor and downregulation of cardiac and vascular arginase. Acta Physiologica. 221 (3), 174-181 (2017).
