Summary
Denna artikel presenterar en effektiv metod för att utföra hjärtinfarkt ischemi och efterföljande kronisk reperfusion hos råttor med hjälp av en minimalt invasiv metod. Dessutom bedöms vänster ventrikulära hemodynamic funktion råttor genom ekokardiografi och isolerade arbetshjärta metoder.
Abstract
Hjärtinfarkt (MI) är fortfarande den största bidragsgivaren till sjuklighet och dödlighet över hela världen. Därför är forskning om detta ämne obligatorisk. En lätt och mycket reproducerbar MI induktion förfarande krävs för att få ytterligare insikt och bättre förståelse för de underliggande patologiska förändringar. Detta förfarande kan också användas för att utvärdera effekterna eller styrkan av nya och lovande behandlingar (som läkemedel eller interventioner) i akut HJÄRTINFARKT, efterföljande ombyggnad och hjärtsvikt (HF). Efter intubation och preoperativ beredning av djuret, utfördes ett bedövningsprotokoll med isofluran och det kirurgiska ingreppet genomfördes snabbt. Med hjälp av en minimalt invasiv strategi, var den vänstra främre fallande gatan (LAD) ligger och occluded av en ligatur. Ocklusionen kan utföras akut för efterföljande reperfusion (ischemi/reperfusion skada). Alternativt kan fartyget ligateras permanent för att undersöka utvecklingen av kronisk hjärtinfarkt, ombyggnad eller HF. Trots vanliga fallgropar är andelen avhopp minimala. Olika behandlingar såsom avlägsna ischemisk konditionering kan undersökas för deras hjärtskyddande potential pre-, peri- och postoperativt. Den postoperativa återhämtningen var snabb som anestesi kontrollerades exakt och varaktigheten av operationen var kort. Postoperativa analgesi administrerades i tre dagar. Den minimalt invasiva proceduren minskar risken för infektion och inflammation. Dessutom underlättar det en snabb återhämtning. "Arbetshjärtat" mätningar utfördes ex vivo och aktiverade exakt kontroll av förspänning, efterlast och flöde. Detta förfarande kräver särskild utrustning och utbildning för att uppnå tillräcklig prestanda. Detta manuskript ger en detaljerad steg-för-steg introduktion för att genomföra dessa mätningar.
Introduction
Även om incidensen minskar kontinuerligt, akut hjärtinfarkt (MI) är fortfarande den största bidragsgivaren till sjuklighet och dödlighet över hela världen1. Det finns begränsningar för att utvärdera effekten av potentiella behandlingar som läkemedel eller kirurgiska ingrepp som förebygger och behandlar akut MI. Innan deras effekter kan undersökas på människor måste dessa behandlingar testas för risker i förväg, inklusive in vivo-undersökningar på djur. Det finns ingen bättre möjlighet att studera en patologi än under in vivo-förhållanden. Därför tillåter MI-induktion hos råttor eller möss och till och med stora djurmodeller (svin eller får) undersökning av kort-(akuta) och långsiktiga (kroniska) förändringar på grund av ischemi i kranskärl och omgivande hjärtmuskeln, samt systemiska förändringar på grund av nedsatt hjärtfunktion. Infarct storlek var tidigare det huvudsakliga målet, men på senare tid efterföljande hjärt remodning processer i akut MI eller ischemi/reperfusion skada samt i följd hjärtsvikt (HF) har blivit av stort intresse. Därför krävs en jämförbar och lätt reproducerbar metod för att nå konsekventa resultat.
Medan användningen av cryo-ablation att få MI har rapporterats2, bygger vår metod på andra studier där utredare occlude den vänstra främre fallande artär (LAD) av en enda ligering. I jämförelse med (hemi-)sternotomy förfaranden, minimalt invasiva tillvägagångssätt som kommer att presenteras i denna artikel, tillåter en snabbare postoperativ återhämtning och markant minskar drifttiden. Ett vanligt steg i andra kirurgiska ingrepp är lyft-ut i hjärtat från bröstkorgen att utföra hjärtsymmen3. Metoden för denna metod gör detta steg onödigt. Beroende på protokollet kan två olika procedurer utföras: en tillfällig ocklusion med hjälp av en tourniquet för att inducera ischemi/reperfusion under en definierad tid; eller en permanent ocklusion av artären genom att fastställa ligaturen. Framgången för ocklusion kan utvärderas med ekg (EKG) och de makroskopiska förändringarna i den vänstra ventrikeln (LV) samt dess paling.
