Summary
Este protocolo descreve a geração robusta de macrófagos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, e métodos para sua caracterização subseqüente. A expressão do marcador de superfície celular, a expressão genética e os ensaios funcionais são usados para avaliar o fenótipo e a função desses macrófagos derivados do iPSC.
Abstract
Os macrófagos estão presentes na maioria dos tecidos vertebrados e compreendem populações de células amplamente dispersas e heterogêneas com diferentes funções. Eles são atores-chave na saúde e doenças, atuando como farócitos durante a defesa imunológica e mediando funções tróficas, de manutenção e reparo. Embora tenha sido possível estudar alguns dos processos moleculares envolvidos na função de macrófagos humanos, tem se mostrado difícil aplicar técnicas de engenharia genética a macrófagos humanos primários. Isso dificultou significativamente nossa capacidade de interrogar as complexas vias genéticas envolvidas na biologia dos macrófagos e de gerar modelos para estados específicos da doença. Uma fonte de macrófagos humanos que é favorável ao vasto arsenal de técnicas de manipulação genética forneceria, portanto, uma ferramenta valiosa neste campo. Apresentamos um protocolo otimizado que permite a geração de macrófagos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) in vitro. Esses macrófagos derivados do iPSC (iPSC-DMs) expressam marcadores de superfície de macrofagos humanos, incluindo CD45, 25F9, CD163 e CD169, e nosso ensaio funcional de imagem em células vivas demonstra que eles exibem atividade fagocítica robusta. IPSC-DMs cultivados podem ser ativados para diferentes estados de macrófagos que exibem expressão genética alterada e atividade fagocítica pela adição de LPS e IFNg, IL4 ou IL10. Assim, este sistema fornece uma plataforma para gerar macrófagos humanos portando alterações genéticas que modelam doenças humanas específicas e uma fonte de células para rastreamento de medicamentos ou terapia celular para tratar essas doenças.
Introduction
Células-tronco embrionárias (ESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte celular auto-renovador que pode ser diferenciada para produzir células de todas as três linhagens de camada de germes. Tecnologias que permitem a manipulação genética de células-tronco pluripotentes humanas (PSCs), como Zinc Finger Nuclease, TALENS e CRISPR-Cas9, revolucionaram a pesquisa médica1,2,3,4. A manipulação genética dos PSCs humanos é uma estratégia particularmente atraente quando a célula primária de interesse é difícil de expandir e/ou manter invitro, ou é difícil de manipular geneticamente, como é o caso dos macrófagos5,,6,,77,8,9. Como os iPSCs humanos podem ser derivados de qualquer célula somática, eles contornam as limitações éticas associadas aos ESCs e fornecem uma estratégia para o uso de medicamentos personalizados. Isso inclui modelagem de doençaespecífica do paciente, teste de drogas e terapia celular autóloga com risco reduzido de rejeição e infecção imunológica6,8,10,11.
Os protocolos que descrevem a geração de macrófagos a partir de iPSCs consistem em um processo de três etapas que inclui: 1) Geração de corpos embrionários; 2) Emergência de células hematopoiéticas em suspensão; 3) Maturação de macrófagos terminais.
A formação de agregados tridimensionais, conhecidos como corpos embrionários (EBs), inicia a diferenciação dos iPSCs. Proteína morfogenética óssea (BMP4), fator de célula-tronco (SCF) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) são adicionados para impulsionar a especificação do mesoderme e apoiar células hematopoiéticas emergentes7,,8,,9,,11,12. As células diferenciais dentro dos EBs também iniciam a ativação de vias de sinalização endógenas como Wnt e Activin. Alguns protocolos de diferenciação não passam pela fase de formação de EB. Nestes casos, os reguladores de sinalização Wnt e Activin, como activina humana recombinante A e/ou Chiron são adicionados ao diferencial iPSCs em um formato de monocamada13,14,15. Aqui, focamos em um protocolo que usa a formação eb. Para a segunda etapa de diferenciação, os EBs são banhados em uma superfície aderente. Estas células anexadas são então expostas a citocinas que promovem o surgimento de células suspensas que incluem progenitores hematopoiéticos e mieloides. Nestas condições de cultura in vitro, a interleucina-3 (IL3) provavelmente suporta a formação e proliferação de células hematopoiéticas de tronco-progenitor16,17, bem como precursores mieloides proliferação e diferenciação18. O fator estimulante da colônia de macrófagos (CSF1) suporta a produção de células mieloides e sua diferenciação para macrófagos19,20. Durante o terceiro estágio de diferenciação, essas células de suspensão são cultivadas na presença de CSF1 para suportar a maturação de macrófagos terminais.
