Summary
प्लाज्मिड डीएनए से पुनः संयोजन रोटावायरस का उत्पादन रोटावायरस प्रतिकृति और रोगजनन के अध्ययन और रोटावायरस अभिव्यक्ति वेक्टर और टीकों के विकास के लिए एक आवश्यक उपकरण प्रदान करता है। इसके साथ ही, हम फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त करने वाले उपभेदों सहित पुनः संयोजन रोटावायरस पैदा करने के लिए एक सरलीकृत रिवर्स जेनेटिक्स दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं।
Abstract
रोटावायरस खंडित डबल-फंसे आरएनए वायरस की एक बड़ी और उभरती आबादी है जो मनुष्यों सहित कई स्तनधारी और एवियन मेजबान प्रजातियों के युवा में गंभीर आंत्रशोथ का कारण बनती है। रोटावायरस रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम के हालिया आगमन के साथ, रोटावायरस जीव विज्ञान का पता लगाने, मौजूदा रोटावायरस टीकों को संशोधित करने और अनुकूलित करने और रोटावायरस मल्टीटारगेट वैक्सीन वैक्टर विकसित करने के लिए निर्देशित म्यूटाजेनेसिस का उपयोग करना संभव हो गया है। इस रिपोर्ट में, हम एक सरलीकृत रिवर्स जेनेटिक्स प्रणाली का वर्णन करते हैं जो पुनः संयोजन रोटावायरस की कुशल और विश्वसनीय वसूली की अनुमति देता है। यह प्रणाली टी7 ट्रांसक्रिप्शन वैक्टर के सह-ट्रांसफेक्शन पर आधारित है जो पूर्ण लंबाई रोटावायरस (+) आरएनए व्यक्त करती है और बीएचके कोशिकाओं में आरएनए कैपिंग एंजाइम को एनकोडिंग करने वाला सीएमवी वेक्टर संविलियन टी7 आरएनए पॉलीमरेज (बीएचके-टी7) का उत्पादन करता है। पुनः संयोजन रोटावायरस MA104 कोशिकाओं के साथ ट्रांससंक्रमित बीएचके-T7 कोशिकाओं को ओवरसीज़ करके परिलक्षित होते हैं, एक बंदर गुर्दे की कोशिका रेखा जो वायरस के विकास के लिए अत्यधिक स्वीकार्य है। इस रिपोर्ट में, हम पुनः संयोजन रोटावायरस पैदा करने के लिए एक दृष्टिकोण का भी वर्णन करते हैं जो जीनोम सेगमेंट 7 (एनएसएसपी3) में 2ए ट्रांसलेशनल स्टॉप-रीस्टार्ट तत्व की शुरुआत के माध्यम से एक अलग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त करते हैं । यह दृष्टिकोण वायरल ओपन रीडिंग फ्रेम में से किसी को हटाने या संशोधित करने से बचा जाता है, इस प्रकार एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते समय पूरी तरह से कार्यात्मक वायरल प्रोटीन को बनाए रखने वाले रिकॉम्बिनेंट रोटावायरस के उत्पादन की अनुमति देता है।
Introduction
रोटावायरस शिशुओं और छोटे बच्चों में गंभीर आंत्रशोथ के प्रमुख कारण हैं, साथ ही कई अन्य स्तनधारी और एवियन प्रजातियों के युवा1। Reoviridae परिवार के सदस्यों के रूप में, रोटावायरस एक खंडित डबल फंसे आरएनए (dsRNA) जीनोम है । जीनोम खंड प्रोटीन2की तीन गाढ़ा परतों से बनने वाले एक गैर - लिफाफे वाले इकोसाहेड्रल विरिशन के भीतर समाहित होते हैं । जीनोम खंडों के अनुक्रमण और फिलोजेनेटिक विश्लेषण के आधार पर रोटावायरस (ए−डी, एफ−जे) की नौ प्रजातियों को3परिभाषित किया गया है । रोटावायरस प्रजाति ए वाले उपभेद मानव रोग के विशाल बहुमत के लिए जिम्मेदार हैं। पिछले दशक में शुरू होने वाले बचपन के प्रतिरक्षण कार्यक्रमों में रोटावायरस टीकों की शुरूआत रोटावायरस मृत्यु दर और रुग्णता में महत्वपूर्ण कटौती के साथ सहसंबद्ध है। सबसे विशेष रूप से, रोटावायरस से जुड़ी बचपन में होने वाली मौतों की संख्या 2000 में लगभग 528,000 से घटकर 2016 में 128,500 हो गईहै4,5. रोटावायरस टीके वायरस के लाइव तनु उपभेदों से तैयार किए जाते हैं, जिसमें 6 महीने की उम्र तक बच्चों को 2 से 3 खुराक ें प्रशासित की जाती हैं। मनुष्यों और अन्य स्तनधारियों की प्रजातियों में घूम रहे आनुवंशिक रूप से विविध रोटावायरस उपभेदों की बड़ी संख्या, जो म्यूटाजेनेसिस और पुनर्वर्गीकरण के माध्यम से तेजी से विकसित होने की उनकी क्षमता के साथ संयुक्त है, बच्चों को संक्रमित करने वाले रोटावायरस के प्रकारों में एंटीजेनिक परिवर्तन का कारण बन सकती है।,7,8 इस तरह के परिवर्तन मौजूदा टीकों की प्रभावकारिता को कमजोर कर सकते हैं, उनके प्रतिस्थापन या संशोधन की आवश्यकता है ।
