Summary
我々は、組織性腫瘍組織スライスにおけるリアルタイム薬物応答を測定するためのプロトコルを導入する。ここで概説する実験戦略は、ex vivo条件下で臨床またはマウス腫瘍に由来する組織スライス上で中高スループットの薬物スクリーンを実施するためのプラットフォームを提供する。
Abstract
腫瘍組織は、癌細胞、浸潤免疫細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および細胞外マトリックスから構成される。この複雑なミリューは、腫瘍微小環境(TME)を構成し、インビボまたは薬物応答ex vivoでの治療に対する応答を調節することができる。従来のがん創薬スクリーンは、単層で培養された細胞に対して行われ、TMEの影響を極めて欠けるシステムである。したがって、高感度かつハイスループットなアッセイを生理学的TMEと統合する実験システムは、前臨床創薬プロセスを強化する。ここでは、中高スループットの薬物スクリーニングのプラットフォームとして、エキビボ腫瘍組織スライス培養を紹介する。オルガノミピック組織スライス培養は、液体空気界面で多孔質膜の支持を得て維持される、正確に切断された薄い腫瘍切片を構成する。本プロトコルでは、患者由来異種移植片(PDX)モデルからマウス腫瘍および腫瘍から調製された組織スライスの調製および維持について説明する。薬物治療に応答して組織生存率の変化を評価するために、我々は生体適合性の発光ベースの生存率アッセイを活用し、組織中の生存細胞のリアルタイム、迅速かつ敏感な測定を可能にした。このプラットフォームを用いて、マルチキナーゼ阻害剤、スタウロスポリン、および細胞傷害剤であるドキソルビシンに対する組織スライスの用量依存応答を評価した。また、単一PDX腫瘍から調製した組織スライスに対して17の臨床および前臨床薬をスクリーニングすることにより、エキビボ薬理学用の組織スライスの適用を実証する。生理学的に関連性が高く、高感度で堅牢なex vivoスクリーニングプラットフォームは、前臨床腫瘍学の創薬と治療の意思決定を大幅に強化します。
Introduction
癌細胞は、周囲の間質組織の物理的および生化学的特性との相互作用がTMEを形成する。TMEは、腫瘍の増殖、転移、および治療1に対する腫瘍応答を調節することを刺激することができる。従来の前臨床薬開発では、薬剤候補は、典型的には、培養癌細胞株を用いて最初にスクリーニングされる、TME2を極度2に欠けているアッセイプラットフォームである。細胞ベースの事前スクリーニング段階における生理学的TMEの欠如は、腫瘍を持つ動物モデルにおける有効な薬剤の発見を制限し、開発の後期臨床段階で多くの有望な腫瘍学的薬剤の高い消耗率に寄与し得る3。
腫瘍薬物反応を調節する上でTMEの重要性にもかかわらず、実験的制約は、創薬および開発の初期段階におけるより生理学的に関連するシステムの適用を制限する。動物モデルまたは患者の腫瘍標本から腫瘍に対して何百もの治療薬をスクリーニングすることは現実的ではない。確かに、外科標本は様々な遺伝的背景を持つ希少な資源であり、動物モデルにおける何千もの候補分子をスクリーニングすることは、実験的規模、コスト、および動物福祉のために実現不可能である。
腫瘍組織スライス培養は、正確に切断され、薄い腫瘍切片がex vivoで培養され、薬物スクリーニングアッセイにおける生理学的TMEの限界に対処することができる。歴史的に、神経科学の分野は、脳組織4のためのスライス培養の開拓および広範な最適化を行った。近年、多くの研究は、細胞株由来腫瘍、自発的腫瘍モデル、患者由来の異種移植片(PDX)、および原発性患者腫瘍を含む様々なタイプの腫瘍組織からのスライスの調製を実証している。エクスビボ組織スライス培養は、生体内およびインビトロ培養5の両方から利益を統合する。腫瘍組織スライスは、無傷の組織アーキテクチャと可変細胞組成を保持し、TMEコンテキスト内の癌細胞の研究を可能にする。
