Summary
Introduciamo un protocollo per misurare la risposta del farmaco in tempo reale nelle fette di tessuto tumorale organotipico. La strategia sperimentale qui descritta fornisce una piattaforma per effettuare schermi di farmaci a medio-alta produzione su fette di tessuto derivate da tumori clinici o murini in condizioni di ex vivo.
Abstract
I tessuti tumorali sono composti da cellule cancerose, cellule immunitarie infiltrate, cellule endoteliali, fibroblasti e matrice extracellulare. Questo complesso ambiente costituisce il microambiente tumorale (TME) e può modulare la risposta alla terapia in vivo o alla risposta ai farmaci ex vivo. Gli schermi convenzionali di scoperta dei farmaci oncologici vengono effettuati su cellule coltivate in un monostrato, un sistema che manca criticamente l'influenza della TME. Pertanto, i sistemi sperimentali che integrano saggi sensibili e ad alto consumo con TME fisiologico rafforzeranno il processo preclinico di scoperta dei farmaci. Qui, introduciamo la coltura della fetta del tessuto tumorale ex vivo come piattaforma per lo screening farmacologico medio-alto.di velocità. La coltura delle fette di tessuto organitipotico costituisce sezioni tumorali sottili e tagliate con precisione che vengono mantenute con il supporto di una membrana porosa in un'interfaccia ad aria liquida. In questo protocollo, descriviamo la preparazione e la manutenzione di fette di tessuto preparate da tumori di topo e tumori da modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente. Per valutare i cambiamenti nella vitalità dei tessuti in risposta al trattamento farmacologico, abbiamo sfruttato un test di vitalità biocompatibile basato sulla luminescenza che consente la misurazione in tempo reale, rapida e sensibile delle cellule vitali nel tessuto. Utilizzando questa piattaforma, abbiamo valutato le risposte dipendenti dalla dose di fette di tessuto all'inibitore multi-chinasi, alla staurosporina e all'agente citotossico, doxorubicina. Inoltre, dimostriamo l'applicazione di fette di tessuto per la farmacologia ex vivo esaminando 17 farmaci clinici e preclinici su fette di tessuto preparati da un singolo tumore PDX. La nostra piattaforma di screening ex vivo fisiologicamente rilevante, altamente sensibile e robusta rafforzerà notevolmente la scoperta di farmaci oncologici preclinici e il processo decisionale per il trattamento.
Introduction
Le interazioni delle cellule tumorali con le proprietà fisiche e biochimiche del tessuto stromale circostante formano il TME. TME può stimolare la crescita del tumore, metastasi, e modulare la risposta del tumore alla terapia1. Nello sviluppo di farmaci preclinici convenzionali, i farmaci farmaci sono in genere sottoposti a screening utilizzando linee cellulari oncologiche coltivate, una piattaforma di analisi che manca criticamente del TME2. Questa mancanza di TME fisiologico nelle fasi di prescreening basate sulle cellule può limitare la scoperta di agenti efficaci nei modelli animali portatori di tumore e può contribuire all'alto tasso di logoramento di molti farmaci oncologici promettenti nelle fasi cliniche successive dello sviluppo3.
Nonostante l'importanza del TME nella modulazione delle risposte ai farmaci tumorali, i vincoli sperimentali limitano l'applicazione di sistemi più fisiologicamente rilevanti durante le prime fasi della scoperta e dello sviluppo dei farmaci. È impraticabile vagliare centinaia di agenti terapeutici su tumori da modelli animali o campioni di tumore del paziente. In effetti, gli esemplari chirurgici sono scarse risorse con diversi background genetici e lo screening di migliaia di molecole candidate nei modelli animali non è fattibile a causa della scala sperimentale, dei costi e del benessere degli animali.
