Summary
우리는 organotypic 종양 조직 조각에 있는 실시간 약 반응을 측정하기 위한 프로토콜을 소개합니다. 여기에 설명된 실험 전략은 생체 내 조건에서 임상 또는 마우스 종양에서 유래한 조직 조각에 중고 처리량 약물 스크린을 수행하는 플랫폼을 제공한다.
Abstract
종양 조직은 암 세포, 침투 된 면역 세포, 내피 세포, 섬유 아세포 및 세포 외 매트릭스로 구성됩니다. 이러한 복잡한 밀리외는 종양 미세환경(TME)을 구성하고 생체내 또는 약물 반응 ex vivo에서 치료에 대한 반응을 조절할 수 있다. 종래의 암 약물 발견 스크린은 단층에서 배양된 세포에서 수행되며, TME의 영향이 비판적으로 결여된 시스템이다. 따라서 민감하고 처리량이 높은 실험을 생리적 TME와 통합하는 실험 시스템은 전임상 약물 발견 과정을 강화할 것이다. 여기서, 우리는 중간 높은 처리량 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서 생체내 종양 조직 슬라이스 배양을 소개한다. Organotypic 조직 슬라이스 배양은 액체 공기 계면에서 다공성 멤브레인의 지지로 유지되는 정밀하게 절단된 얇은 종양 섹션을 구성합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 환자 유래 이종이식(PDX) 모델로부터 마우스 종양 및 종양으로부터 제조된 조직 조각의 제조 및 유지를 설명한다. 약물 치료에 반응하여 조직 생존 력의 변화를 평가하기 위해, 우리는 조직에서 생존 가능한 세포의 실시간, 신속하고 민감한 측정을 가능하게 하는 생체 적합성 발광 기반 생존 성 분석기를 활용했습니다. 이 플랫폼을 사용하여, 우리는 다중 키나아제 억제제, staurosporine 및 세포 독성 에이전트, 독소 루비신에 조직 조각의 복용량 의존적 반응을 평가했습니다. 또한, 단일 PDX 종양으로부터 제조된 조직 슬라이스상에서 17개의 임상 및 전임상 약물을 스크리닝하여 생체내 약리학에 대한 조직 슬라이스의 적용을 입증한다. 우리의 생리학적 관련성, 매우 민감하고 강력한 생체 내 스크리닝 플랫폼은 전임상 종양학 약물 발견 및 치료 의사 결정을 크게 강화할 것입니다.
Introduction
암 세포와 주변 기질 조직의 물리적 및 생화학적 특성과의 상호 작용은 TME를 형성한다. TME는 종양 성장을 자극할 수 있고, 전이, 및 치료에 종양 반응을 조절할 수있습니다 1. 종래의 전임상 약물 개발에서, 약물 후보는 전형적으로 배양된 암 세포주를 사용하여 먼저 스크리밍되며, TME2가비판적으로 결여된 분석 플랫폼이다. 이러한 세포 기반 사전 스크리닝 단계에서생리학적 TME의 부족은 종양을 지탱하는 동물 모델에서 효과적인 제제의 발견을 제한할 수 있으며, 개발3의후기 임상 단계에서 많은 유망한 종양학 약물의 높은 감소율에 기여할 수 있다.
종양 약물 반응을 조절하는 TME의 중요성에도 불구하고, 실험적 제약은 약물 발견 및 개발의 초기 단계에서 보다 생리적으로 관련된 시스템의 적용을 제한합니다. 동물 모형 또는 참을성 있는 종양 견본에서 종양에 치료에이전트의 수백을 가리기 위하여 비실용적입니다. 실제로, 외과 표본은 다양한 유전적 배경을 가진 부족한 자원이며 동물 모델에서 수천 개의 후보 분자를 선별하는 것은 실험적 규모, 비용 및 동물 복지로 인해 실현 가능하지 않습니다.
