Summary
Nous introduisons un protocole pour mesurer la réponse de drogue en temps réel dans les tranches organotypic de tissu de tumeur. La stratégie expérimentale décrite ici fournit une plate-forme pour effectuer des écrans de drogue à débit moyen-élevé sur des tranches de tissu dérivées des tumeurs cliniques ou de souris dans des conditions ex vivo.
Abstract
Les tissus tumoraux sont composés de cellules cancéreuses, de cellules immunitaires infiltrées, de cellules endothéliales, de fibroblastes et de matrice extracellulaire. Ce milieu complexe constitue le microenvironnement de tumeur (TME) et peut moduler la réponse à la thérapie in vivo ou réponse de drogue ex vivo. Des écrans conventionnels de découverte de médicaments contre le cancer sont effectués sur des cellules cultivées dans un monolayer, un système qui manque cruellement de l’influence du TME. Ainsi, les systèmes expérimentaux qui intègrent des essais sensibles et à haut débit avec le TME physiologique renforceront le processus préclinique de découverte de médicaments. Here, we introduce ex vivo tumor tissue slice culture as a platform for medium-high-throughput drug screening. La culture organotypic de tranche de tissu constitue précisément-coupée, les sections minces de tumeur qui sont maintenues avec le soutien d’une membrane poreuse dans une interface liquide-air. Dans ce protocole, nous décrivons la préparation et l’entretien des tranches de tissu préparées à partir des tumeurs et des tumeurs de souris des modèles de xénogreffe patient-dérivés (PDX). Pour évaluer les changements dans la viabilité des tissus en réponse au traitement médicamenteux, nous avons mis à profit un essai biocompatible de viabilité à base de luminescence qui permet une mesure en temps réel, rapide et sensible des cellules viables dans le tissu. À l’aide de cette plate-forme, nous avons évalué les réponses dose-dépendantes des tranches de tissu à l’inhibiteur multi-kinase, staurosporine, et agent cytotoxique, doxorubicine. En outre, nous démontrons l’application des tranches de tissu pour la pharmacologie ex vivo en criblage 17 drogues cliniques et précliniques sur des tranches de tissu préparées à partir d’une tumeur simple de PDX. Notre plate-forme de dépistage ex vivo physiologiquement pertinente, hautement sensible et robuste renforcera considérablement la découverte et la prise de décisions en onclinical en oncologie.
Introduction
Les interactions des cellules cancéreuses avec les propriétés physiques et biochimiques du tissu stromal environnant forment le TME. TME peut stimuler la croissance de tumeur, la métastase, et moduler la réponse de tumeur à la thérapie1. Dans le développement de médicaments précliniques conventionnels, les candidats médicamenteux sont généralement d’abord examinés à l’aide de lignées de cellules cancéreuses cultivées, une plate-forme d’essai qui manque de façon critique le TME2. Ce manque de TME physiologique dans les stades de présélection à base de cellules peut limiter la découverte d’agents efficaces dans les modèles animaux porteurs de tumeurs et peut contribuer au taux élevé d’attrition de nombreux médicaments prometteurs en oncologie dans les derniers stades cliniques de développement3.
Malgré l’importance du TME dans la modulation des réponses de médicaments tumoraux, les contraintes expérimentales limitent l’application de systèmes plus physiologiquement pertinents pendant les premiers stades de la découverte et du développement de médicaments. Il n’est pas pratique de dépister des centaines d’agents thérapeutiques sur les tumeurs à partir de modèles animaux ou de spécimens de tumeurs patientes. En effet, les spécimens chirurgicaux sont des ressources limitées avec des antécédents génétiques variés et le dépistage de milliers de molécules candidates dans des modèles animaux n’est pas faisable en raison de l’échelle expérimentale, le coût et le bien-être animal.
