Summary
Este protocolo describe la robusta generación de macrófagos a partir de células madre pluripotentes inducidas por el hombre, y métodos para su posterior caracterización. La expresión del marcador de superficie celular, la expresión génica y los ensayos funcionales se utilizan para evaluar el fenotipo y la función de estos macrófagos derivados de iPSC.
Abstract
Los macrófagos están presentes en la mayoría de los tejidos vertebrados y comprenden poblaciones celulares ampliamente dispersas y heterogéneas con diferentes funciones. Son actores clave en la salud y la enfermedad, actuando como fagocitos durante la defensa inmune y mediando las funciones tróficas, de mantenimiento y reparación. Aunque ha sido posible estudiar algunos de los procesos moleculares involucrados en la función de los macrófagos humanos, ha resultado difícil aplicar técnicas de ingeniería genética a los macrófagos humanos primarios. Esto ha obstaculizado significativamente nuestra capacidad para interrogar las complejas vías genéticas involucradas en la biología de los macrófagos y para generar modelos para estados específicos de enfermedades. Por lo tanto, una fuente de macrófagos humanos que es susceptible al vasto arsenal de técnicas de manipulación genética proporcionaría una herramienta valiosa en este campo. Presentamos un protocolo optimizado que permite la generación de macrófagos a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) in vitro. Estos macrófagos derivados de iPSC (iPSC-DMs) expresan marcadores de superficie de células macrófoles humanas, incluyendo CD45, 25F9, CD163 y CD169, y nuestro ensayo funcional de imágenes de células en vivo demuestra que exhiben una actividad fagocítica robusta. Los iPSC-DM cultivados se pueden activar a diferentes estados de macrófagos que muestran la expresión génica alterada y la actividad fagocítica mediante la adición de LPS e IFNg, IL4 o IL10. Por lo tanto, este sistema proporciona una plataforma para generar macrófagos humanos portadores de alteraciones genéticas que modelan enfermedades humanas específicas y una fuente de células para la detección de drogas o terapia celular para tratar estas enfermedades.
Introduction
Las células madre embrionarias (ESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) representan una fuente celular autorenovadora que se puede diferenciar para producir células de los tres linajes de capa germinal. Las tecnologías que permiten la manipulación genética de células madre pluripotentes humanas (PSC), como Zinc Finger Nuclease, TALENS y CRISPR-Cas9, han revolucionado la investigación médica1,2,3,4. La manipulación genética de los PSC humanos es una estrategia particularmente atractiva cuando la célula primaria de interés es difícil de expandir y/o mantener invitro, o es difícil de manipular genéticamente, como es el caso de los macrófagos5,,6,7,8,9. Como los iPSC humanos pueden derivarse de cualquier célula somática, eluden las limitaciones éticas asociadas con los ESC y proporcionan una estrategia para la entrega de medicina personalizada. Esto incluye el modelado de enfermedades específicas del paciente, pruebas de drogas y terapia celular autóloga con un menor riesgo de rechazo inmune e infección6,,8,10,11.
Los protocolos que describen la generación de macrófagos a partir de iPSC consisten en un proceso de tres pasos que incluye: 1) Generación de cuerpos embrionarios; 2) Emergencia de células hematopoyéticas en suspensión; 3) Maduración de macrófagos terminales.
La formación de agregados tridimensionales, conocidos como cuerpos embrionarios (EB) inicia la diferenciación de los IPSC. Proteína morfogenética ósea (BMP4), factor de células madre (SCF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se añaden para impulsar la especificación del mesodermo y apoyar las células hematopoyéticas emergentes7,8,9,11,12. Las células diferenciadoras dentro de los EBs también inician la activación de vías de señalización endógenas como Wnt y Activin. Algunos protocolos de diferenciación no pasan por la etapa de formación de EB. En estos casos, los reguladores de señalización Wnt y Activin, como Activin A y/o Chirón humanos recombinantes, se añaden a los iPSC diferenciadores en formato monocapa13,,14,,15. Aquí, nos centramos en un protocolo que utiliza la formación de EB. Para el segundo paso de diferenciación, los EB se chapan en una superficie adherente. Estas células unidas se exponen a citoquinas que promueven la aparición de células de suspensión que incluyen progenitores hematopoyéticos y mieloides. En estas condiciones de cultivo in vitro, la interleucina-3 (IL3) probablemente apoya la formación de células hematopoyéticas de tallo-progenitor a la proliferación16,,17, así como precursores mieloides proliferación y diferenciación18. El factor estimulante de colonias de macrófagos (CSF1) apoya la producción de células mieloides y su diferenciación a los macrófagos19,20. Durante la tercera etapa de diferenciación, estas células de suspensión se cultivan en presencia de CSF1 para apoyar la maduración de los macrófagos terminales.
