Summary
Dieses Protokoll beschreibt die robuste Erzeugung von Makrophagen aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und Methoden für deren anschließende Charakterisierung. Zelloberflächenmarkerexpression, Genexpression und funktionelle Assays werden verwendet, um den Phänotyp und die Funktion dieser iPSC-abgeleiteten Makrophagen zu bewerten.
Abstract
Makrophagen sind in den meisten Wirbeltiergeweben vorhanden und umfassen weit verstreute und heterogene Zellpopulationen mit unterschiedlichen Funktionen. Sie sind Schlüsselakteure in Gesundheit und Krankheit, fungieren als Phagozyten während der Immunabwehr und vermitteln trophische, Wartung, und Reparaturfunktionen. Obwohl es möglich war, einige der molekularen Prozesse zu untersuchen, die an der Funktion der menschlichen Makrophagen beteiligt sind, hat es sich als schwierig erwiesen, gentechnische Techniken auf primäre menschliche Makrophagen anzuwenden. Dies hat unsere Fähigkeit erheblich beeinträchtigt, die komplexen genetischen Pfade der Makrophagenbiologie abzuhören und Modelle für bestimmte Krankheitszustände zu generieren. Eine standardistische Quelle menschlicher Makrophagen, die dem riesigen Arsenal genetischer Manipulationstechniken zugänglich ist, wäre daher ein wertvolles Werkzeug auf diesem Gebiet. Wir präsentieren ein optimiertes Protokoll, das die Erzeugung von Makrophagen aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in vitro ermöglicht. Diese iPSC-abgeleiteten Makrophagen (iPSC-DMs) drücken menschliche Makrophagenzell-Oberflächenmarker aus, einschließlich CD45, 25F9, CD163 und CD169, und unser livezelliger Bild-Funktionstest zeigt, dass sie eine robuste phagozytische Aktivität aufweisen. Kultivierte iPSC-DMs können in verschiedenen Makrophagenzuständen aktiviert werden, die durch Zugabe von LPS und IFNg, IL4 oder IL10 eine veränderte Genexpression und phagozytische Aktivität anzeigen. Somit bietet dieses System eine Plattform, um menschliche Makrophagen mit genetischen Veränderungen zu erzeugen, die bestimmte menschliche Krankheiten modellieren und eine Quelle von Zellen für das Arzneimittelscreening oder die Zelltherapie zur Behandlung dieser Krankheiten.
Introduction
Embryonale Stammzellen (ESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) stellen eine sich selbst erneuernde Zellquelle dar, die differenziert werden kann, um Zellen aller drei Keimschichtlinien zu produzieren. Technologien, die die genetische Manipulation menschlicher pluripotenter Stammzellen (PSCs) ermöglichen, wie Z.B. Zinkfingernuklease, TALENS und CRISPR-Cas9, haben die medizinische Forschung1,2,3,4revolutioniert. Die genetische Manipulation menschlicher PSCs ist eine besonders attraktive Strategie, wenn die primäre Zelle von Interesse schwer zu erweitern und/oder invitro zu erhalten ist, oder schwierig zu manipulieren ist, wie es bei Makrophagen5,6,7,8,9der Fall ist. Da menschliche iPSCs aus jeder somatischen Zelle abgeleitet werden können, umgehen sie die ethischen Beschränkungen im Zusammenhang mit ESCs und bieten eine Strategie für die Bereitstellung personalisierter Medizin. Dazu gehören patientenspezifische Krankheitsmodellierung, Arzneimitteltests und autologe Zelltherapie mit einem reduzierten Risiko für Immunabstoßung und Infektion6,8,10,11.
Protokolle, die die Erzeugung von Makrophagen aus iPSCs beschreiben, bestehen aus einem dreistufigen Prozess, der Folgendes umfasst: 1) Erzeugung von embryoiden Körpern; 2) Entstehung hämatopoetischer Zellen in Suspension; 3) Terminal Makrophagen Reifung.
Die Bildung dreidimensionaler Aggregate, sogenannte embryoiden Körper (EBs), leitet eine Differenzierung von iPSCs ein. Knochenmorphogenetisches Protein (BMP4), Stammzellfaktor (SCF) und vaskulärer endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) werden hinzugefügt, um die Mesoderm-Spezifikation voranzutreiben und entstehende hämatopoetische Zellen7,8,9,11,12zu unterstützen. Die Differenzierungszellen innerhalb der EBs initiieren auch die Aktivierung endogener Signalwege wie Wnt und Activin. Einige Differenzierungsprotokolle durchlaufen nicht die Phase der EB-Bildung. In diesen Fällen werden Wnt- und Activin-Signalregler, wie rekombinantes menschliches Activin A und/oder Chiron, den differenzierenden iPSCs in einem monolayer-Format13,14,15hinzugefügt. Hier konzentrieren wir uns auf ein Protokoll, das EB-Bildung verwendet. Für den zweiten Schritt der Differenzierung werden EBs auf eine aufklebende Oberfläche plattiert. Diese angeschlossenen Zellen werden dann Zytokinen ausgesetzt, die die Entstehung von Suspensionszellen fördern, die hämatopoetische und myeloide Vorläufer enthalten. In diesen In-vitro-Kulturbedingungen unterstützt Interleukin-3 (IL3) wahrscheinlich die hämatopoetische Stammprogenitorzellbildung und Proliferation16,17, sowie myeloische VorläuferProliferation und Differenzierung18. Makrophagenkolonie stimulierender Faktor (CSF1) unterstützt die Produktion von myeloischen Zellen und ihre Differenzierung zu Makrophagen19,20. Während der dritten Stufe der Differenzierung werden diese Suspensionszellen in Gegenwart von CSF1 kultiviert, um die terminale Makrophagenreifung zu unterstützen.