La coltura della falamuna del tessuto tumorale, dove le sezioni tumorali sottili e tagliate con precisione sono coltivate ex vivo, può affrontare la limitazione del TME fisiologico nei saggi di screening farmacologico. Storicamente, il campo delle neuroscienze ha aperto la strada e ha fatto ampie ottimizzazioni della coltura delle fette per il tessuto cerebrale4. Recentemente, molti studi hanno dimostrato la preparazione di fette da vari tipi di tessuto tumorale, tra cui tumori derivati dalla linea cellulare, modelli di tumore spontanei, xenografti derivati dal paziente (PDX) e tumori primari del paziente. La coltura della faldatrice di tessuto ex vivo integra i benefici della cultura in vivo e in vitro5. Le fette di tessuto tumorale mantengono l'architettura del tessuto intatta e la composizione cellulare variegata, consentendo lo studio delle cellule tumorali all'interno del contesto TME.
Questo protocollo introduce un sistema di coltura della coltura delle fette di tessuto tumorale organotico combinato con un saggio di fattibilità in tempo reale e altamente sensibile per valutare le risposte ai farmaci. I test di efficacia farmacologica sulle fette di tessuto tumorale organotipiche in protocolli precedentemente introdotti si basano sulla misurazione dei cambiamenti nella vitalità cellulare mediante incorporazione di coloranti fluorescenti, immunoistochimica (IHC) o MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 difenile tetrazoli) come detto96,7,8. Tuttavia, tutti questi metodi sono saggi di punto finale e soffrono di bassa sensibilità, lunghi tempi di elaborazione, analisi dei dati complessi, portata del segnale ristretta e alto errore sperimentale. Il nostro reagente compatibile con le cellule vive basato sulla luminescenza migliora questi saggi fornendo un'ampia gamma di segnali e una misurazione istantanea (5 minuti) senza elaborazione preliminare e post-elaborazione minima. Questo reagente è altamente sensibile e può coesistere nei mezzi di coltura cellulare, consentendo la misurazione continua e del percorso temporale della vitalità cellulare. Questo sistema di analisi è applicabile allo screening ad alto consumo dei farmaci candidati sulle fette di tessuto nello sviluppo di farmaci preclinici.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sui topi sono stati effettuati in base alle raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Animal Welfare Act e delle linee guida dei National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali nella ricerca biomedica.
1. Preparazione delle fette di tessuto tumorale
- Preparare la coltura della fetta di tessuto (TSC) media seguendo la ricetta nella tabella 1. Filtrare il mezzo con un'unità filtro a vuoto da 0,45 m per sterilizzare.
- Aliquota 250 L di TSC medio per pozzo per un 24 pozzetto, o 1 mL di mezzo per pozzo per un 6 pozzetti. Conservare la piastra in un'incubatrice umidificata di 37 gradi, 5% co 2, finoall'uso.
NOTA: Il mezzo e gli integratori possono essere ottimizzati a seconda dei tipi di tessuto e degli obiettivi sperimentali. La quantità di mezzo dovrebbe essere appena sufficiente per immergere la membrana porosa di un inserto di coltura. Non superare il livello della membrana. Regolare il volume medio se il livello medio è troppo basso o troppo alto. Se i ricercatori stanno testando agenti immunomodulatori, si consiglia il completamento del mezzo con IL-210. - Se si utilizza tessuto tumorale derivato dai topi, eutanasia i topi con una procedura raccomandata, sanificare la pelle esposta dei topi spruzzando 70% etanolo e sezionare i tumori con tecniche asettiche. Conservare il tessuto tumorale in un tubo contenente la soluzione di sale bilanciato di Hank (HBSS) ghiacciata.
- Se si utilizzano tessuti tumorali freschi del paziente, conservare in HBSS ghiacciato per breve termine, o ghiacciato Belzer University of Wisconsin (UW) soluzione per lo stoccaggio a lungo termine (fino a 24 h) per preservare la vitalità dei tessuti.
NOTA: le fette di un tessuto PDX spedite durante la notte in una soluzione UW ghiacciata sono state preparate con successo. - Trasferire il tessuto tumorale in una piastra di coltura di 10 cm contenente HBSS ghiacciato. Tagliare il tumore a metà con un bisturi mentre immerso nella HBSS ghiacciata. Forma i tessuti tumorali in cilindri usando un punzone biopsia di 6 mm di diametro e taglia un lato per creare una superficie piana. Conservare i tessuti nell'HBSS ghiacciato fino all'uso.