La diferenciación de los IPSC humanos en macrófagos in vitro imita la onda temprana de la producción de macrófagos durante el desarrollo. Los macrófagos residentes en tejidos se establecen durante la embriogénesis y tienen un linaje de desarrollo distinto de los monocitos adultos. Varios estudios han demostrado que los iPSC-DMs tienen una firma genética que es más comparable a los macrófagos derivados del hígado fetal que los monocitos derivados de la sangre, lo que sugiere que los iPSC-DMson son más parecidos a los macrófagos residentes en tejidos. Los iPSC-DM expresan niveles más altos de genes que codifican para la secreción de proteínas implicadas en la remodelación de tejidos y la angiogénesis y expresan niveles más bajos de genes que codifican para la secreción proinflamatoria de citoquinas y las actividades de presentación de antígenos21,,22. Además, los iPSC-DMs tienen un requisito de factor de transcripción análogo al de los macrófagos residentes en tejidos23,24. El uso de líneas celulares iPSC noqueadas que son deficientes en los factores de transcripción RUNX1, SPI1 (PU.1) y MYB, Buchrieser et al. mostraron que la generación de iPSC-DMs depende de SPI1 y RUNX1, pero myB independiente. Esto indica que son transcripcionalmente similares a los macrófagos derivados de la yema-sac que se generan durante la primera oleada de hematopoyesis durante el desarrollo23. Por lo tanto, es ampliamente aceptado que los iPSC-DM representan un modelo celular más apropiado para estudiar los macrófagos residentes en tejidos como las células microglia14,,25 y Kupffer11,y una fuente más deseable de células que potencialmente podrían utilizarse en terapias para reparar tejidos. Por ejemplo, se ha demostrado que los macrófagos producidos in vitro a partir de ESCs de ratón fueron eficaces para aliviar la fibrosis en un modelo de lesión hepática inducida por CCl4 in vivo11. Además, estos macrófagos derivados de la ESC eran más eficientes que los macrófagos derivados de la médula ósea en los compartimentos celulares de Kupffer repoblados, balosdedos de macrófagos utilizando clodronato liposomal11 en ratones.
Aquí, describimos los protocolos libres de suero y alimentador para el mantenimiento, la congelación y la descongelación de los iPSC humanos, y para la diferenciación de estos iPSC en macrófagos funcionales. Este protocolo es muy similar al descrito por Van Wilgenburg et al.12, con alteraciones menores incluyendo: 1) medios de mantenimiento iPSC; 2) El inhibidor DE ROCK no se utiliza en la etapa de formación de EB; 3) Se utiliza un enfoque mecánico en lugar de un enfoque enzimático para generar eBs uniformes a partir de colonias de iPSC; 4) El método para la cosecha eb y el enchapado hacia abajo es diferente; 5) Las células de suspensión se cosechan 2 veces a la semana, en lugar de semanalmente; y 6) Las células de suspensión cosechadas se cultivan bajo CSF1 para maduración de macrófagos durante 9 días en lugar de 7 días. También describimos los protocolos utilizados para caracterizar el fenotipo y la función de los macrófagos derivados de iPSC, incluidos los análisis de la expresión génica (qRT-PCR), la expresión del marcador de superficie celular (citometría de flujo) y los ensayos funcionales para evaluar la fagocitosis y la polarización.
Protocol
NOTA: Todos los reactivos y equipos utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales. Los medios deben estar a 37 oC para el cultivo celular. Los medios y reactivos utilizados en el protocolo de diferenciación deben ser estériles.
1. Descongelación y mantenimiento de la línea iPSC humana
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Prepare el medio de mantenimiento celular, los factores de crecimiento y otros reactivos.
- Preparar medios libres de suero hESC (hESC-SFM; ver Tabla de Materiales)complementando el medio-F12 Eagle modificado de Dulbecco (DMEM/F12) con suplemento de hESC, 1,8% p/v albúmina sérica bovina (BSA) y 0,1 mM 2-mercaptoetanol. (
- Preparar la solución de stock de factor de crecimiento de fibroblastos básico humano (bFGF) (10 g/ml) disolviendo bFGF en una solución estéril de albúmina de suero humano (HSA) -fosfato tamponada (PBS). Distribuya la solución de stock como alícuotas de 200 l en criotubos. Las soluciones de stock se pueden almacenar a -20 oC hasta 1 año. Una vez descondezlado, el bFGF de stock se puede almacenar a 4 oC durante 7 días.
- Preparar inhibidor de Rho quinasa (inhibidor de ROCK)-Y27632 solución en stock (1 mg/ml) disolviéndolo en agua estéril. Distribuya la solución en stock como alícuotas de 50 l en criotubos. Las soluciones de stock se pueden almacenar a -20 oC hasta 1 año. Una vez descongelado, el inhibidor ROCK de stock se puede almacenar a 4 oC durante 7 días.
- Sustrato diluido de células madre (ver Tabla de Materiales)1:50 en Solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco con calcio y magnesio.
- Coloque la solución de sustrato de células madre diluidas en placas de cultivo para que el volumen final por superficie sea de 78 l/cm2. Para recubrir el pozo de una placa de 6 pocillos, añadir 750 ml de solución.
- Incubar la placa recubierta durante 1 h en una atmósfera humificada a 37oC y 5%CO2.
- Aspirar el recubrimiento del sustrato de células madre y añadir 1 ml de hESC complementado con 20 ng/ml bFGF y 10 m de inhibidor DE ROCK.
- Para descongelar un vial de células iPSC humanas congeladas, incubar el vial a 37 oC hasta que se descongelen y transfiera las células a medios hESC-SFM de 5 ml.
- Células centrífugas a 100 x g durante 3 min.
- Resuspender en 0,5 ml de hESC-SFM complementado con 20 ng/ml bFGF y 10 m de inhibidor de ROCK. Transfiera las células al pozo recubierto.
