Summary
Мы вводим протокол для измерения реакции препарата в режиме реального времени на органотипические кусочки опухолевой ткани. Экспериментальная стратегия, изложенная здесь, обеспечивает платформу для проведения средне-высокой пропускной связи наркотиков экраны на ткани ломтиками, полученных из клинических или опухолей мыши в условиях ex vivo.
Abstract
Опухолевые ткани состоят из раковых клеток, проникших иммунных клеток, эндотелиальных клеток, фибробластов и внеклеточной матрицы. Эта сложная среда представляет собой микросреду опухоли (TME) и может модулировать ответ на терапию in vivo или ответ на наркотики ex vivo. Обычные экраны обнаружения рака наркотиков проводятся на клетках, культивированных в монослой, система критически не хватает влияния TME. Таким образом, экспериментальные системы, которые интегрируют чувствительные и высокопроизводительные анализы с физиологическим TME, укрепят процесс доклинического открытия препарата. Здесь мы представляем культуру срезов опухолевой ткани ex vivo в качестве платформы для скрининга лекарств со средней высокой пропускной прикладом. Органотипическая культура среза тканей представляет собой точно вырезанные, тонкие опухолевые секции, которые поддерживаются при поддержке пористой мембраны в жидко-воздушном интерфейсе. В этом протоколе мы описываем подготовку и поддержание фрагментов тканей, подготовленных из опухолей и опухолей мыши из моделей ксенотранспланта (PDX), полученных пациентом. Для оценки изменений жизнеспособности тканей в ответ на медикаментозное лечение мы использовали биосовместимый анализ жизнеспособности на основе люминесценции, который позволяет в режиме реального времени, быстро и чувствительно измерять жизнеспособные клетки в тканях. Используя эту платформу, мы оценивали доза-зависимые реакции ломтиков тканей на ингибитор мультикиназы, стауроспорина и цитотоксического агента, доксорубицин. Кроме того, мы демонстрируем применение тканевых ломтиков для фармакологии ex vivo путем скрининга 17 клинических и доклинических препаратов на фрагментах тканей, подготовленных из одной опухоли PDX. Наша физиологически-релевантная, высокочувствительная и надежная платформа скрининга ex vivo значительно укрепит доклиническую онкологическую информацию и принятие решений по лечению.
Introduction
Взаимодействие раковых клеток с физическими и биохимическими свойствами окружающей стромальной ткани образует TME. TME может стимулировать рост опухоли, метастаз, и модулировать реакцию опухоли на терапию1. В обычных доклинических развития наркотиков, кандидаты наркотиков, как правило, первый скрининг с использованием культивированных линий раковых клеток, асссеа платформы, которая критически не хватает TME2. Это отсутствие физиологических TME в клеточных стадиях предварительного скрининга может ограничить открытие эффективных агентов в опухолевых животных моделей и может способствовать высокой скорости истощения многих перспективных онкологических препаратов на более поздних клинических стадиях развития3.
Несмотря на важность TME в модуляции реакций опухолевых препаратов, экспериментальные ограничения ограничивают применение более физиологически значимых систем на ранних стадиях открытия и разработки лекарственных средств. Непрактично проверять сотни терапевтических агентов на опухоли от животных моделей или образцов опухолей пациента. Действительно, хирургические образцы являются скудными ресурсами с разнообразным генетическим фоном, и скрининг тысяч молекул-кандидатов в моделях животных невозможен из-за экспериментального масштаба, стоимости и благополучия животных.
Опухоль ткани ломтик культуры, где точно вырезать, тонкие секции опухоли культивируются ex vivo, может решить ограничение физиологических TME в анализы скрининга наркотиков. Исторически сложилось так, что область неврологии впервые и сделал обширную оптимизацию среза культуры для ткани мозга4. В последнее время многие исследования продемонстрировали подготовку ломтиков из различных типов опухолевых тканей, включая клеточные опухоли, спонтанные модели опухолей, ксенотрансплантаты пациента (PDX) и первичные опухоли пациента. Культура среза тканей Ex vivo интегрирует преимущества как in vivo, так и in vitro culture5. Опухолевые срезы ткани сохраняют нетронутую архитектуру тканей и пестрый состав клеток, что позволяет изучать раковые клетки в контексте TME.