Die Differenzierung menschlicher iPSCs in Makrophagen in vitro imitiert die frühe Welle der Makrophagenproduktion während der Entwicklung. Geweberesidente Makrophagen werden während der Embryogenese festgestellt und haben eine ausgeprägte Entwicklungslinie von erwachsenen Monozyten. Mehrere Studien haben gezeigt, dass iPSC-DMs eine Gensignatur haben, die eher mit fetalen, von Leber abgeleiteten Makrophagen vergleichbar ist als von Blut abgeleiteten Monozyten, was darauf hindeutet, dass iPSC-DMs eher mit geweberesidenten Makrophagen vergleichbar sind. iPSC-DMs drücken höhere Mengen an Genen aus, die für die Sekretion von Proteinen kodieren, die an der Gewebeumgestaltung und Angiogenese beteiligt sind, und drücken niedrigere Ebenen von Genen aus, die für die proinflammatorische Zytokinsekretion und Antigenpräsentationsaktivitäten kodieren21,22. Darüber hinaus haben iPSC-DMs eine analoge Transkriptionsfaktoranforderung zu der von geweberesidenten Makrophagen23,24. Mit Knockout-iPSC-Zelllinien, die bei den Transkriptionsfaktoren RUNX1, SPI1 (PU.1) und MYB mangelhaft sind, zeigten Buchrieser et al. dass die Generierung von iPSC-DMs SPI1 und RUNX1-abhängig, aber MYB unabhängig ist. Dies deutet darauf hin, dass sie transkriptional ähnlich wie Dotter-Sac abgeleitete Makrophagen sind, die während der ersten Welle der Hämatopoese während der Entwicklung23erzeugt werden. Daher ist es weithin anerkannt, dass iPSC-DMs ein geeigneteres Zellmodell darstellen, um geweberesidente Makrophagen wie Mikroglia14,,25 und Kupffer-Zellen11zu untersuchen, und eine wünschenswertere Quelle von Zellen, die möglicherweise in Therapien zur Reparatur von Geweben verwendet werden könnten. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass Makrophagen, die in vitro aus Maus-ESCs hergestellt wurden, bei der Linderung der Fibrose in einem CCl4-induzierten Leberverletzungsmodell in vivo11wirksam waren. Darüber hinaus waren diese ESC-abgeleiteten Makrophagen effizienter als Knochenmark-abgeleitete Makrophagen bei der Wiederbesiedlung von Kupffer-Zellkompartimenten, die von Makrophagen mit liposomalem Clodrat11 bei Mäusen erschöpft waren.
Hier beschreiben wir serum- und feederfreie Protokolle für die Wartung, das Einfrieren und das Auftauen menschlicher iPSCs sowie für die Differenzierung dieser iPSCs in funktionale Makrophagen. Dieses Protokoll ist dem von Van Wilgenburg et al.12beschriebenen sehr ähnlich, mit geringfügigen Änderungen, einschließlich: 1) iPSC-Wartungsmedien; 2) ROCK-Inhibitor wird nicht in der EB-Bildungsstufe verwendet; 3) Ein mechanischer Ansatz anstelle eines enzymatischen Ansatzes wird verwendet, um einheitliche EBs aus iPSC-Kolonien zu erzeugen; 4) Die Methode für eb Ernte und Vergoldung ist unterschiedlich; 5) Suspensionszellen werden 2x pro Woche geerntet, anstatt wöchentlich; und 6) Geerntete Suspensionszellen werden unter CSF1 für die Makrophagenreifung für 9 Statt 7 Tage kultiviert. Wir beschreiben auch Protokolle zur Charakterisierung des iPSC-abgeleiteten Makrophagen-Phänotyps und der Funktion, einschließlich Analysen für Genexpression (qRT-PCR), Zelloberflächenmarkerexpression (Durchflusszytometrie) und funktionelle Assays zur Beurteilung von Phagozytose und Polarisation.
Protocol
HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt. Medien sollten für die Zellkultur bei 37 °C liegen. Medien und Reagenzien, die im Differenzierungsprotokoll verwendet werden, müssen steril sein.
1. Menschliche iPSC Linie Auftauen und Wartung
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Bereiten Sie das Zellwartungsmedium, Wachstumsfaktoren und andere Reagenzien vor.
- Bereiten Sie hESC-serumfreie Medien (hESC-SFM; siehe Tabelle der Materialien) vor, indem Sie Dulbeccos modifizierten Eagle medium-F12 (DMEM/F12) mit hESC-Ergänzung, 1,8% w/v Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 mM 2-Mercaptoethanol ergänzen.
- Bereiten Sie die humane Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor-(bFGF)-Lagerlösung (10 g/ml) vor, indem Sie bFGF in einer sterilen 0,1% humanen Serumalbumin (HSA)-Phosphat-gepufferten Kochstofflösung (PBS) auflösen. Verteilen Sie die Lagerlösung als 200 L Aliquots in Kryoröhren. Lagerlösungen können bis zu einem Jahr bei -20 °C gelagert werden. Nach dem Auftauen kann der Vorrat bFGF 7 Tage lang bei 4 °C gelagert werden.
- Bereiten Sie Rho-Kinase-Hemmer (ROCK-Hemmer)-Y27632-Stammlösung (1 mg/ml) vor, indem Sie sie in sterilem Wasser auflösen. Verteilen Sie die Lagerlösung als 50 L Aliquots in Kryoröhren. Lagerlösungen können bis zu einem Jahr bei -20 °C gelagert werden. Nach dem Auftauen kann der Rock-Hemmer 7 Tage lang bei 4 °C gelagert werden.
- Verdünntes Stammzellsubstrat (siehe Materialtabelle) 1:50 in Dulbeccos Phosphatgepufferte Saline mit Kalzium und Magnesium.
- Legen Sie die verdünnte Stammzellsubstratlösung auf Kulturplatten, so dass das Endvolumen pro Oberfläche 78 l/cm2beträgt. Um den Brunnen einer 6-Well-Platte zu beschichten, fügen Sie 750 l Lösung hinzu.
- Inkubieren Sie die beschichtete Platte für 1 h in einer humierten Atmosphäre bei 37 °C und 5%CO2.
- Aspirieren Sie die Stammzellsubstratbeschichtung und fügen Sie 1 ml hESC hinzu, ergänzt durch 20 ng/mL bFGF und 10 'M ROCK Inhibitor.
- Um eine Durchstechflasche mit gefrorenen menschlichen iPSC-Zellen aufzutauen, inkubieren Sie die Durchstechflasche bei 37 °C, bis sie aufgetaut ist, und übertragen Sie die Zellen in 5 ml hESC-SFM-Medien.