- Células de cultivo durante 24 h.
- Cambie los medios a hESC-SFM complementados con 20 ng/mL bFGF, pero sin inhibidor de ROCK.
- Para mantener las células, cambie el medio todos los días hasta que las células alcancen el 80% de confluencia. Los IPSC indiferenciados suelen tardar de 3 a 4 días en alcanzar el 80% de confluencia.
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Una vez que las células han alcanzado el 80% de confluencia, las células de paso.
- Reemplace el medio de cultivo gastado por 1,5 ml de hESC-SFM fresco complementado con 20 ng/ml de bFGF (sin inhibidor de ROCK).
- Sostenga el recipiente de cultivo en una mano y enrolle una herramienta de paso de celda sazonada (ver Tabla de Materiales)a través de la placa en una dirección (es decir, de izquierda a derecha). Todas las cuchillas del rodillo deben tocar la placa. Mantenga una presión uniforme mientras rueda.
- Repita el balanceo en la misma dirección hasta que se haya cubierto todo el pozo.
- Gire el recipiente de cultivo 90o y repita el balanceo como se describe en los pasos 1.12.2 y 1.12.3.
- Deseche la herramienta de passaging después de su uso.
- Con una pipeta estéril, utilice medios en el pozo para desalojar colonias cortadas.
- Transfiera las células en una proporción de 1:4 a pozos de sustrato de células madre precoatadas (pasos 1.2–1.5) a un volumen de medios final (hESC -SFM complementado con 20 ng/ml bFGF) de 1,5 ml por pozo.
2. Congelación de la línea iPSC humana
- Para congelar las células iPSC, reemplace los medios de un pozo confluente del 70%-80% de una placa de 6 pocillos con hESC-SFM complementado con 20 ng/mL bFGF e inhibidor de ROCK de 10 m.
- Incubar bien a 37oC y 5%CO2 durante 1 h.
- Cortar las colonias con la herramienta de paso celular y colocar colonias desalojadas en un tubo centrífugo.
- Células centrífugas a 100 x g durante 3 min.
- Aspirar los medios y resuspender las células en 1 ml de medios de criopreservación celular (ver Tabla de Materiales).
- Divida las células por igual en dos crioviales y colóquelas en un recipiente de criopreservación de células pre-enfriado a 4 oC.
- Almacene las celdas a -80 oC durante 24-48 h.
- Transfiera los viales a un congelador de -135 oC o a un tanque de nitrógeno líquido.
3. Diferenciación iPSC humana a los macróforos
NOTA: En la Figura 1se muestra un resumen esquemático del protocolo de diferenciación de macrófagos.
- Preparación de factores de crecimiento de diferenciación celular y otros reactivos
- Prepare los medios hESC-SFM (ver sección anterior).
- Preparar 0.1% p/v solución de gelatina porcina disolviendo la gelatina en agua estéril. La solución de gelatina se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 2 años.
- Preparar la solución humana de stock BMP4 (25 g/ml) disolviendo BMP4 en una solución de 4 mM de cloruro de hidrógeno (HCl)-0.2% BSA PBS. Distribuya la solución en stock como alícuotas de 50 l en criotubos. Las soluciones de stock se pueden almacenar a -20 oC hasta 1 año. Una vez descondesinado, el stock BMP4 se puede almacenar a 4 oC durante 5 días.
- Preparar la solución humana de material de VEGF (100 g/ml) disolviendo veGF en una solución de PBS de BSA al 0,2%. Distribuya la solución en stock como alícuotas de 10 l en criotubos. Las soluciones de stock se pueden almacenar a -20 oC hasta 1 año. Una vez descondesinado, el stock VEGF se puede almacenar a 4oC durante 7 días.
- Prepare la solución de stock sCF humano (100 g/ml) disolviendo SCF en una solución de PBS BSA al 0,2%. Distribuya la solución en stock como alícuotas de 5 l en criotubos. Las soluciones de stock se pueden almacenar a -20 oC hasta 1 año. Una vez descondezlado, el SCF de stock se puede almacenar a 4 oC durante 10 días.
- Prepare la solución de material de IL3 humano (10 g/ml) disolviendo IL3 en una solución DE PBS De BSA al 0,2%. Distribuya la solución en stock como alícuotas de 500 l en criotubos. Las soluciones de stock se pueden almacenar a -20 oC hasta 2 años. Una vez descondezlado, el SCF de stock se puede almacenar a 4 oC durante 15 días.
- Prepare la solución de stock de CSF1 humana (10 g/ml) disolviendo CSF1 en una solución de PBS De BSA al 0,2%. Distribuya la solución de stock como alícuotas de 1 ml en criotubos. Las soluciones de stock se pueden almacenar a -20 oC hasta 2 años. Una vez descondezlado, el SCF de stock se puede almacenar a 4 oC durante 15 días.
- Preparar soluciones de stock separadas de 10 g/ml de interferón-gamma (IFNg), interleucina 4 (IL4) e interleucina 10 (IL10) disolviéndose en soluciones de PBS BSA al 0,2%. Preparar el lipopolisacárido (LPS) en una solución en stock de (100 U/ml) disolviéndose en una solución de PBS de BSA al 0,2%. Distribuya cada solución de stock como alícuotas de 35 l. Conservar a -80oC hasta 2 años. Una vez descondezladas, las existencias se pueden almacenar a 4oC durante 7 días.