Ett annat viktigt steg före operationen är intubation. Medan i de flesta fall, intubation utförs via trakeotomi eller via oral insättning av röret under synen genom ett hudsnitt i halsen, beskriver detta protokoll endotracheal intubation av sövda djur som minskar andningssvårigheter eller infektioner postoperativt4,5. För att undvika postoperativa komplikationer avlägsnas luft från bröstkorgen via en spruta innan bröstet stängs.
Den andra uppgiften i denna artikel är utvärdering av hemodynamic funktion via en isolerad fungerande hjärta experimentell modell, hur den används i andra projekt inom vårt institut6,7. Medan ekokardiografi, hjärt magnetisk resonanstomografi (MRI) och invasiv kvantifiering av tryckvolymsslingor är välkända och allmänt använda metoder för att bedöma hjärtfunktion in vivo, är de kända för att ha vissa begränsningar. Invasiva metoder, såsom användning av katetrar för att undersöka den globala funktionen eller specifika parametrar i hjärtat, används ofta och representerar den gyllene standarden för hjärtmätningar. Däremot används ex vivo arbetshjärtan sällan på grund av dess komplexitet och kostnad. Det finns många viktiga aspekter, från blandningen av perfusatet till lämplig kanylering av hjärtat, som är avgörande för en framgångsrik utvärdering. Den isolerade arbetshjärtan apparaten beskrevs först av Oskar Langendorff i 18978 och har ändrats under de senaste decennierna9. Idag finns det två modeller som används: Langendorff (LD) läge och arbetshjärtat (WH) läge. I vår studie används LD-läget för att acklimatisera hjärtat till sin nya miljö (ca 15 min). I detta läge är hjärtat kanylerat via aorta och kranskärlen perfunderas anterogradely, tillräckligt levererar hjärtmuskeln. I LD-läget utför hjärtat inte något tryckvolymarbete. I WH-läget kan det vänstra atriumet däremot kanyleras via en lung ven, genom vilken perfusatet kommer in i det vänstra atriumet. Hjärtat pumpar sedan detta perfusate fysiologiskt mot en fördefinierad efterlast. Genom att öka efterbelastningen över tiden kan hjärtfunktionen mätas kontinuerligt. Parametrar som koronarflöde, hjärtminutvolym (CO), slagvolym (SV) och arbete, förmaksflöde och LV-systoliskt och diastoliskt tryck kan mätas. Effekten av olika behandlingar direkt och enbart på hjärtat kan undersökas6,10. En genomgång av Liao och Podesser9 presenterade den utbredda användningen av denna metod i utvärderingen av farmakologiska effekter på hjärtfunktion och metabolism samt vid utforskning av olika sjukdomar som MI, HF, fetma och diabetes.
Sammanfattningsvis presenterar detta protokoll en reproducerbar metod för att utföra MI eller hjärtinfarkt ischemi/reperfusion (MIR) skada in vivo. I tillägg tillstånd det karakteriseringen av LV (dys-)fungerar på ett isolerat tjallahjärta efter MI. Detta protokoll presenterar en unik kombination av behandling och analys.
Protocol
Det experimentella protokoll som gav de resultat som beskrivs i denna artikel har godkänts av den regionala etikkommittén för laboratoriedjurförsök vid Medicinska universitetet i Wien och det österrikiska förbundsministeriet för utbildning, vetenskap och forskning (BMWFW-66.009/0023-WF/V/3b/2016). Alla experiment överensstämmer med handledningen för vård och användning av försöksdjur, publicerad av US National Institutes of Health (NIH Publikation nr 85-23, reviderad 1996).
OBS: 10−12 veckor gamla hanar Sprague Dawley råttor på 250−300 g kroppsvikt (BW) används. Eftersom följande procedurer och behandlingar utförs i en steril miljö i ett operationsrum (OR), använd scrubs, handskar, ansiktsmasker och huvor vid hantering av djur. Innan du går in i OPERATIONS, se till att händerna tvättas och desinficeras. Om avsikten är att verka på flera djur i en kirurgisk session, antingen tvätta och desinficera, eller autoklav instrumenten mellan operationer. Dessa hygieniska riktlinjer gäller för alla förfaranden som presenteras i protokollavsnittet.
