Summary
Introduzimos um protocolo para medir a resposta de drogas em tempo real em fatias organotípicas de tecido tumoral. A estratégia experimental aqui delineada fornece uma plataforma para realizar telas de medicamentos de médio-alto consumo em fatias de tecido derivadas de tumores clínicos ou de camundongos em condições ex-vivos.
Abstract
Os tecidos tumorais são compostos de células cancerosas, células imunes infiltradas, células endoteliais, fibroblastos e matriz extracelular. Esse ambiente complexo constitui o microambiente tumoral (TME) e pode modular a resposta à terapia in vivo ou à resposta medicamentosa ex vivo. As telas convencionais de descoberta de medicamentos contra o câncer são realizadas em células cultivadas em uma monocamada, um sistema criticamente sem a influência do TME. Assim, sistemas experimentais que integram ensaios sensíveis e de alto nível com TME fisiológico suscitados fortalecerão o processo de descoberta de medicamentos pré-clínicos. Aqui, introduzimos a cultura de fatias de tecido tumoral ex vivo como uma plataforma para triagem de medicamentos de médio-alto consumo. A cultura organotípica de fatias de tecido constitui seções tumorais precisamente cortadas e finas que são mantidas com o apoio de uma membrana porosa em uma interface ar-líquido. Neste protocolo, descrevemos a preparação e manutenção de fatias de tecido preparadas a partir de tumores de camundongos e tumores de modelos de xenoenxerto derivados do paciente (PDX). Para avaliar as mudanças na viabilidade do tecido em resposta ao tratamento medicamentoso, aproveitamos um ensaio de viabilidade baseado em luminescência biocompatível que permite a medição em tempo real, rápida e sensível de células viáveis no tecido. Usando esta plataforma, avaliamos as respostas dependentes de dose de fatias de tecido ao inibidor multi-quinase, staurosporina e agente citotóxico, doxorubicina. Além disso, demonstramos a aplicação de fatias de tecido para farmacologia ex vivo através da triagem de 17 medicamentos clínicos e pré-clínicos em fatias teciduais preparadas a partir de um único tumor PDX. Nossa plataforma de triagem ex vivo fisiologicamente relevante, altamente sensível e robusta fortalecerá muito a descoberta de medicamentos pré-clínicos e a tomada de decisões de tratamento.
Introduction
Interações das células cancerígenas com as propriedades físicas e bioquímicas do tecido estrômático circundante formam o TME. O TME pode estimular o crescimento tumoral, a metástase e a modulação da resposta tumoral à terapia1. No desenvolvimento convencional de medicamentos pré-clínicos, os candidatos a medicamentos são tipicamente triados pela primeira vez usando linhas de células cancerígenas cultivadas, uma plataforma de ensaio que criticamente não tem o TME2. Essa falta de TME fisiológico em estágios de pré-triagem baseados em células pode limitar a descoberta de agentes eficazes em modelos animais portadores de tumores e pode contribuir para a alta taxa de atrito de muitos medicamentos oncológicos promissores em estágios clínicos posteriores de desenvolvimento3.
Apesar da importância da TME na modulação das respostas de medicamentos tumorais, as restrições experimentais limitam a aplicação de sistemas mais fisiologicamente relevantes durante os estágios iniciais da descoberta e desenvolvimento de medicamentos. É impraticável a triagem de centenas de agentes terapêuticos em tumores de modelos animais ou amostras de tumores de pacientes. De fato, os espécimes cirúrgicos são recursos escassos com variadas origens genéticas e a triagem de milhares de moléculas candidatas em modelos animais não é viável devido à escala experimental, custo e bem-estar animal.
A cultura da fatia de tecido tumoral, onde precisamente cortadas, seções finas de tumores são cultivadas ex vivo, pode abordar a limitação do TME fisiológico em ensaios de rastreamento de drogas. Historicamente, o campo da neurociência foi pioneiro e fez extensas otimizações da cultura de fatias para tecido cerebral4. Recentemente, muitos estudos demonstraram a preparação de fatias de vários tipos de tecido tumoral, incluindo tumores derivados da linha celular, modelos de tumores espontâneos, xenoenxertos derivados do paciente (PDX) e tumores primários do paciente. A cultura da fatia de tecido ex vivo integra benefícios tanto da cultura in vivo quanto in vitro5. As fatias de tecido tumoral retêm arquitetura de tecido intacta e composição celular variegated, permitindo o estudo de células cancerígenas dentro do contexto TME.
