Summary
We introduceren een protocol voor het meten van real-time reactie van geneesmiddelen in organotypic tumorweefsel plakjes. De hier geschetste experimentele strategie biedt een platform voor het uitvoeren van medium-high throughput drug schermen op weefselsegmenten afgeleid van klinische of muistumoren in ex vivo omstandigheden.
Abstract
Tumorweefsels zijn samengesteld uit kankercellen, geïnfiltreerd immuuncellen, endotheelcellen, fibroblasten, en extracellulaire matrix. Dit complexe milieu vormt de tumormicroomgeving (TME) en kan de respons op therapie in vivo of medicamenteuze respons ex vivo moduleren. Conventionele kanker drug ontdekking schermen worden uitgevoerd op cellen gekweekt in een monolayer, een systeem kritisch ontbreekt de invloed van TME. Zo zullen experimentele systemen die gevoelige en hoge doorvoertesten integreren met fysiologische TME het preklinische medicijndetectieproces versterken. Hier introduceren we ex vivo tumorweefselslicecultuur als platform voor screening van middelhoge doorvoervan geneesmiddelen. Organotypic weefsel slice cultuur vormt precies gesneden, dunne tumor secties die worden gehandhaafd met de steun van een poreus membraan in een vloeibare lucht interface. In dit protocol beschrijven we de voorbereiding en het onderhoud van weefselsegmenten bereid uit muistumoren en tumoren van patiënt-afgeleide xenograft (PDX) modellen. Om veranderingen in de levensvatbaarheid van het weefsel te beoordelen in reactie op de behandeling van geneesmiddelen, maakten we gebruik van een biocompatibele op luminescentie gebaseerde levensvatbaarheidstest die real-time, snelle en gevoelige meting van levensvatbare cellen in het weefsel mogelijk maakt. Met behulp van dit platform evalueerden we dosisafhankelijke reacties van weefselschijfjes op de multi-kinase-remmer, staurosporine en cytotoxische agent doxorubicine. Verder tonen we de toepassing van weefselsegmenten voor ex vivo farmacologie aan door 17 klinische en preklinische geneesmiddelen te screenen op weefselsegmenten bereid uit één PDX-tumor. Ons fysiologisch relevante, zeer gevoelige en robuuste ex vivo screeningplatform zal de ontdekking en besluitvorming van preklinische oncologiegeneesmiddelen sterk versterken.
Introduction
Kankercelinteracties met de fysische en biochemische eigenschappen van het omringende stromale weefsel vormen de TME. TME kan tumorgroei stimuleren, metastase, en moduleren tumor reactie op therapie1. In conventionele preklinische geneesmiddelen ontwikkeling, kandidaat-geneesmiddelen worden meestal eerst gescreend met behulp van gekweekte kanker cellijnen, een test platform dat kritisch ontbreekt de TME2. Dit gebrek aan fysiologische TME in celgebaseerde prescreeningstadia kan de ontdekking van effectieve middelen in tumordragende diermodellen beperken en kan bijdragen aan het hoge uitputtingspercentage van veel veelbelovende oncologische geneesmiddelen in latere klinische stadia van ontwikkeling3.
Ondanks het belang van TME bij het moduleren van tumormedicijnreacties, beperken experimentele beperkingen de toepassing van meer fysiologisch relevante systemen in de vroege stadia van de ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddelen. Het is onpraktisch om honderden therapeutische middelen te screenen op tumoren van diermodellen of tumormonsters van patiënten. Chirurgische specimens zijn immers schaarse middelen met uiteenlopende genetische achtergronden en het screenen van duizenden kandidaat-moleculen in diermodellen is niet haalbaar vanwege experimentele schaal, kosten en dierenwelzijn.