このプロトコルは、薬物応答を評価するために、リアルタイムで高感度な生存アッセイと組み合わせたorganotypic腫瘍組織スライス培養システムを導入する。以前に導入されたプロトコルにおけるorganotypic型腫瘍組織スライスの薬物有効性試験は、蛍光色素の組み込み、免疫組織化学(IHC)、またはMTT((3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-2]-2,5ジフェニルテトラゾリウム臭化物)アッセイ6,7,6,7,8,9による細胞生存率の変化を測定することに依存している。8,9しかし、これらの方法はすべてエンドポイントアッセイであり、低感度、長い処理時間、複雑なデータ分析、狭い信号範囲、および高い実験誤差に苦しんでいます。当社の発光ベースの生細胞適合試薬は、事前処理と最小限の後処理なしで広い信号範囲と瞬時(〜5分)の測定を提供することにより、これらのアッセイを改善します。この試薬は高感度で、細胞培養培地に共存できるため、細胞生存率の連続的かつタイムコース測定が可能です。このアッセイシステムは、前臨床薬物開発における組織スライス上の薬剤候補のハイスループットスクリーニングに適用可能である。
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Protocol
すべてのマウス実験は、動物福祉法の実験動物のケアと使用のためのガイドと生物医学研究における動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイドラインの勧告に従って行われました。
1. 腫瘍組織スライスの調製
- 表1のレシピに続いて組織スライス培養(TSC)培地を準備する。0.45 μm真空フィルターユニットで媒体をフィルター処理して滅菌します。
- アリコート 250 μL の TSC 培地は、24 ウェルプレートの場合はウェルあたり、または 6 ウェルプレートの場合は 1 mL の培地です。使用するまで37°C、5%CO2加湿2インキュベーターにプレートを保管してください。
注:培地とサプリメントは、組織の種類と実験目標に応じて最適化することができます。培地の量は、培養挿入物の多孔膜を浸すのに十分であるべきである。膜のレベルを超えないようにしてください。中程度のレベルが低すぎる場合や高すぎる場合は、中音量を調整します。研究者が免疫調節薬を検査している場合は、IL-210で培地を補充することをお勧めします。 - マウス由来の腫瘍組織を用いる場合、推奨処置でマウスを安楽死させ、70%エタノールを散布してマウスの露出した皮膚を消毒し、無菌技術で腫瘍を解剖する。腫瘍組織を氷冷ハンクのバランス塩溶液(HBSS)を含むチューブに保存します。
- 新鮮な患者の腫瘍組織を使用する場合は、短期的には氷冷HBSSに保管するか、またはウィスコンシン州の氷冷ベルツァー大学(UW)溶液で長期保存(最大24時間)で組織の生存率を維持します。
注:氷冷UW溶液で一晩出荷されたPDX組織からのスライスは正常に準備されました。 - 腫瘍組織を氷冷HBSSを含む10cm培養プレートに移す。氷冷HBSSに沈めながら、メスで腫瘍を半分に切ります。6mmの直径の生検パンチを使用して腫瘍組織をシリンダーに形作り、片側をトリミングして平らな表面を作ります。使用するまで氷冷HBSSに組織を保管してください。
メモ:一般的に中心にあり、不透明で壊れやすい外観を持つ組織の壊死領域を含めないようにしてください。 - ビブラートを設定します。70%エタノールを使用してすべての機器を消毒します。アクリルガラスの蓋で覆われたビブラートメのバッファートレイをビブラートメ氷浴の中央に置きます。氷浴に氷を加え、冷却されたHBSSでバッファトレイを満たし、スライスしながらティッシュを冷たく保ちます。刃ホルダーにカミソリの刃を取り付けます。
注意:振動子を半滅菌環境に保つことは以前の実験に影響を与えませんが、可能であればバイオセーフティキャビネットの下にビブラートを保管することをお勧めします。 - 歯付き鉗子を使用してHBSSから生検パンチ腫瘍組織を慎重に持ち上げ、糸くずのないペーパータオルで組織を手に入れ、余分な緩衝液を取り除きます。