Este protocolo introduz um sistema organotípico de cultura de fatias de tecido tumoral combinado com um ensaio de viabilidade em tempo real e altamente sensível para avaliar as respostas dos medicamentos. Testes de eficácia de fárfluos em fatias de tecido tumoral organotípico em protocolos previamente introduzidos dependem da medição de mudanças na viabilidade celular por incorporação de corante fluorescente, imunohistoquímica (IHC) ou MTT ((3- [4, 5-dimetilthiazol-2-yl]-2, 5 brometo de tetrazolium dipenyl)6,7,8,9. No entanto, todos esses métodos são ensaios de ponto final e sofrem de baixa sensibilidade, longo tempo de processamento, análises complexas de dados, faixa de sinal estreita e alto erro experimental. Nosso reagente compatível com células vivas à luminescência melhora esses ensaios, fornecendo uma ampla faixa de sinal e medição instantânea (~5 min) sem processamento prévio e processamento mínimo pós-processamento. Este reagente é altamente sensível e pode coexistir na mídia de cultura celular, permitindo a medição contínua e temporal da viabilidade celular. Este sistema de ensaio é aplicável à triagem de alto throughput de candidatos a medicamentos em fatias de tecido no desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos.
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Protocol
Todos os experimentos com camundongos foram realizados de acordo com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Lei de Bem-Estar Animal e das diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais em pesquisas biomédicas.
1. Preparação de fatias de tecido tumoral
- Prepare o meio de cultura de fatiade tecido (TSC) seguindo a receita na Tabela 1. Filtrar o meio com uma unidade de filtro de vácuo de 0,45 μm para esterilizar.
- Alíquota 250 μL de meio TSC por poço para uma placa de 24 poços, ou 1 mL de meio por poço para uma placa de 6 poços. Mantenha a placa em uma incubadora umidificada de 37 °C, 5% CO2 até o uso.
NOTA: Os médios e suplementos podem ser otimizados dependendo dos tipos de tecidos e metas experimentais. A quantidade de meio deve ser suficiente para absorver a membrana porosa de uma inserção de cultura. Não exceda o nível da membrana. Ajuste o volume médio se o nível médio estiver muito baixo ou muito alto. Se os pesquisadores estiverem testando agentes imunomodulatórios, recomendamos a suplementação do meio com IL-210. - Se usar tecido tumoral derivado de camundongos, eutanize camundongos com um procedimento recomendado, higienize a pele exposta de camundongos pulverizando 70% de etanol e disseque tumores com técnicas assépticas. Armazene o tecido tumoral em um tubo que contenha a solução de sal balanceado (HBSS) de Hank.
- Se usar tecidos tumorais frescos do paciente, armazene em HBSS frio a curto prazo ou solução da Universidade Belzer de Wisconsin (UW) para armazenamento a longo prazo (até 24 h) para preservar a viabilidade do tecido.
NOTA: Foram preparadas fatias de um tecido PDX enviadas durante a noite em solução UW gelada. - Transfira o tecido tumoral para uma placa de cultura de 10 cm contendo HBSS gelada. Corte o tumor em metades com um bisturi enquanto submerso em HBSS frio. Modele tecidos tumorais em cilindros usando um soco de biópsia de 6 mm de diâmetro e corte um lado para criar uma superfície plana. Guarde os tecidos em HBSS frio até o uso.
NOTA: Evite incluir a área necrosada do tecido, que geralmente está no centro e tem uma aparência opaca e frágil. - Configure o vibratome. Desinfetar todos os equipamentos com 70% de etanol. Coloque a bandeja de tampão de vibratome coberta com uma tampa de vidro acrílica no centro do banho de gelo vibratome. Adicione gelo ao banho de gelo e encha a bandeja de tampão com HBSS resfriado para manter o tecido frio durante o corte. Coloque uma lâmina de barbear no suporte da lâmina.
NOTA: Embora manter vibratomas em um ambiente semiestéril não tenha afetado experimentos anteriores, recomenda-se armazenar o vibratome sob um gabinete de biossegurança, se disponível. - Levante cuidadosamente um tecido tumoral perfurado por biópsia do HBSS usando fórceps dentados e remova o excesso de tampão, esfregando o tecido com uma toalha de papel sem fiapos.