NOTA: Evitare di includere l'area necrotica del tessuto, che è generalmente al centro e ha un aspetto opaco e fragile. - Impostare il vibratome. Disinfettare tutte le apparecchiature utilizzando il 70% di etanolo. Posizionare il vassoio tampone vibratoma coperto con un coperchio di vetro acrilico al centro del bagno di ghiaccio vibratoma. Aggiungere ghiaccio al bagno di ghiaccio e riempire il vassoio tampone con HBSS raffreddato per mantenere il tessuto fresco durante il taglio. Fissare una lama di rasoio al supporto della lama.
NOTA: Anche se mantenere i vibratomi in un ambiente semisterile non ha influenzato esperimenti precedenti, si consiglia di conservare il vibratoma sotto un armadio di biosicurezza, se disponibile. - Sollevare con attenzione un tessuto tumorale con perforato dalla biopsia dall'HBSS utilizzando la forza dentata e rimuovere il buffer in eccesso tamponando il tessuto con un tovagliolo di carta privo di laminetti.
- Mettere una goccia di colla cianoacrilata di grado medico sulla piastra del campione e posizionare il tessuto su questa goccia. Asciugare all'aria la colla per 2-3 min e mettere la piastra nel vassoio del tampone. Integrare con alcuni HBSS fino a quando il tessuto è completamente immerso nel buffer.
NOTA: Il montaggio dei tessuti in posizione eretta e stabile è fondamentale per generare fette tagliate uniformemente. Se i tessuti montati sono instabili, aggiungere più colla al tessuto circostante per mantenere una posizione eretta o scaricare il tessuto, appiattire il fondo e incollarlo di nuovo. I tessuti elastici tendono a essere spinti e piegati più facilmente durante il taglio, nel qual caso possono essere appropriate lunghezze più brevi (<5 mm) e più rampe. Per i tessuti estremamente fragili, gli asciugamani di carta possono distruggere il tessuto. In questo caso, il tessuto può essere posizionato su una superficie di plastica per eliminare alcuni HBSS in eccesso. - Regolare le impostazioni del vibratoma. Vengono utilizzate le seguenti impostazioni: spessore di taglio: 250 m, ampiezza, 3,00 mm, velocità di taglio : 0,01–0,25 mm/s e angolo della lama di 15-21.
NOTA: Ottimizzare le impostazioni di affettatura a seconda della rigidità del tessuto. I tessuti più morbidi sono più facilmente tagliati con un angolo di lama più profondo a bassa velocità. Un angolo di lama di 18 gradi, velocità di taglio compresa tra 0,10-0,18 mm/s e un'ampiezza di 3,00 mm funziona bene per i tumori del topo 4T1 e PDX HCI010. Il tessuto rigido può essere tagliato con una velocità della lama più veloce. - Impostare le posizioni iniziale e finale della lama e regolare l'altezza dello stage. Eseguire lo strumento con la modalità continua per tagliare le fette per diversi cicli fino a quando i tessuti non vengono tagliati in modo uniforme.
- Continuare a affettare il tessuto. Trasferire le fette insieme a una piccola quantità di buffer HBSS sull'inserto di coltura cellulare con mezzo con una pipetta di trasferimento a punta larga, utilizzando l'aspirazione per sollevare l'intera fetta. Mettere una fetta per inserto su una piastra di 24 pozzetti. Un inserto per 6 piastre di pozzo può ospitare fino a quattro fette per un saggio di replica.
NOTA: Se l'ultimo bordo della fetta di tessuto è ancora attaccato al tessuto non tagliato, fermare il vibratome e separare la fetta di tessuto con due padici di punta fine senza toccare o frugare le fette di tessuto. Una lama di rasoio separata può essere utile per rimuovere il tessuto appeso. - Rimuovere il buffer in eccesso con una pipetta di trasferimento punta fine.