11 रोटावायरस जीनोम खंडों में से किसी में हेरफेर को सक्षम करने वाली पूरी तरह से प्लाज्मिड आधारित रिवर्स जेनेटिक्स प्रणालियों का विकास हाल ही में9हासिल किया गया था। इन प्रणालियों की उपलब्धता के साथ, रोटावायरस प्रतिकृति और रोगजनन के आणविक विवरणों को सुलझाना, एंटी-रोटावायरस यौगिकों के लिए बेहतर उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधियों को विकसित करने और रोटावायरस टीकों के नए संभावित अधिक प्रभावी वर्ग ों को बनाने के लिए संभव हो गया है। रोटावायरस प्रतिकृति के दौरान, छाया हुआ वायरल (+) आरएनए न केवल वायरल प्रोटीन के संश्लेषण का मार्गदर्शन करता है, बल्कि संतान डीएसआरएनए जीनोम सेगमेंट10,,11के संश्लेषण के लिए टेम्पलेट्स के रूप में भी काम करता है। आज तक वर्णित सभी रोटावायरस रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम सीटीएना-व्युत्पन्न (+) आरएनए के स्रोत के रूप में स्तनधारी कोशिका रेखाओं में T7 प्रतिलेखन वेक्टर के ट्रांसफेक्शन पर भरोसा करते हैं जो पुनः संयोजन,वायरस9,,12,13को ठीक करने में उपयोग किया जाता है। प्रतिलेखन वैक्टर के भीतर, पूर्ण लंबाई वायरल सीडीएनए एक अपस्ट्रीम T7 प्रमोटर और डाउनस्ट्रीम हेपेटाइटिस डेल्टा वायरस (HDV) रिबोज़िम के बीच तैनात हैं जैसे कि वायरल (+) आरएनए T7 आरएनए बहुलक द्वारा संश्लेषित किए जाते हैं जिसमें प्रामाणिक 5 ' और 3'-टर्मिनी(चित्रा 1A)होते हैं। पहली पीढ़ी के रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम में, 11 टी7 (pT7) ट्रांसक्रिप्शन वैक्टर के साथ T7 आरएनए पॉलीमरेज (बीएचके-टी7) को व्यक्त करने वाले बेबी हम्सटर किडनी कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करके पुनः संयोजन वायरस बनाए गए थे, सिमियन SA11 वायरस तनाव के एक अद्वितीय (+) आरएनए के प्रत्येक निर्देशन संश्लेषण, और तीन सीएमवी प्रमोटर-ड्राइव अभिव्यक्ति प्लाज्मिड्स, एक एवियन reovirus p10FAST संलयन प्रोटीन और vaccinia वायरस D1R-D12L कैपिंग एंजाइम परिसर9के दो एन्कोडिंग उपइकाइयों को एन्कोडिंग । ट्रांससंक्रमित बीएचके-टी7 कोशिकाओं में उत्पन्न पुनः संयोजन SA11 वायरस MA104 कोशिकाओं के साथ ओवरसीज़िंग द्वारा परिलक्षित किए गए थे, रोटावायरस विकास के लिए एक सेल लाइन स्वतंत्र। पहली पीढ़ी के रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम के एक संशोधित संस्करण का वर्णन किया गया है कि अब समर्थन प्लाज्मिड्स12का उपयोग करता है । इसके बजाय, संशोधित प्रणाली सफलतापूर्वक 11 SA11 T7 प्रतिलेखन वैक्टर के साथ बीएचके-T7 कोशिकाओं को स्थानांतरित करके पुनः संयोजन रोटावायरस उत्पन्न करती है, चेतावनी के साथ कि वायरल कारखाने (विरोप्लाज्म) बिल्डिंग ब्लॉक (गैर संरचनात्मक प्रोटीन NSP2 और NSP5) के लिए वैक्टर अन्य वैक्टर14, 14,,15की तुलना में 3 गुना अधिक स्तरों पर जोड़े जाते हैं। रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम के संशोधित संस्करण भी विकसित किए गए हैं जो रोटावायरस16,17के मानव केयू और ओडलिया उपभेदों की वसूली का समर्थन करते हैं । रोटावायरस जीनोम रिवर्स जेनेटिक्स द्वारा हेरफेर करने के लिए उल्लेखनीय रूप से उत्तरदायी है, जिसमें वीपी418,एनएसएसपी19,एनएसपी219,एनएसपी320,,21और एनएसएसपी522,,23में उत्परिवर्तन के साथ आज तक उत्पन्न पुनः संयोजन वायरस उत्पन्न होते हैं। अब तक उत्पन्न किए गए सबसे उपयोगी वायरसों में वे हैं जिन्हें फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन (एफपी)9,12,,21,24,25व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया है ।