- Coloque uma gota de cola cianoacrilato de grau médico na placa do espécime e coloque o tecido nesta gota. Seque a cola a ar por 2-3 min e coloque a placa na bandeja de tampão. Suplemente com alguns HBSS até que o tecido esteja totalmente imerso no tampão.
NOTA: A montagem de tecidos em posição vertical e estável é fundamental para gerar fatias uniformemente cortadas. Se os tecidos montados estiverem instáveis, adicione mais cola ao tecido circundante para manter uma posição vertical ou descarregar o tecido, achate o fundo e cole-o novamente. Os tecidos elásticos tendem a ser empurrados e dobrados mais facilmente durante o corte, nesse caso comprimentos mais curtos (<5 mm) e múltiplas corridas podem ser apropriados. Para tecidos extremamente frágeis, toalhas de papel podem destruir o tecido. Neste caso, o tecido pode ser colocado sobre uma superfície plástica para afastar algum excesso de HBSS. - Ajuste as configurações de vibratome. As seguintes configurações são utilizadas: espessura de corte = 250 μm, amplitude = 3,00 mm, velocidade de corte = 0,01-0,25 mm/s e ângulo da lâmina = 15°-21°.
NOTA: Otimize as configurações de corte dependendo da rigidez do tecido. Tecidos mais macios são mais facilmente cortados com um ângulo de lâmina mais profundo em menor velocidade. Um ângulo de lâmina de 18°, velocidade de corte entre 0,10-0,18 mm/s, e uma amplitude de 3,00 mm funciona bem para os tumores mouse 4T1 e PDX HCI010. O tecido mais rígido pode ser cortado com uma velocidade de lâmina mais rápida. - Ajuste os locais de partida e fim da lâmina e ajuste a altura do palco. Execute o instrumento com modo contínuo para cortar fatias por vários ciclos até que os tecidos sejam cortados uniformemente.
- Continue cortando o tecido. Transfira as fatias juntamente com uma pequena quantidade de tampão HBSS para a inserção de cultura celular com meio com uma pipeta de transferência de ponta larga, usando sucção para levantar toda a fatia. Coloque uma fatia por inserção em uma placa de 24 poços. Uma inserção para 6 placas de poço pode acomodar até quatro fatias para um ensaio de réplica.
NOTA: Se a última borda da fatia de tecido ainda estiver presa ao tecido sem cortes, pare o vibratome e separe a fatia de tecido com dois pares de fórceps de ponta fina sem tocar ou cutucar as fatias de tecido. Uma lâmina de barbear separada pode ser útil na remoção de tecido pendurado. - Remova qualquer tampão em excesso com uma pipeta de transferência de ponta fina.
- Quando a lâmina chegar perto dos tecidos colados, pare o instrumento, baixe o palco, remova o tecido endurecido com uma lâmina separada e monte um novo tecido. Continue cortando até que foram coletadas fatias suficientes.
- Cultura as placas em uma incubadora umidificada fixada a 37 °C, 5% CO2. As fatias de tecido são cultivadas na interfase ar-líquido na inserção da cultura celular. As fatias de tecido estão prontas para experimentos 24-48 h após a preparação inicial da fatia. Para cultivo a longo prazo, troque o meio a cada 2-3 dias.
2. Medição de viabilidade
- Para a medição da viabilidade da fatia de tecido, troque o meio por um reagente de medição de viabilidade à base de luminescência contendo a luciferase e o prosubstrato a 1:1.000 de diluição no meio TSC seguindo as instruções do fabricante. O reagente mede a atividade de redução das células vivas do prosubstrato metabolizado à luciferina11. Transfira 50 μL de mistura enzimática-substrato em cima de cada fatia de tecido.
- Incubar com agitação suave em um agitador orbital localizado dentro de uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2 durante a noite.
- Sinais luminescentes podem ser medidos usando um leitor de microplacas ou um instrumento de imagem in vivo para tecidos cultivados em uma placa de 24 poços. Para medir a viabilidade individual de múltiplos tecidos em uma placa de 6 poços, deve ser utilizado um sistema de imagem in vivo.