- Quando la lama raggiunge vicino ai tessuti incollati, fermare lo strumento, abbassare lo stadio, rimuovere il tessuto irrigidito con una lama separata e montare un nuovo tessuto. Continuare a affettare fino a quando non sono state raccolte abbastanza fette.
- Colture le piastre in un'incubatrice umidificata fissata a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2. Le fette di tessuto sono coltivate nell'interfase aria-liquido sull'inserto di coltura cellulare. Le fette di tessuto sono pronte per gli esperimenti 24-48 h dopo la preparazione iniziale della fetta. Per la coltivazione a lungo termine, scambiare il mezzo ogni 2-3 giorni.
2. Misurazione della vitalità
- Per la misurazione della vitalità della fetta di tessuto, scambiare il mezzo con un reagente di misurazione della vitalità basato sulla luminescenza contenente luciferasi e prosubstrate a 1:1,000 diluizione nel mezzo TSC seguendo le istruzioni del produttore. Il reagente misura l'attività di riduzione delle cellule vive del prosubstrato metabolizzato alla luciferina11. Trasferire 50 -L di miscela enzimatica-substrato sopra ogni fetta di tessuto.
- Incubare con agitazione delicata su uno shaker orbitale situato all'interno di un'incubatrice umidificata posta a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 durante la notte.
- I segnali luminescenti possono essere misurati utilizzando un lettore di microplacino o uno strumento di imaging in vivo per i tessuti coltivati in una piastra di 24 pozzetti. Per misurare la vitalità individuale di più tessuti su una piastra a 6 pozzetti, è necessario utilizzare un sistema di imaging in vivo.
- Quando si utilizza un lettore a micropiastra, impostare la micropiastra senza coperchio. Qualsiasi tipo di lettore di micropla in grado di misurare l'intensità luminescente dovrebbe essere adatto per l'esperimento. Abbiamo usato le seguenti impostazioni: tempo di lettura : 1 s, misura dall'alto, guadagno : 200.
NOTA: per una maggiore precisione, utilizzare una microplacca a parete bianca per configurare l'esperimento. Bianco-muro, chiaro-fondo 24 piastre bene sono stati testati, e nella maggior parte dei casi, piastre chiare bene non compromettono i risultati. - Quando si utilizza un sistema di imaging in vivo per misurare la vitalità, posizionare la piastra al centro dello stage e rimuovere il coperchio. Acquisire immagini fotografiche normali seguite da immagini luminescenti con un campo di impostazione dello stage a C, tempo di esposizione automatica, f-stop n. 1, impostazione obiettivo come microplacca con altezza del soggetto - 0,0 cm.
- Quantificare l'intensità luminescente utilizzando il software di imaging accompagnato dal sistema di imaging in vivo. Disegnare regioni di interesse coerenti (ROI) intorno a ogni fetta di tessuto. Questo protocollo utilizza un cerchio di 1 cm di diametro come ROI (vedere Figura 1). Misurare il flusso totale (p/s) dell'area.
- Quando si utilizza un lettore a micropiastra, impostare la micropiastra senza coperchio. Qualsiasi tipo di lettore di micropla in grado di misurare l'intensità luminescente dovrebbe essere adatto per l'esperimento. Abbiamo usato le seguenti impostazioni: tempo di lettura : 1 s, misura dall'alto, guadagno : 200.
3. Valutazione dell'effetto farmacologico sulle fette di tessuto
- Misurare la vitalità della linea di base prima del trattamento utilizzando il reagente di misurazione della vitalità basato sulla luminescenza, come spiegato nella sezione 2.
NOTA: Se diversi tessuti hanno una vitalità significativamente inferiore rispetto ad altri, omettere i tessuti dal saggio. - Sciogliere i farmaci nel solfuro dimetile (DMSO) per realizzare soluzioni di stock. Preparare una soluzione farmacologica 10x con TSC o altro mezzo di coltura (25 gradi centigradi per una piastra di 24 pozzetti contenente 250 ldi di mezzo) alle concentrazioni desiderate. Per il controllo del veicolo, preparare il supporto contenente un volume equivalente di DMSO.