Этот протокол вводит органотипическую систему культуры срезов опухолевых тканей в сочетании с анализом жизнеспособности в реальном времени для оценки реакции препарата. Тесты на эффективность препарата на ломтиках орханотипической опухолевой ткани в ранее введенных протоколах опираются на измерение изменений жизнеспособности клеток путем включения флуоресцентного красителя, иммуногистохимии (IHC), или MTT (((3- No 4, 5-диметилтиазол-2-yl-2, 5 дифенилов тетразолиум),7,8,9асса6 Тем не менее, все эти методы являются анализом конечной точки и страдают от низкой чувствительности, длительного времени обработки, сложного анализа данных, узкого диапазона сигналов и высокой экспериментальной ошибки. Наш люминесценция на основе живых клеток совместимый реагент улучшает эти анализы, обеспечивая широкий диапазон сигналов и мгновенное (5 мин) измерения без предварительной обработки и минимальной после обработки. Этот реагент очень чувствителен и может сосуществовать в среде клеточной культуры, что позволяет непрерывнои и время курса измерения жизнеспособности клеток. Эта система асссировки применима к высокопроходимым скринингам кандидатов на ткани на срезах тканей при доклинической разработке лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с мышью проводились в соответствии с рекомендациями, содеянённые в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Закона о защите животных и руководящих принципов Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию животных в биомедицинских исследованиях.
1. Подготовка ломтиков опухолевой ткани
- Подготовка ткани ломтик культуры (TSC) среды после рецепта в таблице 1. Фильтр среды с 0,45 мкм вакуумного фильтра единицы для стерилизации.
- Aliquot 250 л TSC среднего в скважине для 24 хорошо пластины, или 1 мл среднего в хорошо для 6 хорошо пластины. Держите тарелку в 37 градусах Цельсия, 5% CO2 увлажненного инкубатора до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда и добавки могут быть оптимизированы в зависимости от типов тканей и экспериментальных целей. Количество среды должно быть достаточно, чтобы впитать пористую мембрану культуры вставки. Не превышать уровень мембраны. Отрегулируйте средний объем, если средний уровень слишком низкий или слишком высокий. Если исследователи тестируют иммуномодулирующие средства, мы рекомендуем добавки среды с IL-210. - При использовании опухолевых тканей, полученных от мышей, эвтаназии мышей с рекомендуемой процедурой, дезинфицировать обнажённые кожи мышей, распыляя 70% этанола, и вскрыть опухоли с помощью асептических методов. Храните опухолевую ткань в трубке, содержащей сбалансированное соляное решение Хэнка (HBSS).
- При использовании свежих тканей опухоли пациента, хранить в ледяной HBSS на короткий срок, или ледяной Белцер Университета Висконсина (UW) решение для долгосрочного хранения (до 24 ч) для сохранения жизнеспособности тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагменты ткани PDX, отправленные на ночь в ледяном растворе UW, были успешно подготовлены. - Перенесите опухолевую ткань в культурную пластину размером 10 см, содержащую ледяной HBSS. Разрежьте опухоль пополам скальпелем во время погружения в ледяной HBSS. Форма опухолевых тканей в цилиндры с помощью 6 мм диаметр биопсии удар и обрезать одну сторону, чтобы создать плоскую поверхность. Храните ткани в ледяной HBSS до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте в том числе некротической области ткани, которая, как правило, в центре и имеет непрозрачный и хрупкий вид. - Настроили вибратом. Дезинфицировать все оборудование с помощью 70% этанола. Поместите буферный лоток вибратом, покрытый акриловой стеклянной крышкой, в центре ледяной ванны вибратом. Добавить лед в ледяную ванну и заполнить буфер лоток с охлажденных HBSS держать ткань прохладной при нарезке. Прикрепите лезвие бритвы к держателю лезвия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя сохранение вибратом в полустерильной среде не повлияло на предыдущие эксперименты, рекомендуется хранить вибратом под шкафом биобезопасности, если это возможно. - Тщательно поднимите биопсию-пробитой опухолевой ткани из HBSS с помощью зубчатых щипцы и удалить избыточный буфер, dabbing ткани с ворсово-бесплатнобумажное.