종양 조직 슬라이스 배양은, 정밀하게 절단된, 얇은 종양 절편이 생체내에서 배양되는 경우, 약물 스크리닝 어세이에서 생리적 TME의 한계를 해결할 수 있다. 역사적으로, 신경 과학의 분야는 개척하고 뇌 조직에 대한 슬라이스 문화의 광범위한 최적화를 했다4. 최근, 많은 연구는 세포주 유래 종양, 자발적 종양 모델, 환자 유래 이종이식 (PDX) 및 1 차적인 참을성 있는 종양을 포함하여 종양 조직의 각종 모형에서 조각의 준비를 설명했습니다. Ex vivo 조직 슬라이스 배양은 생체 내 및 체외 배양 모두에서 혜택을통합5. 종양 조직 조각은 손상되지 않은 조직 구조 및 변종 된 세포 조성을 유지하여 TME 컨텍스트 내에서 암세포의 연구를 가능하게합니다.
이 프로토콜은 약물 반응을 평가하기 위해 실시간, 매우 민감한 생존 가능성 분석과 결합된 orgnotnotypic 종양 조직 슬라이스 배양 시스템을 소개합니다. 이전에 도입된 프로토콜에서 orgnotnotypic 종양 조직 조각에 대한 약물 효능 시험은 형광 염료 혼입, 면역 조직 화학 (IHC) 또는 MTT ((3- [4, 5-디메틸티아졸-2-yl]-2, 5 디페닐 테트라졸륨,브로마이드) 분석6,,7,8, 8에의한 세포 생존력의 변화를 측정하는 데 의존합니다.89 그러나 이러한 모든 방법은 종점 분석이며 낮은 감도, 긴 처리 시간, 복잡한 데이터 분석, 좁은 신호 범위 및 높은 실험 오차로 고통받고 있습니다. 당사의 발광 기반 라이브 셀 호환 시약은 사전 처리 및 최소한의 사후 처리 없이 광범위한 신호 범위와 순간(~5분) 측정을 제공하여 이러한 공술을 개선합니다. 이 시약은 매우 민감하고 세포 배양 배지에 공존할 수 있어 세포 생존가능성을 지속적으로 그리고 시간 과정으로 측정할 수 있습니다. 이 분석 시스템은 전임상 약물 개발에서 조직 슬라이스에 대한 약물 후보의 높은 처리량 스크리닝에 적용가능하다.
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Protocol
모든 마우스 실험은 동물 복지법의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 가이드의 권고사항과 생물 의학 연구에서 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침서에 따라 수행되었습니다.
1. 종양 조직 조각의 준비
- 표 1의레시피에 따라 티슈 슬라이스 배양(TSC) 배지를 준비한다. 0.45 μm 진공 필터 유닛으로 매 질을 걸어 살균합니다.
- 24 웰 플레이트에 대한 웰 당 TSC 배지의 Aliquot 250 μL, 또는 6 웰 플레이트에 대한 웰 당 매체의 1 mL. 플레이트를 37°C, 5%CO2 가습 인큐베이터에 보관하여 사용한다.
참고: 배지 및 보충제는 조직 유형 및 실험 목표에 따라 최적화될 수 있습니다. 배지의 양은 배양 삽입의 다공성 멤브레인을 흡수하기에 충분해야합니다. 멤브레인의 수준을 초과하지 마십시오. 중간 수준이 너무 낮거나 너무 높으면 중간 볼륨을 조정합니다. 연구원이 면역 조절제를 시험하는 경우에, 우리는 IL-210를가진 매체의 보충을 추천합니다. - 마우스에서 유래한 종양 조직을 사용하는 경우, 권장 절차로 마우스를 안락사시키고, 70% 에탄올을 분무하여 마우스의 노출된 피부를 살균하고, 무균 기술로 종양을 해부한다. 얼음 차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)을 포함하는 관에 종양 조직을 저장합니다.
- 신선한 환자 종양 조직을 사용하는 경우, 단기적으로 얼음 차가운 HBSS에 보관하거나, 조직 생존력을 보존하기 위해 장기간 보관용(최대 24시간)을 위해 위스콘신 대학교(UW) 용액을 보관하십시오.
참고: 얼음으로 차가운 UW 용액으로 하룻밤 동안 출하된 PDX 티슈의 슬라이스가 성공적으로 준비되었습니다. - 종양 조직을 얼음 차가운 HBSS를 포함하는 10cm 배양 판으로 옮김을 옮김. 얼음 차가운 HBSS에 잠긴 동안 메스로 반으로 종양을 잘라. 6mm 직경의 생검 펀치를 사용하여 종양 조직을 실린더로 모양을 만들고 한쪽을 다듬어 평평한 표면을 만듭니다. 사용 될 때까지 얼음 차가운 HBSS에 조직을 저장합니다.
