Summary
Introducimos un protocolo para medir la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral orgatípico. La estrategia experimental descrita aquí proporciona una plataforma para llevar a cabo pantallas de fármacos de rendimiento medio-alto en rodajas de tejido derivadas de tumores clínicos o de ratón en condiciones ex vivo.
Abstract
Los tejidos tumorales se componen de células cancerosas, células inmunitarias infiltradas, células endoteliales, fibroblastos y matriz extracelular. Este ambiente complejo constituye el microambiente tumoral (TME) y puede modular la respuesta al tratamiento in vivo o respuesta farmacológica ex vivo. Las pantallas convencionales de descubrimiento de fármacos contra el cáncer se llevan a cabo en células cultivadas en una monocapa, un sistema que carece críticamente de la influencia de la TME. Por lo tanto, los sistemas experimentales que integran ensayos sensibles y de alto rendimiento con TME fisiológico fortalecerán el proceso de descubrimiento de fármacos preclínicos. Aquí, introducimos el cultivo de rebanadas de tejido tumoral ex vivo como una plataforma para la detección de fármacos de alto rendimiento medio-alto. El cultivo de rebanadas de tejido organotípico constituye secciones tumorales delgadas y cortadas con precisión que se mantienen con el apoyo de una membrana porosa en una interfaz líquido-aire. En este protocolo, describimos la preparación y el mantenimiento de rebanadas de tejido preparadas a partir de tumores de ratón y tumores a partir de modelos de xenoinjerto sorinjertos derivados del paciente (PDX). Para evaluar los cambios en la viabilidad de los tejidos en respuesta al tratamiento farmacológico, aprovechamos un ensayo biocompatible basado en la luminiscencia que permite la medición en tiempo real, rápida y sensible de células viables en el tejido. Usando esta plataforma, evaluamos las respuestas dependientes de la dosis de las rodajas de tejido al inhibidor de la multiquinasa, la estaurosporina y el agente citotóxico, la doxorubicina. Además, demostramos la aplicación de rodajas de tejido para farmacología ex vivo mediante la detección de 17 fármacos clínicos y preclínicos en rodajas de tejido preparadas a partir de un único tumor PDX. Nuestra plataforma de cribado ex vivo, fisiológicamente relevante, altamente sensible y robusta, fortalecerá en gran medida el descubrimiento de fármacos oncológicos preclínicos y la toma de decisiones sobre el tratamiento.
Introduction
Las interacciones de las células cancerosas con las propiedades físicas y bioquímicas del tejido estromal circundante forman el TME. TME puede estimular el crecimiento del tumor, metástasis, y modular la respuesta tumoral a la terapia1. En el desarrollo de fármacos preclínicos convencionales, los candidatos a medicamentos suelen ser examinados por primera vez utilizando líneas celulares de cáncer cultivadas, una plataforma de ensayo que carece críticamente del TME2. Esta falta de TME fisiológico en las etapas de preselección basadas en células puede limitar el descubrimiento de agentes eficaces en modelos animales portadores de tumores y puede contribuir a la alta tasa de desgaste de muchos fármacos oncológicos prometedores en etapas clínicas posteriores del desarrollo3.
A pesar de la importancia de la TME en la modulación de las respuestas a los fármacos tumorales, las limitaciones experimentales limitan la aplicación de sistemas más relevantes desde el punto de vista fisiológico durante las primeras etapas del descubrimiento y desarrollo de fármacos. No es práctico examinar cientos de agentes terapéuticos en tumores de modelos animales o muestras de tumores de pacientes. De hecho, los especímenes quirúrgicos son recursos escasos con orígenes genéticos variados y el cribado de miles de moléculas candidatas en modelos animales no es factible debido a la escala experimental, el costo y el bienestar animal.