- Поместите каплю клея цианоакрилата медицинского класса на пластину образца и поместите ткань на эту каплю. Воздушный сушат клей в течение 2-3 мин и поместите пластину в буферный лоток. Дополнение с некоторыми HBSS до тех пор, пока ткань полностью погружена в буфер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Монтаж тканей в вертикальном, стабильном положении имеет решающее значение для создания равномерно сократить ломтики. Если установленные ткани нестабильны, либо добавьте больше клея в окружающую ткань, чтобы сохранить вертикальное положение или разгрузить ткань, сгладить дно, и клей его снова. Упругие ткани, как правило, получить толкаемых и согнуты легче во время нарезки, и в этом случае более короткие длины (Злт;5 мм) и несколько работает может быть целесообразным. Для очень хрупких тканей, бумажные полотенца могут разрушить ткани. В этом случае, ткань может быть помещена на пластиковой поверхности фитиль от некоторых избыточных HBSS. - Отрегулируйте настройки вибратом. Используются следующие настройки: толщина резки - 250 мкм, амплитуда - 3,00 мм, скорость нарезки - 0,01-0,25 мм/с, угол лезвия - 15-21 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация настроек нарезки в зависимости от жесткости ткани. Более мягкая тканя легче вырезать с более глубоким углом лезвия на более низкой скорости. Угол лезвия 18 ", скорость резки между 0,10-0,18 мм/с, и амплитуда 3,00 мм хорошо работает для мыши 4T1 и PDX HCI010 опухолей. Более жесткая ткань может быть разрезана с более высокой скоростью лезвия. - Установите место начала и конца лезвия и отрегулируйте высоту сцены. Запустите инструмент с непрерывным режимом, чтобы сократить ломтики в течение нескольких циклов, пока ткани вырезать равномерно.
- Продолжайте нарезку ткани. Перенесите ломтики вместе с небольшим количеством буфера HBSS на вставку клеточной культуры со средой с широким наконечником передачи пипетки, используя всасывание, чтобы поднять весь срез. Поместите один ломтик на вставку на 24 хорошо пластины. Вставка для 6 пластин хорошо может вместить до четырех ломтиков для репликации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если последний край ткани ломтик по-прежнему прилагается к неподрезанной ткани, остановить вибратом и отделить кусок ткани с двумя парами тонких щипцы наконечник, не касаясь или тыкать ткани ломтиками. Отдельное лезвие бритвы может быть полезно в удалении подвесной ткани. - Удалите любой избыточный буфер с тонкой пипеткой передачи чаевых.
- Когда лезвие достигнет близко к клеевым тканям, остановите инструмент, опустите сцену, удалите застывную ткань отдельным лезвием и установите новую ткань. Продолжайте нарезку до тех пор, пока не будет собрано достаточное количество ломтиков.
- Культура пластин в увлажненный инкубатор установлен на 37 градусов по Цельсию, 5% CO2. Кусочки ткани культивируются на воздушно-жидком межфазах на вставке клеточной культуры. Части ткани готовы к экспериментам 24-48 ч после первоначального препарата ломтик. Для длительного выращивания, обмен среды каждые 2-3 дней.
2. Измерение жизнеспособности
- Для измерения жизнеспособности среза ткани, обмен среды с люминесценцией на основе измерения жизнеспособности реагента, содержащего как люциферазы и prosubstrate на 1:1,000 разбавления в TSC среде после инструкций производителя. Реагент измеряет активность снижения активности живых клеток метаболизированного просеителя до люциферина11. Передача 50 зл ферментосубстратной смеси поверх каждого ломтика ткани.
- Инкубировать с нежным возбуждением на орбитальный шейкер, расположенный внутри увлажненного инкубатора, установленного при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на ночь.
- Люминесцентные сигналы могут быть измерены с помощью либо микроплиты читателя или in vivo изображений инструмент для тканей культивируется в 24 хорошо пластины. Для измерения индивидуальной жизнеспособности нескольких тканей на 6-й пластине следует использовать систему визуализации in vivo.