- Etapa 1: Generación de cuerpos embrionarios (día 0–día 3)
- En el día 0, agregue 2,25 mL de medios de etapa 1 (hESC-SFM complementado con 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF y 20 ng/mL SCF) en dos pozos de una placa de 6 pocillos de fijación ultrabaja.
- Sustituya los medios de mantenimiento de un pozo confluente del 80% de iPSCs en una placa de 6 pocillos con 1,5 ml de medios de etapa 1.
- Cortar colonias utilizando la herramienta de paso celular y transferir colonias cortadas con una pipeta en los dos pocillos de una placa de pozo de unión ultrabajo 6 (ver Tabla de Materiales).
- En el día 2, lleve las citoquinas a una concentración final de 50 ng/ml BMP4, 50 ng/mL VEGF y 20 ng/mL SCF utilizando 0,5 ml de medios hESC-SFM.
NOTA: Las colonias IPSC se convertirán en EBs(Figura 2A).
- Etapa 2: Emergencia de células hematopoyéticas en suspensión
- En el día 4, cubrir 4 pocillos de una placa de cultivo de tejido de 6 pozos con 0,1% p/v de gelatina e incubar durante al menos 10 min.
- Retire la gelatina y agregue 2,5 ml de medios de etapa 2 (X-VIVO15 complementado con 100 ng/mL CSF1, 25 ng/mL IL-3, 2 mM de glutamax, 1% penicilina-estreptomicina y 0,055 mM 2-mercaptoetanol).
- Recoger los EB formados en un tubo centrífugo de 50 ml y permitir que se asienten en la parte inferior del tubo por gravedad. Aspirar cuidadosamente a los medios.
- Resuspenda los EB en 2 ml de los medios de la etapa 2.
- Transfiera de 10 a 15 EB (no más de 15) a un pozo recubierto de gelatina que contenga 2,5 ml de medios de la etapa 2.
- Incubar EBs a 37oC y 5% de AIRE2.
- Cambie el soporte en los EB chapados cada 3-4 días durante 2-3 semanas.
- Después de 2-3 semanas, los EB comienzan a liberar células hematopoyéticas no adherentes en suspensión.
NOTA: Este período de liberación de la célula de suspensión puede variar y depende de la línea celular. Las células de esta suspensión se pueden cosechar y madurar en macrófagos (ver Etapa 3)(Figura 2A).
- Etapa 3: Maduración de macrófagos terminales
- Recoger las células hematopoyéticas de suspensión y reponer los medios (medios de etapa 2) en la placa EB.
- Células de suspensión centrífuga a 200 x g durante 3 min.
- Resuspender las células de suspensión en medios de estadio 3 (X-VIVO15 complementado con 100 ng/ml De CSF1, 2 mM de glutamax y 1% de penicilina-estreptomicina).
- Placa recogida y células hiladas sobre plástico no tratado placas de grado bacteriológico de 10 cm (10 ml) o 6 placas de cultivo de tejido de pozo sin recubrimiento (3 ml) a una densidad de 0,2 x 106 células/ml.
- Mantenga las celdas en los medios de la etapa 3 durante 9-11 días, cambiando los medios cada 5 días.
NOTA: Los pasos 3.4.1–3.4.5 de la Etapa 3 se pueden repetir cada 3-4 días y las células de suspensión se cosechan de la placa EB original durante un máximo de 3 meses.
- Polarización de macrófagos
- Para activar los macrófagos en un fenotipo M(LPS + IFNg), estimule las células con LPS (concentración final: 100 ng/mL) e IFNg (concentración final: 10 U/mL) durante 48 h. Para activar las células a un fenotipo M(IL4), estimule las células con IL4 (concentración final: 20 ng/ml). Para activar a un fenotipo M(IL10), estimule los macrófagos con IL10 (concentración final: 5 ng/mL).
4. Control de calidad de macróforos derivados de iPSC
- Determinar el número de células de suspensión hematopoyéticas producidas por 6 placas de pozos de EBs contándolas con un hematómetro.
- Evaluar la morfología de los macrófagos como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, la tinción de kit comercial)8,9.
-
Detectar la expresión de marcadores específicos de macrófagos y marcadores de polarización utilizando análisis de expresión génica y citometría de flujo como se describió anteriormente8,9.
- Para experimentos de citometría de flujo en un pozo de una placa de 6 pocillos de macrófagos, cosechar células mediante la aspiración de sus medios de maduración, lavar con 2 ml de PBS, e incubarcon con 2 ml de tampón de disociación de células libres de enzimas durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Pipetear hacia arriba y hacia abajo repetidamente para separar y cosechar macrófagos.
- Cuente las células con un hematitómetro y resuspenderlas en 80 sL de una solución de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA)-PBS de 2%M.
- Añadir 20 l de bloqueador de FC humano MACS.
- Incubar sobre hielo durante 20 min y proteger la luz.
- Agregue un volumen apropiado de 2% de BSA, 0,5 mM de solución DE PBS EDTA para llevar la concentración celular a 1 x 106 macrófagos/ml.