1. Preoperativ förberedelse och anestesi
- Initiera preoperativ anestesi genom att injicera en blandning av xyazin (4 mg/kg BW) och ketamin (100 mg/kg BW) intraperitonealt.
- Intubera råttorna med ett 14 G-rör och volymstyrd ventilation med en blandning av O2, luft och isofluran (1−2,5%) vid 75−85 slag/min, 100 ml/stroke/BW (figur 1A). Om det behövs, för en bättre bild medan intubating: applicera Xylocain via en bomullsullsspets på nedre svalget för att uppnå lokal avkoppling.
- Placera råttorna på ett uppvärmt manöverbord i ryggläge och fäst frambenen med tejp (bild 1B).
- Mät rektaltemperaturen med en sond.
OBS: Den bör bibehållas mellan 37,5−38,5 °C. - Raka bröstkorgen och rengör operationsområdet med antiseptisk povidone jodlösning. Applicera ögonsalven på råttan för att förhindra torkning av ögonen.
- Administrera intraoperativ analgesi genom att injicera piritramid (0,1 ml/kg BW) intraperitonealt.
- Placera EKG-sonder subkutant i djurets extremiteter.
- Kontrollera svans och tå reflexer innan påbörja det kirurgiska ingreppet.
2. Kirurgiskt ingrepp—induktion av hjärtinfarkt
- Utför hudsnitt med hjälp av en skalpell. Se till att starta 2 mm parasternal på vänster bröstkorg i nivå med den 3: e interkostala utrymmet och fortsätta till den främre axillary linjen på nivån för den 5: e interkostala utrymmet (Figur 1C).
- Byt ut de ytliga musklerna försiktigt för att göra revbenen synliga (figur 1D).
- Vid mindre blödning, använd en cauter för att utplåna eller koppla bort den omgivande vävnaden.
- Utför bröstkoktoatomin i nivå med det 4:e interkostala utrymmet och sätt i ett upprullningsdon för att få synbarhet av hjärtat och lungan (figur 1E). Öppna försiktigt lungsäcken för att undvika blödning.
- Tillfälligt ockludera LAD med hjälp av en tourniquet att inducera ischemi / reperfusion (MIR) under en definierad tid; eller permanent (MI) ocklude det genom att göra 6−7 knop med hjälp av en 6-0 sutur för att stänga ligering (Figur 1F,G).
OBS: Den högra platsen för lad-ocklusion ligger ca 2−3 mm under den vänstra öronen på hjärtats ventrala/vänstra laterala marginal. Lyckad ocklusion är associerad med EKG-förändringar (ST-segmentet höjd) och makroskopiska förändringar i LV som paling. - När det gäller ischemi/reperfusion-modellen, öppna LAD:n igen genom att ta bort tourniquet efter 30 minuters ocklusion.
- Stäng bröstkorgen med tre enknapps suturer med hjälp av en 4-0 enda monofilament sutur (figur 1H). Innan den sista suturen dras åt, ta bort eventuell kvarvarande luft från bröstkorgen med en 10 ml spruta för att förhindra en lungkollaps (figur 1I).
- Flytta musklerna och stäng av flyktig anestesi.
- Sutur huden med en kontinuerlig sutur med hjälp av en 4-0 sutur (figur 1J).
- Administrera en antiseptisk spray för att skydda mot infektioner och bita av suturen av råttor.
3. Kriterier för postoperativ behandling och uteslutning
- Håll råttorna på värmebordet tills de vaknar. Extubera råttorna så snart de börjar andas spontant.
- Lägg de extubated råttorna i en bur under en värmelampa för att förhindra att de kyls.
- Återför råttor till djurstallatet under standardiserade förhållanden när de börjar bete sig normalt igen.
- Tillsätt 2 ampuller piritramid och 30 ml 5% glukos till 250 ml vatten för postoperativ analgesi i tre dagar.
- Kontrollera råttornas lämplighet och beteende med checklista- och uteslutningskriterierna (tabell 1). Observera djuren två gånger om dagen under följande vecka, sedan två gånger i veckan.