A diferenciação dos iPSCs humanos em macrófagos in vitro imita a onda inicial da produção de macrófagos durante o desenvolvimento. Os macrófagos residentes em tecidos são estabelecidos durante a embriogênese e têm uma linhagem de desenvolvimento distinta de monócitos adultos. Vários estudos têm mostrado que o iPSC-DMs tem uma assinatura genética que é mais comparável aos macrófagos derivados do fígado fetal do que os monócitos derivados do sangue, sugerindo que os iPSC-DMs são mais parecidos com macrófagos residentes em tecidos. Os iPSC-DMs expressam níveis mais elevados de genes que codificam a secreção de proteínas envolvidas na remodelação de tecidos e angiogênese e expressam níveis mais baixos de codificação de genes para secreção de citocinas pró-inflamatórias e atividades de apresentação de antígenos21,22. Além disso, os iPSC-DMs possuem um requisito de fator de transcrição análogo ao dos macrófagos residentes em tecidos23,24. Usando linhas de células knockout iPSC que são deficientes nos fatores de transcrição RUNX1, SPI1 (PU.1), e MYB, Buchrieser et al. mostraram que a geração de iPSC-DMs é dependente de SPI1 e RUNX1, mas MYB independente. Isso indica que eles são transcricionalmente semelhantes aos macrófagos derivados da gema-sac que são gerados durante a primeira onda de hematopoiesis durante o desenvolvimento23. Portanto, é amplamente aceito que os iPSC-DMs representam um modelo celular mais adequado para estudar macrófagos residentes em tecidos, como as células microglia14,,25 e Kupffer11, e uma fonte mais desejável de células que poderiam potencialmente ser usadas em terapias para reparar tecidos. Por exemplo, foi demonstrado que os macrófagos produzidos in vitro a partir de ESCs de camundongos foram eficazes na fibrose amenizada em um modelo de lesão hepática induzida por CCl4 in vivo11. Além disso, esses macrófagos derivados do ESC eram mais eficientes do que os macrófagos derivados da medula óssea na repovoação dos compartimentos celulares de Kupffer esgotados de macrófagos usando clodronato lipossômico11 em camundongos.
Aqui, descrevemos protocolos livres de soro e alimentação para a manutenção, congelamento e descongelamento de iPSCs humanos, e para a diferenciação desses iPSCs em macrófagos funcionais. Este protocolo é muito semelhante ao descrito por Van Wilgenburg et al.12, com pequenas alterações incluindo: 1) mídia de manutenção iPSC; 2) O inibidor de ROCHA não é utilizado na fase de formação de EB; 3) Uma abordagem mecânica em vez de uma abordagem enzimática é usada para gerar EBs uniformes de colônias iPSC; 4) O método de colheita e emplacamento de EB é diferente; 5) As células de suspensão são colhidas 2x por semana, em vez de semanais; e 6) As células de suspensão colhidas são cultivadas sob CSF1 para maturação de macrófagos por 9 dias em vez de 7 dias. Também descrevemos protocolos utilizados para caracterizar fenótipo e função de macrófagos derivados do iPSC, incluindo análises para expressão genética (qRT-PCR), expressão de marcadores de superfície celular (citometria de fluxo) e ensaios funcionais para avaliar fagocitose e polarização.
Protocol
NOTA: Todos os reagentes e equipamentos utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais. A mídia deve estar a 37 °C para a cultura celular. A mídia e os reagentes utilizados no protocolo de diferenciação devem ser estéreis.
1. Descongelamento e Manutenção de Linhas iPSC humanas
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Prepare o meio de manutenção celular, fatores de crescimento e outros reagentes.
- Prepare a mídia livre de soro hESC (hESC-SFM; ver Tabela de Materiais) complementando o meio-f12 eagle modificado de Dulbecco (DMEM/F12) com suplemento hESC, albumina de soro bovino de 1,8% w/v (BSA) e 0,1 mM 2-mercaptoetanol. (
- Prepare a solução de estoque do fator de crescimento do fibroblasto básico humano (bFGF) (10 μg/mL) dissolvendo o bFGF em uma solução estéril de albumina de soro humano (HSA)-fosfato tamponado solução (PBS). Distribua a solução de estoque como alíquotas de 200 μL em criotubos. As soluções de estoque podem ser armazenadas a -20 °C até 1 ano. Uma vez descongelado, o estoque bFGF pode ser armazenado a 4 °C por 7 dias.
- Prepare o inibidor de quinase rho (inibidor de ROCHA)-Y27632 solução de estoque (1 mg/mL) dissolvendo-o em água estéril. Distribua a solução de estoque como alíquotas de 50 μL em criotubos. As soluções de estoque podem ser armazenadas a -20 °C até 1 ano. Uma vez descongelado, o inibidor de ROCHA pode ser armazenado a 4 °C durante 7 dias.
- Diluir o substrato de células-tronco (ver Tabela de Materiais) 1:50 no Salino Tampão de Fosfato de Dulbecco com cálcio e magnésio.
- Coloque a solução diluída de substrato de células-tronco em placas de cultura para que o volume final por área de superfície seja de 78 μL/cm2. Para revestir o poço de uma placa de 6 poços, adicione 750 μL de solução.
- Incubar a placa revestida por 1 h em uma atmosfera humificada a 37 °C e 5% de CO2.
- Apiratee o revestimento do substrato de células-tronco e adicione 1 mL de hESC suplementado com 20 ng/mL bFGF e 10 μM Rock Inhibitor.
- Para descongelar um frasco de células iPSC humanas congeladas, incubar o frasco a 37 °C até descongelar e transferir as células para 5 mL hESC-SFM.
- Células centrífugas a 100 x g por 3 min.