- Mancha 1 x 105 células en 100 l de 2% de BSA, 0,5 mM de solución EDTA PBS con anticuerpo correspondiente (ver NOTA a continuación) e incubar durante 15 minutos a RT protegido de la luz.
- Lavar 1x con al menos 100 ml de 2% de BSA, 0,5 mM EDTA PBS.
- Resuspenda las células en 200 sL de 2% de BSA, 0,5 mM EDTA PBS.
- Añadir 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, diluido 1:1,000) como un tinte vivo-muerto. Incubar 3 min.
- Para los análisis de citometría de flujo, puerta en la población principal, luego células individuales, y luego células vivas. En la población de células vivas, la expresión de marcador relacionada con macrófagos es evidente(Figura 3A).
NOTA: Los anticuerpos deben ser cuidadosamente valorados para cada línea celular utilizada para derivar macrófagos. Los anticuerpos presentados en la sección de resultados se encuentran en la Tabla de materiales. También se incluye el factor de dilución para los ensayos de citometría de flujo derivados de SFCi55.
5. Ensayo de fagocitosis de alto rendimiento
- Cosecha macrófagos derivados de iPSC (iPSC-DMs) aspirando los medios, añadiendo tampón de disociación de células libres de enzimas heladas e incubando durante 5 min. Recoger macrófagos pipeteando repetidamente.
- Placa 8 x 104 iPSC-DMs en un pozo de un cultivo de tejido de imagen de grado 96 placas de pozo (por ejemplo, Cellcarrier Ultra, Perkin Elmer) al menos 2 días antes de la toma de imágenes de alto rendimiento en 200 l de medios de fase 3.
- Preparar las biopartículas pHrodoGreen Zymosan-A resuponiendo un vial en 2 ml de PBS ("Solución 1"). Solución vórtice para 10 s.
- Diluir los 2 ml de suspensión de perlas PBS 1:5 con más PBS ("Solución 2").
- Sonicate Solution 2 para 8 s y solución de vórtice para 10 s. Manténgala a 4oC. Esta solución se utilizará en el paso 5.11.
- Retire el soporte en iPSC-DMs chapados y lávelo con PBS.
- Manchas iPSC-DMs con una solución PBS que contiene Hoechst 33342 diluido 1:20. Incubar durante 20 min a 37oC.
- Lave las células con PBS.
- Mancha con una solución de PBS que contiene una mancha de membrana plasmática roja profunda diluida 1:1.000 (ver Tabla de Materiales). Incubar durante 30 min a 37oC.
- Lave las células con PBS.
- Añadir 100 l de solución de perlas a 4 oC a cada pozo de iPSC-DMs. Las placas ya están listas para la toma de imágenes.
- Imagen de la placa mediante el uso de un sistema de imágenes de alto contenido y adquirir tres o más campos en el pozo para obtener una buena representación del pozo.
-
Cuantifique la fagocitosis utilizando el software Columbus (software del sistema de análisis de imágenes de alto contenido). Se puede desarrollar un algoritmo específico para el análisis inequívoco de lotes de imágenes:
- Mida la intensidad azul y defina en el software que la señal azul indica los núcleos.
- Mida la intensidad roja y defina en el software que la señal roja indica el citoplasma.
- Defina ese núcleo y el citoplasma juntos corresponde a una célula.
- Mida la intensidad verde en las células y establezca un valor estricto de corte/umbral para considerar una célula como fagocítica.
- Cuantifique la fracción de célula fagocítica y el índice fagocítico promedio por celda. Debido a que la intensidad del color del cordón es proporcional al número de perlas, la actividad fagocítica se puede medir por el número de cuentas ingeridas.
- Aplique el algoritmo/pipeline a todas las imágenes dentro de cada campo y en todos los puntos de tiempo adquiridos, lo que permite un enfoque por lotes robusto e imparcial para determinar las capacidades fagocíticas de las celdas.
NOTA: Columbus es un software de análisis de alto contenido, que ofrece análisis de segmentación celular para fenotipado celular y pruebas funcionales.
Representative Results
Progresión de diferenciación, número de macrófagos y morfología
Los resultados presentados son de la diferenciación de la línea iPSC humana SFCi55 que ha sido descrita y utilizada en una serie de estudios8,9,10,26. El proceso de diferenciación IPSC hacia los macrófagos podría ser monitoreado por microscopía óptica. las colonias iPSC, los cuerpos embrionarios (EB), las células de suspensión hematopoyéticas y los macrófagos maduros fueron morfológicamente distintos(Figura 2A). La morfología de los macrófagos maduros podría validarse aún más mediante la tinción de preparaciones de citospin centrifugado. Los macrófagos derivados de la IPSC eran grandes, y tenían pequeños núcleos de forma ovalada y abundantecitos que contenían muchas vesículas(Figura 2B).
Las primeras 2 semanas de células de suspensión hematopoyéticas cosechan (días 16–28) de una placa completa de 6 pozos de EB contenida, en promedio, 2.59 x 106 x 0.54 células. Después del día 28, se produjo un promedio de 4,64 x 106 x 0,94 de células de suspensión por cada 6 pocillos de EB. A partir del día 80, el número de células de suspensión comenzó a disminuir a medida que los EB se agotan(Figura 2C). Se recomienda detener el protocolo de diferenciación después de que los números caigan por debajo de 3 x 106 precursores por cosecha por 6 pozos de EBs.