ANMÄRKNING: I enlighet med internationella normer, presentera eventuella lidande djur, eller djur som får upp till 6 poäng i utvärderingen med checklistan, till veterinärer att fatta terapi-relaterade beslut. Alla djur som får 7 eller fler poäng måste omedelbart offras med en överdos av ketamin och xyazin.
| Undersökning | Observation | Poäng |
| Kroppsvikt | Stabil | 0 |
| 10% förlust | 4 | |
| 15% förlust för 48 h | 7 | |
| 18% förlust | 7 | |
| normal (päls platt och glänsande) | 0 | |
| Yttre utseende | piloerection (piloerection) | 1 |
| hematom | 2 | |
| hudsår/skärsår/bitmärken | 2 | |
| kraftigt minskad grooming | 4 | |
| (öppningar orena/koagulerade eller fuktiga) | 7 | |
| allvarliga hudirritationer eller sår | 7 | |
| böjd hållning >2 h | 7 | |
| betydande bukdistension (ascites) | 7 | |
| Beteende | normal (sovande, nyfiken, sociala kontakter, reaktion vid beröring) | 0 |
| ovanligt beteende, t.ex. | 2 | |
| självisolering, uttalad hyperaktivitet eller stereotypi | 4 | |
| letargi för <6 h | 4 | |
| letargi för 6 h till 8 h | 7 | |
| apati >8 h | 7 | |
| stereotypi oavbrutet i >10 min. och kvarstår fortfarande efter 2 h | 7 | |
| tecken på smärta vid beröring | 7 | |
| automutilation | 7 | |
| Matsmältningen | Normal | 0 |
| diarré (mjuk avföring) | 3 | |
| diarré för 72 h eller vattniga | 7 | |
| blodig avföring | 7 |
Tabell 1: Checklista och uteslutningskriterier. Denna tabell innehåller de undersökningar som måste observeras och motsvarande poäng. Därför måste den postoperativa behandlingen av djuret anpassas, eller så måste en veterinär rådfrågas.
4. Ekokardiografimätningar
OBS: Ekokardiografi utförs vanligtvis två gånger, före induktion av hjärtinfarkt och innan organen skördas.
- Injicera råttor med en blandning av xyazin (4 mg/kg BW) och ketamin (100 mg/kg BW) intraperitonealt.
- Placera råttorna i ryggläge på en värmebricka. Applicera ekogel på bröstet, vilket hjälper ultraljudsvågorna att färdas bättre och minskar signalstörningar.
- Få parasternal kort axel vyer av LV hålighet på nivån för papillärmuskeln.
- Utför M-läge ekokardiografi för att mäta vänster Ventrikulärt utkast fraktion och morfologi.
5. Organskörd (utan att arbeta hjärta)
- Administrera xyazin (4 mg/kg BW) och ketamin (100 mg/kg BW) intraperitonealt före organskörd. Se till att reflexerna är negativa.
OBS: Ingen intubation krävs eftersom proceduren inte varar längre än 1 min. - Använd en skalpell för att göra ett hudsnitt under xiphoid och utvidga den parallellt till revbenen på båda sidor med sax.
- Skär revbenen i den främre armhålan linjen och ta tag i xiphoid att lyfta bröstet upp(Figur 2A).
- Ta bort anatomiska eller fibrotiska vävnadssamvidhäftningar genom att försiktigt rupturera vävnaden med två par pincett.
- Ta blodprover (för blodgasutvärdering eller molekylära analyser) från vena cava sämre med en 5 ml spruta.
- Utför excision av hela hjärtat vid inlopps- och utloppsnivån (figur 2B). Fortsätt vid behov med att utvärdera arbetshjärtat enligt beskrivningen i avsnitt 6.
- Skördeorgan, chockfrost dem i flytande kväve och förvara i -80 °C för ytterligare molekylära analyser, eller i formaldehyd för histologiska ändamål.
6. Ex vivo hemodynamic mätningar via ett fungerande hjärtsystem
OBS: Apparatens allmänna inställning och komponenter har beskrivits tidigare11. Följande protokoll beskriver hanteringen av djurets hjärta och de nödvändiga stegen för att utvärdera LV-funktionen.
- Söva råttor som beskrivs i steg 5.1 och injicera 200 IE av heparin intravenöst (femorala venen).