- При использовании микроплиты, установить микроплиту без крышки. Любой тип микроплиты, способные измерять люминесцентную интенсивность, должен быть подходящим для эксперимента. Мы использовали следующие настройки: время чтения 1 с, измерение сверху, усиление 200.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более высокой точности используйте микроплиту белой стены для настройки эксперимента. Белая стена, ясно-нижний 24 плиты скважины были протестированы, и в большинстве случаев, четкие пластины хорошо не ставят под угрозу результаты. - При использовании системы визуализации in vivo для измерения жизнеспособности поместите пластину в центр сцены и снимите крышку. Приобретите нормальные фотографические изображения с последующими люминесцентными изображениями с полем постановки на C, автоматическое время экспозиции, f-stop No 1, объективная настройка в виде микроплиты с высотой объекта 0,0 см.
- Количественная интенсивность люминесцентных с помощью программного обеспечения для визуализации сопровождается системой визуализации in vivo. Нарисуйте согласованные области интереса (ROI) вокруг каждого ломтика ткани. Этот протокол использует круг диаметром 1 см в качестве рентабельности инвестиций (см. рисунок 1). Измерьте общий поток (p/s) области.
- При использовании микроплиты, установить микроплиту без крышки. Любой тип микроплиты, способные измерять люминесцентную интенсивность, должен быть подходящим для эксперимента. Мы использовали следующие настройки: время чтения 1 с, измерение сверху, усиление 200.
3. Оценка лекарственного воздействия на кусочки тканей
- Измерьте базовую жизнеспособность перед обработкой с помощью реагента измерения жизнеспособности на основе люминесценции, как это объясняется в разделе 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если несколько тканей имеют значительно более низкую жизнеспособность по сравнению с другими, опустить ткани из ассея. - Растворите препараты в диметилсульфодоксид (DMSO), чтобы сделать запас растворов. Подготовьте 10-x лекарственный раствор с помощью TSC или другой культуры среды (25 л/хорошо для 24 хорошо пластины, содержащей 250 л среднего) в желаемых концентрациях. Для управления транспортным средством подготовьте среду, содержащую эквивалентный объем DMSO.
- Дополнить 10x препарат решение культуры среды в нижней части скважины. Смешайте путем пипетки и передать 50 зл и в среде поверх тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если несколько срезов ткани доступны, тест дубликаты или трипликаты для каждого условия. - Инкубировать ночь с нежной тряской на орбитальной шейкере в 37 градусах Цельсия, 5% CO2,увлажненный инкубатор.
- Снимите пластину с шейкера и насижаем статично в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2,увлажненный инкубатор.
- В нужных временных точках измерьте люминесцентную интенсивность от тканей с помощью микроплитного считывателя или системы визуализации in vivo. Как правило, эффекты препарата становятся обнаруживаемыми после 1-6 дней лечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент жизнеспособности на основе люминесценции стабилен в течение не менее 3 дней в условиях культуры. Тем не менее, субстрат может быть исчерпан во время анализа в зависимости от метаболической активности ткани. Если значительное падение сигнала наблюдается в тканях с ранее высокими сигналами, дополнить субстрат во всех скважинах. - Рассчитайте оставшуюся жизнеспособность обработанных опухолевых тканей с помощью следующего уравнения:
Жизнеспособность обработанной ткани нормализуется ее базовой жизнеспособностью и жизнеспособностью смещения контрольных опухолевых тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы демонстрируем временной курс, протокол оценки эффективности нескольких лекарств для ломтиков опухолевой ткани, приготовленные из тканей опухоли молочной железы мыши 4T1 и модели PDX рака молочной железы, HCI01012. Мы успешно подготовили кусочки ткани из нескольких опухолей, полученных из мыши, PDX, и свежих опухолей пациента10. Общий рабочий процесс подготовки опухолевой ткани и тест на эффективность препарата описан на рисунке 1. В целом, мы могли бы подготовить 20-40 ломтиков ткани из одной объемной опухоли 1000-1500 мм3 в объеме.