इस प्रकाशन में, हम रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिसे हम अपनी प्रयोगशाला में SA11 रोटावायरस के पुनर्संयोजन उपभेदों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग करते हैं। हमारे प्रोटोकॉल की प्रमुख विशेषता 11 pT7 प्रतिलेखन वैक्टर के साथ बीएचके-T7 कोशिकाओं का सह-ट्रांसफेक्शन है (pT7/NSP2SA11 और pT7/NSP5SA11 वैक्टर) के 3x स्तर को शामिल करने के लिए संशोधित और अफ्रीकी सूअर बुखार वायरस (ASFV) NP868R कैपिंग एंजाइम21 Figure 2 हमारे हाथों में, NP868R प्लाज्मिड की उपस्थिति ट्रांससंक्रमित बीएचके-टी7 कोशिकाओं द्वारा पुनः संयोजन वायरस के उच्च टिटर के उत्पादन की ओर ले जाती है। इस प्रकाशन में, हम pT7/NSP3SA11 प्लाज्मिड को संशोधित करने के लिए एक प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं जैसे कि पुनः संयोजन वायरस उत्पन्न किए जा सकते हैं जो न केवल सेगमेंट 7 प्रोटीन उत्पाद NSP3 बल्कि एक अलग एफपी को भी व्यक्त करते हैं। यह पीटी7/एनएसपी3एसए11 प्लाज्मिड में एनएसपी 3 ओपन रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) को फिर से इंजीनियरिंग करके पूरा किया जाता है ताकि एक डाउनस्ट्रीम 2A ट्रांसलेशनल स्टॉप-रीस्टार्ट तत्व हो सके जिसके बाद एफपी ओआरएफ(चित्रा 1बी)24,,26। इस दृष्टिकोण के माध्यम से, हमने विभिन्न एफपी व्यक्त करते हुए पुनः संयोजन रोटावायरस उत्पन्न किया है: UnaG (ग्रीन), एमकेट (दूर-लाल), एमएमआई (लाल), टैगबीआरपी (नीला), सीएफपी (सियान), और वाईएफपी (पीला)24,,27,,28। ये एफपी-एक्सप्रेसिंग रोटावायरस NSP3 ORF को हटाने के बिना किए जाते हैं, इस प्रकार वायरस पैदा होते हैं जो वायरल प्रोटीन के कामकाज के पूर्ण पूरक को एन्कोड करने की उम्मीद करते हैं।
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Protocol
1. मीडिया की तैयारी और सेल संस्कृति रखरखाव
- बच्चे हम्सटर गुर्दे की कोशिकाओं को प्राप्त करें संविलियन T7 आरएनए बहुलक (BHK-T7) और अफ्रीकी हरे बंदर गुर्दे MA104 कोशिकाओं को व्यक्त करते हैं ।
नोट: बीएचके-T7 (या बीएसआर-T7) कोशिकाएं व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, लेकिन आरएनए वायरस जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए रिवर्स जेनेटिक्स का उपयोग करप्रयोगशालाओं की एक आम सेल लाइन हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली बीएचके-टी7 सेल लाइन डॉ उर्सुला जे बुचोल्ज (नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ, बेथेस्डा, एमडी, यूएसए), टी 7 आरएनए पॉलीमरेज29को व्यक्त करने वाली मूल बीएचके सेल लाइन के सह-डेवलपर से प्राप्त की गई थी। MA104 कोशिकाएं प्रमाणित सेल संस्कृतियों (ईसीएसीसी) के यूरोपीय संग्रह और अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह (एटीसीसी) से उपलब्ध हैं। - एक बाँझ वातावरण में निम्नलिखित संस्कृति मीडिया तैयार करें, अधिमानतः एक वर्ग द्वितीय जैविक सुरक्षा कैबिनेट। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में मीडिया स्टोर और उपयोग करने से तुरंत पहले 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म।
नोट: मीडिया घटकों के स्रोत सामग्री की तालिका में प्रदान किए जाते हैं।- DMEM अधूरा माध्यम तैयार करने के लिए, Dulbecco संशोधित ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (MEM) के ५०० mL गठबंधन ४.५ ग्राम/एल ग्लूकोज और 1% ग्लूटामाइन युक्त 100x कलम के 5 mL के साथ-strep ।
- डीएमईएम पूरा माध्यम तैयार करने के लिए, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 25 मिलील के साथ डीएमईएम अधूरा माध्यम के 500 मिलील को मिलाएं।
- जीएमईएम अधूरा माध्यम तैयार करने के लिए, ग्लासगो न्यूनतम आवश्यक माध्यम के 500 मिलीग्राम, 100x ग्लूटामाइन के 5 mL, ट्रिप्टोज-फॉस्फेट शोरबा (टीपीबी) के 50 मिलील, 100x गैर जरूरी अमीनो एसिड (एनईएए) के 5 मिलीएल और 100x पेन-स्ट्रेप के 5 एमएल को मिलाएं।