Tumorweefsel slice cultuur, waar precies gesneden, dunne tumor secties worden gekweekt ex vivo, kan de beperking van fysiologische TME in drug screening testen aan te pakken. Historisch, het gebied van de neurowetenschappen pionier en maakte uitgebreide optimalisaties van slice cultuur voor hersenweefsel4. Onlangs hebben veel studies aangetoond voorbereiding van plakjes uit verschillende soorten tumorweefsel, waaronder cellijn-afgeleide tumoren, spontane tumormodellen, patiënt-afgeleide xenografts (PDX), en primaire patiënt tumoren. Ex vivo tissue slice cultuur integreert voordelen van zowel in vivo als in vitro cultuur5. Tumorweefselsegmenten behouden intacte weefselarchitectuur en bonte celsamenstelling, waardoor kankercellen binnen de TME-context kunnen worden bestudeerd.
Dit protocol introduceert een organotypic tumor weefsel slice cultuursysteem gecombineerd met een real-time, zeer gevoelige levensvatbaarheid test om de reacties van geneesmiddelen te evalueren. De werkzaamheidstests van de drug op organotypic tumorweefselplakken in eerder geïntroduceerde protocollen zijn gebaseerd op het meten van veranderingen in de levensvatbaarheid van de cel door fluorescerende kleurstofopname, immunohistochemie (IHC) of MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 difenyltetrazoliumbromide) test6,7,8,9. Al deze methoden zijn echter eindpunttesten en hebben last van lage gevoeligheid, lange verwerkingstijd, complexe gegevensanalyses, een smal signaalbereik en een hoge experimentele fout. Onze luminescentie-gebaseerde live cel-compatibele reagens verbetert deze tests door het verstrekken van een breed signaal bereik en momentane (~ 5 min) meting zonder voorafgaande verwerking en minimale nabewerking. Dit reagens is zeer gevoelig en kan naast elkaar bestaan in de celcultuur media, waardoor continue en tijd-cursus meting van de levensvatbaarheid van de cel. Dit testsysteem is van toepassing op screening met hoge doorvoer van kandidaat-geneesmiddelen op weefselsegmenten in de ontwikkeling van preklinische geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muisexperimenten werden uitgevoerd volgens de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en Het Gebruik van Laboratoriumdieren van de Wet dierenwelzijn en de Richtlijnen van de Nationale Instituten voor Gezondheid voor de zorg en het gebruik van dieren in biomedisch onderzoek.
1. Voorbereiding van tumorweefselplakjes
- Bereid weefsel slice cultuur (TSC) medium volgens het recept in tabel 1. Filtreer het medium met een 0,45 μm vacuümfilterunit om te steriliseren.
- Aliquot 250 μL TSC medium per put voor een 24 put plaat, of 1 mL medium per put voor een 6 put plaat. Bewaar de plaat in een 37 °C, 5% CO2 bevochtigde couveuse tot gebruik.
LET OP: Het medium en de supplementen kunnen worden geoptimaliseerd, afhankelijk van weefselsoorten en experimentele doelen. De hoeveelheid medium moet net genoeg zijn om het poreuze membraan van een kweekinsert te weken. Niet hoger zijn dan het niveau van het membraan. Pas het gemiddelde volume aan als het gemiddelde niveau te laag of te hoog is. Als onderzoekers immunomodulatory agents testen, raden we aan om het medium aan te vullen met IL-210. - Als het gebruik van tumorweefsel afkomstig van muizen, euthanaseren muizen met een aanbevolen procedure, ontsmetten de blootgestelde huid van muizen door het spuiten van 70% ethanol, en ontleden tumoren met aseptische technieken. Bewaar het tumorweefsel in een buis met ijskoude Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
- Bij gebruik van verse patiënt tumorweefsels, op te slaan in ijskoude HBSS voor de korte termijn, of ijskoude Belzer University of Wisconsin (UW) oplossing voor opslag op langere termijn (tot 24 uur) om weefsel levensvatbaarheid te behouden.
OPMERKING: Plakjes van een PDX-weefsel dat 's nachts in ijskoude UW-oplossing wordt verzonden, zijn met succes voorbereid. - Breng het tumorweefsel over in een kweekplaat van 10 cm met ijskoude HBSS. Snijd de tumor in tweeën met een scalpel terwijl ondergedompeld in ijskoude HBSS. Vorm tumorweefsels in cilinders met behulp van een biopsiepunch met een diameter van 6 mm en trim één kant om een vlak oppervlak te creëren. Bewaar de weefsels in ijskoude HBSS tot gebruik.