- Resuspender em 0,5 mL hESC-SFM complementado com 20 ng/mL bFGF e 10 μM Rock Inhibitor. Transfira as células para o poço revestido.
- Células de cultura por 24 h.
- Mude a mídia para hESC-SFM complementada com 20 ng/mL bFGF, mas sem inibidor DE ROCHA.
- Para manter as células, mude o meio todos os dias até que as células atinjam 80% de confluência. IPSCs indiferenciados geralmente levam de 3 a 4 dias para atingir 80% de confluência.
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Uma vez que as células atingiram 80% de confluência, as células de passagem.
- Substitua o meio de cultura gasto por 1,5 mL de hESC-SFM fresco complementado com 20 ng/mL bFGF (sem inibidor de ROCHA).
- Segure o vaso de cultura em uma mão e role uma ferramenta de passagem de célula descartável (ver Tabela de Materiais) através da placa em uma direção (ou seja, da esquerda para a direita). Todas as lâminas do rolo devem estar tocando na placa. Mantenha a pressão uniforme enquanto rola.
- Repita rolando na mesma direção até que todo o poço tenha sido coberto.
- Gire o vaso de cultura 90° e repita o rolamento conforme descrito nas etapas 1.12.2 e 1.12.3.
- Descarte a ferramenta de passaging após o uso.
- Com uma pipeta estéril, use mídia no poço para desalojar colônias cortadas.
- Transferir células a uma razão de 1:4 para poços de substrato de células-tronco pré-revestidas (passos 1,2-1,5) para um volume de mídia final (hESC -SFM complementado com 20 ng/mL bFGF) de 1,5 mL por poço.
2. Congelamento da linha iPSC humana
- Para congelar as células iPSC, substitua a mídia de um poço confluente de 70%-80% de uma placa de 6 poços com hESC-SFM complementado com 20 ng/mL bFGF e 10 μM Rock Inhibitor.
- Incubar bem a 37 °C e 5% CO2 por 1 h.
- Corte colônias com a ferramenta de passagem de células e coloque colônias desalojadas em um tubo de centrífuga.
- Células centrífugas a 100 x g por 3 min.
- Aspirar a mídia e resuspender as células em 1 mL de mídia de criopreservação celular (ver Tabela de Materiais).
- Divida as células igualmente em dois crioviais e coloque-as em um recipiente de criopreservação celular pré-refrigerado a 4 °C.
- Armazenar células a -80 °C por 24-48 h.
- Transfira frascos para um freezer de -135 °C ou para um tanque de nitrogênio líquido.
3. Diferenciação iPSC humana para macrófagos
NOTA: Um resumo esquemático do protocolo de diferenciação do macrófago é retratado na Figura 1.
- Preparando fatores de crescimento de diferenciação celular e outros reagentes
- Prepare a mídia hESC-SFM (veja a seção anterior).
- Prepare a solução de 0,1% c/v de gelatina suína dissolvendo a gelatina em água estéril. A solução de gelatina pode ser armazenada a 4 °C por até 2 anos.
- Prepare a solução de estoque BMP4 humana (25 μg/mL) dissolvendo o BMP4 em uma solução de cloreto de hidrogênio de 4 mM (HCl)-0,2% de BSA PBS. Distribua a solução de estoque como alíquotas de 50 μL em criotubos. As soluções de estoque podem ser armazenadas a -20 °C até 1 ano. Uma vez descongelado, o estoque BMP4 pode ser armazenado a 4 °C por 5 dias.
- Prepare a solução de estoque VEGF humano (100 μg/mL) dissolvendo o VEGF em uma solução BSA PBS de 0,2%. Distribua a solução de estoque como alíquotas de 10 μL em criotubos. As soluções de estoque podem ser armazenadas a -20 °C até 1 ano. Uma vez descongelado, o estoque VEGF pode ser armazenado a 4 °C por 7 dias.
- Prepare a solução humana de estoque SCF (100 μg/mL) dissolvendo o SCF em uma solução BSA PBS de 0,2%. Distribua a solução de estoque como alíquotas de 5 μL em criotubos. As soluções de estoque podem ser armazenadas a -20 °C até 1 ano. Uma vez descongelado, o estoque SCF pode ser armazenado a 4 °C por 10 dias.
- Prepare a solução de estoque de IL3 humano (10 μg/mL) dissolvendo o IL3 em uma solução BSA PBS de 0,2%. Distribua a solução de estoque como alíquotas de 500 μL em criotubos. As soluções de estoque podem ser armazenadas a -20 °C até 2 anos. Uma vez descongelado, o estoque SCF pode ser armazenado a 4 °C por 15 dias.
- Prepare a solução de estoque csf1 humano (10 μg/mL) dissolvendo o CSF1 em uma solução BSA PBS de 0,2%. Distribua a solução de estoque como alíquotas de 1 mL em criotubos. As soluções de estoque podem ser armazenadas a -20 °C até 2 anos. Uma vez descongelado, o estoque SCF pode ser armazenado a 4 °C por 15 dias.
