Summary
Vi inför ett protokoll för att mäta realtid läkemedelsrespons i organotypiska tumör vävnad skivor. Den experimentella strategi som beskrivs här ger en plattform för att utföra medelhög genomströmning läkemedelsskärmar på vävnadsskivor som härrör från kliniska eller mustumörer i ex vivo villkor.
Abstract
Tumör vävnader består av cancerceller, infiltrerade immunceller, endotelceller, fibroblaster och extracellulära matris. Denna komplexa miljö utgör tumör mikromiljö (TME) och kan modulera svar på terapi in vivo eller läkemedelsrespons ex vivo. Konventionella cancerläkemedel upptäckt skärmar utförs på celler odlade i en monolayer, ett system som kritiskt saknar påverkan av TME. Således kommer experimentella system som integrerar känsliga och hög genomströmningsanalyser med fysiologiska TME att stärka den prekliniska läkemedelsupptäcktsprocessen. Här introducerar vi ex vivo tumör vävnad skiva kultur som en plattform för medium-high-throughput drog screening. Organotypic vävnad skiva kultur utgör exakt skuren, tunn tumör sektioner som underhålls med stöd av ett poröst membran i en flytande luft gränssnitt. I detta protokoll beskriver vi beredning och underhåll av vävnad skivor beredd från mus tumörer och tumörer från patient-härledda xenograft (PDX) modeller. För att bedöma förändringar i vävnadskraften som svar på läkemedelsbehandling, utnyttjade vi en biokompatibel luminescensbaserad lönsamhetsanalys som möjliggör realtid, snabb och känslig mätning av livskraftiga celler i vävnaden. Med hjälp av denna plattform utvärderade vi dosberoende svar av vävnadsskivor till multikinashämmare, staurosporin och cytotoxiskt medel, doxorubicin. Vidare visar vi tillämpningen av vävnad skivor för ex vivo farmakologi genom screening 17 kliniska och prekliniska läkemedel på vävnad skivor beredd från en enda PDX tumör. Vår fysiologiskt relevanta, mycket känsliga och robusta ex vivo screening plattform kommer att kraftigt stärka preklinisk onkologi läkemedelsupptäckt och behandling beslutsfattande.
Introduction
Cancer cell interaktioner med de fysiska och biokemiska egenskaperna hos den omgivande stromal vävnaden bildar TME. TME kan stimulera tumörtillväxt, metastasering och modulera tumörsvar på terapi1. I konventionella prekliniska läkemedelsutveckling, läkemedelskandidater är vanligtvis först screenas med odlade cancer cellinjer, en analys plattform som kritiskt saknar TME2. Denna brist på fysiologiska TME i cellbaserade prescreening stadier kan begränsa upptäckten av effektiva medel i tumörbärande djurmodeller och kan bidra till den höga avgångsfrekvensen för många lovande onkologi läkemedel i senare kliniska stadier av utveckling3.
Trots vikten av TME i modulerande tumör läkemedelssvar, experimentella begränsningar begränsa tillämpningen av mer fysiologiskt relevanta system under de tidiga stadierna av läkemedelsupptäckt och utveckling. Det är opraktiskt att screena hundratals terapeutiska medel på tumörer från djurmodeller eller patienttumörprover. Faktum är att kirurgiska exemplar är knappa resurser med varierande genetisk bakgrund och screening tusentals kandidatmolekyler i djurmodeller är inte möjligt på grund av experimentell skala, kostnader och djurskydd.
Tumör vävnad skiva kultur, där exakt skära, tunna tumör sektioner odlas ex vivo, kan ta itu med begränsningen av fysiologiska TME i läkemedelsscreening analyser. Historiskt sett har neurovetenskapen banat väg för och gjort omfattande optimeringar av skiva kultur för hjärnvävnad4. Nyligen har många studier visat beredning av skivor från olika typer av tumör vävnad inklusive cell linje-härledda tumörer, spontana tumör modeller, patient-härledda xenografts (PDX), och primära patient tumörer. Ex vivo vävnad skiva kultur integrerar fördelar från både in vivo och in vitro kultur5. Tumör vävnad skivor behålla intakt vävnad arkitektur och brokiga cellsammansättning, möjliggör studier av cancerceller inom TME sammanhang.