Для измерений жизнеспособности мы использовали реагент жизнеспособности, совместимый с живыми клетками. Лечение ингибитора мультикиназы, стауроспорина, при концентрации 1 мкм в течение 4 дней снизило интенсивность сигнала в 100 раз по сравнению с опухолевыми тканями, обработанными с помощью контроля ДМСО(рисунок 2A). Части ткани, подготовленные из опухоли 4T1, сохранялись в течение по крайней мере 21 дня с случайным средним обменом(рисунок 2B). Большинство измерений реакции препарата были выполнены в течение 7 дней с подготовки среза ткани. Поскольку реагент, совместимый с клетками, не требует обработки или фиксации перед измерением, он позволил нам проводить измерения времени. В рисунке 2Ссуммируются временно-зависимые изменения в жизнеспособности фрагментов опухолевой ткани из идентичной опухолевой ткани 4Т1. Staurosporine на 500 нм снижение люминесценции с первого дня и достиг самого низкого уровня в день 4, оставаясь низким для каждого последующего тайм-пойнта. В отличие от этого, люминесцентная интенсивность из контрольной группы тканей, дополненных ДМСО, оставалась стабильной до шестого дня. Кроме того, кусочки ткани, приготовленные из идентичных опухолей 4T1, лечились серийными дозами стауроспорина (0-1 мкм) в течение 4 дней, и показали изменения, зависящие доза в жизнеспособности и EC50 (рисунок 2D).
Мы протестировали химиотерапевтические препараты на фрагментах тканей, подготовленных из ортотопической модели PDX рака молочной железы, HCI010. Кусочки ткани PDX лечились доксорубицином, стандартным химиотерапевтическим препаратом, в дозах 0-5 мкм в течение 6 дней, обеспечивая дозозависимые изменения жизнеспособности(рисунок 3A). Кроме того, эффективность 17 препаратов, включая доклинические и клинически одобренные препараты, была протестирована в тройных на фрагментах тканей, подготовленных из одной навалом опухоли HCI010. Препараты применялись при 0,5 км в течение 4 дней в тройном(рисунок 3B). Эти результаты обеспечивают доказательство концепции, что средне-пропускной препарат скрининг может быть выполнен на опухолевых ломтиков с родной TME.
Рисунок 1: Схематичный показ ткани срез подготовки с последующим оценки эффективности препарата. Опухолевые ткани были обработаны в ломтики 6 мм в диаметре и 250 мкм толщиной и культивируется в воздушно-жидкой интерфазы с поддержкой клеточной культуры вставки. Ткань жизнеспособность была измерена с помощью биолюминесцентного реагента как до, так и после лечения наркотиками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Ткань ломтик жизнеспособности измерения и реакции на наркотики. (A) Репрезентативные изображения измерений жизнеспособности на основе люминесценции в части опухолевых тканей молочной железы. Ткань ломтики из опухоли 4T1 были инкубированы с 1 мкм staurosporine или DMSO контроля вместе с люминесцентным реагентом ассы асссы жизнеспособности в течение 4 дней. Изображения были получены с помощью системы визуализации in vivo и проанализированы с помощью сопроводительного программного обеспечения для анализа изображений. Красные круги указывают на рентабельность инвестиций, измеренную для биолюминесценции. Внизу - участок, показывающий люминесцентный сигнал от ломтиков опухолевой ткани, обработанных стауроспорином или контролем, измеренным системой визуализации in vivo. Бар указывает среднее количество четырех срезов ткани показано как круги (контроль) или квадратный (стауроспорин лечение). (B) Участок, показывающий жизнеспособность 4T1 опухолевых тканей ломтики культивируется в течение 21 дней от подготовки. Выживаемость в 21 день, измеренная системой визуализации in vivo, была нормализована до 3-го дня. Каждая точка указывает измерения из одного ломтика; бар указывает среднее; в поле показаны квартили, а усы показывают минимальное максимальное значение измерения. (C) Измерение времени-курса жизнеспособности ткани после лечения staurosporine. С течением времени измерялась жизнеспособность фрагментов тканей из опухоли 4Т1, обработанной стауроспорином (500 нМ) или эквивалентным объемом ДМСО в качестве контроля. Интенсивность люминесценции измерялась микроплитным считывателем по указанным таймочкам. Каждая точка иллюстрирует точку данных из отдельного среза ткани, а барный график указывает на среднее