Summary
Vi introduserer en protokoll for måling av sanntids narkotikarespons i organotypic tumorvevskiver. Den eksperimentelle strategien skissert her gir en plattform for å utføre middels høye gjennomstrømningsmedikamentskjermer på vevsskiver avledet fra kliniske eller mussvulster i ex vivo-forhold.
Abstract
Tumorvev består av kreftceller, infiltrerte immunceller, endotelceller, fibroblaster og ekstracellulær matrise. Dette komplekse miljøet utgjør tumormikromiljøet (TME) og kan modulere respons på terapi in vivo eller legemiddelrespons ex vivo. Konvensjonelle kreft narkotika oppdagelse skjermer utføres på celler dyrket i en monolayer, et system kritisk mangler påvirkning av TME. Dermed vil eksperimentelle systemer som integrerer sensitive og høygjennomstrømningsanalyser med fysiologisk TME styrke den prekliniske narkotikaoppdagelsesprosessen. Her introduserer vi ex vivo tumorvevskivekultur som en plattform for middels høy gjennomstrømning ser ut til å være en av de ulike i de ulike årene. Organotypic vev skive kultur utgjør nøyaktig kuttet, tynne tumor seksjoner som opprettholdes med støtte fra en porøs membran i en flytende luft grensesnitt. I denne protokollen beskriver vi forberedelse og vedlikehold av vevsskiver utarbeidet av musesvulster og svulster fra pasientavledede xenograft (PDX) modeller. For å vurdere endringer i vevslevedyktighet som svar på medikamentell behandling, utnyttet vi en biokompatibel luminescensbasert levedyktighetsanalyse som muliggjør sanntid, rask og sensitiv måling av levedyktige celler i vevet. Ved hjelp av denne plattformen evaluerte vi doseavhengige responser av vevsskiver til multikinasehemmeren, staurosporin og cytotoksisk middel, doksorubicin. Videre demonstrerer vi anvendelsen av vevsskiver for ex vivo farmakologi ved screening 17 kliniske og prekliniske legemidler på vevskiver utarbeidet fra en enkelt PDX-svulst. Vår fysiologisk relevante, svært følsomme og robuste ex vivo screening plattform vil i stor grad styrke preklinisk onkologi narkotika oppdagelse og behandling beslutningstaking.
Introduction
Kreftcelleinteraksjoner med de fysiske og biokjemiske egenskapene til det omkringliggende stromalvevet danner TME. TME kan stimulere tumorvekst, metastase og modulere tumorrespons på terapi1. I konvensjonell preklinisk legemiddelutvikling blir legemiddelkandidater vanligvis først screenet ved hjelp av kultiverte kreftcellelinjer, en analyseplattform som kritisk mangler TME2. Denne mangelen på fysiologisk TME i cellebaserte prescreeningstadier kan begrense oppdagelsen av effektive midler i tumorbærende dyremodeller og kan bidra til den høye attrisjonsraten til mange lovende onkologimedisiner i senere kliniske stadier av utvikling3.
Til tross for betydningen av TME i modulerende tumor narkotika responser, eksperimentelle begrensninger begrense anvendelsen av mer fysiologisk relevante systemer i de tidlige stadiene av narkotika oppdagelse og utvikling. Det er upraktisk å screene hundrevis av terapeutiske midler på svulster fra dyremodeller eller pasienttumorprøver. Faktisk er kirurgiske prøver knappe ressurser med variert genetisk bakgrunn og screening tusenvis av kandidatmolekyler i dyremodeller er ikke mulig på grunn av eksperimentell skala, kostnader og dyrevelferd.
Tumorvevskivekultur, hvor nøyaktig kuttet, tynne tumorseksjoner er kultivert ex vivo, kan ta opp begrensningen av fysiologisk TME i legemiddelscreeningsanalyser. Historisk, feltet av nevrovitenskap pioner og gjort omfattende optimaliseringer av skive kultur for hjernevev4. Nylig har mange studier vist preparat av skiver fra ulike typer tumorvev, inkludert cellelinjeavledede svulster, spontane tumormodeller, pasientavledede xenografts (PDX) og primære pasientsvulster. Ex vivo vev skive kultur integrerer fordeler fra både in vivo og in vitro kultur5. Tumorvevskiver beholder intakt vevsarkitektur og spraglete cellesammensetning, noe som muliggjør studiet av kreftceller i TME-konteksten.