Detta protokoll introducerar en organotypic tumör vävnad segment kultur system i kombination med en realtid, mycket känslig lönsamhet analys för att utvärdera läkemedelssvar. Drug effekt tester på organotypic tumör vävnad skivor i tidigare införda protokoll förlitar sig på att mäta förändringar i cellens livskraft genom fluorescerande färgämne införlivande, immunohistochemistry (IHC), eller MTT ((3- [4, 5-dimetylthiazol-2-yl]-2, 5 difenyl tetrazolium bromid) analys6,,7,8,9. Alla dessa metoder är dock slutpunktsanalyser och lider av låg känslighet, lång bearbetningstid, komplexa dataanalyser, smalt signalområde och högt experimentellt fel. Vår luminescens-baserade levande cell-kompatibla reagens förbättrar dessa analyser genom att tillhandahålla ett brett signalområde och momentana (~ 5 min) mätning utan föregående bearbetning och minimal efterbehandling. Detta reagens är mycket känslig och kan samexistera i cellkulturmedia, vilket möjliggör kontinuerlig och tidsförloppsmätning av cellens livskraft. Detta analyssystem är tillämpligt på hög genomströmning screening av läkemedelskandidater på vävnad skivor i prekliniska läkemedelsutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla musförsök utfördes i enlighet med rekommendationerna i handledningen för vård och användning av djurs välbefinnande och National Institutes of Health riktlinjer för vård och användning av djur i biomedicinsk forskning.
1. Beredning av tumörvävnad skivor
- Förbered odlingsverktyget (TSC) efter receptet i tabell 1. Filtrera mediet med en vakuumfilterenhet på 0,45 μm för att sterilisera.
- Aliquot 250 μL TSC medium per brunn för en 24 brunnsplatta, eller 1 ml medium per brunn för en 6-brunnsplatta. Förvara plattan i en 37 °C, 5% CO2 fuktad inkubator tills den används.
OBS: Mediet och kosttillskott kan optimeras beroende på vävnadstyper och experimentella mål. Mängden medium bör vara precis tillräckligt för att suga det porösa membranet i ett odlingsinsats. Överskrid inte membranets nivå. Justera medelvolymen om medelnivån är för låg eller för hög. Om forskare testar immunmodulerande medel, Vi rekommenderar tillskott av mediet med IL-210. - Om du använder tumörvävnad som härrör från möss, avliva möss med ett rekommenderat förfarande, sanera den exponerade huden på möss genom att spruta 70% etanol och dissekera tumörer med aseptiska tekniker. Förvara tumörvävnaden i ett rör som innehåller iskall Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
- Om du använder färska patient tumör vävnader, lagra i iskall HBSS för kort sikt, eller iskall Belzer University of Wisconsin (UW) lösning för långsiktig lagring (upp till 24 h) för att bevara vävnadsflaska.
OBS: Skivor från en PDX-vävnad som levereras över natten i iskall UW-lösning har förberetts. - Överför tumörvävnaden till en 10 cm kulturplatta som innehåller iskall HBSS. Skär tumören i halvor med en skalpell medan nedsänkt i iskall HBSS. Forma tumörvävnader till cylindrar med hjälp av en biopsistan med 6 mm diameter och trimma ena sidan för att skapa en plan yta. Förvara vävnaderna i iskall HBSS tills den används.
OBS: Undvik att inkludera vävnadens nekrotiska område, som i allmänhet är i centrum och har ett ogenomskinligt och ömtåligt utseende. - Sätt upp vibratomen. Desinficera all utrustning med 70 % etanol. Placera vibratombuffertbrickan täckt med ett akrylglaslock i mitten av det vibratome isbadet. Tillsätt is till isbadet och fyll buffertbrickan med kyld HBSS för att hålla vävnaden sval medan skivning. Fäst ett rakblad på bladhållaren.
OBS: Även om vihåller vibratomer i en semisteril miljö inte har påverkat tidigare experiment, rekommenderas att lagra vibratom under en biosäkerhet skåp om det finns. - Lyft försiktigt upp en biopsi-stansad tumörvävnad från HBSS med hjälp av tandade pincett och ta bort överflödig buffert genom att dabbing vävnaden med en luddfri pappershandduk.