La culture de tranche de tissu de tumeur, où précisément couper, les sections minces de tumeur sont ex vivo cultivées, peuvent aborder la limitation du TME physiologique dans les essais de dépistage de drogue. Historiquement, le domaine des neurosciences a été lancé et a fait des optimisations étendues de la culture des tranches pour les tissus cérébraux4. Récemment, beaucoup d’études ont démontré la préparation des tranches de divers types de tissu de tumeur comprenant des tumeurs de lignée-dérivée de cellules, des modèles spontanés de tumeur, des xénogreffes patient-dérivées (PDX), et des tumeurs patientes primaires. La culture des tranches de tissu ex vivo intègre les avantages de la culture in vivo et in vitro5. Les tranches de tissu tumoral conservent l’architecture intacte de tissu et la composition de cellules panacées, permettant l’étude des cellules cancéreuses dans le contexte de TME.
Ce protocole introduit un système organotypic de culture de tranche de tissu de tumeur combiné avec un essai de viabilité en temps réel, fortement sensible pour évaluer des réponses de drogue. Les tests d’efficacité des médicaments sur les tranches de tissu tumoral organotypiques dans les protocoles précédemment introduits reposent sur la mesure des changements dans la viabilité cellulaire par l’incorporation fluorescente de teinture, l’immunohistochemistry (IHC), ou MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromide) ass6,7,8,9. Cependant, toutes ces méthodes sont des essais de point final et souffrent d’une faible sensibilité, d’un long temps de traitement, d’analyses de données complexes, d’une plage de signaux étroite et d’erreurs expérimentales élevées. Notre réactif compatible avec les cellules vivantes à base de luminescence améliore ces essais en fournissant une large gamme de signaux et une mesure instantanée (5 min) sans traitement préalable et un traitement post minimal. Ce réactif est très sensible et peut coexister dans les médias de culture cellulaire, permettant une mesure continue et temporelle de la viabilité cellulaire. Ce système d’essai s’applique au dépistage à haut débit des candidats aux médicaments sur les tranches de tissus dans le développement de médicaments précliniques.
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Protocol
Toutes les expériences sur les souris ont été réalisées conformément aux recommandations du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Animal Welfare Act et des National Institutes of Health Guidelines for the care and use of animals in biomedical research.
1. Préparation des tranches de tissu tumoral
- Préparer la culture des tranches de tissu (TSC) milieu suivant la recette dans le tableau 1. Filtrer le milieu à l’appel d’une unité de filtre à vide de 0,45 m pour stériliser.
- Aliquot 250 'L de TSC moyen par puits pour une plaque de 24 puits, ou 1 ml de milieu par puits pour une plaque de 6 puits. Conserver la plaque dans un incubateur humidifié de 37 oC et 5 % de CO2 jusqu’à son utilisation.
REMARQUE : Le médium et les suppléments peuvent être optimisés en fonction des types de tissus et des objectifs expérimentaux. La quantité de milieu doit être juste assez pour tremper la membrane poreuse d’un insert de culture. Ne dépassez pas le niveau de la membrane. Ajuster le volume moyen si le niveau moyen est trop bas ou trop élevé. Si les chercheurs testent des agents immunomodulateurs, nous recommandons la supplémentation du milieu avec IL-210. - Si vous utilisez le tissu tumoral dérivé de souris, euthanasiez les souris avec une procédure recommandée, désinfectez la peau exposée des souris en pulvérisant 70% d’éthanol, et disséquent les tumeurs avec des techniques aseptiques. Conservez le tissu tumoral dans un tube contenant la solution de sel équilibré (HBSS) glacée de Hank.
- Si vous utilisez des tissus tumoraux patients frais, entreposez-les dans le HBSS glacé à court terme, ou la solution à froid glacé de l’Université Belzer du Wisconsin (UW) pour un stockage à plus long terme (jusqu’à 24 h) pour préserver la viabilité des tissus.
REMARQUE : Des tranches d’un tissu PDX expédiés pendant la nuit dans une solution UW glacée ont été préparées avec succès. - Transférer le tissu tumoral dans une plaque de culture de 10 cm contenant du HBSS glacé. Couper la tumeur en deux avec un scalpel alors qu’il est immergé dans le HBSS glacé. Façonner les tissus tumoraux en cylindres à l’aide d’un poinçon de biopsie de 6 mm de diamètre et couper un côté pour créer une surface plane. Conservez les tissus dans le HBSS glacé jusqu’à l’utilisation.