- Ao usar um leitor de microplaca, defina a microplaca sem a tampa. Qualquer tipo de leitor de microplaca capaz de medir a intensidade luminescente deve ser adequado para o experimento. Utilizou-se as seguintes configurações: tempo de leitura = 1 s, medição do topo, ganho = 200.
NOTA: Para maior precisão, use uma microplaca de parede branca para configurar o experimento. As placas de 24 poços de parede branca e fundo claro foram testadas e, na maioria dos casos, as placas claras não comprometem os resultados. - Ao utilizar um sistema de imagem in vivo para medir a viabilidade, coloque a placa no centro do palco e remova a tampa. Adquira imagens fotográficas normais seguidas por imagens luminescentes com um campo de configuração de palco em C, tempo de exposição automática, f-stop = 1, configuração objetiva como microplaca com altura do sujeito = 0,0 cm.
- Quantifique a intensidade luminescente utilizando o software de imagem acompanhado do sistema de imagem in vivo. Desenhe regiões de interesse consistentes (ROI) em torno de cada fatia de tecido. Este protocolo usa um círculo de 1 cm de diâmetro como um ROI (Ver Figura 1). Medir o fluxo total (p/s) da área.
- Ao usar um leitor de microplaca, defina a microplaca sem a tampa. Qualquer tipo de leitor de microplaca capaz de medir a intensidade luminescente deve ser adequado para o experimento. Utilizou-se as seguintes configurações: tempo de leitura = 1 s, medição do topo, ganho = 200.
3. Avaliação do efeito da droga nas fatias de tecido
- Medir a viabilidade da linha de base antes do tratamento usando o reagente de medição de viabilidade baseado em luminescência, conforme explicado na seção 2.
NOTA: Se vários tecidos tiverem viabilidade significativamente menor em relação a outros, omitam os tecidos do ensaio. - Dissolver medicamentos em sulfóxido de dimetila (DMSO) para fazer soluções de estoque. Prepare uma solução de droga de 10x com TSC ou outro meio de cultura (25 μL/poço para uma placa de 24 poços contendo 250 μL de meio) nas concentrações desejadas. Para o controle do veículo, prepare o meio contendo um volume equivalente de DMSO.
- Suplemente a solução de 10x para o meio de cultura na parte inferior do poço. Misture por pipetting e transfira 50 μL do meio em cima dos tecidos.
NOTA: Se houver várias fatias de tecido disponíveis, teste duplicatas ou triplicados para cada condição. - Incubar durante a noite com agitação suave em um agitador orbital em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2, umidificada.
- Retire a placa do agitador e incuba-se estáticamente na incubadora 37 °C, 5% CO2,umidificada.
- Nos pontos de tempo desejados, meça a intensidade luminescente dos tecidos usando um leitor de microplacas ou um sistema de imagem in vivo. Normalmente, os efeitos medicamentosos tornam-se detectáveis após 1-6 dias de tratamento.
NOTA: O reagente de viabilidade à base de luminescência é estável por pelo menos 3 dias sob condições culturais. No entanto, o substrato pode ser esgotado durante o ensaio, dependendo da atividade metabólica do tecido. Se uma queda significativa de sinal for observada em tecidos com sinais anteriormente elevados, suplemente o substrato em todos os poços. - Calcular a viabilidade restante dos tecidos tumorais tratados utilizando a seguinte equação:
A viabilidade do tecido tratado é normalizada pela sua viabilidade e viabilidade dos tecidos tumorais de controle.
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Representative Results
Aqui, demonstramos um protocolo de avaliação de eficácia múltipla de medicamentos para fatias de tecido tumoral preparadas a partir de tecidos tumorais de camundongos 4T1 e um modelo PDX de câncer de mama, HCI01012. Preparamos com sucesso fatias de tecido de vários tumores derivados de camundongos, PDX e tumores de pacientes frescos10. O fluxo de trabalho geral da preparação do tecido tumoral e o teste de eficácia da droga são descritosna Figura 1 . Em geral, poderíamos preparar de 20 a 40 fatias de tecido de um único tumor a granel de 1.000-1.500 mm3 em volume.