- Placera en droppe medicinsk kvalitet cyanoakrylat lim på provplattan och placera vävnaden på denna droppe. Lufttorka limmet i 2–3 min och placera plattan i buffertbrickan. Komplettera med vissa HBSS tills vävnaden är helt nedsänkt i bufferten.
OBS: Montering av vävnader i upprätt, stabilt läge är avgörande för att generera jämnt skurna skivor. Om monterade vävnader är instabila, antingen lägga till mer lim till den omgivande vävnaden för att behålla en upprätt position eller lossa vävnaden, platta botten, och limma den igen. Elastiska vävnader tenderar att få skjuts och böjas lättare under skivning, i vilket fall kortare längder (<5 mm) och flera körningar kan vara lämpligt. För extremt ömtåliga vävnader kan pappershanddukar förstöra vävnaden. I detta fall kan vävnaden placeras på en plastyta för att transportera bort lite överskott HBSS. - Justera vibrationsinställningarna. Följande inställningar används: skärtjocklek = 250 μm, amplitud = 3,00 mm, skivningshastighet = 0,01–0,25 mm/s och bladvinkel = 15°–21°.
Obs! Mjukare vävnader skärs lättare med en djupare bladvinkel vid lägre hastighet. En bladvinkel på 18°, skärhastighet mellan 0,10–0,18 mm/s och en amplitud på 3,00 mm fungerar bra för mus 4T1 och PDX HCI010 tumörer. Styvare vävnad kan skäras med en snabbare bladhastighet. - Ställ in bladets start- och slutplatser och justera scenens höjd. Kör instrumentet med kontinuerligt läge för att skära skivor i flera cykler tills vävnaderna skärs jämnt.
- Fortsätt skära vävnaden. Överför skivorna tillsammans med en liten mängd HBSS-buffert på cellodlingsinsatsen med medium med en bred spetsöverföringspisett, med sug för att lyfta hela segmentet. Placera ett segment per insats på en 24-brunnsplatta. En insats för 6 brunnsplattor rymmer upp till fyra skivor för en replikatanalys.
OBS: Om vävnadsskivans sista kant fortfarande är fäst vid den oklippta vävnaden, stoppa vibrera och separera vävnadsskivan med två par fina spetstång pincett utan att röra vid eller peta vävnadsskivorna. Ett separat rakblad kan vara användbart för att ta bort hängande vävnad. - Ta bort eventuell överskjutande buffert med en fin spetsöverföringspisett.
- När bladet når nära de limmade vävnaderna, stoppa instrumentet, sänk scenen, ta bort den stelnade vävnaden med ett separat blad och montera en ny vävnad. Fortsätt skära tills tillräckligt med skivor har samlats in.
- Odla plattorna i en fuktad inkubator inställd på 37 °C, 5% CO2. Vävnadsskivorna odlas vid luftflytande interfas på cellodlingsinsatsen. Vävnadsskivorna är klara för experiment 24–48 timmar efter den första skivaberedningen. För långsiktig odling, byta medium var 2-3 dagar.
2. Mätning av bärkraft
- För mätning av vävnadsskivans bärkraftsmätning, byt ut mediet mot ett mätreagens för blomningsbaserad bärkraft som innehåller både luciferas och prosubstrat vid 1:1 000 spädning i TSC-medium enligt tillverkarens anvisningar. Reagensen mäter reduktionsaktiviteten hos levande celler av metaboliserad prosubstrat till luciferin11. Överför 50 μL enzymsubstratblandning ovanpå varje vävnadsskiva.
- Inkubera med mild omrörning på en orbital shaker placerad inuti en fuktad inkubator inställd på 37 °C med 5% CO2 över natten.
- Självlysande signaler kan mätas med antingen en mikroplåtsläsare eller ett in vivo-bildinstrument för vävnader odlade i en 24-brunnsplatta. För att mäta den individuella livskraften hos flera vävnader på en 6-brunnsplatta bör ett in vivo-bildsystem användas.
- Ställ in mikroplattan utan lock när du använder en mikroplattläsare. Alla typer av mikroplåtsläsare som kan mäta självlysande intensitet bör vara lämpliga för experimentet. Vi använde följande inställningar: lästid = 1 s, mätning uppifrån, gain = 200.