REMARQUE: Évitez d’inclure la zone nécrotique du tissu, qui est généralement au centre et a un aspect opaque et fragile. - Configurez le vibratome. Désinfecter tout l’équipement à l’aide de 70 % d’éthanol. Placer le plateau tampon vibratome recouvert d’un couvercle en verre acrylique au centre du bain de glace vibratome. Ajouter de la glace au bain de glace et remplir le plateau tampon de HBSS refroidi pour garder le tissu frais pendant le découpage. Attachez une lame de rasoir au porte-lames.
REMARQUE : Bien que le maintien des vibratomes dans un environnement semi-stérile n’ait pas affecté les expériences antérieures, il est recommandé de stocker le vibratome sous une armoire de biosécurité si disponible. - Soulevez soigneusement un tissu tumoral à poinçonnage de biopsie du HBSS à l’aide de forceps à dents et retirez l’excès de mémoire tampon en tamponnant le tissu avec un essuie-tout sans peluche.
- Placez une goutte de colle de cyanoacrylate de qualité médicale sur la plaque de spécimen et placez le tissu sur cette goutte. Séchez la colle à l’air pendant 2 à 3 minutes et placez la plaque dans le plateau tampon. Complétez avec un peu de HBSS jusqu’à ce que le tissu soit entièrement immergé dans le tampon.
REMARQUE : Le montage des tissus dans une position verticale et stable est essentiel pour générer des tranches uniformément coupées. Si les tissus montés sont instables, soit ajouter plus de colle au tissu environnant pour conserver une position verticale ou décharger le tissu, aplatir le fond, et le coller à nouveau. Les tissus élastiques ont tendance à être poussés et pliés plus facilement pendant le tranchage, auquel cas des longueurs plus courtes (lt;5 mm) et plusieurs pistes peuvent être appropriées. Pour les tissus extrêmement fragiles, les essuie-tout peuvent détruire le tissu. Dans ce cas, le tissu peut être placé sur une surface en plastique pour évacuer certains excès de HBSS. - Ajuster les réglages vibratome. Les réglages suivants sont utilisés : épaisseur de coupe de 250 m, amplitude de 3,00 mm, vitesse de tranchement de 0,01 à 0,25 mm/s, et angle de lame de 15 à 21 degrés.
REMARQUE : Optimisez les réglages de découpe en fonction de la rigidité du tissu. Les tissus plus mous sont plus facilement coupés avec un angle plus profond de lame à une vitesse plus basse. Un angle de lame de 18 degrés, une vitesse de coupe comprise entre 0,10 et 0,18 mm/s, et une amplitude de 3,00 mm fonctionne bien pour les tumeurs 4T1 et PDX HCI010. Les tissus plus rigides peuvent être coupés avec une vitesse de lame plus rapide. - Définissez les emplacements de départ et de fin de la lame et ajustez la hauteur de la scène. Exécuter l’instrument avec un mode continu pour couper les tranches pendant plusieurs cycles jusqu’à ce que les tissus sont coupés uniformément.
- Continuez à trancher le tissu. Transférer les tranches avec une petite quantité de tampon HBSS sur l’insert de culture cellulaire avec moyen avec une pipette de transfert à large pointe, en utilisant l’aspiration pour soulever la tranche entière. Déposer une tranche par insert sur une assiette de 24 puits. Un insert pour 6 assiettes de puits peut accueillir jusqu’à quatre tranches pour un essai de reproduction.
REMARQUE : Si le dernier bord de la tranche de tissu est toujours attaché au tissu non coupé, arrêtez le vibratome et séparez la tranche de tissu avec deux paires de forceps fins de pointe sans toucher ou piquer les tranches de tissu. Une lame de rasoir séparée peut être utile pour enlever le tissu suspendu. - Retirez tout tampon excédentaire avec une pipette de transfert de pointe fine.