- 標本の版の上に医学等級のシアノアクリルの接着剤の滴を置き、この滴の上にティッシュを置く。接着剤を2~3分間エアドライし、プレートをバッファートレイに入れます。組織がバッファーに完全に浸漬されるまで、いくつかの HBSS を補います。
注:組織を直立した安定した位置に取り付けることは、均一に切断されたスライスを生成するために重要です。装着された組織が不安定な場合は、周囲の組織にさらに接着剤を追加して直立位置を保持するか、組織をアンロードし、底部を平らにしてもう一度接着します。弾性組織は、スライス中に押し込まれ、曲がりやすい傾向があり、その場合は長さが短く(<5 mm)、複数の実行が適切です。非常に壊れやすい組織の場合、ペーパータオルは組織を破壊する可能性があります。この場合、組織は、いくつかの余分なHBSSを離れてウィックするためにプラスチック表面に配置することができます。 - ビブラートの設定を調整します。切断厚 = 250 μm、振幅 = 3.00 mm、スライス速度 = 0.01~0.25 mm/s、ブレード角度 = 15°~21°の設定が使用されます。
注: 組織の剛性に応じてスライス設定を最適化します。より柔らかいティッシュはより速い速度のより深い刃の角度によってより容易に切られる。刃角18°、切断速度は0.10~0.18mm/s、振幅3.00mmはマウス4T1およびPDX HCI010腫瘍に適しています。硬いティッシュはより速い刃の速度と切断することができる。 - ブレードの開始位置と終了位置を設定し、ステージの高さを調整します。ティッシュが均一に切断されるまで、数サイクルのスライスをカットするために連続モードで器具を実行します。
- 組織をスライスし続けます。少量のHBSSバッファーと共に、幅の広いチップ転送ピペットを使用して、スライス全体を持ち上げるため、広いチップ転送ピペットを用いた培地で、少量のHBSSバッファーをセル培養インサートに移します。24ウェルプレートに挿入ごとに1つのスライスを置きます。6つのウェルプレート用のインサートは、複製アッセイ用に最大4枚のスライスを収容できます。
注:ティッシュスライスの最後の端がまだノーカットティッシュに取り付けられている場合は、ビブラートを停止し、組織スライスに触れたり突いたりすることなく、2組の細かい先端鉗子で組織スライスを分離します。別のカミソリの刃は、吊り下げ組織を除去するのに役立ちます。 - 細かいチップ転送ピペットで余分なバッファーを取り除きます。
- 刃が接着された組織の近くに達したら、器具を停止し、ステージを下げ、別のブレードで硬くなった組織を取り除き、新しい組織を取り付ける。十分なスライスが収集されるまでスライスを続けます。
- プレートを37°C、5%CO2に設定した加湿インキュベーターで培養2する。組織スライスは、細胞培養インサート上の空気液間相で培養される。組織スライスは、最初のスライス調製後24〜48時間の実験の準備ができています。長期栽培のために、2~3日ごとに培地交換を行う。
2. 生存率測定
- 組織スライスの生存率測定のために、ルシファーゼとプロ基板の両方を含む発光ベースの生存率測定試薬と、メーカーの指示に従ってTSC培地中の1:1,000希釈で培地を交換します。試薬は、代謝されたプロ基板の生細胞の還元活性をルシフェリン11に測定する。各組織スライスの上に酵素-基質混合物の50 μLを移す。
- 加湿式インキュベーターの内側に位置するオービタルシェーカーに穏やかな攪拌でインキュベートし、一晩で5%CO2で37°Cに設定します。
- 発光信号は、マイクロプレートリーダーまたは24ウェルプレートで培養された組織用のインビボイメージング装置を使用して測定できます。6ウェルプレート上の複数の組織の個々の生存率を測定するには、in vivoイメージングシステムを使用する必要があります。
- マイクロプレートリーダーを使用する場合は、蓋を付けずにマイクロプレートをセットします。発光強度を測定できるマイクロプレートリーダーの任意のタイプは、実験に適している必要があります。読み取り時間 = 1 s、上から測定、ゲイン = 200の設定を使用しました。