OBS: För högre noggrannhet, använd en vit vägg mikroplatta för att ställa in experimentet. Vit-vägg, klar botten 24 brunn plattor har testats, och i de flesta fall, klar brunn plattor inte äventyra resultaten. - När du använder ett in vivo-bildsystem för att mäta livskraften, placera plattan i mitten av scenen och ta bort locket. Förvärva normala fotografiska bilder följt av självlysande bilder med ett fält av sceninställning vid C, automatisk exponeringstid, f-stop = 1, objektiv inställning som mikroplatta med motivets höjd = 0,0 cm.
- Kvantifiera självlysande intensiteten med hjälp av bildhanteringsprogrammet tillsammans med in vivo-bildsystemet. Rita konsekventa regioner av intresse (ROI) runt varje vävnadssegment. Detta protokoll använder en cirkel med diametern 1 cm som en ROI (se bild 1). Mät det totala flödet (p/s) i området.
- Ställ in mikroplattan utan lock när du använder en mikroplattläsare. Alla typer av mikroplåtsläsare som kan mäta självlysande intensitet bör vara lämpliga för experimentet. Vi använde följande inställningar: lästid = 1 s, mätning uppifrån, gain = 200.
3. Utvärdering av läkemedelseffekt på vävnadsskivorna
- Mät baslinjens lönsamhet före behandling med hjälp av det luminescensbaserade mätreagens för lönsamhet som förklaras i avsnitt 2.
OBS: Om flera vävnader har betydligt lägre lönsamhet jämfört med andra, utelämna vävnaderna från analysen. - Lös upp läkemedel i dimetylsulfaoxid (DMSO) för att göra lagerlösningar. Förbered en 10x läkemedelslösning med TSC eller annat odlingsmedium (25 μL/brunn för en 24-brunnsplatta som innehåller 250 μl medium) vid önskade koncentrationer. För fordonskontroll, bereda medium som innehåller en motsvarande volym DMSO.
- Komplettera 10x läkemedelslösning till odlingsmediet längst ner i brunnen. Blanda genom pipettering och överför 50 μL av mediet ovanpå vävnaderna.
Obs: Om flera vävnadsskivor finns tillgängliga, testa dubbletter eller tre exemplar för varje tillstånd. - Inkubera över natten med skonsam skakning på en orbital shaker i en 37 °C, 5% CO2, fuktad inkubator.
- Ta bort plattan från skakapparaten och inkubera statiskt i 37 °C, 5% CO2,fuktad inkubator.
- Vid önskade tidpunkter, mäta ljusstyrkan från vävnaderna med hjälp av en mikroplåtsläsare eller ett in vivo-bildsystem. Vanligtvis blir läkemedelseffekter detekterbara efter 1–6 dagars behandling.
OBS: Det luminescensbaserade livsduglighetsreagensen är stabilt i minst 3 dagar under odlingsförhållanden. Substratet kan dock vara utarmat under analysen beroende på vävnadens metaboliska aktivitet. Om en signifikant signaldroppe observeras i vävnader med tidigare höga signaler, komplettera substratet i alla brunnar. - Beräkna den återstående livskraften hos de behandlade tumörvävnaderna med hjälp av följande ekvation:
Livskraften i den behandlade vävnaden normaliseras av dess baslinje lönsamhet och lönsamhet förskjutning av kontroll tumör vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här visar vi en tid-kurs, flera läkemedel effekt utvärdering protokoll för tumör vävnad skivor beredda från mus 4T1 brösttumör vävnader och en bröstcancer PDX modell, HCI01012. Vi förberedde framgångsrikt vävnadsskivor från flera mus-härledda tumörer, PDX och färska patienttumörer10. Det övergripande arbetsflödet för tumörvävnadsberedningen och läkemedelseffekttestet beskrivs i figur 1. I allmänhet kunde vi förbereda 20-40 vävnad skivor från en enda bulk tumör på 1.000-1.500 mm3 i volym.