- Zentrifugenzellen bei 100 x g für 3 min.
- Resuspend in 0,5 ml hESC-SFM ergänzt mit 20 ng/mL bFGF und 10 'M ROCK Inhibitor. Übertragen Sie Zellen auf den beschichteten Brunnen.
- Kulturzellen für 24 h.
- Medien auf hESC-SFM umstellen, ergänzt mit 20 ng/mL bFGF, jedoch ohne ROCK-Hemmer.
- Um die Zellen zu erhalten, ändern Sie das Medium jeden Tag, bis die Zellen 80% Konfluenz erreichen. Undifferenzierte iPSCs brauchen in der Regel 3–4 Tage, um 80% Konfluenz zu erreichen.
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Sobald die Zellen 80% Konfluenz erreicht haben, Durchgangszellen.
- Ersetzen Sie das verbrauchte Kulturmedium durch 1,5 ml frischen hESC-SFM, ergänzt durch 20 ng/ml bFGF (ohne ROCK-Hemmer).
- Halten Sie das Kulturgefäß in einer Hand und rollen Sie ein Einweg-Zellpassaging-Werkzeug (siehe Materialtabelle)über die Platte in eine Richtung (d. h. von links nach rechts). Alle Klingen in der Rolle müssen die Platte berühren. Halten Sie gleichmäßigen Druck während des Walzens aufrecht.
- Wiederholen Sie das Rollen in die gleiche Richtung, bis der gesamte Brunnen abgedeckt wurde.
- Kulturgefäß um 90° drehen und rollen, wie in den Schritten 1.12.2 und 1.12.3 beschrieben.
- Verwerfen Sie das Passaging-Tool nach der Verwendung.
- Mit einer sterilen Pipette, verwenden Sie Medien im Brunnen, um geschnittene Kolonien zu vertreiben.
- Übertragen Sie Zellen im Verhältnis 1:4 auf vorbeschichtete Stammzellsubstratbrunnen (Schritte 1,2–1,5) auf ein endgültiges Medienvolumen (hESC -SFM ergänzt mit 20 ng/ml bFGF) von 1,5 ml pro Brunnen.
2. Menschliche iPSC Linie Einfrieren
- Um iPSC-Zellen einzufrieren, ersetzen Sie die Medien eines 70 %–80%igen Welles einer 6-Well-Platte durch hESC-SFM, ergänzt durch 20 ng/mL bFGF und 10 M ROCK-Hemmer.
- Gut bei 37 °C und 5%CO2 für 1 h inkubieren.
- Schneiden Sie Kolonien mit dem Zellpassaging-Werkzeug und legen Sie dislodged Kolonien in ein Zentrifugenrohr.
- Zentrifugenzellen bei 100 x g für 3 min.
- Aspirieren Sie die Medien und setzen Sie die Zellen in 1 ml Zellkryokonservierungsmedien wieder aus (siehe Tabelle der Materialien).
- Teilen Sie die Zellen gleichmäßig in zwei Kryovials und legen Sie sie bei 4 °C in einen vorgekühlten Zellkryokonservierungsbehälter.
- Zellen bei -80 °C für 24–48 h lagern.
- Durchstechflaschen entweder in einen Gefrierschrank von -135 °C oder in einen Flüssigstickstofftank übertragen.
3. Menschliche iPSC-Differenzierung zu Makrophagen
HINWEIS: Eine schematische Zusammenfassung des Makrophagendifferenzierungsprotokolls ist in Abbildung 1dargestellt.
- Vorbereitung von Zelldifferenzierungswachstumsfaktoren und anderen Reagenzien
- Bereiten Sie hESC-SFM-Medien vor (siehe vorherigen Abschnitt).
- Bereiten Sie 0,1% w/v Lösung von Schweinegelatine durch Lösen der Gelatine in steriles Wasser vor. Die Gelatinelösung kann bis zu 2 Jahre bei 4 °C gelagert werden.
- Bereiten Sie die humane BMP4-Lagerlösung (25 g/ml) vor, indem Sie BMP4 in eine 4 mM-Chlorwasserstofflösung (HCl)-0,2% BSA PBS auflösen. Verteilen Sie die Lagerlösung als 50 L Aliquots in Kryoröhren. Lagerlösungen können bis zu einem Jahr bei -20 °C gelagert werden. Nach dem Auftauen kann bMP4 5 Tage lang bei 4 °C gelagert werden.
- Bereiten Sie die humane VEGF-Lagerlösung (100 g/ml) vor, indem Sie VEGF in eine 0,2%ige BSA-PBS-Lösung auflösen. Verteilen Sie die Lagerlösung als 10 L Aliquots in Kryoröhren. Lagerlösungen können bis zu einem Jahr bei -20 °C gelagert werden. Nach dem Auftauen kann VEGF 7 Tage lang bei 4 °C gelagert werden.
- Bereiten Sie die menschliche SCF-Lagerlösung (100 g/ml) vor, indem Sie SCF in eine 0,2%ige BSA-PBS-Lösung auflösen. Verteilen Sie die Lagerlösung als 5 L Aliquots in Kryoröhren. Lagerlösungen können bis zu einem Jahr bei -20 °C gelagert werden. Nach dem Auftauen kann der SCF-Lager bei 4 °C für 10 Tage gelagert werden.
- Bereiten Sie die menschliche IL3-Lagerlösung (10 g/ml) vor, indem Sie IL3 in eine 0,2%ige BSA-PBS-Lösung auflösen. Verteilen Sie die Lagerlösung als 500 L Aliquots in Kryoröhren. Lagerlösungen können bei -20 °C bis zu 2 Jahren gelagert werden. Nach dem Auftauen kann der SCF-Lager bei 4 °C für 15 Tage gelagert werden.
- Bereiten Sie die menschliche CSF1-Lagerlösung (10 g/ml) vor, indem Sie CSF1 in eine 0,2%ige BSA-PBS-Lösung auflösen. Verteilen Sie die Lagerlösung als 1 ml Aliquots in Kryoröhren. Lagerlösungen können bei -20 °C bis zu 2 Jahren gelagert werden. Nach dem Auftauen kann der SCF-Lager bei 4 °C für 15 Tage gelagert werden.