- जीएमईएम पूरा माध्यम तैयार करने के लिए, गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस के 25 मिलीग्राम के साथ जीएमईएम अधूरे माध्यम के 500 मिलीग्राम को मिलाएं।
- जीएमईएम +जी कंप्लीट मीडियम तैयार करने के लिए जीएमईएम कंप्लीट मीडियम के 500 मिलीग्राम में 50 एमजी/एमएल जेनेटिकिन (जी418) का 10 मिलील जोड़ें।
- एसएमई अधूरा माध्यम तैयार करने के लिए, जोलिक के संशोधित ईगल के एमईएम के 500 मिलील, 100x ग्लूटामाइन के 5 मिलील, टीपीबी के 50 मिलील, 100x एनईएए के 5 मिलीएल और 100x पेन-स्ट्रीप के 5 मिलीएल को मिलाएं।
- T75 या T175 फ्लास्क में संस्कृति MA104 कोशिकाओं को क्रमशः डीएमईएम पूर्ण माध्यम के 12 या 25 मिलीग्राम युक्त फ्लास्क। MA104 कोशिकाओं को पारित करने के लिए जो 100% कन्फ्ल्युचर तक पहुंच गए हैं, फॉस्फेट-बफर्ड लवलाइन (पीबीएस) के साथ सेल मोनोलेयर 2x को कुल्ला करते हैं, ट्राइप्सिन (0.05%) - ईडीटीए (0.1%) समाधान, और DMEM अधूरा माध्यम के 5 (T75 फ्लास्क) या (T175 फ्लास्क) के 10 मिलील में फिर से निलंबित ।
- ताजा फ्लैक्स में पुनर्निलंबित कोशिकाओं के 0.5−1.0 mL रखें और DMEM पूरा माध्यम जोड़कर उचित अंतिम मात्रा में लाएं। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में फ्लास्क रखें।
- T75 फ्लैक्स में बीएचके-T7 कोशिकाओं का प्रचार करें, जो जीएमईएम और जीएमईएम + जी के उपयोग के बीच बारी-बारी से पारित होने के प्रत्येक दौर के साथ हैं। 100% कन्फ्लोरेंसी तक पहुंच चुकी बीके-टी7 कोशिकाओं को उपसंस्कृति के लिए, पीबीएस के साथ सेल मोनोलेयर 2x को कुल्ला, ट्राइप्सिन-ईटीए समाधान के साथ अलग करना, और मध्यम के 5 मिलील में फिर से निलंबित करना।
- एक ताजा T75 फ्लास्क में जेम या जीएमईएम + जी पूर्ण माध्यम के 15 मिलील रखने के बाद, फिर से निलंबित बीएचके-T7 कोशिकाओं की चार बूंदें जोड़ें। फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
2. प्लाज्मिड तैयारी
- ऐडजीन से रोटावायरस SA11 (+) आरएनए व्यक्त करते हुए निम्नलिखित प्लाज्मिड प्राप्त करें: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP4SA11, और pT7/NSP5SA11 21 लेखकों से ASFV कैपिंग एंजाइम (pCMV/NP868R)21व्यक्त प्लाज्मिड प्राप्त करें ।
नोट: संशोधित pT7/NSP3SA11 प्लाज्मिड्स एक 2A अनुवाद तत्व (pT7/NSP3-2A-3xFL-FP) की गतिविधि के माध्यम से एक एफपी व्यक्त करने के लिए इंजीनियर भी लेखकों से प्राप्त किया जा सकता है24,,26। PT7/NSP3-2A-3xFL-FP प्लाज्मिड्स निम्नलिखित एफपीएस व्यक्त उपलब्ध हैं: UnaG (ग्रीन), mKate (दूर लाल), mRuby (लाल), TagBFP (नीला), CFP (cyan), और YFP (पीला)24। - प्लाज्मिड्स को सक्षम ईमें बदलें । कोलाई DH5α और उचित एंटीबायोटिक युक्त लुरिया शोरबा आगर प्लेटों पर बैक्टीरिया फैल गया । व्यक्तिगत उपनिवेशों से चुनी गई जीवाणु संस्कृतियों को बढ़ाएं और निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्पिन मिनीप्रेप शुद्धिकरण किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके प्लाज्मिड (20 μg) की छोटी मात्रा तैयार करें। मिडी और मैक्सी शुद्धिकरण किट(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करबैक्टीरियल संस्कृतियों से प्लाज्मिड की बड़ी मात्रा में तैयार करें।