Expresión de marcadores de superficie de células de macrófagos derivados de IPSC
La citometría de flujo sigue siendo el método más común utilizado para evaluar el fenotipo de los macrófagos humanos. La estrategia de gating para evaluar la expresión del marcador de superficie celular consiste en gating la población principal de células utilizando parámetros físicos como el tamaño y la granularidad, seguido de gating single cells y luego live cells(Figura 3A). Los macrófagos maduros derivados de iPSC deben expresar el marcador de linaje CD45 y el marcador de maduración de macrófagos 25F9, y ser negativos para el marcador de monocitos/macrófagos inmaduros CD93. Esto es consistente con nuestras observaciones(Figura 3A). Los macrófagos derivados de IPSC también fueron positivos para los marcadores mieloides de linaje CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163 y CD169(Figura 3B). Fueron positivos para el marcador de modulación inmune CD86, y una pequeña proporción de ellos expresaron receptores de quimiocina CX3CR1, CCR2, CCR5 y CCR8 en el estado ingenuo(Figura 3B). Las parcelas se obtuvieron a partir de datos publicados previamente por nuestro laboratorio8.
macrófagos derivados de iPSC fagocitosis y polarización
Una de las características clave de los macrófagos en la defensa del huésped y la homeostasis tisular es su capacidad para fagocitosa de patógenos, células apoptóticas y desechos27. La tasa de fagocitosis está estrechamente asociada con estados fenotípicos específicos28. Para evaluar la capacidad fagocítica iPSC-DM, utilizamos un sistema de imágenes de alto contenido acercarse8,9,11 que hace uso del microscopio PerkinElmer Operetta y las biopartículas de PHrodo Zymosan (conjugados de tinte sensible al pH). Las biopartículas no eran fluorescentes cuando se añadieron a los cultivos(Figura 4A),pero fluorescieron de verde brillante en el pH ácido intracelular(Figura 4B). El microscopio opereta de imágenes en vivo se puso a imágenes cada 5 minutos después de la adición de cuentas durante un tiempo total de 175 min. A continuación, se utilizó una canalización de análisis de imágenes imparcial y de alto rendimiento en la plataforma Columbus para cuantificar la actividad en términos de la fracción fagocítica que representa la proporción de células que fagoocitoson cuentas y el índice fagocítico que es una medida del número de cuentas que cada célula ingirió.
Los macrófagos pueden responder y cambiar su fenotipo dependiendo de las señales ambientales. Para evaluar su capacidad de reacción y cambio en los estímulos ambientales, los iPSC-DM pueden tratarse con LPS e IFNg, IL4 o IL10. Después de 48 h de tratamiento, cambiaron el fenotipo, aquí conocido como M (LPS + IFNg), M (IL4) y M (IL10), respectivamente29. El análisis de expresiones génicas es una herramienta útil para probar el estado de polarización de los macrófagos. Sobre la estimulación DE LPS y IFNg, los macrófagos upregulated mRNA expresión de genes CD40, VCAM1y TNFA (Figura 5A). Tras la estimulación IL4, las células upredaron la expresión del ARNm de los genes CD68, CD84y MRC1 (Figura 5B). Tras la estimulación IL10, iPSC-DMs upregulated expression of MRC1 (Figure 5B). En términos de fagocitosis, los macrófagos tratados con LPS + IFNg o IL4 mostraron un porcentaje significativamente menor de células fagocíticas en comparación con los macrófagos ingenuos. Los iPSC-DM tratados con IL10 mostraron un mayor porcentaje de células fagocíticas e índice fagocítico(Figura 5C–E).
Figura 1: Resumen gráfico de la diferenciación iPSC a macrófagos funcionales maduros. Diagrama dibujado con Biorender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: diferenciación iPSC hacia los macrófagos y el número y morfología iPSC-DM. (A) Imágenes de campo brillante obtenidas de (de izquierda a derecha): una colonia IPSC, cuerpos embrionarios (EB), células de suspensión cosechadas y macrófagos maduros. Barra de escala a 100 m. (B) Imagen de los citospins macrófagos manchados con el kit Kwik-diff. Barra de escala a 25 m. (C) Número de células de suspensión recogidas por cosecha por cada 6 pocillos de EB. Parcela muestra significa + SEM; (n 6 experimentos biológicamente independientes). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Fenotipo del marcador de superficie de la superficie de la célula del macrófago. (A) Estrategia de ampliación para el análisis de macrófagos maduros derivados de iPSC. Las células vivas individuales fueron cerradas, luego analizadas para la expresión de los marcadores de superficie celular CD45, CD93 y 25F9. Las puertas de los marcadores de superficie celular se dibujaron utilizando controles de fluorescencia menos uno (FMO). (B) Histogramas representativos de citometría de flujo para manchas únicas de iPSC-DMs (azul) y controles de isotipo (gris) para marcadores de linaje y mieloides, marcadores de modulación inmune, marcadores de maduración y receptores de quimioquina. Las parcelas son representativas de los experimentos de n a 5 experimentos biológicamente independientes para todos los marcadores de linaje y mieloides, excepto CD105 y CD206 (n.o 3); marcadores de maduración (n.o 5); marcadores de modulación inmunitaria (n.o 3); y los receptores de quimiocina (n.o 3). Las gráficas utilizan datos publicados anteriormente8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ensayos de polarización y fagocitosis IPSC-DM. Imágenes representativas de iPSC-DMs (A) inmediatamente después de la adición de cuentas verdes Zymosan pHrodo y (B) 175 min después de la adición de cuentas. El azul representa los núcleos de las células; el rojo representa el citoplasma de las células. El verde representa las perlas ingeridas (barra de escala de 20 m). (C) Fracción de