- Bereiten Sie separate 10 g/ml-Stammlösungen von Interferon-Gamma (IFNg), Interleukin 4 (IL4) und Interleukin 10 (IL10) vor, indem Sie sich in 0,2% BSA-PBS-Lösungen auflösen. Bereiten Sie Lipopolysaccharid (LPS) auf eine Lagerlösung von (100 U/ml) vor, indem Sie sich in eine 0,2%ige BSA-PBS-Lösung auflösen. Verteilen Sie jede Lagerlösung als 35 L Aliquots. Bei -80 °C bis zu 2 Jahren lagern. Nach dem Auftauen können die Vorräte 7 Tage lang bei 4 °C gelagert werden.
- Stadium 1: Erzeugung von embryoiden Körpern (Tag 0– Tag 3)
- Am Tag 0 2,25 ml Stage 1 Medien (hESC-SFM ergänzt mit 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF und 20 ng/mL SCF) in zwei Bohrungen einer ultralow Befestigung 6 Well Platte.
- Ersetzen Sie Wartungsmedien eines 80% konfluenten Brunnens von iPSCs in einer 6-Well-Platte mit 1,5 ml Stage 1-Medien.
- Schneiden Sie Kolonien mit dem Zellpassaging-Werkzeug und übertragen Sie geschnittene Kolonien mit einer Pipette in die beiden Brunnen einer ultralow Befestigung 6 Brunnenplatte (siehe Tabelle der Materialien).
- Bringen Sie am 2. Tag Zytokine mit 0,5 ml hESC-SFM-Medien auf eine Endkonzentration von 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF und 20 ng/ml SCF.
HINWEIS: IPSC-Kolonien werden zu EBs (Abbildung 2A).
- Stufe 2: Entstehung hämatopoetischer Zellen in Suspension
- An Tag 4 4 Brunnen einer 6 Brunnengewebe-Kulturplatte mit 0,1% w/v Gelatine beschichten und mindestens 10 min inkubieren.
- Entfernen Sie Gelatine und fügen Sie 2,5 ml Stage 2-Medien hinzu (X-VIVO15 ergänzt mit 100 ng/mL CSF1, 25 ng/mL IL-3, 2 mM glutamax, 1% Penicillin-Streptomycin und 0,055 mM 2-Mercaptoethanol).
- Sammeln Sie geformte EBs in einem 50 ml Zentrifugenrohr und lassen Sie sie sich durch Schwerkraft am Boden des Rohres niederlassen. Sorgsam die Medien ansaugen.
- EBs in 2 ml Stage 2-Medien aussetzen.
- 10–15 EBs (nicht mehr als 15) in einen gelatinebeschichteten Brunnen mit 2,5 ml Stage 2-Medien übertragen.
- EBs bei 37 °C und 5%CO2-Luft inkubieren.
- Wechseln Sie die Medien auf plattierten EBs alle 3 bis 4 Tage für 2-3 Wochen.
- Nach 2-3 Wochen beginnen die EBs, nicht haftende hämatopoetische Zellen in Suspension freizusetzen.
HINWEIS: Dieser Zeitraum der Suspensionszellfreigabe kann variieren und ist zelllinienabhängig. Zellen in dieser Suspension können geerntet und zu Makrophagen gereift werden (siehe Stufe 3) (Abbildung 2A).
- Stufe 3: Terminalmakrophagenreifung
- Sammeln Sie suspension hämatopoetische Zellen und füllen Sie Medien (Stufe 2 Medien) auf EB-Platte auf.
- Zentrifugensuspensionszellen bei 200 x g für 3 min.
- Suspensionszellen in Stage-3-Medien aussetzen (X-VIVO15 ergänzt durch 100 ng/mL CSF1, 2 mM Glutamax und 1% Penicillin-Streptomycin).
- Platte gesammelt und gesponnen Zellen auf unbehandelten Kunststoff 10 cm bakteriologische Platten (10 ml) oder unbeschichtet 6 Well Gewebekulturplatten (3 ml) bei einer Dichte von 0,2 x 106 Zellen/ml.
- Bewahren Sie Zellen in Stage 3-Medien für 9–11 Tage auf und wechseln Sie alle 5 Tage die Medien.
HINWEIS: Die Schritte 3.4.1–3.4.5 ab Stufe 3 können alle 3–4 Tage wiederholt und Suspensionszellen bis zu 3 Monate lang von der ursprünglichen EB-Platte geerntet werden.
- Makrophagenpolarisation
- Um Makrophagen für einen M(LPS + IFNg) Phänotyp zu aktivieren, stimulieren Sie die Zellen mit LPS (Endkonzentration: 100 ng/ml) und IFNg (Endkonzentration: 10 U/ml) für 48 h. Um Zellen zu einem M(IL4)-Phänotyp zu aktivieren, stimulieren Sie Zellen mit IL4 (Endkonzentration: 20 ng/ml). Um einen M(IL10)-Phänotyp zu aktivieren, stimulieren Sie Makrophagen mit IL10 (Endkonzentration: 5 ng/ml).
4. iPSC-abgeleitete Makrophagen-Qualitätskontrolle
- Bestimmen Sie die Anzahl der hämatopoetischen Suspensionszellen, die pro 6 Well-Platte von EBs produziert werden, indem Sie sie mit einem Hämatozytometer zählen.
- Bewerten Sie die Makrophagenmorphologie wie zuvor beschrieben (z. B. kommerzielle Kit-Färbung)8,9.
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Erkennen Sie die Expression makrophagenspezifischer Marker und Polarisationsmarker mithilfe von Genexpressionsanalysen und Durchflusszytometrie, wie zuvor beschrieben8,9.
- Für Durchflusszytometrie-Experimente an einem Brunnen einer 6-Well-Platte von Makrophagen, Ernten Sie Zellen durch Ansaugung ihrer Reifungsmedien, waschen Sie sie mit 2 ml PBS und inkubieren Sie sie mit 2 ml enzymfreier Zelldissoziationspuffer für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Pipette immer wieder rauf und runter, um Makrophagen zu lösen und zu ernten.