Para medições de viabilidade, exploramos um reagente de viabilidade compatível com células vivas. O tratamento de um inibidor multi-quinase, staurosporina, com concentração de 1 μM durante 4 dias, reduziu a intensidade do sinal em 100x, em comparação com os tecidos tumorais tratados com controle DMSO(Figura 2A). As fatias de tecido preparadas a partir do tumor 4T1 foram mantidas por pelo menos 21 dias com troca média ocasional (Figura 2B). A maioria das medidas de resposta a medicamentos foram realizadas no prazo de 7 dias a partir da preparação da fatia de tecido. Como o reagente compatível com células vivas não requer processamento ou fixação antes da medição, permitiu-nos realizar medições de tempo-curso. Alterações dependentes do tempo na viabilidade das fatias de tecido tumoral do tecido tumoral idêntico 4T1 são resumidas na Figura 2C. A staurosporina a 500 nM diminuiu a luminescência a partir do primeiro dia e atingiu o nível mais baixo no dia 4, mantendo-se baixa para cada ponto de tempo subseqüente. Em contrapartida, a intensidade luminescente do grupo controle de tecidos suplementados com DMSO manteve-se estável até o dia 6. Além disso, as fatias de tecido preparadas a partir de tumores 4T1 idênticos foram tratadas com doses seriais de staurosporina (0-1 μM) durante 4 dias, e apresentaram alterações dependentes de dose na viabilidade e EC50 (Figura 2D).
Testamos medicamentos quimioterápicos em fatias teciduais preparadas a partir de um modelo ortotópico PDX de câncer de mama, HCI010. As fatias de tecido PDX foram tratadas com doxorubicina, uma droga quimioterápica padrão, em doses de 0-5 μM durante 6 dias, proporcionando alterações dependentes de dose na viabilidade(Figura 3A). Além disso, a eficácia de 17 medicamentos, incluindo medicamentos pré-clínicos e clinicamente aprovados, foi testada em triplicado em fatias teciduais preparadas a partir de um único tumor hci010 a granel. As drogas foram aplicadas a 0,5 μM durante 4 dias em triplicado(Figura 3B). Esses resultados fornecem a prova de conceito de que a triagem de medicamentos de médio porte pode ser realizada em fatias de tumor com TME nativo.
Figura 1: Esquemático mostrando a preparação da fatia de tecido seguida de avaliação da eficácia da droga. Os tecidos tumorais foram transformados em fatias de 6 mm de diâmetro e 250 μm de espessura e cultivados na interfase ar-líquido com apoio de pastilhas de cultura celular. A viabilidade do tecido foi medida por meio de um reagente bioluminescente antes e depois do tratamento medicamentoso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Medição de viabilidade da fatia tecidual e resposta aos medicamentos. (A) Imagens representativas das medidas de viabilidade baseadas em luminescência em fatias de tecido tumoral. As fatias de tecido do tumor 4T1 foram incubadas com controle de staurosporina de 1 μM ou DMSO, juntamente com o reagente de ensaio de viabilidade luminescente por 4 dias. As imagens foram obtidas por meio de um sistema de imagem in vivo e analisadas por meio de um software de análise de imagens. Os círculos vermelhos indicam o ROI medido para bioluminescência. Parte inferior = Uma parcela que mostra sinal luminescente a partir de fatias de tecido tumoral tratadas com staurosporina ou controle medidopor um sistema de imagem in vivo. A barra indica a média das quatro fatias de tecido mostradas como círculos (controle) ou quadrado (staurosporina tratada). (B) Um lote que mostra a viabilidade das fatias de tecido tumoral 4T1 cultivadas durante 21 dias a partir da preparação. A viabilidade no dia 21 medida por um sistema de imagem in vivo foi normalizada para a do dia 3. Cada ponto indica a medição de uma única fatia; a barra indica a média; a caixa mostra quartis, e os bigodes mostram o valor mínimo máximo da medição. (C) Medições de tempo-curso da viabilidade do tecido após o tratamento da staurosporina. A viabilidade das fatias de tecido do tumor 4T1 tratada com staurosporina (500 nM) ou volume equivalente de DMSO como controle foi medida ao longo do tempo. As intensidades de luminescência foram medidas por um leitor de microplacas sobre os pontos de tempo indicados. Cada ponto ilustra um ponto de dados de uma fatia de tecido individual, e