- Prepare soluções separadas de 10 μg/mL de ações de interferon-gama (IFNg), interleucina 4 (IL4) e interleucina 10 (IL10) dissolvendo-se em soluções BSA PBS de 0,2%. Prepare o lipopolissacarídeo (LPS) para uma solução de estoque de (100 U/mL) dissolvendo-se em uma solução BSA PBS de 0,2%. Distribua cada solução de estoque como alíquotas de 35 μL. Armazenar a -80 °C até 2 anos. Uma vez descongelados, os estoques podem ser armazenados a 4 °C por 7 dias.
- Estágio 1: Geração de corpos embrionários (dia 0-dia 3)
- No dia 0, adicione 2,25 mL de mídia estágio 1 (hESC-SFM complementado com 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF e 20 ng/mL SCF) em dois poços de um acessório ultrabaixo 6 placa de poço.
- Substitua a mídia de manutenção de um poço de 80% de iPSCs em uma placa de 6 poços com 1,5 mL de mídia estágio 1.
- Corte as colônias usando a ferramenta de passagem de células e transfira colônias de corte com uma pipeta nos dois poços de um acessório ultrabaixo 6 placa de poço (ver Tabela de Materiais).
- No dia 2, leve citocinas para uma concentração final de 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF e 20 ng/mL SCF utilizando 0,5 mL de mídia hESC-SFM.
NOTA: As colônias IPSC se tornarão EBs (Figura 2A).
- Estágio 2: Emergência de células hematopoiéticas em suspensão
- No dia 4, cubra 4 poços de uma placa de cultura de tecido de 6 poços com gelatina de 0,1% w/v e incubar por pelo menos 10 min.
- Remova a gelatina e adicione 2,5 mL de mídia estágio 2 (X-VIVO15 suplementado com 100 ng/mL CSF1, 25 ng/mL IL-3, 2 mM glutamax, 1% penicilina-estreptomicina e 0,055 mM 2-mercaptoetanol).
- Coletar EBs formados em um tubo de centrífuga de 50 mL e permitir que eles se acomodem na parte inferior do tubo por gravidade. Atribua cuidadosamente a mídia.
- Resuspender EBs em 2 mL de mídia estágio 2.
- Transfira 10-15 EBs (não mais que 15) para um poço revestido de gelatina contendo 2,5 mL de mídia estágio 2.
- Incubar EBs a 37 °C e 5% de CO2 de ar.
- Mude a mídia em EBs banhados a cada 3-4 dias durante 2-3 semanas.
- Após 2-3 semanas, os EBs começam a liberar células hematopoiéticas não aderentes em suspensão.
NOTA: Esse período de liberação da célula de suspensão pode variar e é dependente da linha celular. As células nesta suspensão podem ser colhidas e amadurecidas em macrófagos (ver Estágio 3) (Figura 2A).
- Estágio 3: Maturação de macrófagos terminais
- Coletar células hematopoiéticas de suspensão e reabastecer a mídia (mídia estágio 2) na placa EB.
- Células de suspensão centrífugas a 200 x g por 3 min.
- Resuspender células de suspensão em mídia estágio 3 (X-VIVO15 complementado com CSF1 de 100 ng/mL, glutamax de 2 mM e 1% de penicilina-estreptomicina).
- A placa coletada e girada as células em plástico não tratado 10 cm placas de grau bacteriológico (10 mL) ou 6 placas de cultura de tecido de poço (3 mL) não revestidas a uma densidade de 0,2 x 106 células/mL.
- Mantenha as células na mídia estágio 3 por 9-11 dias, mudando a mídia a cada 5 dias.
NOTA: As etapas 3.4.1-3.4.5 do Estágio 3 podem ser repetidas a cada 3-4 dias e as células de suspensão colhidas da placa EB original por até 3 meses.
- Polarização do macrófago
- Para ativar macrófagos para um fenótipo M (LPS + IFNg), estimule as células com LPS (concentração final: 100 ng/mL) e IFNg (concentração final: 10 U/mL) por 48 h. Para ativar as células para um fenótipo M(IL4), estimule as células com IL4 (concentração final: 20 ng/mL). Para ativar um fenótipo M(IL10), estimule macrófagos com IL10 (concentração final: 5 ng/mL).
4. Verificação de controle de qualidade de macrófagos derivados do iPSC
- Determine o número de células de suspensão hematopoiéticaproduzidas por 6 placas de poços de EBs contando-as com um hematocitometro.
- Avaliar a morfologia do macrófago como descrito anteriormente (por exemplo, coloração do kit comercial)8,9.
-
Detectar a expressão de marcadores específicos de macrófagos e marcadores de polarização usando análises de expressão genética e citometria de fluxo como descrito anteriormente8,9.
- Para experimentos de citometria de fluxo em um poço de 6 poços de macrófagos, células de colheita aspirando suas mídias de maturação, lavar com 2 mL de PBS e incubar-os com 2 mL de tampão de dissociação celular livre de enzimas por 5 min à temperatura ambiente (RT). Pipeta para cima e para baixo repetidamente para desprender e colher macrófagos.
- Conte células com hematocitometro e resuspenda-as em 80 μL de uma solução de BSA de 2%, 0,5 mM de ácido etilenoediaminetetraacético (EDTA)-PBS.
- Adicione 20 μL de bloqueador MacS Humano FC.
- Incubar no gelo por 20 min e proteger da luz.
- Adicione um volume apropriado de 2% de BSA, 0,5 mM EDTA PBS solução para levar a concentração celular a 1 x 106 macrófagos/mL.
