Summary

Verwendung der Durchflusszytometrie zum Erkennen und Quantitieren veränderter Blutbildung in den sich entwickelnden Zebrafischen

Published: April 29, 2021
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Summary

Dieser Test ist eine einfache Methode, um hämatopoetische Zellen bei der Entwicklung embryonaler Zebrafische zu quantitieren. Blutzellen von dissoziierten Zebrafischen werden einer Durchflusszytometrie-Analyse unterzogen. Dies ermöglicht den Nachweis von Blutdefekten bei mutierten Tieren und nach genetischer Veränderung.

Abstract

Die Vielfalt der Zelllinien, die reifes Blut bei Wirbeltieren umfassen, ergibt sich aus der Differenzierung von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs). Dies ist ein kritischer Prozess, der während der gesamten Lebensdauer von Organismen auftritt, und Störungen der molekularen Bahnen, die während der Embryogenese beteiligt sind, können katastrophale langfristige Folgen haben. Aus einer Vielzahl von Gründen ist Zebrafisch (Danio rerio) zu einem Modellorganismus geworden, um Hämatopoese zu studieren. Zebrafisch-Embryonen entwickeln sich extern, und durch 7 Tage Nachfertilisation (dpf) haben die meisten subtypen der endgültigen Blutzellen produziert, die für ihre Lebensdauer bestehen bleiben. Es wurden Assays zur Bewertung der Anzahl hämatopoetischer Zellen entwickelt, die hauptsächlich spezifische histologische Flecken, In-situ-Hybridisierungstechniken und Mikroskopie von transgenen Tieren verwenden, die blutzellspezifische Promotoren verwenden, die die Expression fluoreszierender Proteine fördern. Die meisten Färbe-Assays und In-situ-Hybridisierungstechniken quantifizieren jedoch nicht genau die Anzahl der vorhandenen Blutzellen; nur große Unterschiede in der Zellenzahl sind leicht zu visualisieren. Die Verwendung transgener Tiere und die Analyse von Personen mit fluoreszierender oder konfokaler Mikroskopie kann durchgeführt werden, aber die Quantifizierung dieser Assays beruht entweder auf der manuellen Zählung oder der Verwendung teurer Bildgebungssoftware, die beide Fehler machen können. Die Entwicklung zusätzlicher Methoden zur Beurteilung der Blutzellzahlen wäre wirtschaftlich, schneller und könnte sogar automatisiert werden, um die Wirkung der CRISPR-vermittelten genetischen Veränderung, der Morpholino-vermittelten Transkriptreduktion und der Wirkung von Wirkstoffverbindungen, die Hämatopoese in großem Maßstab beeinflussen, schnell zu bewerten. Dieser neuartige Test zur Quantifizierung von Blutzellen wird durchgeführt, indem ganze Zebrafischembryonen getrennt und die Menge der fluoreszierend markierten Blutzellen analysiert wird. Diese Assays sollten eine Aufklärung der molekularen Bahnen ermöglichen, die für die Entstehung, Expansion und Regulation von Blutzellen während der Embryogenese verantwortlich sind, was es den Forschern ermöglichen wird, neue Faktoren, die während Blutkrankheiten verändert wurden, sowie Die Wege, die während der Evolution der Wirbeltierhämatopoese wesentlich sind, weiter zu entdecken.

Introduction

Die Blutproduktion (Hämatopoese) ist ein wesentlicher Entwicklungsprozess, der zuerst im frühen Embryo beginnt. Dieser Prozess beginnt mit der Erzeugung primitiver roter Blutkörperchen und Makrophagen direkt aus dem Mesoderm und verschiebt sich später in Richtung der Produktion von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs). Diese Stammzellen, die multipotent sind, erzeugen alle Sorten von reifen Blutzellen im Organismus. Das System ist in der Lage, sich selbst zu erneuern, und wird durch diese HSPCs kontinuierlich aufgefüllt. Während dieser Prozess früh in der Entwicklung beginnt, Hämatopoese setzt sich für das Leben des Tieres, bietet die Fähigkeit, Sauerstoff zu entfernten Stellen des Körpers zu transportieren, Blutungen nach Verletzungen zu stoppen, und den Körper vor Infektionen zu schützen. Die Entwicklung dieses komplexen Systems wird zeitlich und räumlich während der Entwicklung gesteuert und jegliche Störungen in der Blutzellproduktion können für den Organismus katastrophal sein, was zu Anämie, Thrombozytopenie, Leukopenie und Leukämie führt.

Ein beliebtes Tiermodell für die hämatopoetische Forschung ist der Zebrafisch (Danio rerio), weil sie eine ähnliche Blutentwicklung im Vergleich zum Menschen haben. Tatsächlich werden viele der Gene und molekularen Bahnen, die während der Hämatopoese verwendet werden, während der Gesamten der Wirbeltierentwicklung konserviert, so dass wir durch das Studium von Zebrafischen mehr über menschliche Gene lernen können. Wichtig ist, dass zebrafischische Embryonen außerhalb des Körpers entstehen und innerhalb von 7 Tagen die meisten reifen Blutzelltypen erzeugt haben, was eine direkte Visualisierung des hämatopoetischen Systems in kurzer Zeit ermöglicht. Zebrafische sind auch extrem fecund, was es Forschern ermöglicht, eine größere Anzahl von Proben in einem kurzen Zeitrahmen zu beobachten, was auch für die Generierung reproduzierbarer Daten wichtig ist. Die kurze Erzeugungszeit und die externe Entwicklung des Zebrafisches ermöglicht eine einfachere Manipulation und Beobachtung während der Mutagenesestudien1,2,3,4,5 und Drogenscreening6,7,8,9,10. Dies ermöglicht es, eine Gruppe vielversprechender therapeutischer Verbindungen für menschliche Bluterkrankungen schnell und effizient zu testen.