참고: 조직의 괴사 부위를 포함하지 마십시오, 이는 일반적으로 중앙에 불투명하고 깨지기 쉬운 외관을 갖는다. - 진동을 설정합니다. 70% 에탄올을 사용하여 모든 장비를 소독하십시오. 비브라토메 얼음 욕조 중앙에 아크릴 유리 뚜껑으로 덮인 비브라토메 완충트레이를 놓습니다. 얼음 욕조에 얼음을 넣고 완충트레이를 냉각된 HBSS로 채우고 자르는 동안 티슈를 시원하게 유지합니다. 면도날을 블레이드 홀더에 부착합니다.
참고: 비장제거 환경에서 진동을 유지하는 것은 이전 실험에 영향을 미치지 않았지만, 사용 가능한 경우 생체 안전 캐비닛 아래에 진동을 보관하는 것이 좋습니다. - 조심스럽게 톱니 집게를 사용하여 HBSS에서 생검 펀치 종양 조직을 들어 올리고 보풀이없는 종이 타월로 조직을 두드려 과도한 완충액을 제거하십시오.
- 의료 등급 시아노 아크릴레이트 접착제 한 방울을 표본 판에 놓고이 방울에 조직을 놓습니다. 접착제를 2-3분 동안 공기 건조시키고 플레이트를 완충트레이에 넣습니다. 조직이 완충제에 완전히 침지 될 때까지 일부 HBSS로 보충하십시오.
참고: 조직을 똑바로 세워 서 안정된 위치에 장착하는 것은 균일하게 절단된 슬라이스를 생성하는 데 매우 중요합니다. 장착 된 조직이 불안정한 경우 주변 조직에 더 많은 접착제를 추가하여 직립 위치를 유지하거나 조직을 언로드하고 바닥을 평평하게하고 다시 붙입니다. 탄성 조직은 슬라이스 중에 더 쉽게 밀고 구부러지는 경향이 있으며, 이 경우 길이가 짧고 (&5 mm) 및 여러 번의 실행이 적절할 수 있습니다. 매우 깨지기 쉬운 조직의 경우 종이 타월은 조직을 파괴 할 수 있습니다. 이 경우, 조직은 일부 과잉 HBSS를 심지 플라스틱 표면에 배치 할 수 있습니다. - 진동 설정을 조정합니다. 절단 두께 = 250 μm, 진폭 = 3.00 mm, 슬라이스 속도 = 0.01-0.25 mm/s 및 블레이드 각도 = 15°-21°의 설정이 사용됩니다.
참고: 조직의 강성에 따라 슬라이싱 설정을 최적화합니다. 더 부드러운 조직은 더 낮은 속도로 더 깊은 블레이드 각도로 더 쉽게 절단됩니다. 18°의 블레이드 각도, 0.10-0.18 mm/s 사이의 절삭 속도 및 3.00 mm의 진폭은 마우스 4T1 및 PDX HCI010 종양에 적합합니다. 더 단단한 조직은 더 빠른 블레이드 속도로 절단 할 수 있습니다. - 블레이드의 시작 및 끝 위치를 설정하고 스테이지의 높이를 조정합니다. 연속 모드로 기기를 실행하여 조직이 균일하게 절단될 때까지 여러 사이클 동안 슬라이스를 잘라냅니다.
- 조직을 계속 자르기. 소량의 HBSS 버퍼와 함께 슬라이스를 와이드 팁 이송 파이펫으로 배지로 세포 배양 인서트에 옮기고 흡입을 사용하여 전체 슬라이스를 들어 올립니다. 24개의 웰 플레이트에 인서트를 한 조각씩 놓습니다. 6개의 웰 플레이트용 인서트가 복제 분석에 대해 최대 4개의 슬라이스를 수용할 수 있습니다.