o gráfico da barra indica o tratamento médio ± SEM. (D) dependente de dose de staurosporina em fatias de tecido. As fatias de tecido preparadas a partir do tumor 4T1 foram suplementadas com doses seriais de staurosporina ou DMSO como controle do veículo. A viabilidade remanescente baseada na luminescência foi medida por um sistema de imagem in vivo em 4 dias após o início do tratamento. A viabilidade relativa foi calculada utilizando-se a equação mostrada no protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Tela de medicamentos em fatias de tecido preparadas a partir de um modelo PDX de câncer de mama. (A) Um complô mostrando mudanças na viabilidade em resposta a várias doses de doxorubicina. As fatias de tecido foram preparadas a partir de um tumor PDX de câncer de mama ortotópico, HCI010. A viabilidade foi medida em fatias tratadas com doses tituladas de doxorubicina. Após 6 dias, a luminescência foi medida por meio de um sistema de imagem in vivo. Bar = média ± SEM.(B) Uma tela de fárreia quimioterápica em pequena escala em fatias de tecido tumoral de um tumor pDX de câncer de mama ortotópico. O gráfico da barra = média ± SEM de experimento triplicado. Esses dados foram publicados anteriormente10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Material | Ml | Concentração Final | Estoque |
| E médio de Guilherme | 500 | ||
| Nicotinamida | 6 | 12 mM | 1 M estoque de nicotinamida no Meio E da Williams, esterilizado |
| Ácido ascórbico | 6 | 50,4 μg/mL | 0,21 g/50 mL (>10 mM estoque) de Ácido Ascórbico no E Médio de William, esterilizado |
| Bicarbonato de sódio | 15 | 2,25 mg/mL | Solução de 7,5% (c/v) |
| Tampão hepes | 10 | 20 mM | 1 M solução de estoque |
| Glicose | 10 | 5 mg/mL | Estoque de 250 mg/ml, steralizado |
| Piruvato de sódio | 5 | 1 mM | Estoque de 100 mM |
| L-Glutamina | 5 | 2 mM | Estoque de 200 mM |
| ITS + Premix | 5 | Contém insulina recombinante humana, transferrina humana (12,5 mgcada), ácido selêno (12,5 μg), BSA (2,5 g) e ácido linoleico (10,7 mg) | |
| Penicilina-Estreptomicina | 2 | 40 Caneta UI/mL, 40 μg/mL Strep | 10.000 Caneta IU/mL, 10.000 μg/mL Strep |
| EGF recombinante | 0.5 | 20 ng/mL | Estoque de 20 μg/mL |
Tabela 1: Receita média TSC.
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Discussion
Neste protocolo, demonstramos uma plataforma para estudos quantitativos e em tempo real de eficácia de medicamentos em fatias organotípicas de tecido tumoral. O sistema de cultura de fatias teciduais oferece vantagens distintas sobre os métodos in vitro tradicionais baseados em células, capturando heterogeneidade celular e características fisiológicas do microambiente tumoral nativo. Esta plataforma também permite maior rendimento para testes de eficácia de medicamentos, ajudando a preencher a lacuna entre estudos de cultura celular e experimentos in vivo.
Para obter resultados precisos e consistentes, é imprescindível minimizar os danos teciduais durante a preparação. As fatias de tecido devem ser manuseadas com pipetas plásticas de ponta larga para evitar danos causados pelo contato físico. O volume médio de cultura deve ser mantido para permitir que a fatia de tecido entre em contato com o ar e o meio durante a duração do experimento.
O meio de cultura deve ser otimizado dependendo do tipo de tecido e finalidade experimental. O meio TSC utilizado neste protocolo é um meio livre de soro que foi originalmente desenvolvido para a cultura hepatocito primária13. Este meio também tem sido usado para manter vários tipos de tumores, incluindo mama, fígado, cólon e pâncreas10. Além disso, demonstramos maior sobrevivência das células imunes usando um meio otimizado baseado em DMEM10. As configurações de vibratome devem ser otimizadas com base na textura do tecido para obter fatias de tecido tumoral intactas e uniformes. Cortar tecidos mais macios e/ou vagamente consolidados é normalmente facilitado usando ângulos de lâmina mais profundos, velocidade de corte mais lenta e fatias mais grossas. Ocasionalmente, os tecidos são muito macios para serem cortados, nesse caso os pesquisadores devem considerar a incorporação do tecido dentro de agarose ponto de fusão baixo, uma técnica comum no corte de tecido cerebral14,15.