Denne protokollen introduserer en organotypic tumor vev stykke kultursystem kombinert med en sanntid, svært følsom levedyktighet analyse for å evaluere narkotikaresponser. Effekttester på organotypic tumorvevskiver i tidligere introduserte protokoller er avhengige av måling av endringer i cellelevedyktighet ved fluorescerende dye inkorporering, immunohistochemistry (IHC) eller MTT ((3- [4, 5-dimetyltiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazoliumbromid) analyse6,,7,,8,9. Alle disse metodene er imidlertid sluttpunktanalyser og lider av lav følsomhet, lang behandlingstid, komplekse dataanalyser, smalt signalområde og høy eksperimentell feil. Vår luminescence-baserte live celle-kompatible reagens forbedrer disse påstandene ved å gi et bredt signalområde og øyeblikkelig (~ 5 min) måling uten forutgående behandling og minimal etterbehandling. Denne reagensen er svært følsom og kan eksistere sammen i cellekulturmediet, noe som gir kontinuerlig og time-course måling av cellelevedyktighet. Dette analysesystemet gjelder for høy gjennomstrømning screening av narkotikakandidater på vevskiver i preklinisk legemiddelutvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museeksperimenter ble utført i henhold til anbefalingene i Veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr i dyrevelferdsloven og National Institutes of Health retningslinjer for omsorg og bruk av dyr i biomedisinsk forskning.
1. Utarbeidelse av tumorvevskiver
- Forbered vevskivekultur (TSC) medium etter oppskriften i tabell 1. Filtrer mediet med en støvfilterenhet på 0,45 μm for å sterilisere.
- Aliquot 250 μL TSC medium per brønn for en 24 brønnplate, eller 1 ml medium per brønn for en 6 brønnplate. Oppbevar platen i en 37 °C, 5 % CO2 fuktet inkubator til bruk.
MERK: Mediet og kosttilskudd kan optimaliseres avhengig av vevstyper og eksperimentelle mål. Mengden medium bør være akkurat nok til å suge den porøse membranen til en kulturinnsats. Ikke overskrid membranens nivå. Juster mellomvolumet hvis middels nivå er for lavt eller for høyt. Hvis forskerne tester immunmodulerende midler, anbefaler vi tilskudd av mediet med IL-210. - Hvis du bruker tumorvev avledet fra mus, euthanize mus med en anbefalt prosedyre, sanitisere den eksponerte huden av mus ved å sprøyte 70% etanol, og dissekere svulster med aseptiske teknikker. Oppbevar tumorvevet i et rør som inneholder iskalde Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS).
- Hvis du bruker fersk pasient tumor vev, lagre i iskalde HBSS for kortsiktig, eller iskald Belzer University of Wisconsin (UW) løsning for lengre sikt lagring (opptil 24 h) for å bevare vev levedyktighet.
MERK: Skiver fra et PDX-vev som sendes over natten i iskald UW-løsning er tilberedt. - Overfør tumorvevet til en 10 cm kulturplate som inneholder iskald HBSS. Skjær svulsten i halvdeler med en skalpell mens den er nedsenket i iskald HBSS. Form tumorvev til sylindere ved hjelp av en 6 mm diameter biopsi punch og trim den ene siden for å skape en flat overflate. Oppbevar vevet i iskald HBSS til bruk.
MERK: Unngå å inkludere det nekrotiske området av vevet, som vanligvis er i sentrum og har et ugjennomsiktig og skjør utseende. - Sett opp vibratome. Desinfiser alt utstyret ved hjelp av 70% etanol. Plasser vibratome bufferbrettet dekket med et akrylglasslokk i midten av vibratome isbadet. Tilsett is til isbadet og fyll opp bufferbrettet med avkjølt HBSS for å holde vevet kjølig mens du kutter. Fest et barberblad til bladholderen.
MERK: Selv om det å holde vibratomer i et semisterilt miljø ikke har påvirket tidligere eksperimenter, anbefales det å lagre vibratomen under et biosikkerhetsskap hvis tilgjengelig. - Løft forsiktig opp et biopsi-punched tumorvev fra HBSS ved hjelp av tanntang og fjern overflødig buffer ved å dabbing vevet med et lofritt papirhåndkle.