नोट: रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम में उपयोग के लिए उपयुक्त प्लाज्मिड ्स को अन्य प्लाज्मिड शुद्धिकरण किट के साथ भी तैयार किया गया है। विशेष रूप से एंडोटॉक्सिन-मुक्त सामग्री उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन की गई किट का उपयोग करके प्लाज्मिड तैयार करना आवश्यक नहीं है। - नुकलीज-फ्री मॉलिक्यूलर बायोलॉजी ग्रेड वॉटर में 1 मिलीग्राम/mL के लिए शुद्ध प्लाज्मिड की सांद्रता समायोजित करें । स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके ~ 1.8 के 260/280 अवशोषअनुपात की पुष्टि करके प्लाज्मिड शुद्धता की जांच करें। इसके अलावा, 0.8% अगारोज जैल पर इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग यह सत्यापित करने के लिए करें कि प्लाज्मिड मुख्य रूप से सुपरकॉइल हैं।
- अलीकोट 0.5 मीटर बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में शुद्ध प्लाज्मिड, प्रत्येक में 10 माइक्रोन युक्त। - 80 डिग्री सेल्सियस पर प्लाज्मिड स्टोर करें।
3. पुनः संयोजन वायरस की पीढ़ी
नोट: मानव और पशु रोटावायरस अनुसंधान, जिसमें पुनर्संयोजन रोटावायरस उपभेदों की पीढ़ी और लक्षण वर्णन शामिल है, को बायोसेफ्टी लेवल 2 (बीएसएल-2) शर्तों के तहत संभाला जाना चाहिए और संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) द्वारा पूर्व अनुमोदन की आवश्यकता होगी। रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र (सीडीसी)30द्वारा उत्पादित माइक्रोबायोलॉजिकल और बायोमेडिकल लेबोरेटरीज (बीएमबीएल) में बायोसेफ्टी में उपयुक्त बीएसएल-2 प्रयोगशाला स्थितियों का वर्णन किया गया है।
- 1 दिन: बीएचके-T7 कोशिकाओं की सीडिंग 12-अच्छी तरह से प्लेटों में
- पीबीएस के साथ T75 फ्लास्क 2x में निहित बीएचके-टी7 कोशिकाओं के एक हौसले से सांवलुएंट मोनोलेयर को कुल्ला करें। ट्राइप्सिन-ईडीटीए समाधान के साथ सेल मोनोलेयर को बाधित करें और जीएमईएम पूर्ण माध्यम के 5 मिलील में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
- माध्यम में व्यवहार्य बीएचके-टी7 कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर और ट्राइपैन-ब्लू समाधान का उपयोग करें। 12-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों में बीज कोशिकाओं, प्रत्येक अच्छी तरह से GMEM (G418-मुक्त) पूरा माध्यम के 1 मिलील की कुल मात्रा में 2 x 105 कोशिकाओं युक्त के साथ । 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटर। कोशिकाओं को 2 दिन तक 80−90% कन्फ्ल्युचर तक पहुंचना चाहिए।
- दूसरा दिन: प्लाज्मिड मिश्रण के साथ बीएचके-T7 कोशिकाओं का ट्रांसफेक्शन
- प्लाज्मिड मिश्रण तैयार करने के लिए, प्लाज्मिड स्टॉक का उपयोग करके 0.5 एमएल माइक्रोसेंटिफ्यूज ट्यूब में निम्नलिखित को 1 मिलीग्राम/एमएल में समायोजित करें: SA11 pT7 प्लाज्मिड ्स VP1 में से प्रत्येक 0.8 माइक्रोन, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 और NSP4, SA11 pT7 प्लाज्मिड्स NSP2 और NSP5 के प्रत्येक 2.4 μL, और pCMV/NP868R के 0.8 μL। धीरे-धीरे ट्यूब को टैप करके प्लाज्मिड मिलाएं और पल्स सेंट्रलाइज्ड द्वारा सामग्री एकत्र करें। एफपीएस व्यक्त करने वाले पुनः संयोजन वायरस तैयार करने के लिए, pT7/NSP3SA11 को उचित pT7/NSP3-2A-3xFL-FP प्लाज्मिड के साथ प्रतिस्थापित करें ।
नोट: प्लाज्मिड मिश्रण का उपयोग होने तक बर्फ पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। प्रत्येक ट्रांसफेक्शन के लिए एक अलग ट्यूब तैयार की जानी चाहिए। - प्लाज्मिड/कम सीरम मीडियम/ट्रांसफेक्शन रिएजेंट मिश्रण तैयार करने के लिए: प्रत्येक प्लाज्मिड मिश्रण में प्रीवार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) कम सीरम मीडियम(सामग्री की तालिका)के 110 माइक्रोन जोड़ें और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। बाद में, प्रत्येक प्लाज्मिड/कम सीरम मध्यम मिश्रण में ट्रांसफेक्शन रिएजेंट(सामग्री की तालिका)के 32 माइक्रोन जोड़ें; यह मिश्रण में प्लाज्मिड के प्रति μg ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के 2.5 μL की एकाग्रता पैदा करता है। भंवर मिश्रण धीरे और 20 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