- Zähle Zellen mit einem Hämatozytometer und resuspendiere sie in 80 l einer 2% BSA, 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-PBS-Lösung.
- Fügen Sie 20 L MACS Human FC Blocker hinzu.
- 20 min auf Eis bebrüten und vor Licht schützen.
- Fügen Sie ein geeignetes Volumen von 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS Lösung hinzu, um die Zellkonzentration auf 1 x 106 Makrophagen/ml zu bringen.
- Stain 1 x 105 Zellen in 100 l von 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS Lösung mit entsprechendem Antikörper (siehe HINWEIS unten) und inkubieren für 15 min bei RT vor Licht geschützt.
- Waschen Sie 1x mit mindestens 100 l von 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS.
- Setzen Sie die Zellen in 200 l von 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS aus.
- Fügen Sie 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, verdünnt 1:1,000) als lebend-toten Farbstoff hinzu. Inkubieren Sie 3 Min.
- Für Strömungszytometrie-Analysen, Gate auf der Hauptpopulation, dann einzelne Zellen, und dann lebende Zellen. Bei der Population der lebenden Zellen ist der makrophagenbezogene Markerausdruck offensichtlich (Abbildung 3A).
HINWEIS: Antikörper sollten für jede Zelllinie, die zum Ableiten von Makrophagen verwendet wird, sorgfältig titriert werden. Antikörper, die im Ergebnisabschnitt vorgestellt werden, sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt. Der Verdünnungsfaktor für SFCi55-abgeleitete Makrophagen-Flow-Zytometrie-Assays ist ebenfalls enthalten.
5. Hoher Durchsatz Phagozytose Assay
- Ernte iPSC-abgeleitete Makrophagen (iPSC-DMs) durch Ansaugung der Medien, Hinzufügen von eiskalten enzymfreien Zelldissoziationspuffer nund inkubieren für 5 min. Sammeln Sie Makrophagen durch wiederholtePipettieren.
- Platte 8 x 104 iPSC-DMs in einem Brunnen einer bildgebenden Gewebekultur Grad 96 WellPlatten (z.B. Cellcarrier Ultra, Perkin Elmer) mindestens 2 Tage vor der Bildgebung mit hohem Durchsatz in 200 L Stage-3-Medien.
- Bereiten Sie pHrodoGreen Zymosan-A Biopartikel vor, indem Sie eine Durchstechflasche in 2 ml PBS ("Lösung 1") wieder aufhängen. Vortex-Lösung für 10 s.
- Verdünnen Sie die 2 ml PBS-Perlenaufhängung 1:5 mit mehr PBS ("Lösung 2").
- Sonicate Solution 2 für 8 s und Wirbellösung für 10 s. Halten Sie sie bei 4 °C. Diese Lösung wird in Schritt 5.11 verwendet.
- Entfernen Sie das Medium auf plattierten iPSC-DMs und waschen Sie es mit PBS.
- Stain iPSC-DMs mit einer PBS-Lösung mit Hoechst 33342 verdünnt 1:20. 20 min bei 37 °C inkubieren.
- Waschen Sie Zellen mit PBS.
- Stain mit einer PBS-Lösung, die tiefrote Plasmamembran-Färbung enthält, 1:1.000 verdünnt (siehe Materialtabelle). 30 min bei 37 °C inkubieren.
- Waschen Sie Zellen mit PBS.
- Fügen Sie 100 L Der Perlenlösung, die bei 4 °C gehalten wird, zu jedem Brunnen von iPSC-DMs hinzu. Die Platten sind nun bildbereit.
- Erstellen Sie die Platte mit einem bildgebenden System mit hohem Inhalt und erfassen Sie drei oder mehr Felder im Brunnen, um eine gute Darstellung des Brunnens zu erhalten.
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Quantifizieren Sie Phagozytose mit Columbus-Software (High-Content Imaging Analysis System Software). Für eine eindeutige Bildbatchanalyse kann ein spezifischer Algorithmus entwickelt werden:
- Messen Sie die blaue Intensität und definieren Sie in der Software, dass blaues Signal die Kerne anzeigt.
- Messen Sie die rote Intensität und definieren Sie in der Software, dass rotes Signal das Zytoplasma anzeigt.
- Definieren Sie, dass Kern und Zytoplasma zusammen einer Zelle entsprechen.
- Messen Sie die grüne Intensität in den Zellen und legen Sie einen strengen Grenzwert/Schwellenwert fest, um eine Zelle als phagozytisch zu betrachten.
- Quantifizieren Sie die phagozytische Zellfraktion und den durchschnittlichen phagozytischen Index pro Zelle. Da die Perlenfarbintensität proportional zur Anzahl der Perlen ist, kann die phagozytische Aktivität anhand der Anzahl der aufgenommenen Perlen gemessen werden.
- Wenden Sie den Algorithmus/die Pipeline auf alle Bilder in jedem Feld und zu allen erfassten Zeitpunkten an, sodass ein robuster und unvoreingenommener Batch-Ansatz zur Bestimmung der phagozytischen Fähigkeiten von Zellen möglich ist.
HINWEIS: Columbus ist eine High-Content-Analyse-Software, die Zellsegmentierungsanalyse für Zellphänotypisierung und Funktionstests bietet.
Representative Results
Differenzierungsprogression, Makrophagenzahl und Morphologie
Die vorgestellten Ergebnisse stammen aus der Differenzierung der sFCi55 humanen iPSC-Linie, die in einer Reihe von Studien beschrieben und verwendet wurde8,9,10,26. Der Prozess der IPSC-Differenzierung hin zu Makrophagen könnte durch optische Mikroskopie überwacht werden. iPSC-Kolonien, embryoide Körper (EBs), hämatopoetische Suspensionszellen und reife Makrophagen waren morphologisch verschieden (Abbildung 2A). Die reife Makrophagenmorphologie könnte durch Färbung zentrifugierter Zytospinpräparate weiter validiert werden. IPSC-abgeleitete Makrophagen waren groß und hatten einzelne kleine ovale Kerne und reichlich Zytoplasma mit vielen Vesikeln (Abbildung 2B).