OPMERKING: Vermijd het opnemen van het necrotische gebied van het weefsel, dat over het algemeen in het midden staat en een ondoorzichtig en fragiel uiterlijk heeft. - Stel het vibratome in. Desinfecteer alle apparatuur met 70% ethanol. Plaats de vibratome buffer lade bedekt met een acryl glazen deksel in het midden van het vibratome ijsbad. Voeg ijs toe aan het ijsbad en vul de bufferlade met gekoelde HBSS om het weefsel koel te houden tijdens het snijden. Bevestig een scheermesje aan de meshouder.
OPMERKING: Hoewel het houden van vibratomen in een semi-steriele omgeving eerdere experimenten niet heeft beïnvloed, wordt aanbevolen om het vibratome op te slaan onder een bioveiligheidskast indien beschikbaar. - Til voorzichtig een biopsie-geponste tumorweefsel van de HBSS met behulp van getande tangen en verwijder overtollige buffer door deppen het weefsel met een pluis-vrije papieren handdoek.
- Plaats een druppel cyanoacrylaatlijm van medische kwaliteit op de plaat van het monster en plaats het weefsel op deze druppel. Droog de lijm 2-3 min door de lucht en plaats de plaat in de bufferbak. Vul aan met wat HBSS totdat het weefsel volledig is ondergedompeld in de buffer.
LET OP: Het monteren van weefsels in een rechtopstaande, stabiele positie is van cruciaal belang om gelijkmatig gesneden plakjes te genereren. Als gemonteerde weefsels onstabiel zijn, voeg dan meer lijm toe aan het omringende weefsel om een rechtopstaande positie te behouden of het weefsel te lossen, de bodem plat te maken en het opnieuw te lijmen. Elastische weefsels hebben de neiging om gemakkelijker geduwd en gebogen te worden tijdens het snijden, in welk geval kortere lengtes (<5 mm) en meerdere runs geschikt kunnen zijn. Voor extreem kwetsbare weefsels kunnen papieren handdoeken het weefsel vernietigen. In dit geval kan het weefsel op een plastic oppervlak worden geplaatst om een aantal overtollige HBSS af te voeren. - Pas de instellingen van het vibratomom aan. De volgende instellingen worden gebruikt: snijdikte = 250 μm, amplitude = 3,00 mm, snijsnelheid = 0,01–0,25 mm/s en bladhoek = 15°–21°.
LET OP: Optimaliseer de snijinstellingen, afhankelijk van de stijfheid van het weefsel. Zachtere weefsels worden gemakkelijker gesneden met een diepere bladhoek bij lagere snelheid. Een bladhoek van 18°, snijsnelheid tussen 0,10-0,18 mm/s en een amplitude van 3,00 mm werkt goed voor muis 4T1- en PDX HCI010-tumoren. Stijver weefsel kan worden gesneden met een hogere bladsnelheid. - Stel de begin- en eindlocaties van het blad in en pas de hoogte van het podium aan. Voer het instrument met continue modus om plakjes te snijden gedurende meerdere cycli totdat de weefsels gelijkmatig worden gesneden.
- Ga door met het snijden van het weefsel. Breng de plakjes samen met een kleine hoeveelheid HBSS buffer op de celcultuur insert met medium met een breed-tip transfer pipet, met behulp van zuigkracht om het hele segment te tillen. Plaats een plakje per insert op een 24 put plaat. Een insert voor 6 goed platen is geschikt voor maximaal vier plakjes voor een repliceren test.
OPMERKING: Als de laatste rand van het weefsel deel is nog steeds bevestigd aan het ongesneden weefsel, stop het vibratome en scheiden het weefsel slice met twee paar fijne tip tangen zonder aan te raken of porren het weefsel plakjes. Een apart scheermesje kan nuttig zijn bij het verwijderen van opknoping weefsel. - Verwijder elke overtollige buffer met een fijne tip transfer pipet.
- Wanneer het blad dicht bij de gelijmde weefsels reikt, stopt u het instrument, laat het stadium zakken, verwijdert u het verstijfde weefsel met een apart mes en monteert u een nieuw weefsel. Ga door met snijden totdat er voldoende plakjes zijn verzameld.