참고 : 티슈 슬라이스의 마지막 가장자리가 절단되지 않은 조직에 여전히 부착된 경우, 진동을 중지하고 조직 조각을 만지거나 찌르지 않고 두 쌍의 미세 팁 집게로 조직 조각을 분리하십시오. 별도의 면도날은 매달려 있는 조직을 제거하는 데 유용할 수 있습니다. - 미세 팁 이송 파이펫으로 여분의 버퍼를 제거합니다.
- 블레이드가 접착 된 조직에 가까워지면 기구를 멈추고 무대를 낮추고 별도의 블레이드로 뻣뻣한 조직을 제거하고 새 조직을 장착하십시오. 충분한 조각이 수집될 때까지 슬라이스를 계속합니다.
- 37°C, 5%CO2로설정된 가습 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다. 조직 슬라이스는 세포 배양 삽입상에서 공기-액체 상호상에서 배양된다. 조직 슬라이스는 초기 슬라이스 제조 후 24-48 시간 동안 실험할 준비가 되어 있다. 장기 재배를 위해 2-3 일마다 중간을 교환하십시오.
2. 생존력 측정
- 조직 슬라이스의 생존율 측정을 위해 제조업체의 지시에 따라 TSC 배지에서 1:1,000 희석에서 루시퍼라제및 판기판을 모두 포함하는 발광 기반 생존율 측정 시약으로 배지를 교환하십시오. 시약은루시퍼린(11)에대사된 프로레이트의 살아있는 세포의 감소 활성을 측정한다. 각 조직 슬라이스 위에 효소 기질 혼합물 50 μL을 전달합니다.
- 가습 된 인큐베이터 내부에위치한 궤도 셰이커에 부드러운 교반과 함께 배양 37 ° C와 5 %CO2 하룻밤.
- 발광 신호는 24 웰 플레이트에서 배양된 조직을 위한 마이크로플레이트 리더 또는 생체 내 이미징 기기를 사용하여 측정할 수 있다. 6 웰 플레이트에 여러 조직의 개별 생존력을 측정하기 위해 생체 내 이미징 시스템을 사용해야합니다.
- 마이크로 플레이트 리더를 사용하는 경우 뚜껑없이 마이크로 플레이트를 설정합니다. 발광 강도를 측정할 수 있는 모든 유형의 마이크로플레이트 리더는 실험에 적합해야 합니다. 우리는 다음 설정을 사용 : 읽기 시간 = 1 초, 상단에서 측정, 게인 = 200.
참고: 정확도를 높이려면 흰색 벽 마이크로플레이트를 사용하여 실험을 설정합니다. 흰색 벽, 명확한 바닥 24 웰 플레이트는 테스트되었으며, 대부분의 경우, 명확한 웰 플레이트는 결과를 손상시키지 않습니다. - 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 생존 가능성을 측정할 때 플레이트를 스테이지 중앙에 놓고 뚜껑을 제거합니다. C, 자동 노출 시간, f-stop = 1, 피사체 높이 = 0.0 cm의 마이크로 플레이트로 객관적인 설정에서 스테이지 설정 필드가 있는 발광 이미지 다음에 일반 사진 이미지를 수집합니다.
- 생체 내 이미징 시스템과 함께 이미징 소프트웨어를 사용하여 발광 강도를 정량화합니다. 각 조직 슬라이스 주위에 일관된 관심 영역(ROI)을 그립니다. 이 프로토콜은 1cm 직경원을 ROI로 사용합니다(그림 1참조). 영역의 총 플럭스(p/s)를 측정합니다.
- 마이크로 플레이트 리더를 사용하는 경우 뚜껑없이 마이크로 플레이트를 설정합니다. 발광 강도를 측정할 수 있는 모든 유형의 마이크로플레이트 리더는 실험에 적합해야 합니다. 우리는 다음 설정을 사용 : 읽기 시간 = 1 초, 상단에서 측정, 게인 = 200.
3. 조직 슬라이스에 대한 약물 효과 평가
- 섹션 2에 설명된 바와 같이 발광 기반 생존성 측정 시약을 사용하여 치료 전에 기준선 생존 가능성을 측정합니다.