El cultivo de rebanadas de tejido tumoral, donde se cultivan con precisión secciones de tumores delgados ex vivo, puede abordar la limitación de la TME fisiológica en los ensayos de detección de drogas. Históricamente, el campo de la neurociencia fue pionero e hizo extensas optimizaciones del cultivo de rebanadas para el tejido cerebral4. Recientemente, muchos estudios han demostrado la preparación de rodajas de varios tipos de tejido tumoral, incluyendo tumores derivados de líneas celulares, modelos tumorales espontáneos, xenoinjertos derivados del paciente (PDX) y tumores primarios de pacientes. El cultivo de rebanadas de tejido ex vivo integra beneficios tanto del cultivo in vivo como del in vitro5. Las rebanadas de tejido tumoral conservan la arquitectura intacta del tejido y la composición celular variable, lo que permite el estudio de las células cancerosas dentro del contexto TME.
Este protocolo introduce un sistema de cultivo de rebanadas de tejido tumoral organotípico combinado con un ensayo de viabilidad altamente sensible en tiempo real para evaluar las respuestas de los medicamentos. Las pruebas de eficacia de fármacos en rodajas de tejido tumoral organotípico en protocolos introducidos anteriormente se basan en la medición de los cambios en la viabilidad celular mediante la incorporación de tintes fluorescentes, inmunohistoquímica (IHC), o MTT ((3- [4, 5-dimetiltiazol-2-yl]-2, 5 bromuro de tetrazolio difenil) ensayo6,7,8,9. Sin embargo, todos estos métodos son ensayos de punto final y sufren de baja sensibilidad, largo tiempo de procesamiento, análisis de datos complejos, rango de señal estrecho y alto error experimental. Nuestro reactivo compatible con células vivas basado en luminiscencia mejora estos ensayos al proporcionar un amplio rango de señal y una medición instantánea (5 min) sin procesamiento previo y postprocesamiento mínimo. Este reactivo es altamente sensible y puede coexistir en los medios de cultivo celular, permitiendo la medición continua y de tiempo de viabilidad celular. Este sistema de ensayo es aplicable a la detección de alto rendimiento de los candidatos a fármacos en rebanadas de tejido en el desarrollo de fármacos preclínicos.
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Protocol
Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Ley de Bienestar Animal y las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales en la investigación biomédica.
1. Preparación de rodajas de tejido tumoral
- Preparar el medio de cultivo de rebanadas de tejido (TSC) siguiendo la receta de la Tabla 1. Filtrar el medio con una unidad de filtro de vacío de 0,45 m para esterilizar.
- Aliquot 250 l de medio TSC por pocto para una placa de 24 pocillos, o 1 ml de medio por pocto para una placa de 6 pocillos. Mantener la placa en una incubadora humidificada de 37oC, 5% CO2 hasta su uso.
NOTA: El medio y los suplementos se pueden optimizar dependiendo de los tipos de tejido y los objetivos experimentales. La cantidad de medio debe ser suficiente para empapar la membrana porosa de un inserto de cultivo. No exceda el nivel de la membrana. Ajuste el volumen medio si el nivel medio es demasiado bajo o demasiado alto. Si los investigadores están probando agentes inmunomoduladores, recomendamos la suplementación del medio con IL-210. - Si utiliza tejido tumoral derivado de ratones, eutanasia ratones con un procedimiento recomendado, desinfecte la piel expuesta de los ratones pulverizando 70% etanol y diseccionando tumores con técnicas asépticas. Almacene el tejido tumoral en un tubo que contenga la solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) helada.
- Si utiliza tejidos tumorales de pacientes frescos, guárdelo en HBSS helado a corto plazo, o en la solución de la Universidad Belzer de Wisconsin (UW) para un almacenamiento a largo plazo (hasta 24 h) para preservar la viabilidad del tejido.
NOTA: Los cortes de un tejido PDX enviados durante la noche en una solución UW helada se han preparado con éxito. - Transfiera el tejido tumoral a una placa de cultivo de 10 cm que contenga HBSS helado. Corta el tumor en mitades con un bisturí mientras estás sumergido en HBSS helado. Forma los tejidos tumorales en cilindros usando un punzón de biopsia de 6 mm de diámetro y recorta un lado para crear una superficie plana. Almacene los tejidos en HBSS helado hasta su uso.