- Lorsque la lame atteint près des tissus collés, arrêtez l’instrument, abaissez le stade, retirez le tissu raidi avec une lame séparée et montez un nouveau tissu. Continuer à trancher jusqu’à ce que suffisamment de tranches aient été recueillies.
- Culture les plaques dans un incubateur humidifié fixé à 37 oC, 5% de CO2. Les tranches de tissu sont cultivées à l’interphase air-liquide sur l’insert de culture cellulaire. Les tranches de tissu sont prêtes pour des expériences 24-48 h après la préparation initiale de la tranche. Pour la culture à long terme, échangez le milieu tous les 2-3 jours.
2. Mesure de viabilité
- Pour la mesure de viabilité de la tranche tissulaire, échangez le milieu avec un réactif de mesure de viabilité basé sur la luminescence contenant à la fois la luciferase et le prosubstrate à 1:1,000 dilution dans le milieu TSC suivant les instructions du fabricant. Le réactif mesure l’activité de réduction des cellules vivantes du prosubstrate métabolisé à la luciferine11. Transférer 50 L de mélange d’enzymes-substrates sur chaque tranche de tissu.
- Incubate avec une agitation douce sur un shaker orbital situé à l’intérieur d’un incubateur humidifié fixé à 37 oC avec 5% de CO2 pendant la nuit.
- Les signaux luminescents peuvent être mesurés à l’aide d’un lecteur de microplaque ou d’un instrument d’imagerie in vivo pour les tissus cultivés dans une plaque de 24 puits. Pour mesurer la viabilité individuelle de plusieurs tissus sur une plaque de 6 puits, un système d’imagerie in vivo devrait être utilisé.
- Lorsque vous utilisez un lecteur de microplaque, réglez la microplaque sans couvercle. Tout type de lecteur de microplaque capable de mesurer l’intensité luminescente devrait convenir à l’expérience. Nous avons utilisé les paramètres suivants : le temps de lecture 1 s, la mesure par le haut, le gain de 200.
REMARQUE : Pour une plus grande précision, utilisez une microplaque à paroi blanche pour configurer l’expérience. Des plaques de puits à parois blanches et à fond clair de 24 ont été testées et, dans la plupart des cas, les plaques de puits claires ne compromettent pas les résultats. - Lors de l’utilisation d’un système d’imagerie in vivo pour mesurer la viabilité, placez la plaque au centre de la scène et retirez le couvercle. Acquérir des images photographiques normales suivies d’images luminescentes avec un champ de mise en scène à C, temps d’exposition automatique, f-stop 1, réglage objectif comme microplaque avec hauteur du sujet - 0,0 cm.
- Quantifiez l’intensité luminescente à l’aide du logiciel d’imagerie accompagné du système d’imagerie in vivo. Dessinez des régions d’intérêt cohérentes (ROI) autour de chaque tranche de tissu. Ce protocole utilise un cercle de 1 cm de diamètre comme retour sur investissement (voir la figure 1). Mesurer le flux total (p/s) de la zone.
- Lorsque vous utilisez un lecteur de microplaque, réglez la microplaque sans couvercle. Tout type de lecteur de microplaque capable de mesurer l’intensité luminescente devrait convenir à l’expérience. Nous avons utilisé les paramètres suivants : le temps de lecture 1 s, la mesure par le haut, le gain de 200.
3. Évaluation de l’effet médicamenteux sur les tranches de tissu
- Mesurer la viabilité de base avant le traitement à l’aide du réactif de mesure de la viabilité fondé sur la luminescence, comme l’explique la section 2.
REMARQUE : Si plusieurs tissus ont une viabilité significativement plus faible par rapport à d’autres, omettez les tissus de l’essai. - Dissoudre les médicaments dans le sulfoxide de diméthyle (DMSO) pour faire des solutions de stock. Préparer une solution de médicament 10x avec TSC ou autre milieu de culture (25 L/puits pour une plaque de puits de 24 contenant 250 L de milieu) aux concentrations désirées. Pour le contrôle du véhicule, préparer un support contenant un volume équivalent de DMSO.