メモ: 精度を高めるには、白壁のマイクロプレートを使用して実験を設定します。白壁、明確な底24の井戸の版はテストされた、そしてほとんどの場合、明確な井戸の版は結果を妥協しない。 - 生体内イメージングシステムを使用して生存率を測定する場合は、プレートをステージの中央に置き、蓋を取り外します。Cでステージ設定のフィールドを持つ発光画像が続く通常の写真画像を取得し、自動露光時間、f-ストップ=1、被写体の高さ= 0.0cmのマイクロプレートとしての目標設定。
- in vivoイメージングシステムを伴うイメージングソフトウェアを使用して、発光強度を定量化します。各組織スライスの周囲に一貫した関心領域(ROI)を描きます。このプロトコルは、ROI として直径 1 cm の円を使用します (図 1を参照)。面積の総流束(p/s)を測定します。
- マイクロプレートリーダーを使用する場合は、蓋を付けずにマイクロプレートをセットします。発光強度を測定できるマイクロプレートリーダーの任意のタイプは、実験に適している必要があります。読み取り時間 = 1 s、上から測定、ゲイン = 200の設定を使用しました。
3. 組織スライスに対する薬物効果の評価
- セクション2で説明したように、発光ベースの生存率測定試薬を用いて治療前のベースライン生存率を測定する。
注:いくつかの組織が他の組織と比較して有意に低い生存率を有する場合は、アッセイから組織を省略してください。 - ジメチルスルホキシド(DMSO)に薬剤を溶解し、ストック液を作ります。所望の濃度でTSCまたは他の培養培地(250 μLの培地を含む24ウェルプレートの場合は25μL/well)を用いて10倍の薬剤溶液を調製します。車両制御のために、DMSOの同等の容積を含む媒体を準備する。
- ウェルの底にある培養培地に10倍の薬物溶液を補充する。ピペットで混合し、組織の上に培地の50 μLを移します。
注:複数の組織スライスが利用可能な場合は、各条件の重複またはトリクエートをテストします。 - 37°C、5%CO2、加湿インキュベーターで軌道シェーカーで穏やかな2揺れで一晩インキュベート。
- プレートをシェーカーから取り出し、37°C、5%CO2、加湿イン2キュベーターで静にインキュベートします。
- 所望のタイムポイントで、マイクロプレートリーダーまたはインビボイメージングシステムを使用して組織からの発光強度を測定する。通常、薬物効果は1〜6日間の治療後に検出可能になる。
注:発光ベースの生存率試薬は、培養条件下で少なくとも3日間安定しています。しかし、組織の代謝活性に応じて、アッセイ中に基質が枯渇する場合がある。以前に高いシグナルを持つ組織で有意なシグナル低下が観察された場合は、すべてのウェルの基質を補完する。 - 次の式を使用して、処理された腫瘍組織の残りの生存率を計算します。
治療された組織の生存率は、制御腫瘍組織のベースライン生存率および生存率シフトによって正規化される。
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Representative Results
ここで、マウス4T1乳房腫瘍組織および乳癌PDXモデルから調製された腫瘍組織スライスに対する複数の薬物有効性評価プロトコルである時間経過を示す、HCI01012を示す。我々は、いくつかのマウス由来腫瘍、PDX、および新鮮な患者腫瘍10からの組織スライスの準備に成功した。腫瘍組織製剤および薬物有効性試験の全体的なワークフローは、図1に記載されている。一般に、体積1,000~1,500mm3の単一バルク腫瘍から20~40個の組織3スライスを準備することができました。