참고 : 여러 조직이 다른 조직에 비해 생존 가능성이 현저히 낮은 경우 분석에서 조직을 생략하십시오. - 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 약물을 용해하여 재고 용액을 만듭니다. 원하는 농도에서 TSC 또는 다른 배양 배지(25 μL/well 의 250 μL를 함유하는 24개의 웰 플레이트에 대해 잘) 10x 약물 용액을 준비합니다. 차량 제어를 위해 동등한 DMSO 부피가 포함된 매체를 준비합니다.
- 웰 의 바닥에 배양 배지에 10x 약물 용액을 보충. 파이펫팅하여 혼합하고 조직 위에 배지의 50 μL을 전달합니다.
참고: 여러 조직 조각을 사용할 수 있는 경우, 테스트 중복 또는 각 조건에 대 한 삼분량. - 37°C, 5%CO2,가습 인큐베이터에서 궤도 셰이커에 부드럽게 흔들어 밤새 배양한다.
- 셰이커에서 플레이트를 제거하고 37°C, 5%CO2,가습 인큐베이터에서 정적으로 배양한다.
- 원하는 시점에서 마이크로 플레이트 리더 또는 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 조직에서 발광 강도를 측정합니다. 보통, 약물 효과 치료 후 감지 될 1-6 일.
참고: 발광 계 생존 시약은 배양 조건 하에서 적어도 3일 동안 안정적입니다. 그러나, 기질은 조직의 대사 활성에 따라 분석 기간 동안 고갈될 수 있다. 이전에 높은 신호가있는 조직에서 상당한 신호 강하가 관찰되면 모든 우물에서 기판을 보충하십시오. - 다음 방정식을 사용하여 치료된 종양 조직의 남은 생존 가능성을 계산합니다.
치료 된 조직의 생존력은 제어 종양 조직의 기준선 생존 및 생존 가능성에 의해 정상화됩니다.
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Representative Results
여기서, 마우스 4T1 유방종양 조직 및 유방암 PDX 모델, HCI01012로부터제조된 종양 조직 슬라이스에 대한 시간 과정, 다중 약물 효능 평가 프로토콜을 입증한다. 우리는 성공적으로 여러 마우스 유래 종양, PDX 및 신선한 환자 종양에서 조직 조각을 제조10. 종양 조직 제제 및 약물 효능 시험의 전반적인 워크플로우는 도 1에기재되어 있다. 일반적으로, 우리는 부피1,000-1,500 mm3의 단 하나 대량 종양에서 20-40 조직 조각을 준비할 수 있었습니다.
생존 력 측정을 위해 당사는 발광 기반의 라이브 셀 호환 생존 시약을 활용했습니다. 다중 키나아제 억제제, 스타우로스포린을 4일 동안 1 μM 농도에서 처리한 결과, DMSO 대조군으로 처리된 종양 조직과 비교하여 신호 강도를 100배 감소시켰습니다(도2A). 4T1 종양으로부터 제조된 조직 슬라이스를 간헐적인 배지 교환으로 적어도 21일 동안 유지하였다(도2B). 대부분의 약물 반응 측정은 조직 슬라이스 제제로부터 7일 이내에 수행되었다. 라이브 셀 호환 시약은 측정 전에 처리 또는 고정이 필요하지 않기 때문에 시간 코스 측정을 수행할 수 있었습니다. 동일한 4T1 종양 조직으로부터의 종양 조직 슬라이스의 생존가능성에 대한 시간 의존적 변화는 도 2C에요약되어 있다. 500 nM의 Staurosporine은 첫날부터 발광을 감소시키고 4 일째에 가장 낮은 수준에 도달하여 이후의 각 시점마다 낮은 수준에 유지되었습니다. 대조적으로, DMSO로 보충된 조직의 대조군으로부터의 발광 강도는 6일째까지 안정적으로 유지되었다. 부가적으로, 동일한 4T1 종양으로부터 제조된 조직 슬라이스는 4일 동안 스타우로스포린(0-1 μM)의 직렬 투여로 처리되었고, 생존력 및 EC50(도 2D)에서용량 의존적 변화를 보였다.