- 20 मिन ऊष्मायन अवधि के दौरान, 12-अच्छी प्लेटों में बीएचके-टी7 कोशिकाओं को कुल्ला (1 दिन पर तैयार) एक बार GMEM अधूरा मीडिया के 2 mL के साथ। बाद में, प्रत्येक कुएं में एसएमई अधूरा माध्यम का 1 mL जोड़ें और इनक्यूबेटर में प्लेटें वापस करें।
- 20 मिन ऊष्मायन अवधि के बाद, प्लाज्मिड/कम सीरम मीडियम/ट्रांसफेक्शन मिश्रण ड्रॉप-बाय-ड्रॉप को 200 माइक्रोन पाइपेटर का उपयोग करके 12-अच्छी तरह प्लेटों में से प्रत्येक कुएं में जोड़ें। धीरे-धीरे प्लेटें रॉक करें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर पर लौटें।
- प्लाज्मिड मिश्रण तैयार करने के लिए, प्लाज्मिड स्टॉक का उपयोग करके 0.5 एमएल माइक्रोसेंटिफ्यूज ट्यूब में निम्नलिखित को 1 मिलीग्राम/एमएल में समायोजित करें: SA11 pT7 प्लाज्मिड ्स VP1 में से प्रत्येक 0.8 माइक्रोन, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 और NSP4, SA11 pT7 प्लाज्मिड्स NSP2 और NSP5 के प्रत्येक 2.4 μL, और pCMV/NP868R के 0.8 μL। धीरे-धीरे ट्यूब को टैप करके प्लाज्मिड मिलाएं और पल्स सेंट्रलाइज्ड द्वारा सामग्री एकत्र करें। एफपीएस व्यक्त करने वाले पुनः संयोजन वायरस तैयार करने के लिए, pT7/NSP3SA11 को उचित pT7/NSP3-2A-3xFL-FP प्लाज्मिड के साथ प्रतिस्थापित करें ।
- 4 दिन: MA104 कोशिकाओं के साथ ट्रांससंक्रमित बीएचके-T7 कोशिकाओं को ओवरसीडिंग
- PBS के साथ एक T75 फ्लास्क 2x में निहित MA104 कोशिकाओं के एक हौसले से शंकुदार मोनोलेयर कुल्ला । ट्राइप्सिन-ईडीटीए समाधान का उपयोग करमोनोलेयर को बाधित करें और डीएमईएम पूर्ण माध्यम के 5 मिलील में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
- एक स्वचालित सेल काउंटर और ट्राइपैन-ब्लू समाधान का उपयोग करके, माध्यम में व्यवहार्य MA104 कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करें। डीएमईएम अधूरे माध्यम में 8 x 105 MA104 कोशिकाओं/mL के लिए एकाग्रता समायोजित करें और ट्रांससंक्रमित बीएचके-T7 कोशिकाओं वाले कुओं में निलंबित कोशिकाओं (2 x 105 कोशिकाओं) ड्रॉपवाइज के ०.२५ मिलील जोड़ें ।
- प्रत्येक कुएं में 1 मिलीग्राम/एमएल ट्रिप्सिन स्टॉक के 0.8 माइक्रोन जोड़कर मध्यम में ट्राइप्सिन (पोर्सिन अग्नाशय प्रकार IX) की एकाग्रता को समायोजित करें।
नोट: ट्राइप्सिन स्टॉक ्स पीबीएस में तैयार किया जाना चाहिए, जिसे अलीकोट किया जाना चाहिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। - शेष MA104 कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए 6 अच्छी तरह से प्लेटें है कि 7 दिन पर की जरूरत होगी पुनः संयोजन वायरस बढ़ाना तैयार करते हैं । 6-अच्छी प्लेटों को बीज करने के लिए, DMEM पूर्ण माध्यम में 1.5 x 105 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता के लिए MA104 कोशिकाओं को पतला कर दिया जाता है और प्रत्येक कुएं में 2 किलोएल रखें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेटें रखें।
- 7 दिन: ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं से पुनरीमंडल वायरस की वसूली और प्रवर्धन
- विषय BHK-T7/MA104 कोशिकाओं में 12 अच्छी तरह से प्लेटों को बाँझ परिस्थितियों में फ्रीज के तीन चक्रों के लिए,-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और एक कमरे के तापमान की सतह के बीच चलती प्लेटें । 1.5 मीटर ट्यूबों में लिसेट्स स्थानांतरित करने के बाद, 500 x ग्राम (4 डिग्री सेल्सियस) पर 10 00 के लिए सेंट्रलाइज ट्यूब बड़े सेलुलर मलबे को गोली देते हैं। सुपरनेटेंट को कलेक्ट करें और 4 डिग्री सेल्सियस (शॉर्ट टर्म) या -20 डिग्री सेल्सियस (लॉन्ग टर्म) पर स्टोर करें।