生存率測定では、発光ベースの生細胞適合性生存率試薬を利用しました。マルチキナーゼ阻害剤の治療は、スタウロスポリンを、1μM濃度で4日間、DMSOコントロールで治療した腫瘍組織と比較して100倍のシグナル強度を低下させた(図2A)。4T1腫瘍から調製した組織スライスを、時折中型交換で少なくとも21日間維持した(図2B)。薬物応答測定の大部分は、組織スライス調製から7日以内に行った。生細胞適合試薬は測定前に処理や固定を必要としないため、タイムコース測定を行える。同一の4T1腫瘍組織からの腫瘍組織スライスの生存可能性の時間依存的変化を図2Cに要約する。500nMのスタウロスポリンは1日目から発光を減少させ、4日目で最低レベルに達し、その後の各時点で低いままである。対照的に、DMSOを補った組織の対照群からの発光強度は6日目まで安定していた。さらに、同一の4T1腫瘍から調製した組織スライスを、4日間のスタウロスポリン(0~1μM)の連続投与で処理し、生存率およびEC50の用量依存的変化を示した(図2D)。
乳癌の正腸PDXモデルHCI010から調製された組織スライスに対する化学療法薬を試験した。PDX組織スライスは、標準的な化学療法薬であるドキソルビシンを6日間0〜5μMの用量で処理し、生存率の用量依存性の変化を提供した(図3A)。また、前臨床および臨床的に承認された薬剤を含む17の薬剤の効能を、単一バルクHCI010腫瘍から調製した組織スライス上の三重化で試験した。この薬剤は、3重化で4日間0.5μMで塗布した(図3B)。これらの結果は、中スループットの薬物スクリーニングがネイティブTMEを有する腫瘍スライスに対して行うことができるという概念実証を提供する。
図1:組織スライス調製物の後に薬剤有効性評価を示す模式図。腫瘍組織は、直径6mm、厚さ250μmのスライスに加工し、細胞培養インサートからの支持を得て空気液間相で培養した。組織の生存率は、薬物治療の前後の両方で生物発光試薬を用いて測定した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:薬剤に対する組織スライスの生存率測定および応答(A) 乳房腫瘍組織スライスにおける発光ベースの生存率測定の代表的な画像。4T1腫瘍からの組織スライスを、1μMスタウロスポリンまたはDMSO対照を、発光生用アッセイ試薬と共に4日間インキュベートした。in vivoイメージングシステムを用いて画像を取得し、付随する画像解析ソフトウェアで解析した。赤い円は生物発光のために測定されたROIを示す。下=インビボイメージングシステムで測定したスタウロスポリンまたはコントロールで治療された腫瘍組織スライスからの発光シグナルを示すプロット。棒は、円(対照)または正方形(スタウロスポリン処理)として示される4つの組織スライスの平均を示す。(B)4T1腫瘍組織スライスの生存率を示すプロットを、調製から21日間培養した。Bin vivoイメージングシステムにより測定された21日目の生存率は、3日目の基準に正規化した。各ドットは、1 つのスライスからの測定値を示します。バーは平均を示します。ボックスには四分位数が表示され、ひげは測定値の最小値から最大値を示します。(C)スタウロスポリン処理後の組織生存率のタイムコース測定。スタウロスポリン(500 nM)またはDMSOの同等の量をコントロールとして処理した4T1腫瘍からの組織スライスの生存率を、時間の経過とともに測定した。発光強度は、示されたタイムポイントにわたってマイクロプレートリーダーによって測定された。各ドットは、個々の組織スライスからのデータポイントを示し、棒グラフは、組織スライス上のスDタウロスポリンの平均±SEM(D)用量依存的治療を示す。4T1腫瘍から調製した組織スライスは、スタウロスポリンまたはDMSOの連続投与を車両制御として補充した。発光に基づく残りの生存率を、治療開始後4日目にインビボイメージングシステムで測定した。相対生存率は、プロトコルに示す式を用いて計算した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:乳癌PDXモデルから調製した組織スライスにおける薬物スクリーン。(A)ドキソルビシンの種々の用量に応答して生存率の変化を示すプロット。組織スライスを、PDX腫瘍である同位所の乳癌PDX腫瘍から調製した。生存率は、ドキソルビシンの滴定用量で処理されたスライスで測定した。6日後、インビボイメージングシステムを用いて発光を測定した。Bar =平均 ± SEM. (B) PDX腫瘍の異形性乳癌由来の腫瘍組織スライスに対する小規模な化学療法薬スクリーン。棒グラフ=三重実験の平均±SEM。これらのデータは以前に公開されています10.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 材料 | Ml | 最終濃度 | 株式 |