우리는 유방암, HCI010의 정형 및 PDX 모형에서 준비된 조직 조각에 화학요법 약을 시험했습니다. PDX 조직 슬라이스는 표준 화학요법 약물인 독소루비신(doxorubicin)으로 6일 동안 0-5 μM의 투여량으로 처리되었고, 생존율에 대한 용량 의존적 변화를제공한다(그림 3A). 또한, 전임상 및 임상적으로 승인된 약물을 포함한 17개의 약물의 효능을 단일 벌크 HCI010 종양으로부터 제조된 조직 슬라이스에 삼중으로 시험하였다. 약물을 3일 동안 0.5 μM에서 3일 동안 적용하였다(도3B). 이러한 결과는 중간 처리량 약물 스크리닝이 네이티브 TME를 가진 종양 조각에 수행될 수 있다는 개념 증명을 제공합니다.
도 1: 조직 슬라이스 제제를 보여주는 회로도 및 약물 효능 평가. 종양 조직을 직경 6 mm 및 250 μm 두께의 슬라이스로 처리하고 세포 배양 인서트로부터의 지지체로 공기-액체 상호상에서 배양시켰다. 조직 생존성은 약물 치료 전후에 모두 생물 발광 시약을 사용하여 측정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 조직 슬라이스 생존력 측정 및 약물에 대한 반응. (A)유방 종양 조직 슬라이스에서 발광 기반 생존 능력 측정의 대표적인 이미지. 4T1 종양으로부터의 조직 슬라이스를 4일 동안 발광 생존 성 분석 시약과 함께 1 μM 스타우로스포린 또는 DMSO 대조군으로 배양하였다. 영상은 생체내 이미징 시스템을 사용하여 획득하고 동반이미지 분석 소프트웨어에 의해 분석되었다. 빨간색 원은 생물 발광에 대해 측정된 ROI를 나타냅니다. 하단 = 생체 내 이미징 시스템에 의해 측정된 바와 같이 스타우로스포린 또는 대조군으로 처리된 종양 조직 슬라이스로부터발광 신호를 나타내는 플롯. 막대는 원(control) 또는 정사각형(염색사포린 처리)으로 도시된 4개의 조직 슬라이스의 평균을 나타낸다. (B)제제로부터 21일 동안 배양된 4T1 종양 조직 슬라이스의 생존가능성을 나타내는 플롯. 생체 내 이미징 시스템에 의해 측정된 21일째에 생존력은 3일째로 정규화되었다. 각 점은 단일 슬라이스의 측정값을 나타냅니다. 막대는 평균을 나타냅니다. 상자에는 사분위수가 표시되고 수염은 최소 값에서 최대 값까지 측정값을 표시합니다. (C)스타우로스포린 치료 후 조직 생존력의 시간 과정 측정. 대조군으로서 스타우로스포린(500 nM) 또는 이와 동등한 부피의 DMSO로 처리된 4T1 종양으로부터의 조직 슬라이스의 생존가능성을 시간이 지남에 따라 측정하였다. 발광 강도는 표시된 시간 점에 걸쳐 마이크로 플레이트 판독기에 의해 측정되었다. 각 도트는 개별 조직 슬라이스로부터의 데이터포인트를 나타내고, 막대 그래프는 평균 ±SEM.(D)조직 슬라이스상에서 스타우로스포린의 투여 의존적 치료를 나타낸다. 4T1 종양으로부터 제조된 조직 슬라이스를 비히클 대조군으로서 스타우로스포린 또는 DMSO의 연속 투여량으로 보충하였다. 발광에 기초한 나머지 생존력은 치료 개시 후 4일 에서 생체 내 이미징 시스템에 의해 측정되었다. 상대생존가능성은 프로토콜에 도시된 방정식을 사용하여 계산하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 유방암 PDX 모델로부터 제조된 조직 슬라이스의 약물 스크린. (A)독소루비신의 다양한 투여량에 반응하여 생존력의 변화를 보여주는 플롯. 조직 슬라이스를 PDX 종양, HCI010 정형암 유방암으로부터 제조하였다. 생존력은 독소루비신의 적정 용량으로 처리된 슬라이스에서 측정하였다. 6일 후, 생체내 이미징 시스템을 사용하여 발광을 측정하였습니다. 바= 평균 ± SEM.(B)정형암 유방암 PDX 종양으로부터종양 조직 슬라이스에 대한 소규모 화학치료제 스크린. 막대 그래프 = 삼중실험의 평균 ±SEM. 이러한 데이터는 이전에게시되었습니다 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 물자 | Ml | 최종 농도 | 주식 |