Die ersten 2 Wochen der hämatopoetischen Suspensionszellen ernten (Tage 16–28) einer vollen 6-Well-Platte EBs enthalten im Durchschnitt 2,59 x 106 x 0,54 Zellen. Nach Tag 28 wurden durchschnittlich 4,64 x 106 x 0,94 Suspensionszellen pro 6 Wellplatten von EBs hergestellt. Ab Tag 80 begann die Zahl der Suspensionszellen zu sinken, als die EBs erschöpft waren (Abbildung 2C). Es wird empfohlen, das Differenzierungsprotokoll zu stoppen, nachdem die Zahlen unter 3 x 106 Vorläufer pro Ernte pro 6 Wellplatte von EBs fallen.
IPSC-abgeleitete Makrophagen-Zelloberflächen-Marker-Expression
Die Durchflusszytometrie ist nach wie vor die häufigste Methode zur Beurteilung des Phänotyps menschlicher Makrophagen. Die Gating-Strategie zur Bewertung der Zelloberflächenmarker-Expression besteht darin, die Hauptgesamtheit von Zellen mithilfe physikalischer Parameter wie Größe und Granularität zu verankern, gefolgt von dem Gating einzelner Zellen und dann der lebendigen Zellen(Abbildung 3A). Ausgereifte iPSC-abgeleitete Makrophagen sollten den Lineage-Marker CD45 und den Makrophagen-Reifungsmarker 25F9 ausdrücken und für Monozyten/Unreife Makrophagenmarker CD93 negativ sein. Dies steht im Einklang mit unseren Beobachtungen (Abbildung 3A). IPSC-abgeleitete Makrophagen waren auch positiv für lineage myeloid markers CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163 und CD169 (Abbildung 3B). Sie waren positiv für den Immunmodulationsmarker CD86, und ein kleiner Teil von ihnen drückte Chemokin-Rezeptoren CX3CR1, CCR2, CCR5 und CCR8 im naiven Zustand aus (Abbildung 3B). Die Parzellen stammen aus Daten, die zuvor von unserem Labor8veröffentlicht wurden.
iPSC-abgeleitete Makrophagenphagozytose und Polarisation
Eines der Wichtigsten Merkmale von Makrophagen in der Wirtsabwehr und Gewebehomöostase ist ihre Fähigkeit, Phagozytose-Erreger, apoptotische Zellen, und Schmutz27. Die Rate der Phagozytose ist eng mit bestimmten phänotypischen Zuständenverbunden 28. Zur Beurteilung der phagozytischen Fähigkeit von iPSC-DM haben wir ein hochauflösendes Bildgebungssystem8,9,11 verwendet, das das PerkinElmer Operettenmikroskop und pHrodo Zymosan Biopartikel (pH-empfindliche Farbstoffkonjugate) verwendet. Biopartikel waren nicht fluoreszierend, wenn sie den Kulturen zugesetzt wurden (Abbildung 4A), aber fluoresciertehelles Grün im intrazellulären sauren pH -Wert (Abbildung 4B). Das live-bildgebende Operettenmikroskop wurde alle 5 min nach Zugabe von Perlen für eine Gesamtzeit von 175 min abgestellt. Eine Pipeline mit hohem Durchsatz und unvoreingenommener Bildanalyse wurde dann in der Columbus-Plattform verwendet, um die Aktivität in Bezug auf die phagozytische Fraktion zu quantifizieren, die den Anteil der Zellen darstellt, die phagozytosierte Perlen und der phagozytische Index darstellen, der ein Maß für die Anzahl der Perlen ist, die jede Zelle aufgenommen hat.
Makrophagen können je nach Umwelthinweise reagieren und ihren Phänotyp ändern. Um ihre Reaktions- und Veränderungsfähigkeit bei Umgebungsreizen zu beurteilen, können iPSC-DMs mit LPS und IFNg, IL4 oder IL10 behandelt werden. Nach 48 h Behandlung veränderten sie den Phänotyp, hierin als M (LPS + IFNg), M (IL4) und M (IL10) bzw.29bezeichnet. Die Genexpressionsanalyse ist ein nützliches Werkzeug, um den Polarisationsstatus von Makrophagen zu testen. Bei LPS- und IFNg-Stimulation, Makrophagen upreguliert mRNA-Expression der Gene CD40, VCAM1,und TNFA (Abbildung 5A). Bei IL4-Stimulation, Zellen upreguliert mRNA-Expression der Gene CD68, CD84und MRC1 (Abbildung 5B). Nach IL10 Stimulation, iPSC-DMs upregulated Expression von MRC1 (Abbildung 5B). In Bezug auf die Phagozytose zeigten Makrophagen, die mit LPS + IFNg oder IL4 behandelt wurden, einen signifikant geringeren Prozentsatz phagozytischer Zellen im Vergleich zu naiven Makrophagen. iPSC-DMs, die mit IL10 behandelt wurden, zeigten einen erhöhten Prozentsatz an phagozytischen Zellen und phagozytischen Indizes (Abbildung 5C–E).