- Integrare la soluzione farmaco 10x al mezzo di coltura nella parte inferiore del pozzo. Mescolare con il pipettaggio e trasferire 50 - L del mezzo sulla parte superiore dei tessuti.
NOTA: se sono disponibili più fette di tessuto, verificare i duplicati o i triplicati per ogni condizione. - Incubare durante la notte con agitazione delicata su uno shaker orbitale in un 37 gradi centigradi, 5% CO2, incubatore umidificato.
- Togliere la piastra dall'agitatore e incubare staticamente nel 37 gradi centigradi, 5% CO2, incubatrice umidificata.
- Nei momenti desiderati, misurare l'intensità luminescente dai tessuti utilizzando un lettore di microplacino o un sistema di imaging in vivo. Di solito, gli effetti della droga diventano rilevabili dopo 1-6 giorni di trattamento.
NOTA: il reagente di vitalità basato sulla luminescenza è stabile per almeno 3 giorni in condizioni di coltura. Tuttavia, il substrato può essere esaurito durante il saggio a seconda dell'attività metabolica del tessuto. Se si osserva una significativa caduta del segnale nei tessuti con segnali precedentemente elevati, integrare il substrato in tutti i pozzi. - Calcolare la vitalità rimanente dei tessuti tumorali trattati utilizzando la seguente equazione:
La vitalità del tessuto trattato è normalizzata dal suo spostamento di vitalità e vitalità dei tessuti tumorali di controllo.
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Representative Results
Qui, dimostriamo un corso temporale, protocollo di valutazione dell'efficacia del farmaco multiplo per le fette di tessuto tumorale preparate da tessuti tumorali al seno 4T1 del topo e un modello PDX del cancro al seno, HCI01012. Abbiamo preparato con successo fette di tessuto da diversi tumori derivati dal topo, PDX e tumori dei pazienti freschi10. Il flusso di lavoro complessivo della preparazione del tessuto tumorale e del test di efficacia del farmaco è descritto nella Figura 1. In generale, potremmo preparare 20-40 fette di tessuto da un singolo tumore sfuso di 1.000-1.500 mmdi volume.
Per le misurazioni della vitalità, abbiamo sfruttato un reagente di fattibilità compatibile con le cellule vive basato sulla luminescente. Il trattamento di un inibitore multi-chinasi, staurosporina, a 1 concentrazione di M per 4 giorni ha ridotto l'intensità del segnale di 100x, rispetto ai tessuti tumorali trattati con controllo DMSO (Figura 2A). Le fette di tessuto preparate dal tumore 4T1 sono state mantenute per almeno 21 giorni con scambio medio occasionale (Figura 2B). La maggior parte delle misurazioni di risposta al farmaco sono state eseguite entro 7 giorni dalla preparazione della falda a sezione tissutale. Poiché il reagente compatibile con le cellule vive non richiede l'elaborazione o la fissazione prima della misurazione, ci ha permesso di effettuare misurazioni del percorso temporale. I cambiamenti dipendenti dal tempo nella vitalità delle fette di tessuto tumorale dallo stesso tessuto tumorale 4T1 sono riassunti nella Figura 2C. La staurosporina a 500 nM ha diminuito la luminescenza dal giorno 1 e ha raggiunto il livello più basso al giorno 4, rimanendo basso per ogni momento successivo. Al contrario, l'intensità luminescente del gruppo di controllo dei tessuti integrata con DMSO è rimasta stabile fino al giorno 6. Inoltre, le fette di tessuto preparate da tumori 4T1 identici sono state trattate con dosi seriali di staurosporina per 4 giorni e hanno mostrato variazioni dipendenti dalla dose nella vitalità e dall'EC50 (Figura 2D).