- Mancha 1 x 105 células em 100 μL de 2% de BSA, 0,5 mM SOLUÇÃO EDTA PBS com anticorpo correspondente (ver NOTA abaixo) e incubar por 15 min em RT protegido da luz.
- Lave 1x com pelo menos 100 μL de 2% de BSA, 0,5 mM EDTA PBS.
- Resuspender as células em 200 μL de 2% bsa, 0,5 mM EDTA PBS.
- Adicione 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, diluído 1:1.000) como um tine vivo morto. Incubar 3 min.
- Para análises de citometria de fluxo, portão na população principal, depois células únicas, e então células vivas. Sobre a população de células vivas, a expressão do marcador relacionado ao macrófago é evidente(Figura 3A).
NOTA: Os anticorpos devem ser cuidadosamente titulados para cada linha celular usada para derivar macrófagos. Os anticorpos apresentados na seção de resultados estão na Tabela de Materiais. O fator de diluição para ensaios de citometria de fluxo de macrófagos derivados do SFCi55 também está incluído.
5. Ensaio de phagocitose de alta duração
- Colher macrófagos derivados do iPSC (iPSC-DMs) aspirando a mídia, adicionando tampão de dissociação de células livres de enzimas geladas e incubando por 5 min. Coletar macrófagos por pipetting repetidamente.
- Placa 8 x 104 iPSC-DMs em um poço de uma cultura de tecido de imagem grau 96 placas de poço (por exemplo, Cellcarrier Ultra, Perkin Elmer) pelo menos 2 dias antes de imagem de alta produção em 200 μL de mídia estágio 3.
- Prepare as biopartículas pHrodoGreen Zymosan-A resuspendendo um frasco em 2 mL de PBS ("Solução 1"). Solução vortex para 10 s.
- Diluir a suspensão de 2 mL de bémpbs 1:5 com mais PBS ("Solução 2").
- Solução Sonicate 2 para 8 s e solução de vórtice para 10 s. Mantenha-a a 4 °C. Esta solução será utilizada na etapa 5.11.
- Remova a mídia em iPSC-DMs banhados e lave com PBS.
- Stain iPSC-DMs com uma solução PBS contendo Hoechst 33342 diluído 1:20. Incubar por 20 min a 37 °C.
- Lave células com PBS.
- Mancha com uma solução PBS contendo uma mancha de membrana de plasma vermelho profundo diluída 1:1.000 (ver Tabela de Materiais). Incubar por 30 min a 37 °C.
- Lave células com PBS.
- Adicione 100 μL de solução de talude mantida a 4 °C a cada poço de iPSC-DMs. As placas estão prontas para a imagem.
- Imagem da placa usando um sistema de imagem de alto conteúdo e adquirir três ou mais campos através do poço para obter uma boa representação do poço.
-
Quantifique a fagocitose usando o software Columbus (software de análise de imagens de alto conteúdo). Um algoritmo específico pode ser desenvolvido para análise inequívoca de lotes de imagens:
- Meça a intensidade azul e defina no software que o sinal azul indica os núcleos.
- Meça a intensidade vermelha e defina no software que o sinal vermelho indica o citoplasma.
- Defina que núcleo e citoplasma juntos correspondem a uma célula.
- Medir a intensidade verde nas células e estabelecer um valor de corte/limiar rigoroso para considerar uma célula como fagocítica.
- Quantifique a fração de células fagocíticas e o índice fagocítico médio por célula. Como a intensidade da cor das contas é proporcional ao número de contas, a atividade fagocítica pode ser medida pelo número de contas ingeridas.
- Aplique o algoritmo/pipeline a todas as imagens dentro de cada campo e em todos os pontos de tempo adquiridos, permitindo uma abordagem de lote robusta e imparcial para determinar as capacidades fagocíticas das células.
NOTA: Columbus é um software de análise de alto conteúdo, que oferece análise de segmentação celular para fenotipagem celular e testes funcionais.
Representative Results
Progressão de diferenciação, número de macrófagos e morfologia
Os resultados apresentados são da diferenciação da linha IPSC humana SFCi55 que foi descrita e utilizada em vários estudos8,,9,10,26. O processo de diferenciação do IPSC em relação aos macrófagos poderia ser monitorado por microscopia óptica. Colônias iPSC, corpos embrionários (EBs), células de suspensão hematopoiética e macrófagos maduros foram morfologicamente distintos(Figura 2A). A morfologia de macrófagos maduros poderia ser ainda mais validada pela coloração de preparações centrífugas de citospin. Os macrófagos derivados do IPSC eram grandes, e tinham núcleos em forma oval simples e citoplasma abundante contendo muitas vesículas(Figura 2B).
As primeiras 2 semanas de colheitas de células de suspensão hematopoiética (dias 16-28) de um prato completo de 6 poços de EBs continham, em média, 2,59 x 106 ± 0,54 células. Após o dia 28, foram produzidas uma média de 4,64 x 106 ± 0,94 de células de suspensão por 6 placas de poços de EBs. A partir do dia 80, o número de células de suspensão começou a cair à medida que os EBs se esgotavam (Figura 2C). Recomenda-se parar o protocolo de diferenciação após os números caírem abaixo de 3 x 106 precursores por colheita por 6 placas de poços de EBs.