SEM. (D) Дозо-зависимое лечение staurosporine на ломтиках ткани. Ткань ломтики, подготовленные из опухоли 4T1 были дополнены серийные дозы staurosporine или DMSO в качестве управления транспортным средством. Оставшаяся жизнеспособность, основанная на люминесценции, измерялась системой визуализации in vivo через 4 дня после начала лечения. Относительная жизнеспособность была рассчитана с использованием уравнения, показанного в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Экран наркотиков в ткани ломтиками, подготовленными из модели рака молочной железы PDX. (A) Участок, показывающий изменения в жизнеспособности в ответ на различные дозы доксорубицина. Части ткани были подготовлены из ортотопического рака молочной железы PDX опухоли, HCI010. Выживаемость измерялась в ломтиках, обработанных титронными дозами доксорубицина. После 6 дней, люминесценция была измерена с помощью системы визуализации in vivo. Бар - ЭТО SEM. (B) Мелкомасштабный химиотерапевтический скрининг препарата на ломтиках опухолевой ткани от ортотопического рака молочной железы PDX опухоли. Диаграмма бара - означает SEM тройного эксперимента. Эти данные были опубликованы ранее10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Материал | Мл | Окончательная концентрация | Фондовая |
| Уильям средний E | 500 | ||
| Никотинамид | 6 | 12 мМ | 1 M акции Никотинамида в Среднем E Уильямса, стерилизованы |
| Аскорбиновая кислота | 6 | 50,4 мкг/мл | 0,21 г/50 мл (10 мм) аскорбиновой кислоты в Уильяме Medium E, стерилизованной |
| Бикарбонат натрия | 15 | 2,25 мг/мл | 7.5% (w/v) решение |
| ХЕПЕС Баффер | 10 | 20 мМ | 1 M биржевое решение |
| Глюкозы | 10 | 5 мг/мл | 250 мг/мл бульона, стерализованного |
| Пируват натрия | 5 | 1 мМ | 100 мМ запас |
| Л-глютамин | 5 | 2 мМ | 200 мМ запас |
| ИТС - Премикс | 5 | Содержит рекомбинантный инсулин человека, комсоментный трансферин (12,5 мг каждый), селеновую кислоту (12,5 мкг), БСА (2,5 г) и линолевая кислота (10,7 мг) | |
| Пенициллин-стрептомицин | 2 | 40 МЕ/мл ручка, 40 мкг/мл Strep | 10 000 МЕ/мл пера, 10 000 мкг/мл Strep |
| Рекомбинантный EGF | 0.5 | 20 нг/мл | 20 мкг/мл бульона |
Таблица 1: Средний рецепт TSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы демонстрируем платформу для количественных и в режиме реального времени исследований эффективности лекарств на органотипических фрагментах опухолевых тканей. Система культуры срезов тканей обеспечивает явные преимущества по сравнению с традиционными клеточными методами in vitro, захватывая неоднородность клеток и физиологические характеристики родной микросреды опухоли. Эта платформа также обеспечивает более высокую пропускную связь для тестирования эффективности препарата, помогая преодолеть разрыв между исследованиями клеточной культуры и экспериментами in vivo.
Для получения точных и последовательных результатов необходимо минимизировать повреждения тканей во время подготовки. Ткань ломтики должны быть обработаны с широким наконечником пластиковых пипетки, чтобы избежать повреждений, вызванных физическим контактом. Необходимо поддерживать средний объем культуры, чтобы фрагмент ткани контактировал как с воздухом, так и со средой в течение всего эксперимента.
Культурная среда должна быть оптимизирована в зависимости от типа ткани и экспериментального назначения. Среда TSC, используемая в этом протоколе, является средой, свободной от сыворотки, которая была первоначально разработана для первичной гепатоцитной культуры13. Эта среда также была использована для поддержания нескольких типов опухолей, включая грудь, печень, толстую кишку и поджелудочную железу10. Кроме того, мы продемонстрировали повышенную выживаемость иммунных клеток с помощью оптимизированной среды на основе DMEM10. Настройки вибратомдолжны должны быть оптимизированы на основе текстуры ткани, чтобы получить нетронутые и однородные кусочки опухолевой ткани. Нарезка более мягкой и/или слабо консолидированной ткани, как правило, облегчается с помощью более глубоких углов лезвия, более медленной скорости резки и более толстых ломтиков. Иногда, ткани слишком мягкие, чтобы сократить, и в этом случае исследователи должны рассмотреть встраивание ткани в пределах низкой точки плавления агарозы, техника, распространенная в ткани мозга нарезки14,15.