| ウィリアムズ ミディアム E | 500 | ||
| ニコチンアミド | 6 | 12mM | ウィリアムズ中型Eのニコチンアミド1M在庫、殺菌 |
| アスコルビン酸 | 6 | 50.4 μg/mL | 0.21 g/50 mL (>10 mM 在庫) の スコルビン酸 をウィリアムズ 中型 E で除菌 |
| 炭酸水素ナトリウム | 15 | 2.25 mg/mL | 7.5% (w/v) ソリューション |
| ヘペスバッファー | 10 | 20mM | 1 Mストックソリューション |
| グルコース | 10 | 5 mg/mL | 250 mg/ml ストック、滅菌 |
| ピルビン酸ナトリウム | 5 | 1 mM | 100 mM在庫 |
| L-グルタミン | 5 | 2 mM | 200 mM 在庫 |
| ITS + プレミックス | 5 | ヒト組換えインスリン、ヒトトランスフェリン(それぞれ12.5mg)、セレン酸(12.5μg)、BSA(2.5g)、リノール酸(10.7mg)を含む | |
| ペニシリンストレプトマイシン | 2 | 40 IU/mLペン、40 μg/mLストレップ | 10,000 IU/mLペン、10,000 μg/mLストレップ |
| 組換えEGF | 0.5 | 20 ng/mL | 20 μg/mL 在庫 |
表1:TSC培地のレシピ。
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Discussion
このプロトコルでは、organotypic腫瘍組織スライスに関する定量的かつリアルタイムの薬物有効性研究のためのプラットフォームを実証する。組織スライス培養システムは、天然腫瘍微小環境の細胞異質性および生理学的特徴を捕捉することにより、従来の細胞ベースのin vitro法よりも明確な利点を提供する。このプラットフォームは、薬物有効性試験のスループットを高め、細胞培養研究と生体内実験のギャップを埋めるのに役立ちます。
正確で一貫した結果を得るためには、調製中の組織の損傷を最小限に抑えることが不可欠です。物理的な接触によって引き起こされる損傷を避けるために、ティッシュスライスは広い先端プラスチックピペットと処理されるべきである。培養培地の体積は、実験の間、組織スライスが空気と媒体の両方に接触できるように維持されなければならない。
培養培地は、組織の種類や実験目的に応じて最適化する必要があります。このプロトコルで使用されるTSC培地は、原発性肝細胞培養13のためにもともと開発された無血清培地である。この培地はまた、いくつかのタイプの腫瘍を維持するために使用されてきたが、乳癌、肝臓、結腸、膵臓10を含む。さらに、最適化されたDMEMベースの培地10を用いて免疫細胞生存率を高める方法を実証した。ビブラートームの設定は、組織のテクスチャに基づいて最適化され、無傷で均一な腫瘍組織スライスを得る必要があります。より柔らかく、または緩く統合されたティッシュをスライスすることは、通常、より深い刃の角度、遅い切断速度および厚いスライスを使用することによって容易になる。時折、組織は柔らかすぎて切断できないが、その場合、研究者は低融点アガロース内に組織を埋め込むことを検討すべきである、脳組織スライス14、15,15に共通する技術。