macrófagos fagocíticos y (D) índice fagocítico/intensidad verde per macrófago fagocítico a lo largo del tiempo en estado ingenuo (n 6 experimentos biológicamente independientes). Las gráficas muestran el valor medio y las barras representan8el SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Evaluación de estados de polarización iPSC-DM. Cuantificación relativa de los análisis RT-PCR de iPSC-DMs ingenuos y polarizados para evaluar la expresión de (A) M(LPS+IFN-); (B) Genes asociados a M(IL4) y M (IL10) (n.o 6 experimentos biológicamente independientes; Múltiples comparaciones de ANOVA y Holm-Sidak después de la prueba. Los grupos polarizados se compararon estadísticamente con el grupo ingenuo solamente). Las gráficas muestran el valor medio y las barras de error representan la desviación estándar. ND en las gráficas: transcripción no detectada. Los datos de estas gráficas se publicaron previamente8. (C) Imágenes representativas de iPSC-DMs 175 min después de la adición de perlas pHrodo de iPSC-DMs tratadas con (de izquierda a derecha): sin citoquinas, LPS+IFN-Y, IL-4 e IL-10 (barra de escala a 20 m). (D) Fracción de macrófagos fagocíticos e (E) índice fagocítico/intensidad verde per macrófago fagocítico en tratamientos macrófagos ingenuos y polarizados 175 min después de la adición de cuentas (n 12 experimentos biológicamente independientes, comparaciones múltiples de ANOVA unidireccional y Holm-Sidak después de la prueba. Los grupos polarizados se compararon estadísticamente con el grupo ingenuo solamente). Las gráficas muestran el valor medio y las barras de error representan la desviación estándar (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El protocolo para la generación de iPSC-DMs descrito aquí es robusto y permite la producción de un gran número de células homogéneas a partir de un número relativamente pequeño de iPSC. Tras la diferenciación inicial de aproximadamente 1 x 106 iPSCs, los cultivos subsiguientes se pueden cosechar cada 4 días durante un máximo de 2-3 meses, lo que resulta en la producción de al menos 6,5 x 107 macrófagos en ese tiempo. Estos macrófagos humanos generados in vitro son morfológicamente similares a los macrófagos humanos primarios, expresan los marcadores clave de la superficie de la célula del macrófago y presentan actividad fagocítica. El protocolo para la diferenciación de macrófagos es reproducible y se puede aplicar a otras líneas celulares hiPSC y hESC, pero el tiempo preciso de la primera cosecha de los precursores de macrófagos y el número absoluto de células que se pueden generar varía entre las líneas iPSC.
Se ha demostrado que los macrófagos se pueden generar a partir de iPSC que han sido manipulados genéticamente. Por ejemplo, se insertó un casete transgéno compuesto por el reportero fluorescente ZsGreen bajo el control del promotor constitutivo de CAG en el locus AAVS1 de la línea SFCi55 iPSC, y posteriormente se demostró que esta línea iPSC podría diferenciarse en macrófagos zsGreen-expressing8. Estos macrófagos fluorescentes podrían utilizarse en el futuro para realizar un seguimiento de la migración y la estabilidad de los macrófagos terapéuticos en modelos de enfermedad. En otro estudio, los macrófagos se generaron a partir de una línea iPSC que había sido manipulada genéticamente para expresar un factor de transcripción inducido por tamoxifeno, KLF1. La activación de KLF1 en macrófagos derivados de iPSC dio lugar a la producción de macrófagos con un fenotipo comparable a los macrófagos de la isla eritroidea9. Potencialmente, esta estrategia podría utilizarse para programar genéticamente macrófagos derivados de iPSC en fenotipos asociados con otras poblaciones de macrófagos específicos de tejidos como las células Kupffer del hígado o las células de Langerhans de la piel. Esto sería posible una vez que se identifiquen los factores clave de transcripción que definen estos tipos de celda.
En cuanto al protocolo, es muy importante tener en cuenta que la condición de la población inicial de los ISPs es fundamental para una diferenciación exitosa. Los cultivos iPSC humanos pueden ser invadidos por subpoblaciones anormalmente anormales en varios pasajes, por lo que se recomienda una curación robusta de las existencias de iPSC y grandes reservas maestras de lotes sometidas al control de calidad del genoma. En nuestras manos, los protocolos de mantenimiento descritos aquí pueden mantener los iPSC karyotípicamente normales durante un máximo de 2 meses en cultivo continuo, pero esto puede variar para diferentes líneas celulares y en diferentes laboratorios. Si se encuentran problemas, es aconsejable utilizar un vial fresco de ISPC indiferenciados para cada experimento de diferenciación. Además, la cultura inicial de los iPSC indiferenciados no debe ser superior al 80% de confluentes. En la etapa de chapado de EB, solo se deben chapar entre 10 y 15 EB por pozo de una placa de cultivo de tejido de 6 pozos, y es fundamental que estos EB se extiendan uniformemente por el pozo. Un mayor número de EB y/o aglomeración de EB en el centro del pozo tuvo un efecto negativo en el número de macrófagos generados. Se debe tener cuidado al reponer los medios y cosechar células de suspensión de progenitores similares a monocitos de los cultivos de EB para evitar perturbar la adhesión de los EB a la superficie de las placas de cultivo recubiertas. El número de células de suspensión hematopoyéticas producidas aumenta gradualmente con cada cosecha, con una producción óptima entre los días 40-72 de diferenciación(Figura 2). La producción disminuye progresivamente después del día 68 y las placas tienden a agotarse después de 2,5 meses, aunque el tiempo preciso puede variar dependiendo de la línea iPSC.