Ранее в нескольких исследованиях были введены терапевтические подходы к тестированию лекарственных средств на культивированные кусочки тканей. Эти исследования опирались на флуоресцентный краситель инкорпорации, иммуногистохимии, или MTT анализы для оценки жизнеспособности тканей6,7,8,9. В этом протоколе мы использовали для измерения жизнеспособности реагент RealTime-Glo 11, совместимый с живой клеткой, совместимость с живым иживым реагентом RealTime-Glo11. Анализы на основе люминесценции имеют ряд преимуществ по сравнению с ранее использовавшиеся методами, включая повышенную чувствительность, более широкий диапазон сигналов и способность быстро делать измерения жизнеспособности в режиме реального времени. Измерение времени является коротким как для микроплитных считывателей (No1 с/хорошо), так и для системы визуализации in vivo (1 мин/пластина) и может обеспечить показания интенсивности сигнала непосредственно с минимальной обработкой. Более быстрое приобретение сигнала и меньшее количество шагов постобработки являются необходимыми функциями в высокой пропускной способности скрининга наркотиков, что позволяет люциферина основе жизнеспособности измерений, чтобы гораздо больше выборки пропускной способности в культуре среза ткани. В то время как анализ на основе люциферазы обеспечивает точное количественное измерение жизнеспособности всего среза, он не в состоянии обнаружить индуцированные препаратами изменения типа клеток в ткани. Тем не менее, сочетание люминесценции на основе измерений жизнеспособности с конечным пунктом IHC на том же срезе ткани позволит клеточного типа конкретных измерений.
В то время как система культуры среза тканей является мощным инструментом в привлечении сложности опухолевых тканей к высокой пропускной способностью скрининговой платформы, она имеет несколько недостатков. Врожденная неоднородность в опухолевой ткани может вызвать дифференциальные реакции препарата среди фрагментов тканей даже из той же навалом опухоли. Иногда в наших экспериментах наблюдались относительно большие различия в реакции на лекарственные препараты среди фрагментов тканей. Мы можем частично преодолеть эту вариацию, усреднев несколько фрагментов ткани, подготовленных из разных участков в пределах одной и той же опухоли. Хотя культура среза тканей может быть сохранена на базовом уровне жизнеспособности, по крайней мере 21 дней(рисунок 2B),популяции клеток меняются с течением времени. Мы описали сдвиги в популяции иммунных клеток в ходе экспериментов культуры среза тканей10. Поэтому мы рекомендуем, чтобы срезы тканей были исследованы в течение более коротких временных интервалов, чтобы подвести их характеристики родной ткани.
Ткань ломтик культуры готова заполнить критический пробел в открытии наркотиков и развития между высокой пропускной клеточной культуры скрининга клеток и экспериментов на животных. Сотни препаратов могут быть оценены на ломтиках, полученных от одной биопсии опухоли, добавив повышенную физиологическую актуальность до исследований на животных. Эта система могла бы помочь сократить количество экспериментов на животных, необходимых для вывоза наркотиков на рынок. Кроме того, кусочки тканей, подготовленные из опухолей пациента, обладают информативным потенциалом в руководящих планах лечения в клинике. Более ста терапевтических препаратов доступны сегодня, но Есть несколько биомаркеров для руководства их выбор. Кроме того, неоднородность у пациентов также приводит к несоответствию в ответ. Ткань ломтики от пациента биопсии могут быть использованы для тестирования нескольких препаратов перед лечением системно, предоставляя ценную информацию об эффективности препарата в течение недели. В целом, в режиме реального времени и быстрое тестирование препаратов с использованием систем культуры среза тканей имеет большой потенциал в разработке рака наркотиков и терапевтических решений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH/NCI (K22CA201229, P30CA015704) и Фондом Сидни Киммеля «Киммел» (Kimmel Scholar Award), премией открытия рака легких (LCD-505536). Мы хотели бы поблагодарить доктора Алану Уэлм (Университет штата юта) за предоставление опухоли рака молочной железы PDX. Мы также хотели бы поблагодарить сотрудников сравнительной медицины, Фред Хатчинсон онкологический научный центр (FHCRC) для поддержания модели PDX и членов лаборатории Gujral для полезных дискуссий. N.N.A поддерживается стипендией JSPS по зарубежным исследованиям и междисциплинарной подготовке грантов FHCRC. A.J.B. поддерживается Хромосомы Метаболизм и Рак Обучение Грант от FHCRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