Expressão de marcadores de superfície de macrophage derivados do IPSC
A citometria de fluxo continua sendo o método mais comum usado para avaliar o fenótipo dos macrófagos humanos. A estratégia de gating para avaliar a expressão do marcador de superfície celular consiste em gating a principal população de células usando parâmetros físicos como tamanho e granularidade, seguido por células únicas e, em seguida, células vivas(Figura 3A). Os macrófagos maduros derivados do iPSC devem expressar o marcador de linha cd45 e o marcador de maturação do macrófago 25F9, e ser negativos para o marcador de macrófagos monócitos/imaturos CD93. Isso é consistente com nossas observações(Figura 3A). Os macrófagos derivados do IPSC também foram positivos para os marcadores mieloides de linhagem CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163 e CD169(Figura 3B). Eles foram positivos para o marcador de modulação imunológica CD86, e uma pequena proporção deles expressou receptores de quimiocina CX3CR1, CCR2, CCR5 e CCR8 no estado ingênuo(Figura 3B). As parcelas foram obtidas a partir de dados publicados anteriormente pelo nosso laboratório8.
Fagocitose e polarização de macrófagos derivados do iPSC
Uma das principais características dos macrófagos na defesa do hospedeiro e na homeostase tecidual é sua capacidade de fagocitose patógenos, células apoptóticas e detritos27. A taxa de fagocitose está intimamente associada aos estados pinópicos específicos28. Para avaliar a capacidade fagocítica iPSC-DM, utilizamos uma abordagem de sistema de imagem de alto conteúdo8,,9,11 que faz uso do Microscópio PerkinElmer Operetta e biopartículas pHrodo Zymosan (conjugados de corantes sensíveis ao pH). As biopartículas não eram fluorescentes quando adicionadas às culturas (Figura 4A), mas fluorescem verde brilhante no pH ácido intracelular(Figura 4B). O microscópio Operetta de imagem ao vivo foi definido para imagem a cada 5 min após a adição de contas por um tempo total de 175 min. Um alto pipeline de análise de imagem foi então usado na plataforma de Colombo para quantificar a atividade em termos da fração fagocítica que representa a proporção de células que as contas fagocitosed e o índice fagocítico que é uma medida do número de contas que cada célula ingeriu.
Macrófagos podem responder e mudar seu fenótipo dependendo de pistas ambientais. Para avaliar sua capacidade de reagir e mudar sobre estímulos ambientais, os iPSC-DMs podem ser tratados com LPS e IFNg, IL4 ou IL10. Após 48h de tratamento, eles mudaram o fenótipo, aqui referido como M (LPS + IFNg), M (IL4) e M (IL10), respectivamente29. A análise da expressão gênica é uma ferramenta útil para testar o status de polarização dos macrófagos. Após a estimulação LPS e IFNg, os macrófagos upregularam a expressão mRNA dos genes CD40, VCAM1e TNFA (Figura 5A). Após a estimulação IL4, as células upreguladas expressão mRNA dos genes CD68, CD84e MRC1 (Figura 5B). Após a estimulação il10, iPSC-DMs upregulated expressão de MRC1 (Figura 5B). Em termos de fagocitose, os macrófagos tratados com LPS + IFNg ou IL4 apresentaram uma porcentagem significativamente menor de células fagocíticas quando comparados aos macrófagos ingênuos. IPSC-DMs tratados com IL10 apresentaram aumento percentual de células fagocíticas e índice fagocítico(Figura 5C–E).
Figura 1: Resumo gráfico da diferenciação do iPSC para macrófagos funcionais maduros. Diagrama desenhado com Biorender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: diferenciação iPSC para macrófagos e número de iPSC-DM e morfologia. (A) Imagens de Campo Brilhante obtidas de (da esquerda para a direita): uma colônia IPSC, corpos embrionários (EBs), células de suspensão colhidas e macrófagos maduros. Barra de escala = 100 μm. (B) Imagem de citospins de macrófagos manchados com kit Kwik-diff. Barra de escala = 25 μm. (C) Número de células de suspensão coletadas por colheita por uma placa de 6 poços de EBs. Plot shows significa + SEM; (n = 6 experimentos biologicamente independentes). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fenótipo do marcador de superfície da célula do macrófago. (A) Estratégia gating para análise de macrófagos maduros derivados do iPSC. As células vivas únicas foram fechadas e depois analisadas para a expressão dos marcadores de superfície celular CD45, CD93 e 25F9. Os portões para os marcadores de superfície celular foram desenhados usando controles de fluorescência menos um (FMO). (B) Histogramas de citometria de fluxo representativos para manchas únicas de controles iPSC-DMs (azul) e isótipo (cinza) para marcação de linhagem e mieloide, marcadores de modulação imunológica, marcadores de maturação e receptores de quimiocina. As parcelas são representativas de n = 5 experimentos biologicamente independentes para toda linhagem e marcadores mieloides, exceto CD105 e CD206 (n = 3); marcadores de maturação (n = 5); marcadores de modulação imunológica (n = 3); e receptores de quimiocina (n = 3). As parcelas usam dados publicados anteriormente8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ensaios de polarização e fagocitose do IPSC-DM. Imagens representativas de iPSC-DMs(A) imediatamente após a adição de contas verdes zymosan pHrodo e (B) 175 min após a adição de contas. Azul representa os núcleos das células; vermelho representa o citoplasma das células. Verde representa contas ingeridas (Barra de escala = 20 μm). (C) Fração de macrófagos fagocíticos e(D)índice fagocítico/intensidade