- Kweek de platen in een bevochtigde couveuse op 37 °C, 5% CO2. De weefselplakjes worden gekweekt bij de lucht-vloeibare interfase op de celcultuurtussenvoegsel. De weefselplakjes zijn 24-48 uur na de eerste snijvoorbereiding klaar voor experimenten. Voor langdurige teelt, ruil het medium om de 2-3 dagen.
2. Levensvatbaarheidsmeting
- Voor de levensvatbaarheidsmeting van het weefselsegment u het medium uitwisselen met een op luminescentie gebaseerd levensvatbaarheidsregenagenagens dat zowel luciferase als prosubstrate met 1:1.000 verdunning in TSC-medium bevat volgens de instructies van de fabrikant. Het reagens meet de reductieactiviteit van levende cellen van gemetaboliseerd prosubstraat tot luciferin11. Breng 50 μL enzymsubstraatmengsel over op elk weefselsegment.
- Incubeer met zachte agitatie op een orbitale shaker in een bevochtigde couveuse op 37 °C met 5% CO2 's nachts.
- Lichtgevende signalen kunnen worden gemeten met behulp van een microplaatlezer of een in vivo beeldvormingsinstrument voor weefsels die in een 24-putplaat worden gekweekt. Om de individuele levensvatbaarheid van meerdere weefsels op een 6-putplaat te meten, moet een in vivo beeldvormingssysteem worden gebruikt.
- Wanneer u een microplaatlezer gebruikt, stelt u de microplaat in zonder het deksel. Elk type microplaatlezer dat de lichtsterkte kan meten, moet geschikt zijn voor het experiment. We gebruikten de volgende instellingen: leestijd = 1 s, meting vanaf de top, gain = 200.
OPMERKING: Voor een hogere nauwkeurigheid gebruikt u een microplaat met witte wand om het experiment in te stellen. White-wall, clear-bottom 24 goed platen zijn getest, en in de meeste gevallen, duidelijke goed platen niet in gevaar brengen van de resultaten. - Wanneer u een in vivo beeldvormingssysteem gebruikt om de levensvatbaarheid te meten, plaatst u de plaat in het midden van het podium en verwijdert u het deksel. Verwerf normale fotografische beelden gevolgd door lichtgevende beelden met een veld van podiuminstelling bij C, automatische belichtingstijd, f-stop = 1, objectieve instelling als microplaat met onderwerphoogte = 0,0 cm.
- Kwantificeer de lichtsterkte intensiteit met behulp van de imaging software vergezeld van het in vivo imaging systeem. Teken consistente gebieden van belang (ROI) rond elk weefselsegment. Dit protocol gebruikt een cirkel met een diameter van 1 cm als ROI (zie figuur 1). Meet de totale flux (p/s) van het gebied.
- Wanneer u een microplaatlezer gebruikt, stelt u de microplaat in zonder het deksel. Elk type microplaatlezer dat de lichtsterkte kan meten, moet geschikt zijn voor het experiment. We gebruikten de volgende instellingen: leestijd = 1 s, meting vanaf de top, gain = 200.
3. Evaluatie van het drugeffect op de weefselsegmenten
- Meet de levensvatbaarheid van de basislijn vóór de behandeling met behulp van het op luminescentie gebaseerde levensvatbaarheidsreagens zoals uiteengezet in punt 2.
OPMERKING: Als meerdere weefsels aanzienlijk minder levensvatbaar zijn dan andere, laat de weefsels van de test weg. - Los geneesmiddelen op in dimethylsulfoxide (DMSO) om voorraadoplossingen te maken. Bereid een 10x drugoplossing voor met TSC of ander kweekmedium (25 μL/well voor een 24-putplaat met 250 μL medium) bij de gewenste concentraties. Bereid voor voertuigcontrole medium met een gelijkwaardig volume DMSO.
- Vul de 10x drug oplossing aan de cultuur medium aan de onderkant van de put. Meng door te pipetteren en breng 50 μL van het medium over de weefsels.