NOTA: Evite incluir la zona necrótica del tejido, que generalmente está en el centro y tiene un aspecto opaco y frágil. - Configure el vibratome. Desinfectar todo el equipo con 70% de etanol. Coloque la bandeja tampón de vibratome cubierta con una tapa de vidrio acrílico en el centro del baño de hielo vibratome. Agregue hielo al baño de hielo y llene la bandeja tampón con HBSS enfriado para mantener el tejido fresco mientras corta. Coloque una cuchilla de afeitar en el soporte de la cuchilla.
NOTA: Aunque mantener los vibratomes en un entorno semiestéril no ha afectado a experimentos previos, se recomienda almacenar el vibratomo bajo un gabinete de bioseguridad si está disponible. - Levante cuidadosamente un tejido tumoral perforado con biopsia del HBSS usando fórceps dentados y elimine el exceso de tampón examinando el tejido con una toalla de papel sin pelusas.
- Coloque una gota de pegamento de cianoacrilato de grado médico en la placa de la muestra y coloque el tejido en esta gota. Seque al aire el pegamento durante 2-3 minutos y coloque la placa en la bandeja tampón. Suplementar con un poco de HBSS hasta que el tejido esté completamente sumergido en el tampón.
NOTA: El montaje de los tejidos en una posición vertical y estable es fundamental para generar rodajas cortadas uniformemente. Si los tejidos montados son inestables, agregue más pegamento al tejido circundante para conservar una posición vertical o descargue el tejido, aplane la parte inferior y vuelva a pegarlo. Los tejidos elásticos tienden a ser empujados y doblados más fácilmente durante el corte, en cuyo caso las longitudes más cortas (<5 mm) y múltiples corridas pueden ser apropiadas. Para los tejidos extremadamente frágiles, las toallas de papel pueden destruir el tejido. En este caso, el tejido se puede colocar en una superficie de plástico para eliminar el exceso de HBSS. - Ajuste los ajustes del vibratome. Se utilizan los siguientes ajustes: espesor de corte a 250 m, amplitud de 3,00 mm, velocidad de corte a 0,01–0,25 mm/s y ángulo de la hoja de 15o–21o.
NOTA: Optimice los ajustes de corte en función de la rigidez del tejido. Los tejidos más blandos se cortan más fácilmente con un ángulo de hoja más profundo a menor velocidad. Un ángulo de la hoja de 18o, una velocidad de corte entre 0,10–0,18 mm/s y una amplitud de 3,00 mm funciona bien para los tumores de ratón 4T1 y PDX HCI010. El tejido más rígido se puede cortar con una velocidad de cuchilla más rápida. - Establezca las ubicaciones inicial y final de la hoja y ajuste la altura del escenario. Ejecute el instrumento con modo continuo para cortar rodajas durante varios ciclos hasta que los tejidos se corten uniformemente.
- Continúe cortando el tejido. Transfiera las rebanadas junto con una pequeña cantidad de búfer de HBSS a la plaquita de cultivo celular con un medio con una pipeta de transferencia de punta ancha, utilizando la succión para levantar toda la rebanada. Coloque una rebanada por plaquita en un plato de 24 pocillos. Un inserto para 6 placas de pozo spuede acomodar hasta cuatro rodajas para un ensayo de réplica.
NOTA: Si el último borde de la rebanada de tejido todavía está unido al tejido sin cortar, detenga el vibratome y separe la rebanada de tejido con dos pares de fórceps de punta fina sin tocar ni pinchar las rodajas de tejido. Una cuchilla de afeitar separada puede ser útil para eliminar el tejido colgante. - Retire el exceso de tampón con una pipeta de transferencia de punta fina.