- Plasser en dråpe medisinsk karakter cyanoakrylat lim på prøveplaten og plasser vevet på denne dråpen. Lufttørk limet i 2–3 min og plasser platen i bufferskuffen. Supplere med noen HBSS til vevet er helt nedsenket i bufferen.
MERK: Montering av vev i oppreist, stabil posisjon er avgjørende for å generere jevnt kutteskiver. Hvis montert vev er ustabilt, enten legge mer lim til det omkringliggende vevet for å beholde en oppreist posisjon eller losse vevet, flate bunnen, og lim den igjen. Elastiskvev har en tendens til å bli presset og bøyd lettere under kutting, i så fall kan kortere lengder (<5 mm) og flere løp være hensiktsmessige. For ekstremt skjøre vev kan papirhåndklær ødelegge vevet. I dette tilfellet kan vevet plasseres på en plastoverflate for å transportere bort noe overflødig HBSS. - Juster vibratome-innstillingene. Følgende innstillinger brukes: skjæretykkelse = 250 μm, amplitude = 3,00 mm, skjærehastighet = 0,01–0,25 mm/s og bladvinkel = 15°–21°.
MERK: Optimaliser skjæreinnstillingene avhengig av stivheten i vevet. Mykere vev kuttes lettere med en dypere bladvinkel ved lavere hastighet. En bladvinkel på 18°, skjærehastighet mellom 0,10–0,18 mm/s, og en amplitude på 3,00 mm fungerer bra for mus 4T1 og PDX HCI010 svulster. Stivere vev kan kuttes med en raskere bladhastighet. - Still inn start- og sluttplasseringene til bladet og juster høyden på trinnet. Kjør instrumentet med kontinuerlig modus for å kutte skiver i flere sykluser til vevet er kuttet jevnt.
- Fortsett å kutte vevet. Overfør skivene sammen med en liten mengde HBSS-buffer på cellekulturinnsatsen med medium med en bredspissoverføringspipette, ved hjelp av suging for å løfte hele skiven. Plasser en skive per innsats på en 24 brønnplate. En innsats for 6 brønnplater kan romme opptil fire skiver for en replikaanalyse.
MERK: Hvis den siste kanten av vevsskiven fortsatt er festet til det ukuttede vevet, stopp vibratomen og skill vevsskiven med to par fine spisstang uten å berøre eller poking vevsskivene. Et eget barberblad kan være nyttig for å fjerne hengende vev. - Fjern overflødig buffer med en fin tip overføringspipette.
- Når bladet kommer nær det limte vevet, stopper du instrumentet, senker scenen, fjerner det stive vevet med et separat blad og monterer et nytt vev. Fortsett å kutte til nok skiver er samlet inn.
- Kultur platene i en fuktet inkubator satt til 37 °C, 5% CO2. Vevsskivene er kultiverte ved luft-flytende interphase på cellekulturinnsatsen. Vevsskivene er klare for eksperimenter 24–48 timer etter den første skivepreparatet. For langsiktig dyrking, børstre mediet hver 2-3 dag.
2. Måling av levedyktighet
- For levedyktighetsmåling av vevsskiven, bytt medmediet med et luminescensbasert levedyktighetsmålingsreagens som inneholder både luciferase og prosubstrat ved 1:1000 fortynning i TSC-mediet etter produsentens instruksjoner. Reagensen måler reduksjonsaktiviteten til levende celler av metabolisert prosubstrat til luciferin11. Overfør 50 μL enzymsubstratblanding på toppen av hver vevsskive.
- Inkuber med mild agitasjon på en orbital shaker plassert inne i en fuktet inkubator satt til 37 °C med 5% CO2 over natten.
- Selvlysende signaler kan måles ved hjelp av enten en mikroplateleser eller et in vivo bildeinstrument for vev dyrket i en 24 brønnplate. For å måle den individuelle levedyktigheten til flere vev på en 6 brønnplate, bør et in vivo bildesystem brukes.
- Når du bruker en mikroplateleser, still inn mikroplaten uten lokket. Enhver type mikroplateleser som er i stand til å måle selvlysende intensitet, bør være egnet for eksperimentet. Vi brukte følgende innstillinger: lesetid = 1 s, måling fra toppen, gevinst = 200.