Abbildung 1: Grafische Zusammenfassung der iPSC-Differenzierung zu ausgereiften funktionellen Makrophagen. Diagramm mit Biorender gezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: iPSC-Differenzierung in Richtung Makrophagen und iPSC-DM-Zahl und Morphologie. (A) Hellfeldbilder aus (v.l.n.r.): eine IPSC-Kolonie, embryoide Körper (EBs), geerntete Suspensionszellen und ausgereifte Makrophagen. Skalenbalken = 100 m. (B) Bild von Makrophagen-Zytospins, gefärbt mit Kwik-diff-Kit. Skalenbalken = 25 m. (C) Anzahl der Suspensionszellen, die pro Ernte pro 6 Brunnenplatte EBs gesammelt werden. Plot zeigt Mittelwert + SEM; (n = 6 biologisch unabhängige Experimente). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Makrophagen-Zell-Oberflächenmarker-Phänotyp. (A) Gating-Strategie zur Analyse ausgereifter iPSC-abgeleiteter Makrophagen. Einzelne, lebende Zellen wurden abgezäutt und dann auf die Expression der Zelloberflächenmarker CD45, CD93 und 25F9 analysiert. Die Tore für die Zelloberflächenmarker wurden mit Fluoreszenz minus eins (FMO) gezeichnet. (B) Repräsentative Durchflusszytometrie-Histogramme für einzelne Flecken von iPSC-DMs (blau) und Isotyp-Kontrollen (grau) für Linien- und Myeloidmarker, Immunmodulationsmarker, Reifungsmarker und Chemokinrezeptoren. Die Parzellen sind repräsentativ für n = 5 biologisch unabhängige Experimente für alle Linien und myeloischen Marker, mit Ausnahme von CD105 und CD206 (n = 3); Reifungsmarker (n = 5); Immunmodulationsmarker (n = 3); und Chemokinrezeptoren (n = 3). Plots verwenden zuvor veröffentlichte Daten8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: IPSC-DM Polarisation und Phagozytose-Assays. Repräsentative Bilder von iPSC-DMs (A) unmittelbar nach dem Zusatz von Zymosan pHrodo grünen Perlen und (B) 175 min nach dem Zusatz von Perlen. Blau stellt die Zellkerne dar; rot stellt das Zytoplasma der Zellen dar. Grün steht für aufgenommene Perlen (Scale bar = 20 m). (C) Anteil phagozytischer Makrophagen und (D) phagozytischer Index/grüne Intensität pro phagozytischer Makrophagen im Zeitverlauf im naiven Zustand (n = 6 biologisch unabhängige Experimente). Plots zeigen den Mittelwert und die Balken stellen das SEM dar. Plots verwenden zuvor veröffentlichte Daten8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Auswertung von iPSC-DM Polarisationszuständen. Relative Quantifizierung von RT-PCR-Analysen naiver und polarisierter iPSC-DMs zur Beurteilung der Expression von (A) M(LPS+IFN); (B) M(IL4) und M (IL10)-assoziierte Gene (n = 6 biologisch unabhängige Experimente; Die einseitigen Vergleiche von ANOVA und Holm-Sidak nach dem Test. Polarisierte Gruppen wurden nur statistisch mit der naiven Gruppe verglichen). Plots zeigen den Mittelwert an, und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. ND in Plots = Transkript nicht erkannt. Die Daten für diese Diagramme wurden zuvor veröffentlicht8. (C) Repräsentative Bilder von iPSC-DMs 175 min nach Zugabe von pHrodo-Perlen von iPSC-DMs, die mit (von links nach rechts) behandelt wurden: keine Zytokine, LPS+IFN-Y, IL-4 und IL-10 (Scale bar = 20 m). (D) Anteil phagozytischer Makrophagen und (E) phagozytischer Index/grüne Intensität pro phagozytischer Makrophagen in naiven und polarisierten Makrophagenbehandlungen 175 min nach Zugabe von Perlen (n = 12 biologisch unabhängige Experimente, einseitige ANOVA und Holm-Sidaks mehrfache Vergleiche nach dem Test). Polarisierte Gruppen wurden nur statistisch mit der naiven Gruppe verglichen). Plots zeigen den Mittelwert und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll zur Erzeugung von iPSC-DMs ist robust und ermöglicht die Produktion einer großen Anzahl homogener Zellen aus einer relativ kleinen Anzahl von iPSCs. Nach der anfänglichen Differenzierung von ca. 1 x 106 iPSCs können die nachfolgenden Kulturen alle 4 Tage für bis zu 2–3 Monate geerntet werden, was zu einer Produktion von mindestens 6,5 x 107 Makrophagen in dieser Zeit führt. Diese in vitro-generierten menschlichen Makrophagen ähneln morphologisch primären menschlichen Makrophagen, drücken die wichtigsten Makrophagenzell-Oberflächenmarker aus und zeigen phagozytische Aktivität. Das Protokoll zur Makrophagendifferenzierung ist reproduzierbar und kann auf andere hiPSC- und hESC-Zelllinien angewendet werden, aber der genaue Zeitpunkt der ersten Ernte der Makrophagen-Vorläufer und die absolute Anzahl der Zellen, die erzeugt werden können, variiert zwischen iPSC-Linien.
Es wurde nachgewiesen, dass Makrophagen aus genetisch manipulierten iPSCs erzeugt werden können. So wurde beispielsweise eine Transgenkassette, bestehend aus dem fluoreszierenden Reporter ZsGreen unter der Kontrolle des konstituierenden CAG-Promotors, in den AAVS1-Lokus der SFCi55 iPSC-Linie eingeführt, und es wurde anschließend gezeigt, dass diese iPSC-Leitung in ZsGreen-exezierende Makrophagen8unterschieden werden konnte. Diese fluoreszierenden Makrophagen könnten in Zukunft verwendet werden, um die Migration und Stabilität therapeutischer Makrophagen in Krankheitsmodellen zu verfolgen. In einer anderen Studie wurden Makrophagen aus einer iPSC-Linie erzeugt, die genetisch manipuliert worden war, um einen Tamoxifen-induzierten Transkriptionsfaktor, KLF1, auszudrücken. Die Aktivierung von KLF1 in iPSC-abgeleiteten Makrophagen führte zur Produktion von Makrophagen mit einem Phänotyp, der mit Makrophagen der Erythroidinsel9vergleichbar ist. Potenziell könnte diese Strategie verwendet werden, um iPSC-abgeleitete Makrophagen genetisch in Phänotypen zu programmieren, die mit anderen gewebespezifischen Makrophagenpopulationen wie Kupffer-Zellen der Leber oder Langerhans-Zellen der Haut assoziiert sind. Dies wäre möglich, sobald die wichtigsten Transkriptionsfaktoren, die diese Zelltypen definieren, identifiziert werden.