- Cuando la hoja se acerque a los tejidos pegados, detenga el instrumento, baje el escenario, retire el tejido rígido con una hoja separada y monte un tejido nuevo. Continúe cortando hasta que se hayan recogido suficientes rodajas.
- Cultivo de las placas en una incubadora humidificada a 37oC, 5% CO2. Las rodajas de tejido se cultivan en la interfase aire-líquido en el inserto de cultivo celular. Las rodajas de tejido están listas para experimentos de 24 a 48 h después de la preparación inicial de la rebanada. Para el cultivo a largo plazo, cambie el medio cada 2-3 días.
2. Medición de viabilidad
- Para la medición de viabilidad de la rebanada de tejido, cambie el medio con un reactivo de medición de viabilidad basado en luminiscencia que contenga luciferasa y prosustrato a 1:1,000 de dilución en el medio TSC siguiendo las instrucciones del fabricante. El reactivo mide la actividad de reducción de las células vivas de prosustrato metabolizado a luciferina11. Transfiera 50 ml de mezcla enzima-sustrato encima de cada rebanada de tejido.
- Incubar con agitación suave en un agitador orbital situado dentro de una incubadora humidificada a 37oC con 5% deCO2 durante la noche.
- Las señales luminosas se pueden medir utilizando un lector de microplacas o un instrumento de imagen in vivo para tejidos cultivados en una placa de 24 pocillos. Para medir la viabilidad individual de múltiples tejidos en una placa de 6 pocillos, se debe utilizar un sistema de imágenes in vivo.
- Cuando utilice un lector de microplacas, ajuste la microplaca sin la tapa. Cualquier tipo de lector de microplacas capaz de medir la intensidad luminiscente debe ser adecuado para el experimento. Usamos los siguientes ajustes: tiempo de lectura 1 s, medición desde la parte superior, ganancia a 200.
NOTA: Para una mayor precisión, utilice una microplaca de pared blanca para configurar el experimento. Se han probado 24 placas de pozo de pared blanca y fondo transparente, y en la mayoría de los casos, las placas de pozo transparente no comprometen los resultados. - Cuando utilice un sistema de imágenes in vivo para medir la viabilidad, coloque la placa en el centro del escenario y retire la tapa. Adquiera imágenes fotográficas normales seguidas de imágenes luminiscentes con un ajuste de campo de escenario en C, tiempo de exposición automática, f-stop 1, ajuste objetivo como microplaca con altura de sujeto a 0,0 cm.
- Cuantifique la intensidad luminiscente utilizando el software de imágenes acompañado con el sistema de imágenes in vivo. Dibuje regiones consistentes de interés (ROI) alrededor de cada rebanada de tejido. Este protocolo utiliza un círculo de 1 cm de diámetro como ROI (consulte la figura 1). Mida el flujo total (p/s) del área.
- Cuando utilice un lector de microplacas, ajuste la microplaca sin la tapa. Cualquier tipo de lector de microplacas capaz de medir la intensidad luminiscente debe ser adecuado para el experimento. Usamos los siguientes ajustes: tiempo de lectura 1 s, medición desde la parte superior, ganancia a 200.
3. Evaluación del efecto farmacológico en las rodajas de tejido
- Mida la viabilidad basal antes del tratamiento utilizando el reactivo de medición de viabilidad basado en luminiscencia, como se explica en la sección 2.
NOTA: Si varios tejidos tienen una viabilidad significativamente menor en comparación con otros, omita los tejidos del ensayo. - Disolver fármacos en dimetilsulfóxido (DMSO) para hacer soluciones de stock. Preparar una solución de fármaco 10x con TSC u otro medio de cultivo (25 l/bien para una placa de 24 pocillos que contenga 250 ml de medio) a las concentraciones deseadas. Para el control del vehículo, prepare un medio que contenga un volumen equivalente de DMSO.
- Complemente la solución de fármaco10x al medio de cultivo en la parte inferior del pozo. Mezclar pipeteando y transferir 50 l del medio en la parte superior de los tejidos.