| 윌리엄스 미디엄 E | 500 | ||
| 니코틴아미드 | 6 | 12 mM | 윌리엄스 의 중간 E에서 니코틴 아미드의 1M 재고, 살균 |
| 아스코르브산 | 6 | 50.4 μg/mL | 윌리엄의 중간 E에서 아스코르브 산의 0.21 g/50 mL (>10 mM 재고), 살균 |
| 중탄산나트륨 | 15 | 2.25 mg/mL | 7.5% (v) 솔루션 |
| 헤페스 버퍼 | 10 | 20 mM | 1 M 재고 솔루션 |
| 포도 당 | 10 | 5 mg/mL | 250 mg/ml 스톡, 스테얼 |
| 피루바테 나트륨 | 5 | 1 mM | 100 mM 재고 |
| L-글루타민 | 5 | 2 mM | 200 mM 재고 |
| ITS + 프리믹스 | 5 | 인간 재조합 인슐린, 인간 트랜스퍼린 (각각 12.5 mg), 셀렌산 (12.5 μg), BSA (2.5 g), 리놀레산 (10.7 mg) 함유 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | 2 | 40 IU/mL 펜, 40 μg/mL 스트렙 | 10,000 IU/mL 펜, 10,000 μg/mL 스트렙 |
| 재조합 EGF | 0.5 | 20 ng/mL | 20 μg/mL 재고 |
표 1: TSC 중간 레시피.
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Discussion
이 프로토콜에서, 우리는 organotypic 종양 조직 조각에 정량적, 실시간 약물 효능 연구를위한 플랫폼을 보여줍니다. 조직 슬라이스 배양 시스템은 네이티브 종양 미세 환경의 세포 이질성 및 생리학적 특성을 포착함으로써 기존의 세포 기반 체외 방식에 비해 뚜렷한 이점을 제공한다. 이 플랫폼은 또한 약물 효능 테스트를 위한 더 높은 처리량을 가능하게 하여 세포 배양 연구와 생체 내 실험 사이의 격차를 해소하는 데 도움을 줍니다.
정확 하 고 일관 된 결과 얻으려면, 준비 하는 동안 조직 손상을 최소화 하는 것이 필수적이다. 조직 조각은 물리적 접촉으로 인한 손상을 방지하기 위해 넓은 팁 플라스틱 파이펫으로 처리해야합니다. 배양 배지 부피는 조직 슬라이스가 실험 기간 동안 공기 및 배지 둘 다에 접촉할 수 있도록 유지되어야 한다.
배양 배지는 조직 유형 및 실험 목적에 따라 최적화되어야 한다. 이 프로토콜에 사용되는 TSC 배지는 원래 1차 간세포배양(13)을위해 개발된 무혈청 매미이다. 이 매체는 또한 유방, 간, 결장 및 췌장10을포함하여 종양의 몇몇 모형을 유지하기 위하여 이용되었습니다. 또한, 최적화된 DMEM 기반 배지10을사용하여 향상된 면역 세포 생존을 입증했습니다. 진동 설정은 손상되지 않고 균일한 종양 조직 조각을 얻기 위해 조직 질감에 따라 최적화되어야합니다. 더 부드럽고 느슨하게 통합된 조직을 자르는 것은 일반적으로 더 깊은 블레이드 각도, 느린 절단 속도 및 두꺼운 슬라이스를 사용하여 더 쉬워집니다. 때때로, 조직은 잘라 너무 연약합니다, 이 경우 연구원은 낮은 융점 agarose,14,,15를슬라이스 뇌 조직에서 일반적인 기술 내에 조직을 포함 고려해야한다.