OPMERKING: Als er meerdere weefselsegmenten beschikbaar zijn, test duplicaat of drievoud voor elke aandoening. - Incubeer 's nachts met voorzichtig schudden op een orbitale shaker in een 37 °C, 5% CO2,bevochtigd incubator.
- Haal de plaat uit de shaker en incubeer statisch in de 37 °C, 5% CO2,bevochtigde couveuse.
- Meet op gewenste tijdpunten de lichtsterkte intensiteit van de weefsels met behulp van een microplaatlezer of een in vivo beeldvormingssysteem. Meestal worden drugseffecten detecteerbaar na 1-6 dagen behandeling.
OPMERKING: Het op luminescentie gebaseerde levensvatbaarheidsreagens is stabiel gedurende ten minste 3 dagen onder kweekomstandigheden. Echter, het substraat kan worden uitgeput tijdens de test, afhankelijk van de metabolische activiteit van het weefsel. Als een significante signaaldaling wordt waargenomen in weefsels met eerder hoge signalen, vul het substraat in alle putten aan. - Bereken de resterende levensvatbaarheid van de behandelde tumorweefsels met behulp van de volgende vergelijking:
De levensvatbaarheid van het behandelde weefsel wordt genormaliseerd door de uitgangslevensvatbaarheid en levensvatbaarheid verschuiving van controle tumorweefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier tonen we een tijd-cursus, meerdere drug werkzaamheid evaluatie protocol voor tumorweefsel plakjes bereid uit muis 4T1 borsttumor weefsels en een borstkanker PDX model, HCI01012. We hebben met succes weefselplakjes voorbereid van verschillende muis-afgeleide tumoren, PDX, en verse patiënt tumoren10. De algehele workflow van de tumorweefselvoorbereiding en de werkzaamheidstest van geneesmiddelen wordt beschreven in figuur 1. In het algemeen konden we 20-40 weefselplakjes bereiden van een enkele bulktumor van 1.000-1.500 mm3 in volume.
Voor levensvatbaarheidsmetingen maakten we gebruik van een luminescent-gebaseerde, levende cel-compatibele levensvatbaarheidreagens. Behandeling van een multi-kinase remmer, staurosporine, bij 1 μM concentratie gedurende 4 dagen verminderde de signaalintensiteit met 100x, vergeleken met tumorweefsels behandeld met DMSO controle (Figuur 2A). De weefselplakjes bereid uit de 4T1 tumor werden gedurende ten minste 21 dagen onderhouden met incidentele middelgrote uitwisseling(figuur 2B). De meeste van de responsmetingen van het geneesmiddel werden uitgevoerd binnen 7 dagen na weefselschijfvoorbereiding. Omdat het levende celcompatibele reagens geen verwerking of fixatie voor meting vereist, konden we tijdgangenmetingen uitvoeren. Tijdsafhankelijke veranderingen in de levensvatbaarheid van tumorweefselsegmenten uit het identieke 4T1 tumorweefsel worden samengevat in figuur 2C. Staurosporine bij 500 nM verminderde luminescentie vanaf dag 1 en bereikte het laagste niveau op dag 4, en bleef laag voor elk volgend tijdpunt. Daarentegen bleef de lichtsterkte intensiteit van de controlegroep weefsels aangevuld met DMSO stabiel tot dag 6. Bovendien werden weefselsegmenten bereid uit identieke 4T1-tumoren gedurende 4 dagen behandeld met seriële doses staurosporine (0-1 μM) en vertoonden dosisafhankelijke veranderingen in de levensvatbaarheid en EG50 (figuur 2D).
We testten chemotherapeutische geneesmiddelen op weefselplakjes bereid uit een orthotopisch PDX-model van borstkanker, HCI010. PDX-weefselplakjes werden gedurende 6 dagen behandeld met doxorubicine, een standaard chemotherapeutisch medicijn, bij doses van 0-5 μM, wat voor dosisafhankelijke veranderingen in de levensvatbaarheid(figuur 3A)voorzag. Verder werd de werkzaamheid van 17 geneesmiddelen, waaronder preklinische en klinisch goedgekeurde geneesmiddelen, getest in drievoud op weefselsegmenten bereid uit een enkele bulk HCI010 tumor. De drugs werden toegepast op 0,5 μM gedurende 4 dagen in drievoud (Figuur 3B). Deze resultaten bieden proof-of-concept dat medium-throughput drug screening kan worden uitgevoerd op tumor plakjes met native TME.