verde por macrófago fagocítico ao longo do tempo no estado ingênuo (n = 6 experimentos biologicamente independentes). As parcelas mostram o valor médio e as barras representam o uso de sem. As parcelas utilizam dados publicados anteriormente8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Avaliação dos estados de polarização do IPSC-DM. Quantificação relativa das análises RT-PCR de iPSC-DMs ingênuos e polarizados para avaliar a expressão de (A) M(LPS+IFNΥ); (B) M(IL4) e M (IL10)-associados (n = 6 experimentos biologicamente independentes; As múltiplas comparações de ANOVA e Holm-Sidak após o teste. Os grupos polarizados foram estatisticamente comparados apenas ao grupo ingênuo). As parcelas mostram o valor médio, e as barras de erro representam o desvio padrão. ND em parcelas = transcrição não detectada. Os dados dessas parcelas foram publicados anteriormente8. (C) Imagens representativas de iPSC-DMs 175 min após a adição de contas de pHrodo de iPSC-DMs tratadas com (da esquerda para a direita): sem citocinas, LPS+IFN-Y, IL-4 e IL-10 (Barra de escala = 20 μm). (D) Fração dos macrófagos fagocíticos e (E) índice fagocítico/intensidade verde por macrófago fagocítico em tratamentos de macrófagos ingênuos e polarizados 175 min após a adição de contas (n = 12 experimentos biologicamente independentes, anova unidirecional e as múltiplas comparações de Holm-Sidak após o teste. Os grupos polarizados foram estatisticamente comparados apenas ao grupo ingênuo). As parcelas mostram o valor médio e as barras de erro representam o desvio padrão (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O protocolo para a geração de iPSC-DMs descritoaqui é robusto e permite a produção de um grande número de células homogêneas a partir de um número relativamente pequeno de iPSCs. Após a diferenciação inicial de aproximadamente 1 x 106 iPSCs, as culturas subseqüentes podem ser colhidas a cada 4 dias por até 2-3 meses, resultando na produção de pelo menos 6,5 x 107 macrófagos ao longo desse tempo. Estes macrófagos humanos gerados in vitro são morfologicamente semelhantes aos macrófagos humanos primários, expressam os principais marcadores de superfície das células dos macrófagos e exibem atividade fagocítica. O protocolo de diferenciação de macrófagos é reprodutível e pode ser aplicado a outras linhas de células hiPSC e hESC, mas o tempo preciso da primeira colheita dos precursores do macrófago e o número absoluto de células que podem ser geradas varia entre as linhas iPSC.
Foi demonstrado que macrófagos podem ser gerados a partir de iPSCs que foram geneticamente manipulados. Por exemplo, um transgênico constituído pelo repórter fluorescente ZsGreen sob o controle do promotor CAG constitutivo foi inserido no lócus AAVS1 da linha SFCi55 iPSC, e foi posteriormente mostrado que esta linha iPSC poderia ser diferenciada em macrófagos expressos zsGreen8. Esses macrófagos fluorescentes poderiam ser usados no futuro para acompanhar a migração e estabilidade dos macrófagos terapêuticos em modelos de doença. Em outro estudo, os macrófagos foram gerados a partir de uma linha iPSC que havia sido manipulada geneticamente para expressar um fator de transcrição induzido por tamoxifen, KLF1. A ativação do KLF1 em macrófagos derivados do iPSC resultou na produção de macrófagos com um fenótipo comparável aos macrófagos da ilha eritróida9. Potencialmente, essa estratégia poderia ser usada para programar geneticamente macrófagos derivados do iPSC em fenótipos associados a outras populações de macrófagos específicos do tecido, como células kupffer do fígado ou células langerhans da pele. Isso seria possível uma vez que os principais fatores de transcrição que definem esses tipos de células sejam identificados.
Em termos de protocolo, é muito importante notar que a condição da população inicial dos iPSCs é fundamental para a diferenciação bem sucedida. Culturas humanas de iPSC podem ser invadidas por subpopulações cariotipicamente anormais ao longo de várias passagens, por isso recomenda-se a curadoria robusta de estoques de iPSC e grandes estoques mestres de lotes submetidos ao controle da qualidade do genoma. Em nossas mãos, os protocolos de manutenção descritos aqui podem manter iPSCs cariotipicamente normais por até 2 meses em cultura contínua, mas isso pode variar para diferentes linhas celulares e em diferentes laboratórios. Se os problemas forem encontrados, é aconselhável usar um frasco fresco de iPSCs indiferenciados para cada experimento de diferenciação. Além disso, a cultura inicial de iPSCs indiferenciadas não deve ser superior a 80% de confluentes. Na fase de chapeamento EB, apenas 10-15 EBs devem ser banhados por poço de uma placa de cultura de tecido de 6 poços, e é fundamental que esses EBs estejam espalhados uniformemente pelo poço. Um maior número de EBs e/ou clumping de EBs no centro do poço teve um efeito negativo sobre o número de macrófagos gerados. Deve-se tomar cuidado ao reabastecer a mídia e colher células de suspensão progenitoras semelhantes a monócitos das culturas EB para evitar perturbar a adesão dos EBs à superfície das placas de cultura revestidas. O número de células de suspensão hematopoiética produzidas gradualmente aumenta a cada safra, com produção ótima entre os dias 40 e 72 de diferenciação(Figura 2). A produção diminui progressivamente após o dia 68 e as placas tendem a esgotar após 2,5 meses, embora o tempo preciso possa variar dependendo da linha iPSC.