NOTA: Si hay varias rebanadas de tejido disponibles, el examen duplica o triplica para cada afección. - Incubar durante la noche con suave temblor en un agitador orbital en una incubadora humidificada de 37oC, 5% CO2.
- Retirar la placa de la coctelera e incubar estáticamente en la incubadora humidificada de 37oC, 5%CO2,humidificado.
- En los momentos deseados, mida la intensidad luminiscente de los tejidos utilizando un lector de microplacas o un sistema de imágenes in vivo. Por lo general, los efectos farmacológicos se vuelven detectables después de 1–6 días de tratamiento.
NOTA: El reactivo de viabilidad basado en luminiscencia es estable durante al menos 3 días en condiciones de cultivo. Sin embargo, el sustrato puede agotarse durante el ensayo dependiendo de la actividad metabólica del tejido. Si se observa una caída significativa de la señal en los tejidos con señales previamente altas, complementar el sustrato en todos los pozos. - Calcular la viabilidad restante de los tejidos tumorales tratados utilizando la siguiente ecuación:
La viabilidad del tejido tratado se normaliza por su viabilidad basal y el cambio de viabilidad de los tejidos tumorales de control.
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Representative Results
Aquí, demostramos un protocolo de evaluación de eficacia de múltiples fármacos de curso de tiempo para las rodajas de tejido tumoral preparadas a partir de tejidos tumorales de mama 4T1 de ratón y un modelo PDX de cáncer de mama, HCI01012. Preparamos con éxito rebanadas de tejido de varios tumores derivados del ratón, PDX, y tumores de pacientes frescos10. El flujo de trabajo general de la preparación del tejido tumoral y la prueba de eficacia del fármaco se describe en la Figura 1. En general, podríamos preparar de 20 a 40 rebanadas de tejido de un solo tumor a granel de 1.000 a 1.500 mm3 de volumen.
Para mediciones de viabilidad, aprovechamos un reactivo de viabilidad compatible con células vivas de base luminiscente. El tratamiento de un inhibidor de la multiquinasa, la estaurosporina, a 1 m de concentración durante 4 días, redujo la intensidad de la señal en 100x, en comparación con los tejidos tumorales tratados con el control DMSO(Figura 2A). Las rodajas de tejido preparadas a partir del tumor 4T1 se mantuvieron durante al menos 21 días con intercambio medio ocasional(Figura 2B). La mayoría de las mediciones de respuesta a fármacos se realizaron dentro de los 7 días posteriores a la preparación de la rebanada de tejido. Debido a que el reactivo compatible con células vivas no requiere procesamiento o fijación antes de la medición, nos permitió llevar a cabo mediciones de curso de tiempo. Los cambios dependientes del tiempo en la viabilidad de las rodajas de tejido tumoral del tejido tumoral 4T1 idéntico se resumen en la Figura 2C. La estaurosporina a 500 nM disminuyó la luminiscencia desde el día 1 y alcanzó el nivel más bajo en el día 4, permaneciendo bajo para cada punto de tiempo posterior. Por el contrario, la intensidad luminiscente del grupo de control de los tejidos complementados con DMSO se mantuvo estable hasta el día 6. Además, las rodajas de tejido preparadas a partir de tumores 4T1 idénticos se trataron con dosis en serie de estaurosporina (0-1 m) durante 4 días, y mostraron cambios dependientes de la dosis en la viabilidad y CE50 (Figura 2D).
Probamos fármacos quimioterápicos en rebanadas de tejido preparadas a partir de un modelo ortotópico pdX de cáncer de mama, HCI010. Las rodajas de tejido PDX se trataron con doxorubicina, un medicamento quimioterapéutico estándar, a dosis de 0 a 5 m durante 6 días, proporcionando cambios en la viabilidad dependientes de la dosis(Figura 3A). Además, la eficacia de 17 fármacos, incluidos los medicamentos preclínicos y clínicamente aprobados, se probó en triplicado en rodajas de tejido preparadas a partir de un tumor HCI010 a granel. Los medicamentos se aplicaron a 0,5 m durante 4 días en triplicado(Figura 3B). Estos resultados proporcionan una prueba de concepto de que el cribado de fármacos de rendimiento medio se puede realizar en rodajas de tumores con TME nativo.