För lönsamhetsmätningar utnyttjade vi ett självlysande, levande cellkompatibelt livsdugligt reagens. Behandling av en multiasarinhämmare, staurosporin, vid 1 μM koncentration i 4 dagar minskade signalintensiteten med 100x, jämfört med tumörvävnader som behandlats med DMSO kontroll (Figur 2A). Vävnaden skivor beredd från 4T1 tumör bibehölls i minst 21 dagar med enstaka medium utbyte (Figur 2B). De flesta av läkemedelsresponsmätningarna utfördes inom 7 dagar från beredning av vävnadsskivor. Eftersom den levande cellkompatibla reagensen inte kräver bearbetning eller fixering före mätning, gjorde det möjligt för oss att utföra tidsloppsmätningar. Tidsberoende förändringar i livskraften hos tumörvävnad skivor från identiska 4T1 tumör vävnad sammanfattas i figur 2C. Staurosporin vid 500 nM minskade luminescens från dag 1 och nådde den lägsta nivån på dag 4, återstående låg för varje efterföljande tidpunkt. Däremot förblev den självlysande intensiteten från kontrollgruppen av vävnader kompletteras med DMSO stabil fram till dag 6. Dessutom behandlades vävnadsskivor som framställts av identiska 4T1-tumörer med seriella doser av staurosporin (0–1 μM) i 4 dagar, och visade dosberoende förändringar i livskraften och EG50 (figur 2D).
Vi testade kemoterapeutiska läkemedel på vävnad skivor beredd från en orthotopic PDX modell av bröstcancer, HCI010. PDX vävnad skivor behandlades med doxorubicin, en standard kemoterapeutiska läkemedel, vid doser på 0-5 μM i 6 dagar, vilket ger dosberoende förändringar i livskraft (figur 3A). Vidare, effekten av 17 läkemedel, inklusive prekliniska och kliniskt godkända läkemedel, testades i tre exemplar på vävnad skivor beredda från en enda bulk HCI010 tumör. Läkemedlen applicerades vid 0,5 μM i 4 dagar i tre exemplar (figur 3B). Dessa resultat ger proof-of-concept att medium-genomströmning drog screening kan utföras på tumör skivor med infödda TME.
Figur 1: Schematisk visar vävnad skiva beredning följt av läkemedelseffekt utvärdering. Tumör vävnader bearbetades i skivor 6 mm i diameter och 250 μm tjock och odlade i luft-flytande interfas med stöd från cell kultur skär. Vävnadsflaskan mättes med hjälp av ett bioluminescerande reagens både före och efter läkemedelsbehandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mätning och reaktion på läkemedlens livskraft i vävnadsskiva. (A)Representativa bilder av luminescensbaserade lönsamhetsmätningar i brösttumörvävnadsskivor. Vävnad skivor från 4T1 tumör var inkuberas med 1 μM staurosporin eller DMSO kontroll tillsammans med självlysande lönsamhet analys reagens i 4 dagar. Bilder erhölls med hjälp av ett in vivo-bildsystem och analyserades av medföljande bildanalysprogramvara. Röda cirklar indikerar avkastningen mätt för bioluminescens. Botten = Ett område som visar självlysande signal från tumörvävnad skivor behandlas med staurosporin eller kontroll mätt med en in vivo bildsystem. Stapeln anger medelvärdet av de fyra vävnadsskivor som visas som cirklar (kontroll) eller kvadratiska (staurosporinbehandlade). (B)Ett område som visar livskraften hos 4T1 tumörvävnadsskivor odlade i 21 dagar från beredningen. Lönsamheten dag 21 mätt med ett in vivo-bildsystem normaliserades till dag 3. Varje punkt anger mätning från ett enda segment. Stapeln anger medelvärdet. Rutan visar kvartiler och morrhår visar det lägsta till högsta värdet för mätningen. (C)Tids-kurs mätningar av vävnadskraft efter staurosporin behandling. Lönsamheten för vävnad skivor från 4T1 tumör behandlas med staurosporin (500 nM) eller motsvarande volym DMSO som en kontroll mättes över tiden. Luminescence intensiteter mättes av en microplate läsare över de angivna tidspunkterna. Varje punkt illustrerar en datapunkt från en enskild vävnadsskiva, och stapeldiagrammet anger medelvärdet ± SEM. (D) Dosberoende behandling av staurosporin på vävnadsskivor. Vävnad skivor beredd från 4T1 tumör kompletterades med seriell doser av staurosporin eller DMSO som ett fordon kontroll. Den återstående lönsamheten baserat på luminescens mättes med ett in vivo-bildsystem 4 dagar efter behandlingsstart. Relativ bärkraft beräknades med hjälp av ekvationen som visas i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Drogskärm i vävnadsskivor framställda av en PDX-modell av bröstcancer. (A)Ett område som visar förändringar i lönsamheten som svar på olika doser av doxorubicin. Vävnaden skivor var beredda från en orthotopic bröstcancer PDX tumör, HCI010. Lönsamheten mättes i skivor som behandlades med titrerade doser av doxorubicin. Efter 6 dagar mättes luminescens med hjälp av ett in vivo-bildsystem. Bar = medelvärde ± SEM. (B) En småskalig kemoterapeutisk läkemedelsskärm på tumörvävnadsskivor från en orthotopic bröstcancer PDX-tumör. Stapeldiagrammet = medelvärde ± SEM för trearbetsexperiment. Dessa uppgifter har publicerats tidigare10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Material | Ml | Slutlig koncentration | Lager |
| Williams medium E | 500 | ||
| Nikotinamid | 6 | 12 mM | 1 M lager av nikotinamid i Williams Medium E, steriliserad |
| Askorbinsyra | 6 | 50,4 μg/ml | 0,21 g/50 ml (>10 mM lager) askorbinsyra i Williams Medium E, steriliserat |
| Natriumbikarbonat | 15 | 2,25 mg/ml | 7,5% (w / v) lösning |
| HEPES-buffert | 10 | 20 mM | 1 M lagerlösning |
| Glukos | 10 | 5 mg/ml | 250 mg/ml lager, stestaliserad |
| Natriumpyruvat | 5 | 1 mM | 100 mM lager |
| L-glutamin | 5 | 2 mM | 200 mM lager |
| ITS + Premix | 5 | Innehåller humant rekombinant insulin, humant transferrin (12,5 mg vardera), selensyra (12,5 μg), BSA (2,5 g) och linolsyra (10,7 mg) | |
| Penicillin-Streptomycin | 2 | 40 IE/mL Pen, 40 μg/mL Strep | 10 000 IE/mL Pen, 10 000 μg/ml Strep |
| Rekombinant EGF | 0.5 | 20 ng/ml | 20 μg/ml-lager |
Tabell 1: TSC medium recept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll visar vi en plattform för kvantitativa och realtid läkemedelseffekt studier på organotypic tumör vävnad skivor. Vävnaden segmentet kultursystemet ger tydliga fördelar jämfört med traditionella cellbaserade in vitro-metoder genom att fånga cell heterogenitet och fysiologiska egenskaper hos den inhemska tumörmikromiljön. Denna plattform möjliggör också högre genomströmning för läkemedelseffektivitetstester, vilket bidrar till att överbrygga klyftan mellan cellodlingsstudier och in vivo-experiment.
För att få korrekta och konsekventa resultat är det absolut nödvändigt att minimera vävnadsskador under beredningen. Vävnadsskivor bör hanteras med breda spetsplastpipetter för att undvika skador orsakade av fysisk kontakt. Odlingsmediets volym måste bibehållas så att vävnadsskivan kan komma i kontakt med både luft och medium under hela försöket.
Odlingsmediet bör optimeras beroende på vävnadstyp och experimentellt syfte. TSC-mediet som används i detta protokoll är ett serumfritt medium som ursprungligen utvecklades för primär hepatocytkultur13. Detta medium har också använts för att upprätthålla flera typer av tumörer, inklusive bröst, lever, kolon, och bukspottkörteln10. Vidare visade vi förbättrad immuncell överlevnad med hjälp av en optimerad DMEM-baserade medium10. Vibratome inställningar bör optimeras baserat på vävnad struktur för att få intakt och enhetlig tumör vävnad skivor. Skivning mjukare och / eller löst konsoliderade vävnader görs vanligtvis lättare genom att använda djupare bladvinklar, långsammare skärhastighet, och tjockare skivor. Ibland, vävnader är för mjuka för att skära, i vilket fall forskare bör överväga att bädda in vävnaden inom låg smältpunkt agatros, en teknik som är vanlig i hjärnvävnad skivning14,15.