- Complétez la solution de drogue 10x au milieu de culture au bas du puits. Mélanger par tuyauterie et transférer 50 l’un du milieu sur le dessus des tissus.
REMARQUE : Si plusieurs tranches de tissu sont disponibles, testez des doublons ou des triplicates pour chaque condition. - Incuber toute la nuit avec des secousses douces sur un shaker orbital dans un 37 'C, 5% de CO2, incubateur humidifié.
- Retirer la plaque du shaker et incuber statiquement dans le 37 oC, 5% de CO2, incubateur humidifié.
- Aux points de temps souhaités, mesurez l’intensité luminescente des tissus à l’aide d’un lecteur de microplaque ou d’un système d’imagerie in vivo. Habituellement, les effets de drogue deviennent détectables après 1-6 jours de traitement.
REMARQUE : Le réactif de viabilité basé sur la luminescence est stable pendant au moins 3 jours dans des conditions culturelles. Cependant, le substrat peut être épuisé pendant l’essai en fonction de l’activité métabolique du tissu. Si une baisse significative du signal est observée dans les tissus avec des signaux précédemment élevés, complétez le substrat dans tous les puits. - Calculer la viabilité restante des tissus tumoraux traités à l’aide de l’équation suivante :
La viabilité du tissu traité est normalisée par sa viabilité de base et le déplacement de viabilité des tissus de tumeur de contrôle.
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Representative Results
Ici, nous démontrons un temps-cours, protocole d’évaluation d’efficacité de drogue multiple pour des tranches de tissu de tumeur préparées à partir des tissus de tumeur de sein de souris 4T1 et un modèle de PDX de cancer du sein, HCI01012. Nous avons réussi à préparer des tranches de tissu de plusieurs tumeurs dérivées de souris, PDX, et les tumeurs patientes fraîches10. Le flux de travail global de la préparation du tissu tumoral et le test d’efficacité de drogue est décrit dans la figure 1. En général, nous pourrions préparer 20 à 40 tranches de tissu à partir d’une tumeur en vrac unique de 1 000 à 1 500 mm3 en volume.
Pour les mesures de viabilité, nous avons exploité un réactif de viabilité compatible avec les cellules vivantes à base de luminescent. Le traitement d’un inhibiteur multi-kinase, staurosporine, à une concentration de 1 M pendant 4 jours a réduit l’intensité du signal de 100x, par rapport aux tissus tumoraux traités avec le contrôle DMSO (figure 2A). Les tranches de tissu préparées à partir de la tumeur 4T1 ont été maintenues pendant au moins 21 jours avec l’échange moyen occasionnel(figure 2B). La plupart des mesures de réponse de drogue ont été exécutées dans les 7 jours de préparation de tranche de tissu. Étant donné que le réactif compatible avec les cellules vivantes ne nécessite pas de traitement ou de fixation avant la mesure, il nous a permis d’effectuer des mesures de cours de temps. Les changements dépendants du temps dans la viabilité des tranches de tissu de tumeur du tissu 4T1 identique de tumeur sont résumés dans la figure 2C. Staurosporine à 500 nM a diminué la luminescence du jour 1 et a atteint le niveau le plus bas au jour 4, restant faible pour chaque point de temps suivant. En revanche, l’intensité luminescente du groupe témoin des tissus complétés par DMSO est restée stable jusqu’au 6e jour. En outre, les tranches de tissu préparées à partir de tumeurs identiques de 4T1 ont été traitées avec des doses sérieuses de staurosporine (0-1 'M) pendant 4 jours, et ont montré des changements dose-dépendants dans la viabilité et EC50 (figure 2D).