- Öppna bröstkorgen via ett snitt under costalbågen med en skalpell och sträck ut den till både främre armhålorna med sax och lyft bröstbenet.
- Skär de stora fartygen nära deras utlopp eller inlopp till hjärtat för att punktskatta det (figur 2B).
- Fördjupa hjärtat i iskall Krebs-Henseleit buffert och montera den på erytrocyt-perfunderas isolerade hjärtat systemet via kanylformning av aorta (Figur 3A).
- Börja med LD-läget med en konstant efterlast på 60 mmHg (stabiliseringsperiod).
- Efter 15 minuter LD-läge växlar du till WH-läget. Kannulera därför det vänstra atriumet via en lung ven (figur 3B). Ändra sedan flödesriktningen i systemet genom att öppna klippet som ocklurar förmakskanylen. Detta resulterar i en perfusion av det vänstra atriumet och ett fysiologiskt blodflöde i det vänstra hjärtat11.
- Registrera hemoodynamiska mätningar för 20 min i WH-läget.
- Samla bloddroppar av koronar med en 2 ml spruta för att mäta koronarflöde (CF, mL/min) var 5:e minut.
OBS: CF mäts som skillnaden mellan vänster förmaksflöde (LAF) och aortaflöde (AF). - Utför kontinuerliga mätningar av LAF (motsvarande hjärtminutvolym) och AF med en flödessond.
OBS: Sonden sätts in via WH-apparaten i LV. Alla uppgifter registreras kontinuerligt. - Om det pågående protokollet begär, sätt in en high-fidelity kateter retrograd via aortaklaffen i LV och mäta vänster ventrikel systoliskt tryck (LVSP).
- För att bedöma det tryckvolymsarbete som utförs per minut, beräkna slagvolymen som hjärtminutvolym dividerat med hjärtfrekvens.
- Beräkna externt hjärtarbete (EHW) enligt följande formel: CO x LVSP (g x m/min) normaliserat till hjärtvikt.
Representative Results
Följande resultat har publicerats av Pilz et al.6. Med denna exakta kirurgiska ingrepp kan den hjärtskyddande effekten av avlägsna ischemiska perconditioning (RIPerc) undersökas. Detta är en potentiell ny behandling för patienter som lider av akut hjärtinfarkt eller MIR och efterföljande ventrikulär ombyggnad, vilket i många fall leder till på varandra följande HF. Härma patofysiologiska förändringar av MI / MIR är ett obligatoriskt steg i utvärderingen av behandlingar som in vitro eller ex vivo studier inte ger den fysiologiska miljön. I detta protokoll utsattes djuren för 30 minuter LAD-ocklusion följt av reperfusion (dvs. MIR).
För att bevisa att förfarandet var reproducerbara utfördes histologiska skärsår och fläckar (figur 4A). Det var tydligt att fibrotiska ärr i MIR + RIPerc behandlade djur var jämförbar med ärr bildandet av Sham djur medan jämförelsen av fibros mellan Sham och MIR grupper var betydande (Figur 4B). Dessutom uppvisade MIR+RIPerc-behandlade djur signifikant minskad fibros jämfört med MIR-behandlade djur. De representativa histologiska bilderna klargör dock styrkan i detta kirurgiska ingrepp, eftersom infarkten uttryckligen upprätthålls i MIR-gruppen (figur 4A). Med in vivo echography mättes utskjutningsfraktion, LV-end-diastoliska och end-systoliska diametrar (LVEDD och LVESD) och visade signifikant nedsatt hjärtfunktion på grund av MIR-behandling medan hemodynamiska parametrar bevarades av RIPerc (figur 4C−F). Ex vivo hemodynamic data uppvisade effektiviteten av förfarandet som MIR gruppen visade betydande minskningar i LVSP, hjärtminutvolym (CO), stroke volym (SV) samt yttre hjärtarbete (EHW) (Figur 5A−G).
En litteratur sökning om detta kirurgiska ingrepp rapporterade inga negativa eller otillfredsställande kommentarer och resultat när det utfördes tillräckligt. Fallgropar som nämns i inledningen och diskussionen måste dock förhindras och utbildning är obligatorisk för att få en stabil prestationsnivå och för att uppnå jämförbara resultat.