MERK: For høyere nøyaktighet, bruk en mikroplate med hvite vegger til å sette opp eksperimentet. Hvitvegg, klar bunn 24 brønnplater har blitt testet, og i de fleste tilfeller, klare brønnplater ikke kompromittere resultatene. - Når du bruker et in vivo bildesystem for å måle levedyktigheten, plasser platen midt på scenen og fjern lokket. Få normale fotografiske bilder etterfulgt av selvlysende bilder med et felt av scenen innstilling på C, auto eksponeringstid, f-stop = 1, objektiv innstilling som mikroplate med motivhøyde = 0,0 cm.
- Kvantifiser den selvlysende intensiteten ved hjelp av bildeprogramvaren sammen med in vivo-bildesystemet. Tegn konsekvente områder av interesse (ROI) rundt hver vevsskive. Denne protokollen bruker en sirkel med 1 cm diameter som et avkastningsrom (se figur 1). Mål den totale fluksen (p/s) i området.
- Når du bruker en mikroplateleser, still inn mikroplaten uten lokket. Enhver type mikroplateleser som er i stand til å måle selvlysende intensitet, bør være egnet for eksperimentet. Vi brukte følgende innstillinger: lesetid = 1 s, måling fra toppen, gevinst = 200.
3. Evaluering av legemiddeleffekt på vevsskivene
- Mål levedyktighet en grunnlinje før behandling ved hjelp av reagensen for luminescensbasert levedyktighetsmåling som forklart i avsnitt 2.
MERK: Hvis flere vev har betydelig lavere levedyktighet sammenlignet med andre, utelate vevet fra analysen. - Oppløs legemidler i dimetylsulfoksid (DMSO) for å lage lagerløsninger. Forbered en 10x legemiddelløsning med TSC eller annet kulturmedium (25 μL/brønn for en 24 brønnplate som inneholder 250 μL medium) ved ønskede konsentrasjoner. For kjøretøykontroll må du klargjøre mediet som inneholder et tilsvarende volum av DMSO.
- Supplere 10x narkotika løsning til kulturmediet på bunnen av brønnen. Bland med pipettering og overfør 50 μL av mediet på toppen av vevet.
MERK: Hvis flere vevsskiver er tilgjengelige, tester duduplikater eller triplicates for hver tilstand. - Inkuber over natten med mild risting på en orbital shaker i en 37 °C, 5% CO2,fuktet inkubator.
- Fjern platen fra shaker en statisk inkubator i 37 °C, 5 % CO2,fuktet inkubator.
- Ved ønskede tidspunkter måler du den selvlysende intensiteten fra vevet ved hjelp av en mikroplateleser eller et in vivo bildesystem. Vanligvis blir legemiddeleffekter påviselig etter 1–6 dagers behandling.
MERK: Armaturbasert levedyktighetsreagens er stabil i minst 3 dager under kulturforhold. Imidlertid kan substratet bli utarmet under analysen avhengig av vevs metabolske aktivitet. Hvis et betydelig signalfall observeres i vev med tidligere høye signaler, suppleresubstratet i alle brønnene. - Beregn gjenværende levedyktighet av det behandlede tumorvevet ved hjelp av følgende ligning:
Levedyktigheten til det behandlede vevet normaliseres ved sin baseline levedyktighet og levedyktighetskift av kontrolltumorvev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi en tidsforløp, flere effektevalueringsprotokoll for tumorvevskiver utarbeidet av mus 4T1 brysttumorvev og en brystkreft PDX-modell, HCI01012. Vi forberedte vevsskiver fra flere musavledede svulster, PDX og friske pasientsvulster10. Den generelle arbeidsflyten til tumorvevspreparatet og legemiddeleffekttesten er beskrevet i figur 1. Generelt kunne vi forberede 20–40 vevsskiver fra en enkelt bulksvulst på 1000–1500 mm3 i volum.