Abbiamo testato farmaci chemioterapici su fette di tessuto preparati da un modello ortotopico PDX di cancro al seno, HCI010. Le fette di tessuto PDX sono state trattate con doxorubicina, un farmaco chemioterapico standard, a dosi di 0-5 M per 6 giorni, fornendo variazioni di vitalità dipendenti dalla dose (Figura 3A). Inoltre, l'efficacia di 17 farmaci, compresi i farmaci preclinici e clinicamente approvati, è stata testata in triplice copia su fette di tessuto preparate da un singolo tumore HCI010 di massa. I farmaci sono stati applicati a 0,5 M per 4 giorni in triplice(Figura 3B). Questi risultati forniscono la prova di concetto che lo screening farmacologico a medio-velocità può essere eseguito su fette di tumore con TME nativo.
Figura 1: Schema che mostra la preparazione della sezione del tessuto seguita dalla valutazione dell'efficacia del farmaco. I tessuti tumorali sono stati trasformati in fette di 6 mm di diametro e 250 m di spessore e coltivati nell'interfase aria-liquido con il supporto di inserti di coltura cellulare. La vitalità dei tessuti è stata misurata utilizzando un reagente bioluminescente sia prima che dopo il trattamento farmacologico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Misurazione della vitalità della fetta di tessuto e risposta ai farmaci. (A) Immagini rappresentative delle misurazioni di vitalità basate sulla luminescenza nelle fette del tessuto tumorale del seno. Le fette di tessuto del tumore 4T1 sono state incubate con 1 staurosporina o controllo DMSO insieme al reagente di saggio di fattibilità luminescente per 4 giorni. Le immagini sono state ottenute utilizzando un sistema di imaging in vivo e analizzate mediante software di analisi delle immagini. I cerchi rossi indicano il ROI misurato per la bioluminescenza. In basso: una trama che mostra il segnale luminescente proveniente da fette di tessuto tumorale trattate con staurosporina o controllo misurato da un sistema di imaging in vivo. La barra indica la media delle quattro fette di tessuto mostrate come cerchi (controllo) o quadrati (trattata con staurosporina). (B) Un grafico che mostra la vitalità di 4T1 fette di tessuto tumorale coltivate per 21 giorni dalla preparazione. La vitalità al giorno 21 misurata da un sistema di imaging in vivo è stata normalizzata a quella del terzo giorno. Ogni punto indica la misurazione da una singola sezione; la barra indica la media; la scatola mostra i quartili e i baffi mostrano il valore minimo-massimo della misurazione. (C) Misurazioni del decorso temporale della vitalità dei tessuti dopo il trattamento della staurosporina. La vitalità delle fette di tessuto del tumore 4T1 trattato con staurosporina (500 nM) o volume equivalente di DMSO come controllo sono stati misurati nel tempo. Le intensità di luminescenza sono state misurate da un lettore di microplacino rispetto ai punti temporali indicati. Ogni punto illustra un punto dati da una singola fetta di tessuto, e il grafico a barre indica il trattamento medio - SEM. (D) Dose-dipendente da staurosporina su fette di tessuto. Le fette di tessuto preparate a partire dal tumore 4T1 sono state integrate con dosi seriali di staurosporina o DMSO come controllo del veicolo. La rimanente vitalità basata sulla luminescenza è stata misurata da un sistema di imaging in vivo a 4 giorni dopo l'avvio del trattamento. La vitalità relativa è stata calcolata utilizzando l'equazione mostrata nel protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Screening dei farmaci in fette di tessuto preparato da un modello PDX di cancro al seno. (A) Un grafico che mostra cambiamenti nella fattibilità in risposta a varie doxorubicina. Le