Figura 1: Esquema que muestra la preparación de la rebanada de tejido seguida de la evaluación de la eficacia del fármaco. Los tejidos tumorales se procesaron en rodajas de 6 mm de diámetro y 250 mm de espesor y se cultivaron en la interfase aire-líquido con el apoyo de las inserciones de cultivo celular. La viabilidad del tejido se midió utilizando un reactivo bioluminiscente antes y después del tratamiento farmacológico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Medición de la viabilidad de la rebanada de tejido y respuesta a los fármacos. (A) Imágenes representativas de mediciones de viabilidad basadas en luminiscencia en rodajas de tejido tumoral mamario. Las rodajas de tejido del tumor 4T1 se incubaron con 1 m de control de estaurosporina o DMSO junto con el reactivo de ensayo de viabilidad luminiscente durante 4 días. Las imágenes se obtuvieron utilizando un sistema de imágenes in vivo y se analizaron mediante el software de análisis de imágenes que acompaña. Los círculos rojos indican el ROI medido para la bioluminiscencia. Parte inferior: una gráfica que muestra la señal luminiscente de las rodajas de tejido tumoral tratadas con estaurosporina o el control medido por un sistema de imágenes in vivo. La barra indica la media de las cuatro rebanadas de tejido mostradas como círculos (control) o cuadrados (tratado con estaurosporina). (B) Una gráfica que muestra la viabilidad de las rodajas de tejido tumoral 4T1 cultivadas durante 21 días desde la preparación. La viabilidad en el día 21 medida por un sistema de imágenes in vivo se normalizó a la del día 3. Cada punto indica la medición de un solo sector; la barra indica la media; la caja muestra los cuartiles, y los bigotes muestran el valor mínimo al máximo de la medida. (C) Mediciones a paso de la viabilidad del tejido después del tratamiento con estaurosporina. La viabilidad de las rodajas de tejido del tumor 4T1 tratadas con estaurosporina (500 nM) o volumen equivalente de DMSO como control se midieron con el tiempo. Las intensidades de luminiscencia fueron medidas por un lector de microplacas sobre los puntos de tiempo indicados. Cada punto ilustra un punto de datos de una rebanada de tejido individual, y el gráfico de barras indica la media de seM. (D) Tratamiento dependiente de la dosis de la estaurosporina en las rodajas de tejido. Las rodajas de tejido preparadas a partir del tumor 4T1 se complementaron con dosis en serie de estaurosporina o DMSO como control del vehículo. La viabilidad restante basada en la luminiscencia se midió mediante un sistema de imágenes in vivo a los 4 días posteriores al inicio del tratamiento. La viabilidad relativa se calculó utilizando la ecuación que se muestra en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Examen de drogas en rebanadas de tejido preparadas a partir de un modelo PDX de cáncer de mama. (A) Una gráfica que muestra cambios en la viabilidad en respuesta a varias dosis de doxorubicina. Las rebanadas de tejido se prepararon a partir de un tumor toortópico de cáncer de mama PDX, HCI010. La viabilidad se midió en rodajas tratadas con dosis valoradas de doxorubicina. Después de 6 días, la luminiscencia se midió utilizando un sistema de imágenes in vivo. Bar - media - SEM. (B) Una prueba de análisis quimioterapéutico a pequeña escala en las rodajas de tejido tumoral de un tumor toortópico de cáncer de mama PDX. El gráfico de la barra es media, SEM del experimento triplicado. Estos datos se han publicado previamente10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Material | Ml | Concentración final | Acción |