Figuur 1: Schematisch resultaat weefselslicepreparaat gevolgd door evaluatie van de werkzaamheid van geneesmiddelen. Tumorweefsels werden verwerkt tot plakjes met een diameter van 6 mm en 250 μm dik en gekweekt in de lucht-vloeibare interfase met ondersteuning van celkweekinserts. De levensvatbaarheid van het weefsel werd gemeten met behulp van een bioluminescent reagens zowel voor als na de behandeling van het geneesmiddel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Weefsel slice levensvatbaarheid meting en reactie op de drugs. (A) Representatieve beelden van op luminescentie gebaseerde levensvatbaarheidsmetingen in plakjes borsttumorweefsel. Weefselplakjes van 4T1 tumor werden 4 dagen lang geïncubeerd met 1 μM staurosporine of DMSO-controle samen met lichtgevende levensvatbaarheidstestreagens. Beelden werden verkregen met behulp van een in vivo imaging systeem en geanalyseerd door bijbehorende beeldanalyse software. Rode cirkels geven de ROI aan die voor bioluminescentie wordt gemeten. Bodem = Een plot met lichtgevend signaal van tumorweefsel plakjes behandeld met staurosporine of controle zoals gemeten door een in vivo imaging systeem. De balk geeft het gemiddelde aan van de vier weefselsegmenten die als cirkels (controle) of vierkant (staurosporine behandeld) worden weergegeven. (B) Een plot met levensvatbaarheid van 4T1 tumorweefsel plakjes gekweekt voor 21 dagen na de voorbereiding. De levensvatbaarheid op dag 21, gemeten door een in vivo beeldvormingssysteem, werd genormaliseerd tot die van dag 3. Elke stip geeft meting aan vanuit één segment; de balk geeft het gemiddelde aan; de doos toont kwartielen, en snorharen tonen de minimale tot maximale waarde van de meting. cC) tijdgangenmetingen van de levensvatbaarheid van het weefsel na de behandeling met staurosporine. De levensvatbaarheid van weefselsegmenten van de 4T1-tumor die met staurosporine (500 nM) of een gelijkwaardig volume DMSO als controle werden behandeld, werd in de loop van de tijd gemeten. Luminescentieintensiteiten werden gemeten door een microplaatlezer over de aangegeven tijdpunten. Elke stip illustreert een datapunt uit een individueel weefselsegment, en de staafgrafiek geeft gemiddelde ± SEM. (D) Dosis-afhankelijke behandeling van staurosporine op weefselsegmenten aan. Weefselplakjes bereid uit 4T1 tumor werden aangevuld met seriële doses staurosporine of DMSO als voertuig controle. De resterende levensvatbaarheid op basis van luminescentie werd gemeten door een in vivo beeldvormingssysteem op 4 dagen na de initiatie van de behandeling. De relatieve levensvatbaarheid werd berekend aan de hand van de vergelijking in het protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Drug scherm in weefsel plakjes bereid van een borstkanker PDX model. (A) Een perceel met veranderingen in de levensvatbaarheid in reactie op verschillende doses doxorubicine. De weefselplakjes werden bereid uit een orthotopische borstkanker PDX tumor, HCI010. De levensvatbaarheid werd gemeten in plakjes die werden behandeld met getitreerde doses doxorubicine. Na 6 dagen werd luminescentie gemeten met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem. Bar = gemiddelde ± SEM. (B) Een kleinschalig chemotherapeutisch medicijnscherm op tumorweefselplakjes van een orthotopische borstkanker PDX tumor. De staafgrafiek = gemiddelde ± SEM van driedubbelexperiment. Deze gegevens zijn eerder gepubliceerd10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Materiaal | Ml | Definitieve concentratie | Voorraad |