Figur 1: Preoperativ förberedelse och kirurgiskt ingrepp. (A) Intubation av djuret med hjälp av ett 14 G-rör. (B)Supine positionering och desinfektion av det kirurgiska fältet. (C)Hudsnitt (2 mm parasternal på vänster bröstkorg i nivå med den 3: e interkostalutrymme). Snittet måste nå den främre axillary linjen i nivå med den 5: e interkostala utrymmet. (D) Förskjut musklerna för att göra revbenen synliga. (E) Öppning av bröstkorgen. FF) Permanent ocklusion av LAD med 6−7 knop. (G)Transient ocklusion av LAD med hjälp av en tourniquet. HH) Stängning av bröstet efter hjärtinfarkt och reperfusion genom att placera tre enknutssuturer runt revbenen. (I)Korrekt stängning av bröstkorgen. Använd en 10 ml-spruta för att avlägsna eventuell kvarvarande luft från bröstkorgen innan den sista knuten fästs ordentligt. Detta är viktigt för att förhindra en lungkollaps. (J)Hud sutur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Organskörd. (A) Öppna bröstet med sub-xiphoidal nedskärningar och utvidga dem till båda mitten av armhålorna linjer. Ytterligare skärsår genom revbenen utförs för att underlätta lyft av bröstbenet. (B)Excision av hjärtat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Isolerad hjärtapparat. (A) Langendorff läge. Hjärtat är monterat på WH-apparaten via kanylering av aorta. (B)Arbetsläge. Systemet kan kopplas till WH-modellen för att utvärdera hjärtfunktionen genom att kanylera det vänstra atriumet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Effekten av avlägsna ischemisk konditionering på ärrbildning, vänster ventrikulär funktion och ombyggnad. (A)Histologiska LV skivor skördas dag 14 post-hjärtinfarkt reperfusion. ( B)Kvantifierade resultat av fibros i stapeldiagram. C)Representativa ekokardiogram i M-läge. (D)Utmatningsfraktion (EF) kvantifierad i stapeldiagram. E)LV änd-systolisk diameter (LVESD) kvantifierad i stapeldiagram. F)LV-end-diastolisk diameter (LVEDD) kvantifierad i stapeldiagram. MIR, hjärtinfarkt ischemi-reperfusion; RIPerc, fjärrstyrd perkonditionering. Uppgifterna uttrycks som medelvärde ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0.001. Omtryckt från Pilz et al.6 med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: RIPercs effekt på LV-hemodynamic funktion. (A)LV systoliskt tryck (LVSP), (B) hjärtminutvolym (CO) och (C) stroke volym (SV) resultat erhölls från den isolerade arbetshjärta dag 14 post-hjärtinfarkt reperfusion. D)CO avbildas som en funktion av efterlasten. F)Externt hjärtarbete som funktion av efterlast, kvantifierade resultat i stapeldiagram (E och G). Data uttrycks som medelvärde ± SEM och n = 4–7 per grupp. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0.001. MIR, hjärtinfarkt/reperfusion; RIPerc, fjärrsystemisk förkonditionering; EHW, yttre hjärtaarbete; SV, slagvolym; AUC, område under kurvan. Omtryckt från Pilz et al.6 med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Negativa remodeling post-MI anses vara en viktig mekanism i utvecklingen av hjärtsvikt. För att säkerställa kontinuiteten i kardiovaskulär forskning bör därför experimentella förfaranden och tekniker kunna reproduceras. Ett begripligt och tydligt definierat experimentellt protokoll är en grundläggande del av reproducerbarheten. Reproducerbarhet avser resultat som kan upprepas av flera forskare och valideras över laboratorier. Denna studie syftade till att presentera en semi-minimalt invasiv metod för att inducera kronisk eller åter perfunderas MI och bedöma hjärt hemodynamic funktion hos råttor.
Dessa resultat och ytterligare publicerade data visar den höga styrkan av denna kirurgiska metod och dess betydelse i forskning om MI, remodeling och HF. Medan ischemi/reperfusion skada kan användas för att förstå förändringarna i MI med efterföljande reperfusion, permanent ocklusion möjliggör ytterligare förståelse av kort- och långsiktiga ombyggnad processer av hjärtmuskeln. Andra kirurgiska metoder orsaka mer vävnadsskador och djur visar högre risker för att utveckla infektioner och lungkollaps, vilket resulterar i högre avhopp priser. Syftet med detta förfarande är däremot att minska dödligheten genom specifika förbättringar i installationen och hanteringen. Dessutom visar de variationer i fibrotic ärr expansion på grund av att instabil LAD ocklusion.