Nous avons testé des médicaments chimiothérapeutiques sur des tranches de tissu préparées à partir d’un modèle orthotopique PDX du cancer du sein, HCI010. Les tranches de tissu PDX ont été traitées avec de la doxorubicine, un médicament chimiothérapeutique standard, à des doses de 0 à 5 M pendant 6 jours, ce qui a entraîné des changements de viabilité dépendants de la dose(figure 3A). En outre, l’efficacité de 17 médicaments, y compris les médicaments précliniques et médicalement approuvés, a été testée en triplicate sur des tranches de tissu préparées à partir d’une seule tumeur en vrac HCI010. Les médicaments ont été appliqués à 0,5 M pendant 4 jours en triplicate(figure 3B). Ces résultats fournissent la preuve de concept que le dépistage moyen-débit de drogue peut être exécuté sur des tranches de tumeur avec TME indigène.
Figure 1 : Schéma montrant la préparation de tranche de tissu suivie de l’évaluation d’efficacité de drogue. Les tissus tumoraux ont été traités en tranches de 6 mm de diamètre et 250 m d’épaisseur et cultivés dans l’interphase air-liquide avec le soutien des inserts de culture cellulaire. La viabilité des tissus a été mesurée à l’aide d’un réactif bioluminescent avant et après le traitement médicamenteux. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Mesure et réponse de la viabilité des tranches de tissu aux médicaments. (A) Images représentatives des mesures de viabilité basées sur la luminescence dans les tranches de tissu de tumeur de sein. Des tranches de tissu de la tumeur de 4T1 ont été incubées avec le contrôle de staurosporine ou de DMSO de 1 M avec le réagent de viabilité luminescent pendant 4 jours. Des images ont été obtenues à l’aide d’un système d’imagerie in vivo et analysées par le logiciel d’analyse d’images qui l’accompagne. Les cercles rouges indiquent le retour sur investissement mesuré pour la bioluminescence. En bas - Une parcelle montrant le signal luminescent des tranches de tissu tumoral traitées avec la staurosporine ou le contrôle tel que mesuré par un système d’imagerie in vivo. La barre indique la moyenne des quatre tranches de tissu montrées comme cercles (contrôle) ou carré (staurosporine traitée). (B) Une parcelle montrant la viabilité des tranches de tissu de tumeur de 4T1 cultivées pendant 21 jours de préparation. La viabilité au jour 21 mesurée par un système d’imagerie in vivo a été normalisée à celle du jour 3. Chaque point indique la mesure à partir d’une seule tranche; la barre indique la moyenne; la boîte montre les quartiles, et les moustaches montrent la valeur minimale à maximale de la mesure. (C) Mesures de temps-cours de la viabilité de tissu après le traitement de staurosporine. La viabilité des tranches de tissu de la tumeur de 4T1 traitée avec la staurosporine (500 nM) ou le volume équivalent de DMSO comme contrôle ont été mesurées au fil du temps. Les intensités de Luminescence ont été mesurées par un lecteur de microplate au-dessus des points de temps indiqués. Chaque point illustre un point de données à partir d’une tranche de tissu individuelle, et le graphique à barres indique moyen - SEM. (D) Traitement dépendant de la dose de staurosporine sur les tranches de tissu. Les tranches de tissu préparées à partir de la tumeur de 4T1 ont été complétées avec des doses sérieuses de staurosporine ou DMSO comme contrôle de véhicule. La viabilité restante basée sur la luminescence a été mesurée par un système d’imagerie in vivo à 4 jours après l’initiation du traitement. La viabilité relative a été calculée à l’aide de l’équation indiquée dans le protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Dépistage de médicaments dans des tranches de tissu préparées à partir d’un modèle PDX de cancer du sein. (A) Une parcelle montrant des changements de