Tidigare, flera studier infört terapeutiska drogtester metoder på odlade vävnad skivor. Dessa studier förlitade sig på fluorescerande färgämne inkorporering, immunohistochemistry, eller MTT analyser för att utvärdera vävnadsviabilitet6,,7,,8,9. I det här protokollet använde vi det luminescensbaserade, levande cellkompatibla reagenset RealTime-Glo11 för mätning av livskraft. Luminescensbaserade analyser har flera fördelar jämfört med tidigare använda metoder, inklusive ökad känslighet, bredare signalområde och förmågan att snabbt göra lönsamhetsmätningar i realtid. Mättiden är kort för både mikroplåtsläsare (~1 s/well) och ett in vivo-bildsystem (~1 min/platta) och kan ge signalintensitetsavläsningar direkt med minimal bearbetning. Snabbare förvärv av signalen och färre efterbearbetning steg är nödvändiga funktioner i hög genomströmning läkemedelsscreening, vilket möjliggör luciferin-baserade lönsamhet mätningar för att möjliggöra en mycket större prov genomströmning i vävnad skiva kultur. Medan en luciferas-baserad analys ger en exakt, kvantitativ mätning av hela skivan lönsamhet, Det är inte att upptäcka läkemedelsinducerad cell typ-specifika förändringar i vävnaden. Kopplingslumenscensbaserade lönsamhetsmätningar med slutpunkt IHC på samma vävnadsskiva möjliggör dock celltypspecifika mätningar.
Medan vävnaden segmentet kultursystemet är ett kraftfullt verktyg för att föra tumörvävnad komplexitet till en hög genomströmning screening plattform, den har flera nackdelar. Inneboende heterogenitet inom en tumör vävnad kan orsaka differentiell läkemedelsreaktioner bland vävnad skivor även från samma bulk tumör. Ibland observerade vi relativt stora variationer i läkemedelsrespons bland vävnadsskivor i våra experiment. Vi kan delvis övervinna denna variation genom att i genomsnitt flera vävnad skivor beredda från olika platser inom samma tumör. Även om vävnadsskiva odling kan upprätthållas vid baslinjen nivå av livskraft i minst 21 dagar (figur 2B), cell populationer förändras över tiden. Vi har beskrivit förändringar i immuncellpopulationen under loppet av vävnadssegment kultur experiment10. Därför rekommenderar vi vävnad skivor undersökas över kortare odling tidsintervall för att sammanfatta inhemska vävnad egenskaper.
Vävnad skiva kultur är redo att fylla en kritisk lucka i narkotika upptäckt och utveckling mellan hög genomströmning cellkultur screening och djurförsök. Hundratals läkemedel kan utvärderas på skivor som produceras från en enda tumör biopsi, lägga till ökad fysiologisk relevans före djurstudier. Detta system skulle kunna bidra till att minska antalet djurförsök som krävs för att få ut narkotika på marknaden. Dessutom vävnad skivor beredda från patienten tumörer har informativ potential att styra behandlingsplaner på kliniken. Över hundra terapeutiska läkemedel finns idag, men det finns få biomarkörer för att styra deras urval. Dessutom leder heterogenitet hos patienter också till skillnader i svar. Vävnad skivor från en patient biopsi kan användas för att testa flera läkemedel innan behandling systemiskt, ger värdefull information om läkemedelseffekt inom en veckas tid. Övergripande, realtid och snabb testning av läkemedel med hjälp av vävnad segment kultursystem har stor potential i cancer läkemedelsutveckling och terapeutiska beslut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] och Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Vi vill tacka Dr Alana Welm (University of Utah) för att tillhandahålla bröstcancer PDX tumör. Vi vill också tacka personalen på Comparative Medicine, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) för underhåll av PDX-modellen och medlemmar av Gujral labbet för hjälpsamma diskussioner. N.N.A stöds av JSPS Overseas Research Fellowship and Interdisciplinary Training Grant från FHCRC. A.J.B. stöds av Chromosome Metabolism and Cancer Training Grant från FHCRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