For levedyktighetsmålinger utnyttet vi en selvlysende, levende cellekompatibel levedyktighetsreagens. Behandling av en multikinasehemmer, staurosporin, ved 1 μM konsentrasjon i 4 dager reduserte signalintensiteten med 100x, sammenlignet med tumorvev behandlet med DMSO-kontroll (figur 2A). Vevsskivene utarbeidet fra 4T1-svulsten ble opprettholdt i minst 21 dager med sporadisk middels utveksling (figur 2B). De fleste av narkotikaresponsmålingene ble utført innen 7 dager fra vevsskivepreparat. Fordi den live cellekompatible reagensen ikke krever behandling eller fiksering før måling, tillot det oss å utføre tidskursmålinger. Tidsavhengige endringer i levedyktigheten til tumorvevskiver fra det identiske 4T1-tumorvevet er oppsummert i figur 2C. Staurosporin ved 500 nM reduserte luminescens fra dag 1 og nådde det laveste nivået på dag 4, og holdt seg lavt for hvert påfølgende tidspunkt. I motsetning, den selvlysende intensiteten fra kontrollgruppen av vev supplert med DMSO forble stabil til dag 6. I tillegg ble vevsskiver tilberedt av identiske 4T1 svulster behandlet med seriedoser av staurosporin (0–1 μM) i 4 dager, og viste doseavhengige endringer i levedyktighet og EC50 (figur 2D).
Vi testet kjemoterapeutiske legemidler på vevskiver tilberedt fra en ortotopisk PDX-modell av brystkreft, HCI010. PDX vevskiver ble behandlet med doksorubicin, et standard kjemoterapeutisk legemiddel, ved doser på 0–5 μM i 6 dager, noe som gir doseavhengige endringer i levedyktighet (figur 3A). Videre ble effekten av 17 legemidler, inkludert prekliniske og klinisk godkjente legemidler, testet i triplicate på vevsskiver tilberedt fra en enkelt bulk HCI010-svulst. Legemidlene ble brukt ved 0,5 μM i 4 dager i triplicate (figur 3B). Disse resultatene gir bevis på konseptet at middels gjennomstrømning narkotika screening kan utføres på tumor skiver med innfødte TME.
Figur 1: Skjematisk som viser vevskivepreparat etterfulgt av evaluering av legemiddeleffekt. Tumorvev ble behandlet i skiver 6 mm i diameter og 250 μm tykt og kultivert i luftflytende interfase med støtte fra cellekulturinnsatser. Vevslevedyktighet ble målt ved hjelp av en bioluminescerende reagens både før og etter medikamentbehandling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vevskivelevedyktighetsmåling og respons på stoffene. (A) Representative bilder av luminescensbaserte levedyktighetsmålinger i brysttumorvevskiver. Vevsskiver fra 4T1-svulst ble inkubert med 1 μM staurosporin eller DMSO-kontroll sammen med selvlysende vibarhetsanalysereagens i 4 dager. Bilder ble innhentet ved hjelp av et in vivo bildesystem og analysert av tilhørende bildeanalyseprogramvare. Røde sirkler indikerer avkastningen målt for bioluminescens. Bunn = En tomt som viser selvlysende signal fra tumorvevskiver behandlet med staurosporin eller kontroll målt ved et in vivo bildesystem. Baren indikerer gjennomsnittet av de fire vevsskivene vist som sirkler (kontroll) eller firkantet (staurosporin behandlet). (B) Et plott som viser levedyktighet av 4T1 tumorvevskiver dyrket i 21 dager fra forberedelse. Levedyktighet på dag 21 målt ved et in vivo bildesystem ble normalisert til dag 3. Hvert punkt angir måling fra en enkelt skive; linjen indikerer gjennomsnittet; boksen viser kvartiler, og whiskers viser minimum til maksimal verdi av målingen. (C) Tidsforløpsmålinger av vevslevedyktighet etter behandling med staurosporin. Levedyktigheten til vevsskiver fra 4T1-svulsten behandlet med staurosporin (500 nM) eller tilsvarende volum av DMSO som en kontroll ble målt over tid. Luminescence intensiteter ble målt av en mikroplateleser over de angitte tidspunktene. Hver prikk illustrerer et datapunkt fra en individuell vevsskive, og søylegrafen indikerer gjennomsnitt ± SEM. (D) Doseavhengig behandling av staurosporin på