| William's Medium E | 500 | ||
| Nicotinamida | 6 | 12 mM | 1 M de nicotinamida en Medium E de Williams, esterilizada |
| Acido ascórbico | 6 | 50,4 g/ml | 0,21 g/50 mL (>10 mM de stock) de ácido ascórbico en el medio E de William, esterilizado |
| Bicarbonato de sodio | 15 | 2,25 mg/ml | 7,5% (p/v) solución |
| Búfer HEPES | 10 | 20 mM | Solución de stock de 1 M |
| Glucosa | 10 | 5 mg/ml | 250 mg/ml de stock esterilizado |
| Piruvato de sodio | 5 | 1 mM | 100 mM de stock |
| L-glutamina | 5 | 2 mM | Stock de 200 mM |
| ITS + Premezcla | 5 | Contiene insulina recombinante humana, transferrina humana (12,5 mg cada una), ácido selenoso (12,5 g), BSA (2,5 g) y ácido linoleico (10,7 mg) | |
| Penicilina-Streptomicina | 2 | 40 UI/ml Pluma, 40 g/ml Strep | Pluma de 10.000 UI/ml, 10.000 g/ml Strep |
| EGF recombinante | 0.5 | 20 ng/mL | Stock de 20 g/ml |
Tabla 1: Receta media TSC.
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Discussion
En este protocolo, demostramos una plataforma para estudios cuantitativos y en tiempo real de eficacia de fármacos en rodajas de tejido tumoral organotípico. El sistema de cultivo de rebanadas de tejido proporciona ventajas distintas sobre los métodos in vitro tradicionales basados en células mediante la captura de la heterogeneidad celular y las características fisiológicas del microambiente tumoral nativo. Esta plataforma también permite un mayor rendimiento para las pruebas de eficacia de fármacos, ayudando a cerrar la brecha entre los estudios de cultivo celular y los experimentos in vivo.
Para obtener resultados precisos y consistentes, es imperativo minimizar el daño tisular durante la preparación. Las rodajas de tejido deben manipularse con pipetas de plástico de punta ancha para evitar daños causados por el contacto físico. El volumen medio de cultivo debe mantenerse para permitir que la rebanada de tejido entre en contacto tanto con el aire como en el medio durante la duración del experimento.
El medio de cultivo debe optimizarse en función del tipo de tejido y el propósito experimental. El medio TSC utilizado en este protocolo es un medio libre de suero que fue desarrollado originalmente para el cultivo primario de hepatocitos13. Este medio también se ha utilizado para mantener varios tipos de tumores, incluyendo mama, hígado, colon, y páncreas10. Además, demostramos una mayor supervivencia de las células inmunitarias utilizando un medio optimizado basado en DMEM10. La configuración del vibratome debe optimizarse en función de la textura del tejido para obtener rebanadas de tejido tumoral intactas y uniformes. El corte de tejidos más suaves y/o consolidados sueltos normalmente se hace más fácil mediante el uso de ángulos de hoja más profundos, velocidad de corte más lenta y rodajas más gruesas. Ocasionalmente, los tejidos son demasiado blandos para cortar, en cuyo caso los investigadores deben considerar la inserción del tejido dentro de agarosa de bajo punto de fusión, una técnica común en el corte de tejido cerebral14,15.