이전에, 몇몇 연구 결과는 배양된 조직 조각에 치료 약 시험 접근을 소개했습니다. 이러한 연구는 조직 생존력을 평가하기 위해 형광 염료 혼입, 면역 조직화학 또는 MTT 분석에의존하여 6,,7,,8,,9. 이 프로토콜에서는 발광 기반의 라이브 셀 호환 시약 RealTime-Glo11을 사용했습니다. 발광 기반 측정법은 감도 증가, 더 넓은 신호 범위 및 실시간 생존 능력 측정을 신속하게 할 수 있는 능력을 포함하여 이전에 사용된 방법에 비해 몇 가지 이점이 있습니다. 측정 시간은 마이크로 플레이트 판독기(~1s/well)와 생체 내 이미징 시스템(~1분/플레이트)에 대해 짧으며 최소한의 처리로 직접 신호 강도 판독값을 제공할 수 있습니다. 신호를 더 빠르게 획득하고 처리 후 처리 단계가 적어 처리량이 많은 약물 스크리닝에 필요한 기능이 있으므로 luciferin 기반 생존 율 측정을 통해 조직 슬라이스 배양에서 훨씬 더 큰 시료 처리량을 구현할 수 있습니다. 루시퍼라제 계 분석법은 전체 슬라이스 생존가능성에 대한 정확하고 정량적인 측정을 제공하지만, 조직에서 약물 유발 세포 유형 별 변화를 검출할 수 없다. 그러나 동일한 조직 슬라이스의 엔드포인트 IHC와 발광 기반 생존 능력 측정을 결합하면 세포 유형별 측정이 가능합니다.
조직 슬라이스 배양 시스템은 높은 처리량 스크리닝 플랫폼에 종양 조직 복잡성을 가져오는 강력한 도구이지만, 몇 가지 단점이 있습니다. 종양 조직 내의 내재된 이질성은 동일 대량 종양에서조차 조직 조각 중 차등 약물 반응을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 때때로, 우리는 우리의 실험에 있는 조직 조각 중 약 반응에 있는 상대적으로 큰 변이를 관찰했습니다. 우리는 부분적으로 동일 종양 내의 다른 사이트에서 준비된 다중 조직 조각을 평균하여 이 변이를 극복할 수 있습니다. 조직 슬라이스 배양은 적어도 21일 동안 생존가능성의 기준선 수준에서 유지될 수있지만(도 2B),세포 집단은 시간이 지남에 따라 변화한다. 우리는 조직 슬라이스 배양 실험10의과정 동안 면역 세포 집단의 변화를 기술했다. 따라서, 우리는 조직 조각을 네이티브 조직 특성을 되풀이하기 위해 짧은 배양 시간 간격을 통해 검사하는 것이 좋습니다.
조직 슬라이스 배양은 높은 처리량 세포 배양 및 동물 실험 사이의 약물 발견 및 개발에 중요한 격차를 채울 태세입니다. 수백 개의 약물은 단일 종양 생검에서 생산된 슬라이스에서 평가될 수 있으며, 동물 연구 전에 생리학적 관련성이 증가합니다. 이 시스템은 시장에 약물을 가지고하는 데 필요한 동물 실험의 수를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 환자 종양에서 준비 된 조직 조각은 클리닉에서 치료 계획을 안내하는 유익한 잠재력을 가지고 있습니다. 100개 이상의 치료 약물이 오늘날 사용할 수 있지만, 그들의 선택을 안내하는 바이오마커는 거의 없습니다. 더욱이, 환자에 있는 이질성은 또한 반응에 있는 불균형 귀착됩니다. 환자 생검에서 조직 조각은 1 주일 의 시간 안에 약 효험에 귀중한 정보를 제공하는 체계적으로 취급하기 전에 다중 약을 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다. 전반적으로, 조직 슬라이스 배양 시스템을 이용한 약물의 실시간 및 신속한 테스트는 암 약물 개발 및 치료 결정에 큰 잠재력을 가지고 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704], 시드니 킴멜 재단 [킴멜 학자 상], 폐암 발견 상 (LCD-505536)에 의해 지원되었다. 우리는 유방암 PDX 종양을 제공해 준 Alana Welm 박사(유타 대학교)에게 감사드립니다. 우리는 또한 PDX 모형의 정비를 위한 비교 의학, 프레드 허친슨 암 연구 센터 (FHCRC)에 있는 직원 및 유용한 토론을 위한 Gujral 실험실의 일원에게 감사하고 싶습니다. N.N.A는 FHCRC의 JSPS 해외 연구 펠로우십 및 학제 간 교육 교부금의 지원을 받고 있습니다. A.J.B.는 FHCRC의 염색체 대사 및 암 훈련 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
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