fette di tessuto sono state preparate da un tumore ortotopico della PDX al seno, HCI010. La viabilità è stata misurata in fette trattate con dosi titorate di doxorubicina. Dopo 6 giorni, la luminescenza è stata misurata utilizzando un sistema di imaging in vivo. Barra - media(B)Uno screening farmacologico chemioterapico su piccola scala sulle fette di tessuto tumorale da un tumore PDX a cancro al seno ortotopico. Il grafico a barre ( media e SEM dell'esperimento triplicerio). Questi dati sono stati pubblicati in precedenza10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Materiale | Ml | Concentrazione finale | Stock |
| Il mezzo E di William | 500 | ||
| Nicotinammide | 6 | 12 mM | 1 M di nicotinammide nella Media E di Williams, sterilizzata |
| Acido ascorbico | 6 | 50,4 g/mL | 0,21 g/50 mL (>10 mm stock) di acido ascorbico in William's Medium E, sterilizzato |
| Bicarbonato di sodio | 15 | 2,25 mg/mL | Soluzione 7.5% (w/v) |
| HEPES Buffer | 10 | 20 mM | Soluzione di magazzino da 1 M |
| Glucosio | 10 | 5 mg/mL | 250 mg/ml di stock steralizzato |
| Pirata di sodio | 5 | 1 mM | 100 mM di magazzino |
| L-Glutamina | 5 | 2 mM | 200 mM di magazzino |
| L'ERS - Premix | 5 | Contiene insulina ricombinante umana, transferrina umana (12,5 mg ciascuno), acido selenoso (12,5 g), BSA (2,5 g) e acido linoleico (10,7 mg) | |
| Penicillina-Streptomicina | 2 | 40 IU/mL Pen, 40 g/mL Strep | 10.000 IU/mL Pen, 10.000 g/mL Strep |
| EGF ricombinante | 0.5 | 20 ng/mL | 20 stock g/mL |
Tabella 1: ricetta media TSC.
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Discussion
In questo protocollo, dimostriamo una piattaforma per studi quantitativi e di efficacia dei farmaci in tempo reale sulle fette di tessuto tumorale organotipipico. Il sistema di coltura delle fette di tessuto offre vantaggi distinti rispetto ai tradizionali metodi in vitro basati sulle cellule catturando l'eterogeneità cellulare e le caratteristiche fisiologiche del microambiente tumorale nativo. Questa piattaforma consente inoltre una maggiore produttività per i test di efficacia dei farmaci, contribuendo a colmare il divario tra gli studi sulla coltura cellulare e gli esperimenti in vivo.
Per ottenere risultati accurati e coerenti, è imperativo ridurre al minimo i danni ai tessuti durante la preparazione. Le fette di tessuto devono essere maneggiate con pipette di plastica a punta larga per evitare danni causati dal contatto fisico. Il volume medio di coltura deve essere mantenuto per consentire alla fetta di tessuto di contattare sia l'aria che il mezzo per la durata dell'esperimento.
Il mezzo di coltura deve essere ottimizzato in base al tipo di tessuto e allo scopo sperimentale. Il mezzo TSC utilizzato in questo protocollo è un mezzo senza siero che è stato originariamente sviluppato per la cultura primaria degli epatociti13. Questo mezzo è stato utilizzato anche per mantenere diversi tipi di tumori, tra cui seno, fegato, colon, e pancreas10. Inoltre, abbiamo dimostrato una maggiore sopravvivenza delle cellule immunitarie utilizzando un mezzo ottimizzato basato su DMEM10. Le impostazioni del vibratome devono essere ottimizzate in base alla texture del tessuto per ottenere fette di tessuto tumorale intatte e uniformi. Affettare tessuti più morbidi e/o consolidati in modo non profondo è in genere reso più facile utilizzando angoli di lama più profondi, velocità di taglio più lenta e fette più spesse. Occasionalmente, i tessuti sono troppo morbidi per essere tagliati, nel qual caso i ricercatori dovrebbero considerare l'incorporamento del tessuto all'interno del punto di fusione basso, una tecnica comune nel tessuto cerebrale affettare14,15.