Wichtig ist, dass Zebrafische auch genetisch freundlich sind, und das Genom wird sequenziert und mit Anmerkungen benotet. Diese Traktionsfähigkeit ermöglicht reverse genetische Techniken wie Morpholino- (MO-) vermittelten Knockdown und CRISPR-vermittelte genetische Ablation durchzuführen. Zebrafische haben auch ihre Nützlichkeit als Modell bewiesen, um vorn genetische Bildschirme durchzuführen; viele wesentliche Gene und Wege, die an der Wirbeltierblutbildung beteiligt sind, wurden auf diese Weise entdeckt. Zahlreiche Methoden zur Beobachtung von Blutzellen wurden auch bei Zebrafischen entwickelt. Während es traditionelle histologische Färbetechniken gibt, ist es auch möglich, in situ-Hybridisierung für blutspezifische Transkripte durchzuführen. Wichtig ist, dass es auch zahlreiche transgene Fischlinien gibt, bei denen fluoreszierende Proteine durch linienspezifische Promotoren exprimiert werden, was die Kennzeichnung bestimmter Blutzellen mit fluoreszierenden Proteinen11ermöglicht. Dies ermöglicht es Forschern, die Entstehung, Expansion und Regulierung von Blutzellen in einem lebenden Organismus im Laufe der Zeit aktuell zu beobachten.

Insgesamt hat die Erhaltung des hämatopoetischen Systems, das Vorhandensein und die einfache Entwicklung von transgenen Linien, einfache Visualisierung und kurze Erzeugungszeit den Zebrafisch zu einem wirtschaftlichen, schnellen und anpassungsfähigen Modell der Hämatopoese gemacht. Um die Toolbox der Techniken zu verbessern, die für Zebrafischforscher zur Verfügung stehen, haben wir diesen Test entwickelt, um die Anzahl der Blutzellen in Embryonen robust zu quantisieren. Die Methode beinhaltet die Verdauung transgener Tiere und die Durchführung von Durchflusszytometrie für fluoreszierende Blutzellen. Auf diese Weise können Blutzellen von mutierten Tieren, die Wirkung der MO- und CRISPR-Modifikation und die Wirkung kleiner Moleküle schnell und reproduzierbar quantitativ analysiert werden. Diese Assays sind benutzerfreundliche und wirtschaftliche Möglichkeiten, Blutzellen aufzuzählen, was die Untersuchung ihrer Erzeugung, Proliferation und Wartung im Laufe der Zeit ermöglicht.

Protocol

Der Beirat des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der California State University, Chico, genehmigte alle unten beschriebenen Methoden. HINWEIS: Es wird empfohlen, Embryonen mit 1-Phenyl 2-Thiourea (PTU; Tabelle 1) nach der Nachfruchtung (hpf) nach 24 Stunden, um Pigmentierung zu verhindern, die sich negativ auf die Fluoreszenzdiskriminierung durch Durchflusszytometrie auswirkt. Alle unten aufgeführten Verfahren sind für die Durchflusszytometrie und Fluor…

Representative Results

Um rote Blutkörperchen in embryonalen Zebrafischen aufzuzählen, wurden lcr:GFP16 Embryonen im Einzellstadium mit PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO oder 7,0 ng/nL ism1 MO mit 7,0 ng ism1 mRNA12injiziert. Bei 48 hpf wurden sie verdaut und einer Strömungszytometrie-Analyse unterzogen. Nach der Analyse des Prozentsatzes der GFP+ rote Blutkörperchen aus jeder Probe (jede Probe ist 5 zufällig ausgewählte E…

Discussion

Zebrafische sind ein ausgezeichnetes Modellsystem für das Studium der primitiven und definitiven Wirbeltierhämatopoese. In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Assays entwickelt und verfeinert, die es Zebrafischen ermöglichten, ein schnelles und wirtschaftliches Modell für das Testen von Medikamenten, die Erzeugung und Erprobung genetischer Mutanten zu werden und insgesamt es Forschern zu ermöglichen, molekulare Pfade zu analysieren, die für hämatopoese unerlässlich sind. Dieses Protokoll verwendet embryonale Z…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Finanzierung erfolgte durch die National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 an D.L.S.), die National Science Foundation (NSF: MRT 1626406 bis D.L.S.) und das Honor es Program an der California State University Chico (nach K.F.R.). Die Autoren danken Betsey Tamietti für das Labormanagement und Kathy Johns für die Amtshilfe.

Materials

1.5 ml MCF tube FisherBrand 05-408-129
10 mm Polystyrene easygrip Petri dish Corning Falcon 351008
5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap Corning Falcon 352235
BD FACSAria Fusion flow cytometer BD Biosciences
Dithiolthreitol (DTT) Sigma-Aldrich 646563
DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14080-055
FBS 500 mL Gemini Bio-Products 100-108
HyClone PBS (1x) GE Healthcare Life Sciences sh30256.01
Librease Roche Sigma-Aldrich 5401119001 dissociation protease
Pronase Roche Sigma-Aldrich 11459643001 dechorionation protease
SYTOX Red Dead Cell Stain Invitrogen  S34859

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Cite This Article
Rueb, K. F., Stachura, D. L. Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (170), e61035, doi:10.3791/61035 (2021).

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