vevsskiver. Vevsskiver tilberedt fra 4T1-svulst ble supplert med seriedoser av staurosporin eller DMSO som kjøretøykontroll. Den gjenværende levedyktigheten basert på luminescens ble målt ved et in vivo bildesystem ved 4 dager etter behandlingsstart. Relativ levedyktighet ble beregnet ved hjelp av ligningen som vises i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Stoffskjerm i vevsskiver utarbeidet av en pdx-modell for brystkreft. (A) En tomt som viser endringer i levedyktighet som svar på ulike doser doksorubicin. Vevsskivene ble utarbeidet fra en ortotopisk brystkreft PDX svulst, HCI010. Levedyktighet ble målt i skiver behandlet med titrererte doser doksorubicin. Etter 6 dager ble luminescens målt ved hjelp av et in vivo bildesystem. Bar = gjennomsnitt ± SEM. (B) En liten skala kjemoterapeutisk legemiddel skjerm på tumorvev skiver fra en ortotopisk brystkreft PDX svulst. Søylegrafen = gjennomsnitt ± SEM av triplicate eksperiment. Disse dataene er publisert tidligere10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Materiale | Ml | Endelig konsentrasjon | Lager |
| William's Medium E | 500 | ||
| Nikotinamid | 6 | 12 mM (andre kan være på siden) | 1 M lager av nikotinamid i Williams' Medium E, sterilisert |
| Askorbinsyre | 6 | 50,4 μg/ml | 0,21 g/50 ml (>10 mM lager) av askorbinsyre i Williams Medium E, sterilisert |
| Natriumbikarbonat | 15 | 2,25 mg/ml | 7,5 % (w/v) oppløsning |
| HEPES Buffer | 10 | 20 mM (andre kan være på siden) | 1 M lagerløsning |
| Glukose | 10 | 5 mg/ml | 250 mg/ml glstrikk, steralisert |
| Natrium pyruvat | 5 | 1 mM (andre kan være på siden) | 100 mM lager |
| L-Glutamin (nær L-Glutamin) | 5 | 2 mM (andre kan være på siden) | 200 mM lager |
| Dens + Premix | 5 | Inneholder humant rekombinant insulin, humantransferrin (12,5 mg hver), selensyre (12,5 μg), BSA (2,5 g) og linolsyre (10,7 mg) | |
| Penicillin-Streptomycin | 2 | 40 IE/ml penn, 40 μg/ml Strep | 10 000 IE/ml penn, 10 000 μg/ml Strep |
| Rekombinant EGF | 0.5 | 20 ng/ml | 20 μg/ml lager |
Tabell 1: TSC middels oppskrift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen demonstrerer vi en plattform for kvantitative, og sanntids legemiddeleffektstudier på organotypic tumorvevskiver. Vevskivekultursystemet gir tydelige fordeler fremfor tradisjonelle cellebaserte in vitro-metoder ved å fange celleheterogenitet og fysiologiske egenskaper ved det innfødte tumormikromiljøet. Denne plattformen muliggjør også høyere gjennomstrømning for testing av legemiddeleffekter, noe som bidrar til å bygge bro mellom cellekulturstudier og in vivo-eksperimenter.
For å oppnå nøyaktige og konsekvente resultater, er det viktig å minimere vevsskader under forberedelsen. Vevsskiver bør håndteres med brede spissplastpipetter for å unngå skade forårsaket av fysisk kontakt. Kulturmellomvolumet må opprettholdes for å tillate vevsskiven å kontakte både luften og mediet så lenge eksperimentet varer.
Kulturmediet bør optimaliseres avhengig av vevstype og eksperimentelt formål. TSC-mediet som brukes i denne protokollen er et serumfritt medium som opprinnelig ble utviklet for primær hepatocyttkultur13. Dette mediet har også blitt brukt til å opprettholde flere typer svulster, inkludert bryst, lever, kolon og bukspyttkjertel10. Videre demonstrerte vi forbedret immuncelleoverlevelse ved hjelp av et optimalisert DMEM-basert medium10. Vibratome innstillinger bør optimaliseres basert på vev tekstur for å oppnå intakt og ensartet tumor vev skiver. Kutting mykere og/eller løst konsolidert vev er vanligvis gjort enklere ved hjelp av dypere bladvinkler, langsommere skjærehastighet og tykkere skiver. Av og til er vev for mykt å kutte, i så fall bør forskere vurdere å bygge inn vevet innenfor lavt smeltepunkt agarose, en teknikk som er vanlig i hjernevev kutte14,15.