Anteriormente, varios estudios introdujeron enfoques terapéuticos de pruebas de drogas en rebanadas de tejido cultivado. Estos estudios se basaron en la incorporación de tintes fluorescentes, inmunohistoquímica, o ensayos MTT para evaluar la viabilidad de los tejidos6,7,8,9. En este protocolo, utilizamos el reactivo compatible con células vivas RealTime-Glo11 basado en luminiscencia para la medición de la viabilidad. Los ensayos basados en luminiscencia tienen varios beneficios sobre los métodos utilizados anteriormente, incluyendo una mayor sensibilidad, un rango de señal más amplio y la capacidad de realizar rápidamente mediciones de viabilidad en tiempo real. El tiempo de medición es corto tanto para los lectores de microplacas (1 s/pozo) como para un sistema de imágenes in vivo (1 min/placa) y puede proporcionar lecturas de intensidad de señal directamente con un procesamiento mínimo. La adquisición más rápida de la señal y menos pasos de postprocesamiento son características necesarias en el cribado de fármacos de alto rendimiento, lo que permite mediciones de viabilidad basadas en luciferina para permitir un rendimiento de muestra mucho mayor en el cultivo de rebanadas de tejido. Mientras que un ensayo basado en luciferasa proporciona una medición precisa y cuantitativa de toda la viabilidad de la rebanada, es incapaz de detectar cambios específicos de tipo de célula inducido por fármacos en el tejido. Sin embargo, las mediciones de viabilidad basadas en luminiscencia de acoplamiento con IHC de punto final en la misma rebanada de tejido permitirán mediciones específicas del tipo de celda.
Mientras que el sistema de cultivo de rebanadas de tejido es una herramienta poderosa para llevar la complejidad del tejido tumoral a una plataforma de cribado de alto rendimiento, tiene varios inconvenientes. La heterogeneidad inherente dentro de un tejido tumoral puede causar respuestas diferenciales a los medicamentos entre las rebanadas de tejido incluso del mismo tumor a granel. En ocasiones, observamos variaciones relativamente grandes en la respuesta a fármacos entre las rebanadas de tejido en nuestros experimentos. Podemos superar parcialmente esta variación promediando múltiples rebanadas de tejido preparadas desde diferentes sitios dentro del mismo tumor. Aunque el cultivo de rebanadas de tejido se puede mantener en el nivel basal de viabilidad durante al menos 21 días(Figura 2B),las poblaciones celulares cambian con el tiempo. Hemos descrito cambios en la población de células inmunitarias durante el curso de los experimentos de cultivo de rebanadas de tejido10. Por lo tanto, recomendamos que las rebanadas de tejido se examinen en intervalos de tiempo de cultivo más cortos para recapitular las características del tejido nativo.
El cultivo de rebanadas de tejido está preparado para llenar un vacío crítico en el descubrimiento y desarrollo de fármacos entre la detección de cultivo celular de alto rendimiento y los experimentos con animales. Cientos de fármacos se pueden evaluar en rodajas producidas a partir de una sola biopsia tumoral, añadiendo mayor relevancia fisiológica antes de los estudios en animales. Este sistema podría ayudar a reducir el número de experimentos con animales necesarios para llevar drogas al mercado. Además, las rebanadas de tejido preparadas a partir de tumores de pacientes tienen potencial informativo para guiar los planes de tratamiento en la clínica. Más de cien medicamentos terapéuticos están disponibles hoy en día, sin embargo, hay pocos biomarcadores para guiar su selección. Además, la heterogeneidad en los pacientes también produce disparidades en la respuesta. Las rebanadas de tejido de una biopsia de paciente se pueden utilizar para probar múltiples medicamentos antes de tratar los análisis de forma sistémica, proporcionando información valiosa sobre la eficacia de los medicamentos dentro de una semana. En general, pruebas rápidas y en tiempo real de drogas utilizando sistemas de cultivo de rebanadas de tejido tiene un gran potencial en el desarrollo de fármacos contra el cáncer y decisiones terapéuticas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] y Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Nos gustaría agradecer a la Dra. Alana Welm (Universidad de Utah) por proporcionar el tumor PDX de cáncer de mama. También nos gustaría agradecer al personal de Medicina Comparada, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) por el mantenimiento del modelo PDX y a los miembros del laboratorio Gujral por sus útiles discusiones. N.N.A cuenta con el apoyo de la Beca de Investigación en el Extranjero JSPS y la Beca de Capacitación Interdisciplinaria de FHCRC. A.J.B. es apoyado por la Beca de Metabolismo De cromosomas y Entrenamiento del Cáncer de FHCRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
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