- पीबीएस के साथ 6-अच्छी प्लेटों (4 दिन पर तैयार) 2x में MA104 मोनोलेयर धोएं। डीएमईएम के 2 mL को प्रत्येक कुएं में अधूरा रखें जिसमें 0.5 μg/mL ट्राइप्सिन हो। बीएचके-टी7/एमए104 सेल से बरामद 300 माइक्रोन को कुएं में डालकर 37 डिग्री सेल्सियस, 5 प्रतिशत सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेटें लगाएं।
- 7 दिनों के लिए या पूर्ण साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) देखे जाने तक इनक्यूबेट प्लेटें। फ्रीज-गल के तीन चक्रों द्वारा 6-अच्छी तरह की प्लेटों में Lyse MA104 कोशिकाओं, तो 1.5 mL माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के लिए lysates हस्तांतरण। 500 x ग्राम (4 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिन के लिए सेंट्रलाइज्ड द्वारा पैलेट बड़ा सेलुलर मलबा। स्पष्ट सेल को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
4. पुनः संयोजन वायरस के पट्टिका अलगाव
- 10 माइक्रोन/एमएल की अंतिम एकाग्रता में ट्राइप्सिन जोड़कर और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करके स्पष्ट सेल लाइसेट्स के 100 माइक्रोन में वायरस को सक्रिय करें। DMEM अधूरे माध्यम में10-1 से 10-7 (1 mL प्रत्येक) तक 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने की श्रृंखला तैयार करें।-7
- 6-अच्छी प्लेटों में MA104 मोनोलेयर कुल्ला 2x पीबीएस के 2 मिलील के साथ और एक बार DMEM अधूरा माध्यम के साथ । प्लेटों में डुप्लीकेट में लिसैट कमजोरके के 400 मीटर जोड़ें। एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें, मोनोलेयर में कमजोरियों को पुनर्वितरित करने के लिए हर 10−15 टिन का कमाल करें।
- माइक्रोवेव ओवन का उपयोग करके पानी में पिघलने वाले 1.5% अगारोज के साथ 2x ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (EMEM; 37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्वगामी) के समान मात्रा को मिलाकर एक अगारोज-एमईएम ओवरले समाधान तैयार करें और 45 डिग्री सेल्सियस तक प्रीकूल्ड किया गया है। पानी के स्नान का उपयोग करके 42 डिग्री सेल्सियस पर ओवरले समाधान बनाए रखें और कोशिकाओं को रखने से तुरंत पहले 0.5 μg/mL ट्राइप्सिन की अंतिम एकाग्रता में समायोजित करें।
- 6-अच्छी प्लेटों से लिसैट कमजोर हो जाएं, फिर अधूरे डीएमईएम के 2 मिलील के साथ एक बार कोशिकाओं को कुल्ला करें। प्रत्येक कुएं में निहित सेल मोनोलेयर पर अगारोज-एमईएम ओवरले समाधान के 3 मिलील को धीरे से ओवरले करें। आगगुलाब ओवरले को कमरे के तापमान पर कठोर होने दें, फिर इनक्यूबेटर पर प्लेटें वापस करें।
- तीन दिन बाद, चरण 4.3 के रूप में एक अगारोज-एमईएम ओवरले समाधान तैयार करें और 42 डिग्री सेल्सियस तक लाएं। उपयोग करने से तुरंत पहले, ओवरले समाधान को 50 μg/mL तटस्थ लाल(सामग्री की तालिका)की अंतिम एकाग्रता में समायोजित करें।
- 6-अच्छी प्लेटों में मौजूदा अगारोज परत के शीर्ष पर ओवरले समाधान के 2 mL जोड़ें। नई अगारोज परत को कठोर करने की अनुमति देने के बाद, इनक्यूबेटर में प्लेटें वापस करें। तटस्थ लाल युक्त समाधानों और प्लेटों को प्रकाश के संपर्क से बचाएं।
- अगले 6 घंटे से अधिक, एक प्रकाश बॉक्स की सहायता से 6-अच्छी प्लेटों में रोटावायरस सजीले टुकड़े की पहचान करें। डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट्स का उपयोग करके स्पष्ट रूप से परिभाषित सजीले टुकड़े चुनें, जो पूरी तरह से सेल परत तक विस्तारित अगारोज प्लग को ठीक करें।
- एक १.५ mL डीएमईएम अधूरा माध्यम और भंवर के ०.५ mL युक्त ट्यूब में प्लग निष्कासित 30 एस के लिए नमूना पट्टिका-अलग वायरस 6 में MA104 मोनोलेयर पर प्रचार द्वारा मध्यम में eluted-अच्छी तरह से प्लेटों या T25 DMEM अधूरा माध्यम और ०.५ μg/mL ट्रिप्सिन युक्त फ्लैक्स ।
नोट: पट्टिका परख द्वारा रोटावायरस के अलगाव और टिटरिंग के बारे में अतिरिक्त जानकारी अर्नोल्ड एट अल31में उपलब्ध है ।