Anteriormente, vários estudos introduziram abordagens terapêuticas de testes de drogas em fatias de tecido cultivadas. Estes estudos basearam-se na incorporação de corantes fluorescentes, imunohistoquímica ou ensaios MTT para avaliar a viabilidade do tecido6,7,8,9. Neste protocolo, usamos o reagente realtime-glo11 baseado em luminescência para medição de viabilidade. Ensaios baseados em luminescência têm vários benefícios em relação aos métodos usados anteriormente, incluindo aumento da sensibilidade, maior alcance de sinal e a capacidade de fazer rapidamente medições de viabilidade em tempo real. O tempo de medição é curto tanto para leitores de microplacas (~1 s/well) quanto para um sistema de imagem in vivo (~1 min/placa) e pode fornecer leituras de intensidade de sinal diretamente com processamento mínimo. A aquisição mais rápida do sinal e menos etapas de pós-processamento são características necessárias na triagem de medicamentos de alto grau, permitindo que medidas de viabilidade baseadas em luciferina permitam um throughput amostral muito maior na cultura de fatias de tecido. Embora um ensaio à base de luciferase forneça uma medição quantitativa precisa de toda a viabilidade da fatia, ele é incapaz de detectar alterações específicas do tipo de célula induzida por drogas no tecido. No entanto, medirções de viabilidade baseadas em luminescência de acoplamento com IHC de ponto final na mesma fatia de tecido permitirão medições específicas do tipo celular.
Embora o sistema de cultura de fatias de tecido seja uma ferramenta poderosa para levar a complexidade do tecido tumoral a uma plataforma de triagem de alto desempenho, ele tem várias desvantagens. A heterogeneidade inerente dentro de um tecido tumoral pode causar respostas de medicamentos diferenciais entre as fatias de tecido, mesmo do mesmo tumor a granel. Na ocasião, observamos variações relativamente grandes na resposta de medicamentos entre fatias de tecido em nossos experimentos. Podemos superar parcialmente essa variação, com a média de múltiplas fatias de tecido preparadas em diferentes locais dentro do mesmo tumor. Embora a cultura da fatia de tecido possa ser mantida no nível de viabilidade da linha de base por pelo menos 21 dias(Figura 2B),as populações celulares mudam ao longo do tempo. Descrevemos mudanças na população de células imunes durante o curso de experimentos de cultura de fatias de tecido10. Por isso, recomendamos que as fatias de tecido sejam examinadas em intervalos de tempo mais curtos para recapitular características do tecido nativo.
A cultura de fatias de tecido está pronta para preencher uma lacuna crítica na descoberta e desenvolvimento de drogas entre a triagem de cultura celular de alto consumo e experimentos em animais. Centenas de medicamentos podem ser avaliados em fatias produzidas a partir de uma única biópsia tumoral, adicionando maior relevância fisiológica antes de estudos em animais. Esse sistema poderia ajudar a reduzir o número de experimentos em animais necessários para trazer drogas ao mercado. Além disso, as fatias de tecido preparadas a partir de tumores de pacientes têm potencial informativo para orientar planos de tratamento na clínica. Mais de cem drogas terapêuticas estão disponíveis hoje, mas há poucos biomarcadores para orientar sua seleção. Além disso, a heterogeneidade nos pacientes também resulta em disparidades de resposta. Fatias de tecido de uma biópsia do paciente podem ser usadas para testar várias drogas antes de tratar sistematicamente, fornecendo informações valiosas sobre a eficácia da droga dentro de uma semana. No geral, o teste em tempo real e rápido de drogas usando sistemas de cultura de fatias de tecido tem grande potencial no desenvolvimento de medicamentos para câncer e decisões terapêuticas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704], e Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Gostaríamos de agradecer à Dra. Alana Welm (Universidade de Utah) por fornecer o tumor PDX do câncer de mama. Gostaríamos também de agradecer aos funcionários do Centro de Pesquisa do Câncer Comparativo, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) pela manutenção do modelo PDX e aos membros do laboratório Gujral para discussões úteis. O N.N.A é apoiado pela JSPS Overseas Research Fellowship e interdisciplinary Training Grant da FHCRC. A.J.B. é apoiado pelo Chromosome Metabolism and Cancer Training Grant da FHCRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
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