| William's Medium E | 500 | ||
| Nicotinamide | 6 | 12 mM | 1 M voorraad van Nicotinamide in Williams' Medium E, gesteriliseerd |
| Ascorbinezuur | 6 | 50,4 μg/mL | 0,21 g/50 mL (>10 mM voorraad) van Ascorbinezuur in William's Medium E, gesteriliseerd |
| Natriumbicarbonaat | 15 | 2,25 mg/mL | 7,5% (w/v) oplossing |
| HEPES Buffer | 10 | 20 mM | 1 M voorraadoplossing |
| Glucose | 10 | 5 mg/mL | 250 mg/ml bouillon, gesteraliseerd |
| Natriumpyruvaat | 5 | 1 mM | 100 mM voorraad |
| L-Glutamine L-Glutamine | 5 | 2 mM | 200 mM voorraad |
| ITS + Premix | 5 | Bevat menselijke recombinant insuline, menselijke transferrin (12,5 mg per stuk), seleneuze zuur (12,5 μg), BSA (2,5 g), en linolzuur (10,7 mg) | |
| Penicilline-Streptomycine | 2 | 40 IU/mL Pen, 40 μg/mL Strep | 10.000 IU/mL Pen, 10.000 μg/mL Strep |
| Recombinant EGF | 0.5 | 20 ng/mL | 20 μg/mL voorraad |
Tabel 1: TSC medium recept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol tonen we een platform voor kwantitatieve en real-time onderzoek naar de werkzaamheid van geneesmiddelen op organotypic tumorweefselsegmenten. Het weefsel slice cultuursysteem biedt duidelijke voordelen ten opzichte van de traditionele cel-gebaseerde in vitro methoden door het vastleggen van cel heterogeniteit en fysiologische kenmerken van de inheemse tumor micro-omgeving. Dit platform maakt ook een hogere doorvoer mogelijk voor medicijnwerkzaamheidstests, waardoor de kloof tussen celkweekstudies en in vivo experimenten wordt gedicht.
Om nauwkeurige en consistente resultaten te verkrijgen, is het noodzakelijk om weefselschade tijdens de voorbereiding te minimaliseren. Weefselplakjes moeten worden behandeld met brede tip plastic pipetten om schade veroorzaakt door fysiek contact te voorkomen. Het medium volume van de kweek moet worden gehandhaafd zodat het weefselsegment gedurende de duur van het experiment zowel met de lucht als het medium kan worden incontact gehouden.
Het kweekmedium moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het weefseltype en het experimentele doel. Het TSC medium dat in dit protocol wordt gebruikt is een serumvrij medium dat oorspronkelijk werd ontwikkeld voor primaire hepatocytecultuur13. Dit medium is ook gebruikt om verschillende soorten tumoren te behouden, waaronder borst, lever, dikke darm, en alvleesklier10. Verder hebben we aangetoond verbeterde immuuncel overleving met behulp van een geoptimaliseerde DMEM-gebaseerde medium10. Vibratome instellingen moeten worden geoptimaliseerd op basis van weefsel textuur om intacte en uniforme tumorweefsel plakjes te verkrijgen. Snijden zachter en / of losjes geconsolideerd weefsels wordt meestal gemakkelijker gemaakt met behulp van diepere bladhoeken, langzamere snijsnelheid, en dikkere plakjes. Af en toe, weefsels zijn te zacht om te snijden, in welk geval onderzoekers moeten overwegen inbedding van het weefsel in laag smeltpunt agarose, een techniek die vaak voorkomt in hersenweefsel snijden14,15.