以前, いくつかの研究は、培養組織スライスに治療薬のテストアプローチを導入しました.これらの研究は、組織の生存率を評価するために蛍光染料の組み込み、免疫組織化学、またはMTTアッセイに依存していた6,7,8,,9.このプロトコルでは、発光ベースの生細胞適合試薬RealTime-Glo11を使用して生存率測定を行いました。発光ベースのアッセイは、感度の向上、信号範囲の広さ、リアルタイムの生存率測定を迅速に行う機能など、以前に使用された方法に対していくつかの利点があります。測定時間はマイクロプレートリーダー(〜1s/well)とインビボイメージングシステム(〜1分/プレート)の両方に短く、最小限の処理で信号強度の測定値を直接提供できます。高スループットの薬物スクリーニングでは、シグナルの取得を速め、後処理ステップが少なくてすむ機能が必要であり、ルシフェリンベースの生存率測定により、組織スライス培養におけるサンプルスループットをはるかに大きくすることができます。ルシファーゼベースのアッセイは、スライス全体の生存率を正確かつ定量的に測定しますが、組織の薬物誘発細胞型特異的変化を検出することができません。しかし、同じ組織スライス上のエンドポイントIHCとの結合発光ベースの生存率測定は、細胞タイプ特異的測定を可能にする。
組織スライス培養システムは、腫瘍組織の複雑さをハイスループットスクリーニングプラットフォームに持ち込む強力なツールですが、いくつかの欠点があります。腫瘍組織内の固有の不均一性は、同じバルク腫瘍からの組織スライス間で差動薬物応答を引き起こす可能性がある。時折、我々の実験では、組織スライス間の薬物反応の比較的大きな変動を観察した。同じ腫瘍内の異なる部位から調製された複数の組織スライスを平均化することで、この変動を部分的に克服することができます。組織スライス培養は少なくとも21日間生存率のベースラインレベルで維持することができるが(図2B)、細胞集団は時間の経過とともに変化する。我々は、組織スライス培養実験10の過程における免疫細胞集団の変化について述べた。そのため、ネイティブの組織特性を再現するために、より短い培養時間間隔で組織スライスを調べることをお勧めします。
組織スライス培養は、高スループット細胞培養スクリーニングと動物実験との間の創薬および開発における重要なギャップを埋める準備ができている。何百もの薬物は、単一の腫瘍生検から産生されるスライスで評価することができ、動物実験の前に生理学的関連性を高める。このシステムは、医薬品を市場に投入するために必要な動物実験の数を減らすのに役立つ可能性があります。さらに、患者腫瘍から調製された組織スライスは、診療所で治療計画を導く有益な可能性を有する。今日では100以上の治療薬が入手可能ですが、選択を導くバイオマーカーはほとんどありません。また、患者の異質性もそれに応じて格差を生じる。患者生検の組織スライスは、全身治療前に複数の薬物を検査するために使用することができ、1週間以内に薬物の有効性に関する貴重な情報を提供する。全体的に、組織スライス培養システムを使用した薬物のリアルタイムかつ迅速な検査は、がん治療薬の開発および治療上の決定に大きな可能性を秘めています。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作品は、NIH/NCI[K22CA201229、P30CA015704]、シドニー・キンメル財団[キンメル・スカラー賞]、肺癌発見賞(LCD-505536)によって支えられました。乳がんPDX腫瘍を提供してくれたアラナ・ウェルム博士(ユタ大学)に感謝します。また、比較医学、フレッド・ハッチンソンがん研究センター(FHCRC)のスタッフ、PDXモデルのメンテナンス、グジュラルラボのメンバーの皆様に有益な議論をいただきたいです。N.N.Aは、FHCRCのJSPS海外研究フェローシップと学際的トレーニング助成金の支援を受けています。A.J.B.は、FHCRCの染色体代謝および癌トレーニング助成金によって支えられています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
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