viabilité en réponse à diverses doses de doxorubicine. Les tranches de tissu ont été préparées à partir d’une tumeur orthotopique de cancer du sein DE PDX, HCI010. La viabilité a été mesurée en tranches traitées avec des doses titrées de doxorubicine. Après 6 jours, la luminescence a été mesurée à l’aide d’un système d’imagerie in vivo. Bar - moyenne - SEM. (B) Un petit écran de médicament chimiothérapeutique sur les tranches de tissu tumoral d’une tumeur orthotopique de cancer du sein PDX. Le graphique à barres moyen de l’expérience triplicate. Ces données ont été publiées précédemment10. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Matériel | Ml | Concentration finale | Stock |
| William’s Medium E | 500 | ||
| Nicotinamide | 6 | 12 mM | 1 M de stock de Nicotinamide dans le Medium E de Williams, stérilisé |
| Acide ascorbique | 6 | 50,4 g/mL | 0,21 g/50 mL (stock de 10 mM) d’acide ascorbique dans le moyen E de William, stérilisé |
| Sodium Bicarbonate | 15 | 2,25 mg/mL | Solution de 7,5 % (w/v) |
| Coussin HEPES | 10 | 20 mM | Solution stock de 1 M |
| Glucose | 10 | 5 mg/mL | 250 mg/ml de bouillon, stérilisé |
| Sodium Pyruvate | 5 | 1 mM | 100 mM de stock |
| L-Glutamine | 5 | 2 mM | 200 mM de stock |
| ITS et Premix | 5 | Contient de l’insuline recombinante humaine, de la transferrine humaine (12,5 mg chacune), de l’acide sélévant (12,5 g), de la BSA (2,5 g) et de l’acide linoléique (10,7 mg) | |
| Pénicilline-Streptomycine | 2 | 40 IU/mL Pen, 40 'g/mL Strep | 10 000 stylos IU/mL, 10 000 'g/mL Strep |
| Recombinant EGF | 0.5 | 20 ng/mL | 20 stock de g/mL |
Tableau 1 : Recette moyenne TSC.
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Discussion
Dans ce protocole, nous démontrons une plate-forme pour des études quantitatives, et en temps réel d’efficacité de drogue sur des tranches organotypic de tissu de tumeur. Le système de culture de tranche de tissu fournit des avantages distincts au-dessus des méthodes in vitro cellulaires traditionnelles en capturant l’hétérogénéité de cellules et les caractéristiques physiologiques du microenvironnement indigène de tumeur. Cette plate-forme permet également un débit plus élevé pour les tests d’efficacité des médicaments, aidant à combler le fossé entre les études de culture cellulaire et les expériences in vivo.
Pour obtenir des résultats précis et cohérents, il est impératif de minimiser les lésions tissulaires pendant la préparation. Les tranches de tissu doivent être manipulées avec de larges pipettes en plastique pour éviter les dommages causés par le contact physique. Le volume moyen de culture doit être maintenu pour permettre à la tranche de tissu de contacter à la fois l’air et le milieu pendant la durée de l’expérience.
Le milieu de culture doit être optimisé en fonction du type de tissu et du but expérimental. Le médium TSC utilisé dans ce protocole est un milieu sans sérum qui a été développé à l’origine pour la culture hépatocyte primaire13. Ce milieu a également été utilisé pour maintenir plusieurs types de tumeurs, y compris le sein, le foie, le côlon et le pancréas10. En outre, nous avons démontré une survie accrue des cellules immunitaires à l’aide d’un moyen optimisé à base de DMEM10. Les réglages vibratome doivent être optimisés en fonction de la texture des tissus pour obtenir des tranches de tissu tumoral intactes et uniformes. Le découpage des tissus plus doux et/ou lâchement consolidés est généralement facilité en utilisant des angles plus profonds de lame, une vitesse de coupe plus lente et des tranches plus épaisses. De temps en temps, les tissus sont trop mous pour couper, auquel cas les chercheurs devraient envisager d’intégrer le tissu dans l’agarose de point de fusion bas, une technique commune dans le tissu cérébral trancheant14,15.