Una limitación de nuestro protocolo es que no ha sido posible criopreservar las células de suspensión hematopoyéticas generadas al final de la Etapa 2. Los protocolos que se basan en la activación exógena de WNT informan sobre una tasa de recuperación del 40% después de la criopreservación, pero estos protocolos informan sólo de una cosecha celular, por lo que el número absoluto de macrófagos generados es bajo30. El protocolo descrito aquí, induciendo la señalización endógena a través de la formación de EB, se puede cosechar quincenalmente, produciendo un rendimiento total de macrófagos mucho mayor.
En resumen, presentamos un protocolo detallado para la producción de macrófagos funcionales derivados de iPSC. La creación de experimentos in vitro con macrófagos derivados de iPSC para estudiar la biología de los macrófagos en salud y enfermedad tiene muchas ventajas sobre los experimentos con macrófagos derivados de monocitos (MDM). Estas ventajas incluyen la facilidad de acceso al material (por ejemplo, no se requieren donantes), se pueden producir grandes cantidades de macrófagos, y es factible y relativamente sencillo producir macrófagos modificados genéticamente. Además, los macrófagos derivados de iPSC podrían ser un mejor recurso para el estudio de la biología de los macrófagos residentes en los tejidos.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Fiona Rossi y Claire Cryer por su ayuda con la citometría de flujo, Eoghan O'Duibhir y Bertrand Vernay con microscopía. Este trabajo fue financiado por CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) e Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust PhD studentship (A.M), MRC Precision Medicine Studentship (T.V). L.C. y J.W.P. contaron con el apoyo de Wellcome Trust (101067/Z/13/Z), el Consejo de Investigación Médica (MR/N022556/1) y cost action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350010 | |
| Abtibody CD64-APC -CY7 | Biolegend | 305026 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody 25F9-EFLUOR 660 | Ebioscience | 15599866 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CCR2-PE-Cy7 | Biolegend | 357212 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CCR5 PE | Biolegend | 313707 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CCR8 PE | Biolegend | 360603 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD11b-PE | Biolegend | 301305 | Dilution factor: 1:50 |
| Antibody CD14-APC | Ebioscience | 10669167 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CD163-PE-CY7 | BIolegend | 333614 | Dilution factor: 1:25 |
| Antibody CD169-APC | Biolegend | 346007 | Dilution factor: 1:25 |
| Antibody CD206-PE | Biolegend | 321106 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD209-PE-CY7 | Biolegend | 3310114 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD274-PE-CY7 | Biolegend | 329718 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD43-PE | Ebioscience | 10854419 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD45-APC | Ebioscience | 15577936 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CD86-APC | Biolegend | 305412 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD93-PE | Ebioscience | 10804637 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CX3CR1-PE | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody HLA-DR-BV650 | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
| Antiboy CD115-PE | Biolegend | 347308 | Dilution factor: 1:40 |
| Cell Dissociation Buffer, enzyme free | Thermofisher | 13151014 | |
| Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS | Gibco | 13151014 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well | PerkinElmer | 6055302 | |
| CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain | Thermofisher | C10046 | Cryopreservation media |
| Cryostor CS10 | Sigma | C2874 | |
| CTS CELLstart Substrate | Invitrogen | A1014201 | Stem cell substrate |
| DAPI | Merck | D9542-1MG | Final concentration 1 μg/mL |
| DPBS, calcium, magnesium (500 mL) | Thermofisher | 14040091 | |
| FcR Blocking Reagent, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHG0021 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IFNY | Thermofisher | 14-8319-80 | |
| Human Serum Albuminum | Irvine Scientific | 9988 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli | Sigma | L2630 | |
| NucBlue (Hoechst33342) | Thermofisher | R37605 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis | Thermofisher | P35365 | |
| Porcine Skin Gelatin | Sigma | G9136 | |
| Recombinant Human BMP4 Protein | R&D | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human IL10 | Preprotech | 200-10 | |
| Recombinant Human IL3 | Preprotech | 200-03-10 | |
| Recombinant Human IL4 | Preprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100 μg | Biolegend | 574806 | |
| Recombinant Human VEGF Protein | R&D | 293-VE-010 | |
| Rock Inhibitor Y-27632 | Merck | SCM075 | |
| SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHC2111 | |
| StemPro hESC SFM | Thermofisher | A1000701 | |
| StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool | Thermofisher | 23181010 | |
| Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface | Greiner | 657970 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| X-Vivo 15 500 mL bottle | Lonza | BE02-060F |
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