Tidligere introduserte flere studier terapeutiske narkotikatestingtilnærminger på kultiverte vevsskiver. Disse studiene var avhengige av fluorescerende dye inkorporering, immunohistochemistry, eller MTT analyser for å evaluere vev levedyktighet6,,7,,8,9. I denne protokollen brukte vi den luminescensbaserte, live cellekompatible reagensen RealTime-Glo11 til levedyktighetsmåling. Luminescence-baserte analyser har flere fordeler over tidligere brukte metoder, inkludert økt følsomhet, bredere signalområde, og evnen til raskt å foreta sanntidslevedyktighetsmålinger. Måletiden er kort for både mikroplatelesere (~ 1 s / brønn) og et in vivo bildesystem (~ 1 min / plate) og kan gi signalintensitetsavlesninger direkte med minimal behandling. Raskere oppkjøp av signalet og færre etterbehandlingstrinn er nødvendige funksjoner i høy gjennomstrømning av legemiddelscreening, slik at luciferin-baserte levedyktighetsmålinger muliggjør en mye større prøvegjennomstrømning i vevsskivekultur. Mens en luciferase-basert analyse gir en nøyaktig, kvantitativ måling av hele skivelevedyktigheten, er det ikke i stand til å oppdage legemiddelinduserte celletypespesifikke endringer i vevet. Koblingsluminescensbaserte levedyktighetsmålinger med endepunkt IHC på samme vevsskive vil imidlertid muliggjøre celletypespesifikke målinger.
Mens vevskivekultursystemet er et kraftig verktøy for å bringe tumorvevkompleksitet til en høygjennomstrømningsscreeningsplattform, har det flere ulemper. Iboende heterogenitet i et tumorvev kan forårsake differensialnarkotikaresponser blant vevsskiver selv fra samme bulksvulst. Noen ganger observerte vi relativt store variasjoner i legemiddelrespons blant vevsskiver i våre eksperimenter. Vi kan delvis overvinne denne variasjonen ved å snitte flere vevsskiver utarbeidet fra forskjellige steder i samme svulst. Selv om vevskivekulturen kan opprettholdes ved baseline nivå av levedyktighet i minst 21 dager (Figur 2B), endres cellepopulasjoner over tid. Vi har beskrevet endringer i immuncellepopulasjonen i løpet av vevsskivekultureksperimenter10. Derfor anbefaler vi vevsskiver undersøkes over kortere kuling tidsintervaller for å rekapitulere innfødte vevegenskaper.
Vevskivekulturen er klar til å fylle et kritisk gap i narkotikaoppdagelse og utvikling mellom høy gjennomstrømningscellekulturscreening og dyreforsøk. Hundrevis av legemidler kan evalueres på skiver produsert fra en enkelt tumorbiopsi, og legger til økt fysiologisk relevans før dyrestudier. Dette systemet kan bidra til å redusere antall dyreforsøk som kreves for å bringe narkotika til markedet. Videre har vevsskiver utarbeidet fra pasientsvulster informativt potensial i å veilede behandlingsplaner i klinikken. Over hundre terapeutiske legemidler er tilgjengelige i dag, men det er få biomarkører for å veilede deres valg. Videre resulterer heterogeneitet hos pasienter også i forskjeller i respons. Vevsskiver fra en pasientbiopsi kan brukes til å teste flere legemidler før de behandles systemisk, noe som gir verdifull informasjon om legemiddeleffekt innen en ukes tid. Samlet sett har sanntids- og rask testing av legemidler som bruker vevskultursystemer stort potensial i kreftutvikling og terapeutiske beslutninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704], og Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Vi vil gjerne takke Dr. Alana Welm (University of Utah) for å gi brystkreft PDX svulst. Vi vil også takke de ansatte ved Comparative Medicine, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) for vedlikehold av PDX-modellen og medlemmer av Gujral-laboratoriet for nyttige diskusjoner. N.N.A støttes av JSPS Overseas Research Fellowship og Tverrfaglig opplæringsstipend fra FHCRC. A.J.B. støttes av Chromosom Metabolism and Cancer Training Grant fra FHCRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