Auparavant, plusieurs études ont introduit des approches thérapeutiques de test de drogue sur les tranches de tissu cultivé. Ces études se sont appuyées sur l’incorporation fluorescente de colorant, l’immunohistochimie, ou les essais de MTT pour évaluer la viabilité des tissus6,7,8,9. Dans ce protocole, nous avons utilisé le réactif compatible avec les cellules en luminescence RealTime-Glo11 pour mesurer la viabilité. Les essais basés sur la luminescence ont plusieurs avantages par rapport aux méthodes précédemment utilisées, y compris une sensibilité accrue, une plus grande plage de signaux et la capacité de faire rapidement des mesures de viabilité en temps réel. Le temps de mesure est court pour les lecteurs de microplaque (1 s/puits) et pour un système d’imagerie in vivo (1 min/plaque) et peut fournir des lectures d’intensité du signal directement avec un traitement minimal. L’acquisition plus rapide du signal et moins d’étapes de posttraitement sont des caractéristiques nécessaires dans le dépistage des médicaments à haut débit, ce qui permet des mesures de viabilité à base de luciferine pour permettre un débit d’échantillon beaucoup plus grand dans la culture des tranches de tissu. Bien qu’un essai à base de luciferase fournisse une mesure quantitative précise de la viabilité de la tranche entière, il est incapable de détecter les changements médicamenteux-induits de type cellulaire spécifique dans le tissu. Cependant, l’accouplement des mesures de viabilité basées sur la luminescence avec le point final IHC sur la même tranche de tissu permettra des mesures spécifiques au type cellulaire.
Tandis que le système de culture de tranche de tissu est un outil puissant en apportant la complexité de tissu de tumeur à une plate-forme de criblage de haut-débit, il a plusieurs inconvénients. L’hétérogénéité inhérente dans un tissu tumoral peut causer des réponses de drogue différentielles parmi des tranches de tissu même de la même tumeur en vrac. À l’occasion, nous avons observé des variations relativement importantes de la réponse des médicaments parmi les tranches de tissus dans nos expériences. Nous pouvons partiellement surmonter cette variation en faisant la moyenne de plusieurs tranches de tissu préparées à partir de différents sites dans la même tumeur. Bien que la culture des tranches de tissu puisse être maintenue au niveau de base de la viabilité pendant au moins 21 jours(figure 2B), les populations cellulaires changent au fil du temps. Nous avons décrit des changements dans la population de cellules immunitaires au cours des expériences de culture de tranches de tissu10. Par conséquent, nous recommandons que les tranches de tissu soient examinées sur des intervalles de temps de culture plus courts pour récapituler les caractéristiques indigènes des tissus.
La culture des tranches de tissu est prête à combler une lacune critique dans la découverte et le développement de médicaments entre le dépistage de la culture cellulaire à haut débit et les expériences animales. Des centaines de médicaments peuvent être évalués sur des tranches produites à partir d’une biopsie tumorale unique, ajoutant une pertinence physiologique accrue avant des études animales. Ce système pourrait aider à réduire le nombre d’expériences animales nécessaires pour mettre les médicaments sur le marché. En outre, les tranches de tissu préparées à partir des tumeurs patientes ont le potentiel d’information dans les plans de traitement de guidage dans la clinique. Plus d’une centaine de médicaments thérapeutiques sont disponibles aujourd’hui, mais il ya peu de biomarqueurs pour guider leur sélection. En outre, l’hétérogénéité chez les patients entraîne également des disparités dans la réponse. Les tranches de tissu d’une biopsie patiente peuvent être employées pour tester plusieurs drogues avant de traiter systémiquement, fournissant des informations valables sur l’efficacité de drogue dans la semaine. Dans l’ensemble, les tests en temps réel et rapides des médicaments utilisant des systèmes de culture de tranches de tissu ont un grand potentiel dans le développement de médicaments contre le cancer et les décisions thérapeutiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] et Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Nous tenons à remercier la Dre Alana Welm (Université de l’Utah) d’avoir fourni la tumeur PDX du cancer du sein. Nous tenons également à remercier le personnel de la médecine comparée, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) pour l’entretien du modèle PDX et les membres du laboratoire Gujral pour des discussions utiles. N.N.A est appuyée par la JSPS Overseas Research Fellowship and Interdisciplinary Training Grant du FHCRC. A.J.B. est soutenu par la subvention de formation sur le métabolisme des chromosomes et le cancer du FHCRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
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