In Bezug auf das Protokoll ist es sehr wichtig zu beachten, dass der Zustand der Startpopulation von iPSCs für eine erfolgreiche Differenzierung entscheidend ist. Menschliche iPSC-Kulturen können mit karyotypisch abnormalen Subpopulationen über mehrere Passagen überrannt werden, so dass eine robuste Kuration von iPSC-Beständen und großen Chargen-Master-Beständen, die einer Genomqualitätskontrolle unterzogen werden, empfohlen wird. In unseren Händen können die hier beschriebenen Wartungsprotokolle karyotypische iPSCs für bis zu 2 Monate in kontinuierlicher Kultur aufrechterhalten, aber dies kann für verschiedene Zelllinien und in verschiedenen Laboratorien variieren. Wenn Probleme auftreten, ist es ratsam, für jedes Differenzierungsexperiment eine frische Durchstechflasche mit undifferenzierten iPSCs zu verwenden. Darüber hinaus sollte die Ausgangskultur der undifferenzierten iPSCs nicht mehr als 80 % konfluent sein. In der EB-Beschichtungsphase sollten nur 10–15 EBs pro Brunnen einer 6 Brunnengewebekulturplatte plattiert werden, und es ist wichtig, dass diese EBs gleichmäßig über den Brunnen verteilt sind. Eine höhere Anzahl von EBs und/oder Klumpen von EBs in der Mitte des Brunnens hatte einen negativen Einfluss auf die Anzahl der erzeugten Makrophagen. Beim Auffüllen von Medien und der Ernte monozytenähnlicher Vorläufersuspensionszellen aus den EB-Kulturen ist vorsichtgeboten, um die Haftung von EBs an der Oberfläche der beschichteten Kulturplatten nicht zu stören. Die Anzahl der produzierten hämatopoetischen Suspensionszellen nimmt mit jeder Ernte allmählich zu, wobei die Produktion zwischen den Tagen 40–72 der Differenzierung optimal ist (Abbildung 2). Die Produktion sinkt nach Tag 68 schrittweise und die Platten neigen dazu, nach 2,5 Monaten auszuschöpfen, obwohl das genaue Timing je nach iPSC-Linie variieren kann.
Eine Einschränkung unseres Protokolls besteht darin, dass es nicht möglich war, die hämatopoetischen Suspensionszellen, die am Ende von Stufe 2 erzeugt wurden, kryokonservieren zu können. Protokolle, die auf der exogenen Aktivierung von WNT basieren, berichten über eine Rückgewinnungsrate von 40 % nach kryokonservierung, aber diese Protokolle melden nur eine Zellernte, so dass die absolute Anzahl der erzeugten Makrophagen niedrig ist30. Das hier beschriebene Protokoll, das über die Bildung von EBs eine endogene Signalisierung induzieren, kann zweiwöchentlich geerntet werden, was zu einem viel höheren Gesamtmakrophagenertrag führt.
Zusammenfassend stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von funktionellen iPSC-abgeleiteten Makrophagen vor. Die Einrichtung von In-vitro-Experimenten mit iPSC-abgeleiteten Makrophagen zur Untersuchung der Makrophagenbiologie in Gesundheit und Krankheit hat viele Vorteile gegenüber Experimenten mit Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDMs). Zu diesen Vorteilen gehören die einfache Zugänglichkeit des Materials (z. B. sind keine Spender erforderlich), sehr große Mengen an Makrophagen können produziert werden, und es ist machbar und relativ einfach, genetisch veränderte Makrophagen herzustellen. Darüber hinaus könnten iPSC-abgeleitete Makrophagen eine bessere Ressource für die Erforschung der geweberesidenten Makrophagenbiologie sein.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Wir danken Fiona Rossi und Claire Cryer für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie, Eoghan O'Duibhir und Bertrand Vernay bei der Mikroskopie. Diese Arbeit wurde von CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) und Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust PhD Studentship (A.M), MRC Precision Medicine Studentship (T.V.) finanziert. L.C. und J.W.P. wurden von Wellcome Trust (101067/Z/13/Z), Medical Research Council (MR/N022556/1) und COST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350010 | |
| Abtibody CD64-APC -CY7 | Biolegend | 305026 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody 25F9-EFLUOR 660 | Ebioscience | 15599866 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CCR2-PE-Cy7 | Biolegend | 357212 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CCR5 PE | Biolegend | 313707 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CCR8 PE | Biolegend | 360603 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD11b-PE | Biolegend | 301305 | Dilution factor: 1:50 |
| Antibody CD14-APC | Ebioscience | 10669167 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CD163-PE-CY7 | BIolegend | 333614 | Dilution factor: 1:25 |
| Antibody CD169-APC | Biolegend | 346007 | Dilution factor: 1:25 |
| Antibody CD206-PE | Biolegend | 321106 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD209-PE-CY7 | Biolegend | 3310114 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD274-PE-CY7 | Biolegend | 329718 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD43-PE | Ebioscience | 10854419 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD45-APC | Ebioscience | 15577936 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CD86-APC | Biolegend | 305412 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD93-PE | Ebioscience | 10804637 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CX3CR1-PE | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody HLA-DR-BV650 | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
| Antiboy CD115-PE | Biolegend | 347308 | Dilution factor: 1:40 |
| Cell Dissociation Buffer, enzyme free | Thermofisher | 13151014 | |
| Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS | Gibco | 13151014 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well | PerkinElmer | 6055302 | |
| CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain | Thermofisher | C10046 | Cryopreservation media |
| Cryostor CS10 | Sigma | C2874 | |
| CTS CELLstart Substrate | Invitrogen | A1014201 | Stem cell substrate |
| DAPI | Merck | D9542-1MG | Final concentration 1 μg/mL |
| DPBS, calcium, magnesium (500 mL) | Thermofisher | 14040091 | |
| FcR Blocking Reagent, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHG0021 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IFNY | Thermofisher | 14-8319-80 | |
| Human Serum Albuminum | Irvine Scientific | 9988 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli | Sigma | L2630 | |
| NucBlue (Hoechst33342) | Thermofisher | R37605 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis | Thermofisher | P35365 | |
| Porcine Skin Gelatin | Sigma | G9136 | |
| Recombinant Human BMP4 Protein | R&D | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human IL10 | Preprotech | 200-10 | |
| Recombinant Human IL3 | Preprotech | 200-03-10 | |
| Recombinant Human IL4 | Preprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100 μg | Biolegend | 574806 | |
| Recombinant Human VEGF Protein | R&D | 293-VE-010 | |
| Rock Inhibitor Y-27632 | Merck | SCM075 | |
| SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHC2111 | |
| StemPro hESC SFM | Thermofisher | A1000701 | |
| StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool | Thermofisher | 23181010 | |
| Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface | Greiner | 657970 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| X-Vivo 15 500 mL bottle | Lonza | BE02-060F |
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