Vårt protokoll ger en enkel metod för intubation, som är ett av de mest kritiska stegen i hela proceduren. I motsats till flera andra publikationer12, är trakeotomi inte utförs i vårt förfarande. Detta förbättrar uppvaknandet och rehabiliteringen av djuren postoperativt, vilket leder till utvecklingen av de patofysiologiska förändringar som är avsedda genom detta kirurgiska ingrepp innan djuren genomgår postoperativa mätningar. Självklart, om det är en icke-överlevnad protokoll, trakeotomi utförs under synen och är därmed lättare att utföra. Dessutom är stängning av trakeotomi i ett överlevnadsprotokoll inte tillämpligt. Om bröstkorgen öppnas är det obligatoriskt att ventilera lungan för att förhindra kollaps. Därför är råttorna intubated före det kirurgiska ingreppet. Den minimalt invasiva metoden skär inte revbenen eller bröstbenet vilket bibehåller bröstkorgens kompakthet och stabilitet. Följaktligen förbättras djurens återhämtning och risken för spontan lungkollaps eller blödning är relativt låg.
Som tidigare nämnts, medan intubationen är av klar fördel, är det svårt att utföra och kan orsaka en högre avhopp i början av experimenten. Detta problem kan mildras med utbildning och viss anatomisk kunskap. Det är viktigt att sätta in röret i rätt vinkel och sträcka djurets kropp tills ljuset lyser genom de vokala läppar varefter röret försiktigt kan skjutas framåt. Var noga med att inte skada de vokala läpparna eftersom detta kan orsaka svullnad, efterföljande ocklusion av glottis och kvävning.
Det är också viktigt att LAD är ligated korrekt. Det lilla kirurgiska fönstret, det snabba bultande hjärtat och den ventilerade lungan (undvik att röra vid det så mycket som möjligt eftersom varje kontakt kan resultera i blödning i lungan) gör att kärlet inte syns tydligt. Därför är anatomisk kunskap oumbärlig. Den vänstra auricle är oumbärlig för att standardisera både det riskområde och att placera ligering runt LAD. Sömmen måste utföras intramurally, inte transmurally i LV eftersom detta kan orsaka en minskning av LV kammaren diameter och volym som inte beror på de patologiska processerna. Framgångsrik ocklusion är associerad med cyanos av det hjärtinfarkt område som är i riskzonen och höjd av ST-segmentet på EKG. Den huvudsakliga begränsningen av detta förfarande är korrekt placering av suturen. För att uppnå jämförbara resultat måste stygnen vara på samma nivå och behöva använda liknande mängder vävnad. Detta kräver en hög utbildningsnivå och djurens olika vikter måste beaktas. En annan punkt att tänka på är adekvat avlägsnande av lungkollaps innan stängningen av interkostal utrymmet. Om detta inte utförs exakt kommer djuren att uppvisa andningssvårigheter eftersom inflationen i den vänstra lungan kommer att hindras av en lunga. Som tidigare nämnts kan detta mildras genom att använda en spruta för att avlägsna eventuell kvarvarande luft från bröstkorgen.
För närvarande är detta MI-förfarande en vanlig metod som garanterar jämförbara resultat och en hög överlevnadsgrad om de kritiska stegen utförs med hög precision. Framtida projekt på olika behandlingar, enheter eller läkemedel i MI, HF eller hjärt ombyggnad kan utvärderas genom att utföra denna minimalt invasiva teknik.
Wh-mätningarna används, som nämnts ovan, inte ofta eftersom underhåll och hantering kräver särskild utrustning och kunskap. För att få representativa och jämförbara uppgifter måste fallgropar undvikas. De mest kritiska stegen är montering av hjärtat och växling från D-modellen till WH-läget. Om hjärtat inte är tillräckligt struket kan monteringen vara svår eftersom tillräcklig aortavävnadslängd krävs för att fästa hjärtat på apparaten. Strax efter anslutning till LD-läget kan hjärtfrekvensen minska på grund av tvättning i kallbuffert, frånkoppling av dess fysiologiska stimuli i kroppen eller reperfusion med blod från en annan art av apparaten. I sådana fall måste en pacemaker appliceras på både återställa och bevara den fysiologiska frekvensen. Detta säkerställer jämförbara resultat för alla djur. Eftersom blodvolymen i apparaten är en multipel av den fysiologiska volymen hos råttor används röda blodkroppar hos nötkreatur i en Krebs-Henseleit-buffertbaserad suspension.