In precedenza, diversi studi hanno introdotto approcci di test terapeutici sui tessuti coltivati. Questi studi si basavano sull'incorporazione di tine fluorescenti, sull'immunohistochimica o sui saggi MTT per valutare la vitalità dei tessuti6,7,8,9. In questo protocollo, abbiamo utilizzato il reagente RealTime-Glo11 basato sulla luminescenza, compatibile con le cellule vive, per la misurazione della vitalità. I saggi basati sulla luminescenza hanno diversi vantaggi rispetto ai metodi utilizzati in precedenza, tra cui una maggiore sensibilità, una più ampia gamma di segnali e la capacità di effettuare rapidamente misurazioni di fattibilità in tempo reale. Il tempo di misurazione è breve sia per i lettori di microplacche (1 s/well) che per un sistema di imaging in vivo (1 min/piastra) e possono fornire letture dell'intensità del segnale direttamente con un'elaborazione minima. L'acquisizione più rapida del segnale e un minor numero di passaggi di post-elaborazione sono caratteristiche necessarie nello screening dei farmaci ad alta velocità effettiva, consentendo misurazioni della vitalità basate su luciferine per consentire una maggiore velocità effettiva del campione nella coltura delle sezioni di tessuto. Mentre un saggio basato su luciferasi fornisce una misurazione accurata e quantitativa dell'intera vitalità della fetta, non è in grado di rilevare i cambiamenti specifici del tipo di cellula indotti dal farmaco nel tessuto. Tuttavia, le misurazioni della vitalità basate sulla luminescenza di accoppiamento con l'IHC del punto finale sulla stessa fetta di tessuto consentiranno misurazioni specifiche del tipo di cellula.
Mentre il sistema di coltura della fetta di tessuto è un potente strumento per portare la complessità del tessuto tumorale a una piattaforma di screening ad alto valore di velocità, ha diversi inconvenienti. L'eterogeneità intrinseca all'interno di un tessuto tumorale può causare risposte differenziali del farmaco tra le fette di tessuto anche dallo stesso tumore di massa. A volte, abbiamo osservato variazioni relativamente grandi nella risposta ai farmaci tra le fette di tessuto nei nostri esperimenti. Possiamo parzialmente superare questa variazione mediando più fette di tessuto preparate da siti diversi all'interno dello stesso tumore. Anche se la coltura delle fette di tessuto può essere mantenuta a livello di base di vitalità per almeno 21 giorni(Figura 2B),le popolazioni di cellule cambiano nel tempo. Abbiamo descritto i cambiamenti nella popolazione di cellule immunitarie nel corso degli esperimenti di coltura delle fette tissutali10. Pertanto, si consiglia di esaminare le fette di tessuto per intervalli di tempo di coltura più brevi per ricapitolare le caratteristiche dei tessuti nativi.
La coltura delle fette di tessuto è pronta a colmare una lacuna critica nella scoperta e nello sviluppo di farmaci tra lo screening della coltura cellulare ad alta produttività e gli esperimenti sugli animali. Centinaia di farmaci possono essere valutati su fette prodotte da una singola biopsia tumorale, aggiungendo una maggiore rilevanza fisiologica prima degli studi sugli animali. Questo sistema potrebbe contribuire a ridurre il numero di esperimenti sugli animali necessari per portare i farmaci sul mercato. Inoltre, le fette di tessuto preparate dai tumori dei pazienti hanno un potenziale informativo nel guidare i piani di trattamento in clinica. Oggi sono disponibili oltre cento farmaci terapeutici, ma ci sono pochi biomarcatori per guidarne la selezione. Inoltre, l'eterogeneità nei pazienti comporta anche disparità di risposta. Le fette di tessuto della biopsia di un paziente possono essere utilizzate per testare più farmaci prima di trattare sistematicamente, fornendo informazioni preziose sull'efficacia dei farmaci entro una settimana. Nel complesso, il test in tempo reale e rapido dei farmaci che utilizzano sistemi di coltura delle fette di tessuto ha un grande potenziale nello sviluppo di farmaci oncologici e nelle decisioni terapeutiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] e dalla Fondazione Sidney Kimmel [Kimmel Scholar Award], lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Ringraziamo la dott.ssa Alana Welm (Università dello Utah) per aver fornito il tumore al PDX del cancro al seno. Vorremmo anche ringraziare il personale di Comparative Medicine, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) per la manutenzione del modello PDX e dei membri del laboratorio Gujral per discussioni utili. N.N.A è supportato dalla JSPS Overseas Research Fellowship e dal Interdisciplinary Training Grant della FHCRC. A.J.B. è supportato dal Chmoosome Metabolism and Cancer Training Grant della FHCRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
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