Uma limitação do nosso protocolo é que não foi possível criopreservar as células de suspensão hematopoiética geradas no final do Estágio 2. Protocolos que dependem da ativação exógena da WNT relatam uma taxa de recuperação de 40% após a criopreservação, mas esses protocolos relatam apenas uma colheita celular, de modo que o número absoluto de macrófagos gerados é baixo30. O protocolo descrito aqui, induzindo a sinalização endógena através da formação de EBs, pode ser colhido quinzenalmente, produzindo um rendimento total de macrófagos muito maior.
Em resumo, apresentamos um protocolo detalhado para a produção de macrófagos funcionais derivados do iPSC. A criação de experimentos in vitro com macrófagos derivados do iPSC para estudar a biologia dos macrófagos em saúde e doença tem muitas vantagens em relação a experimentos com macrófagos derivados de monócitos (MDMs). Essas vantagens incluem a facilidade de acessibilidade ao material (por exemplo, não são necessários doadores), grandes quantidades de macrófagos podem ser produzidas, e é viável e relativamente simples produzir macrófagos geneticamente modificados. Além disso, os macrófagos derivados do iPSC podem ser melhores recursos para o estudo da biologia de macrófagos residentes em tecidos.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Fiona Rossi e Claire Cryer pela ajuda com citometria de fluxo, Eoghan O'Duibhir e Bertrand Vernay com microscopia. Este trabalho foi financiado pela CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) e Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust PhD studentship (A.M), MRC Precision Medicine Studentship (T.V). L.C. e J.W.P. foram apoiados pela Wellcome Trust (101067/Z/13/Z), Medical Research Council (MR/N022556/1) e COST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350010 | |
| Abtibody CD64-APC -CY7 | Biolegend | 305026 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody 25F9-EFLUOR 660 | Ebioscience | 15599866 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CCR2-PE-Cy7 | Biolegend | 357212 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CCR5 PE | Biolegend | 313707 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CCR8 PE | Biolegend | 360603 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD11b-PE | Biolegend | 301305 | Dilution factor: 1:50 |
| Antibody CD14-APC | Ebioscience | 10669167 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CD163-PE-CY7 | BIolegend | 333614 | Dilution factor: 1:25 |
| Antibody CD169-APC | Biolegend | 346007 | Dilution factor: 1:25 |
| Antibody CD206-PE | Biolegend | 321106 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD209-PE-CY7 | Biolegend | 3310114 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD274-PE-CY7 | Biolegend | 329718 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD43-PE | Ebioscience | 10854419 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD45-APC | Ebioscience | 15577936 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CD86-APC | Biolegend | 305412 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD93-PE | Ebioscience | 10804637 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CX3CR1-PE | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody HLA-DR-BV650 | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
| Antiboy CD115-PE | Biolegend | 347308 | Dilution factor: 1:40 |
| Cell Dissociation Buffer, enzyme free | Thermofisher | 13151014 | |
| Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS | Gibco | 13151014 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well | PerkinElmer | 6055302 | |
| CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain | Thermofisher | C10046 | Cryopreservation media |
| Cryostor CS10 | Sigma | C2874 | |
| CTS CELLstart Substrate | Invitrogen | A1014201 | Stem cell substrate |
| DAPI | Merck | D9542-1MG | Final concentration 1 μg/mL |
| DPBS, calcium, magnesium (500 mL) | Thermofisher | 14040091 | |
| FcR Blocking Reagent, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHG0021 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IFNY | Thermofisher | 14-8319-80 | |
| Human Serum Albuminum | Irvine Scientific | 9988 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli | Sigma | L2630 | |
| NucBlue (Hoechst33342) | Thermofisher | R37605 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis | Thermofisher | P35365 | |
| Porcine Skin Gelatin | Sigma | G9136 | |
| Recombinant Human BMP4 Protein | R&D | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human IL10 | Preprotech | 200-10 | |
| Recombinant Human IL3 | Preprotech | 200-03-10 | |
| Recombinant Human IL4 | Preprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100 μg | Biolegend | 574806 | |
| Recombinant Human VEGF Protein | R&D | 293-VE-010 | |
| Rock Inhibitor Y-27632 | Merck | SCM075 | |
| SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHC2111 | |
| StemPro hESC SFM | Thermofisher | A1000701 | |
| StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool | Thermofisher | 23181010 | |
| Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface | Greiner | 657970 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| X-Vivo 15 500 mL bottle | Lonza | BE02-060F |
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