Övergången från LD-läget till WH-läget är synonymt med en övergång från passivt till aktivt hjärtarbete. LD-läget används för att vänja hjärtat till sin nya miljö. I WH-läget måste hjärtat utföra sina fysiologiska utmatningsfunktioner. Därför krävs en kort anpassningsfas till de nya omständigheterna före utvärderingen genom att efterbelastningen ökas.
Ett annat kritiskt steg som ofta glöms bort är adekvat beredning och underhåll av apparaten och perfusatet. Den exakta volymen för varje förening skall blandas och temperaturen i systemet måste kontrolleras och justeras. Ändå är WH en elegant metod för att bedöma hjärtminutvolym, strokevolym, vänster ventrikulärt systoliskt tryck och koronarflöde samtidigt.
Detta mycket reproducerbara förfarande för att inducera hjärtinfarkt och de representerar data som erhållits av WH-apparaten bevisar själva sin förmåga. Den semi-minimally invasiva metoden, nivån av LAD ocklusion och intubation metod underlätta snabb återhämtning och låg variation i infarct storlek. Dessutom ger hjärtfunktionsanalys i isolerade arbetshjärtan värdefulla hemodynamic resultat.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar driftteaterteamet och teknikerna vid Centrum för biomedicinsk forskning för deras bidrag, tekniskt bistånd, värdefulla insatser och råd. Projekten finansieras av Ludwig Boltzmann Institute, Cluster for Cardiovascular Research (REM-projektet).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
| Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
| Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
| Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
| INTUBATION | |||
| Air | |||
| Oxygen (pure) | |||
| Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
| 14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
| PREPARATION | |||
| Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
| Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
| Shaver | |||
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
| Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
| Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
| Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
| Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
| Mensur | MTI | 29-260/25 | |
| Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
| Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
| Needleholder thin | Martin | ||
| Round hook | BT-190 | ||
| Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
| Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
| Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
| Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
| Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
| Surgical scissors | |||
| SUTURES | |||
| PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
| Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
| Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
| COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
| PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
| EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
| Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
| Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
| Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
| Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
| Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
| PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |
References
- WHO. Global Health Estimates 2015: Deaths by Cause, Age, Sex, by Country and by Region, 2000-2015. World Health Organization. , (2016).
- Jaquet, K., et al. Reduction of myocardial scar size after implantation of mesenchymal stem cells in rats: what is the mechanism. Stem Cells and Development. 14 (3), 299-309 (2005).
- Liu, P., Xu, B., Cavalieri, T. A., Hock, C. E. Age-related difference in myocardial function and inflammation in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion. Cardiovascular Research. 56 (3), 443-453 (2002).
- Kolk, M. V. V., et al. LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments. (32), e1438 (2009).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery. Journal of Visualized Experiments. (150), e59591 (2019).
- Pilz, P. M., et al. Remote ischemic perconditioning attenuates adverse cardiac remodeling and preserves left ventricular function in a rat model of reperfused myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 285, 72-79 (2019).
- Santer, D., et al. In vivo and ex vivo functional characterization of left ventricular remodelling after myocardial infarction in mice. ESC Heart Failure. 2 (3), 171-177 (2015).
- Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugetierherzen II. Über den Einfluss von Wärme und Kälte auf das Herz der warmblütigen Tiere. Pflügers Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 66 (67-68), 355-400 (1897).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
- Podesser, B. K., et al. The erythrocyte-perfused "working heart" model: hemodynamic and metabolic performance in comparison to crystalloid perfused hearts. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 9-15 (1999).
- Kiss, A., et al. Argon preconditioning enhances postischaemic cardiac functional recovery following cardioplegic arrest and global cold ischaemia. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 54 (3), 539-546 (2018).
- Kiss, A., et al. Vagal nerve stimulation reduces infarct size via a mechanism involving the alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor and downregulation of cardiac and vascular arginase. Acta Physiologica. 221 (3), 174-181 (2017).