Eerder introduceerden verschillende studies therapeutische medicijntestbenaderingen op gekweekte weefselsegmenten. Deze studies waren gebaseerd op fluorescerende kleurstofintegratie, immunohistochemie of MTT-tests om de levensvatbaarheid van het weefsel te evalueren6,7,8,9. In dit protocol gebruikten we het op luminescentie gebaseerde, live celcompatibele reagens RealTime-Glo11 voor levensvatbaarheidsmeting. Luminescentie gebaseerde tests hebben verschillende voordelen ten opzichte van eerder gebruikte methoden, waaronder verhoogde gevoeligheid, breder signaalbereik en de mogelijkheid om snel real-time levensvatbaarheidsmetingen te doen. Het meten van de tijd is kort voor zowel microplate lezers (~ 1 s / goed) en een in vivo imaging systeem (~ 1 min / plaat) en kan signaalintensiteit lezingen direct met minimale verwerking. Snellere verwerving van het signaal en minder nabewerkingsstappen zijn noodzakelijke functies bij screening van geneesmiddelen met een hoge doorvoer, waardoor op luciferingebaseerde levensvatbaarheidsmetingen een veel grotere monsterdoorvoer in weefselsegmentkweek mogelijk zijn. Terwijl een luciferase-gebaseerde test een nauwkeurige, kwantitatieve meting van de gehele plaklevensvatbaarheid verstrekt, is het niet in staat om drug-veroorzaakte celtype-specifieke veranderingen in het weefsel te ontdekken. Het koppelen van luminescentiegebaseerde levensvatbaarheidsmetingen met eindpunt IHC op hetzelfde weefselsegment maakt celtypespecifieke metingen echter mogelijk.
Terwijl het weefsel slice cultuursysteem is een krachtig hulpmiddel in het brengen van tumorweefsel complexiteit om een high-throughput screening platform, het heeft een aantal nadelen. Inherente heterogeniteit binnen een tumorweefsel kan leiden tot differentiële reacties van geneesmiddelen onder weefsel segmenten, zelfs van dezelfde bulk tumor. Af en toe zagen we relatief grote variaties in de reactie van geneesmiddelen tussen weefselschijfjes in onze experimenten. We kunnen deze variatie gedeeltelijk overwinnen door het gemiddelde van meerdere weefselsegmenten bereid van verschillende sites binnen dezelfde tumor. Hoewel weefselslicecultuur ten minste 21 dagen(figuur 2B)op basisniveau van levensvatbaarheid kan worden gehandhaafd, veranderen de celpopulaties in de loop van de tijd. We hebben beschreven verschuivingen in immuuncel bevolking in de loop van weefsel slice cultuur experimenten10. Daarom raden we weefselplakjes aan om te worden onderzocht over kortere kweektijdintervallen om de kenmerken van inheems weefsel samen te vatten.
Weefsel slice cultuur is klaar om een kritische kloof in de ontdekking van geneesmiddelen en ontwikkeling tussen hoge doorvoer cel cultuur screening en dierproeven te vullen. Honderden geneesmiddelen kunnen worden geëvalueerd op plakjes geproduceerd uit een enkele tumor biopsie, het toevoegen van verhoogde fysiologische relevantie voorafgaand aan dierstudies. Dit systeem zou kunnen helpen om het aantal dierproeven te verminderen dat nodig is om geneesmiddelen op de markt te brengen. Bovendien, weefsel plakjes bereid uit patiënt tumoren hebben informatief potentieel in het begeleiden van de behandeling plannen in de kliniek. Meer dan honderd therapeutische geneesmiddelen zijn vandaag beschikbaar, maar er zijn weinig biomarkers om hun selectie te begeleiden. Bovendien leidt heterogeniteit bij patiënten ook tot verschillen in respons. Weefselplakjes van een biopsie van de patiënt kunnen worden gebruikt om meerdere geneesmiddelen te testen voordat ze systemisch worden behandeld, en bieden waardevolle informatie over de werkzaamheid van geneesmiddelen binnen een week tijd. Over het algemeen, real-time en snelle testen van geneesmiddelen met behulp van weefsel slice cultuursystemen heeft een groot potentieel in de ontwikkeling van kanker geneesmiddelen en therapeutische beslissingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] en Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). We willen Dr. Alana Welm (Universiteit van Utah) bedanken voor het verstrekken van de borstkanker PDX tumor. We willen ook het personeel van Comparative Medicine, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) bedanken voor het onderhoud van het PDX-model en leden van het Gujral-lab voor nuttige discussies. N.N.A. wordt ondersteund door de JSPS Overseas Research Fellowship en Interdisciplinary Training Grant van FHCRC. A.J.B. wordt ondersteund door de Chromosoom Metabolisme en Kanker Training Grant van FHCRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