5. वायरल डीएसआरएनए के जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस
- स्पष्ट संक्रमित कोशिका के 600 माइक्रोन और ग्वानिडिनियम के 400 माइक्रोनल 1.5 एमएल माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूबमें, 30 एस के लिए भंवर, और 5 मिन के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। 200 माइक्रोन क्लोरोफॉर्म, 30 एस के लिए भंवर और 3 मिन के लिए इनक्यूबेट जोड़ें। 13,000 x जी (4 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिन के लिए अपकेंद्री के बाद, ऊपरी जलीय चरण के ~ 550 माइक्रोन को ताजा ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
- ठंडी आइसोप्रोपाइल अल्कोहल और इन्वर्टिंग ट्यूब 4−6x के 2 वॉल्यूम (~ 900 माइक्रोन) जोड़कर जलीय चरण से वायरल डीएसआरएनए को ठीक करें। 10 मिन के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेटिंग के बाद, 10 मिन के लिए 13,000 x ग्राम (4 डिग्री सेल्सियस) पर अपकेंद्रित्र ट्यूब। अधिनायकों को त्यागें और आरएनए छर्रों को बनाए रखें।
- टटोलने वाले को ट्यूब में 75% इथेनॉल का 1 एमएल जोड़कर, एक बार उलटा करके, और 5 मिन के लिए 7,500 x g (4 डिग्री सेल्सियस) पर अपकेंद्री से धोएं। एक पाइपेटर के साथ इथेनॉल धोने को सावधानीपूर्वक हटाने के बाद, आरएनए छर्रों को 5−10 मिनट के लिए लैब बेंच पर हवा-सूखी करने की अनुमति दें। 15 माइक्रोन में आरएनए छर्रों को न्यूकलीज-फ्री मॉलिक्यूलर बायोलॉजी ग्रेड वॉटर में घोलें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 6x डीएनए लोडिंग बफर के 2 μL के साथ भंग आरएनए नमूनों के 10 μL गठबंधन, प्रीकास्ट पर लोड 10% पॉलीएक्रिलामाइड मिनी जैल (या हाथ से कलाकारों समकक्ष), और Tris में इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा RNAs हल-ग्लाइसिन एक निरंतर वर्तमान (16 एमए) के तहत 2 घंटे के लिए बफर चल रहा है । ~ 1 μg/ml एथिडियम ब्रोमाइड युक्त पानी में 5−10 मिन के लिए जैल भिगोएं और यूवी ट्रांसलिलाइटर के साथ रोटावायरस जीनोम सेगमेंट का पता लगाएं।
6. वायरल डीएसआरएनए की वसूली और अनुक्रमण
- न्यूक्लिक-एसिड क्रॉसलिंक पैदा करने से बचने के लिए पॉलीएक्रिलामाइड जैल पर वायरल डीएसआरएनए बैंड का पता लगाएं, जो अधिमानतः कम तीव्रता वाले लंबी तरंगदैर्ध्य यूवी लाइट का उपयोग करते हैं। एक ताजा रेजर ब्लेड का उपयोग करके, dsRNA बैंड युक्त जेल के टुकड़े को काट दें और 1.5 मीटर माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
- RNase मुक्त पानी के 10−20 μL जोड़ने के बाद, एक RNase मुक्त डिस्पोजेबल पैलेट मूसल के साथ प्रत्येक टुकड़े को कुचलने के लिए एक १.५ mL माइक्रोसेंरिफ्यूज ट्यूब फिट या एक 18 जी सुई के माध्यम से ऊपर और नीचे ड्राइंग द्वारा डिजाइन । इनक्यूबेट ने रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर टुकड़ों को कुचल दिया।
- कुचल जेल के टुकड़ों वाली ट्यूबों से तरल के 3 μL ठीक करें। वायरल dsRNAs के सीडीएनए उत्पन्न एक कदम रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) किट(सामग्री की तालिका)और उपयुक्त ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर का उपयोग करके।
नोट: पीसीआर उत्पादों को पीसीआर क्लीन-अप किट(सामग्री की तालिका)के साथ जेल-शुद्ध किया जाता है और वाणिज्यिक डीएनए अनुक्रम सेवाओं द्वारा प्राइमर के साथ रात भर अनुक्रमण के लिए बाहर भेजा जाता है।
7. वायरल प्रोटीन का इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण
- डीईएम पूर्ण माध्यम के 2 मीटर की कुल मात्रा में 3 x 105 MA104 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से बीज 6-अच्छी तरह से प्लेटें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेटें रखें और कोशिकाओं तक पहुंचने तक छोड़ दें (3−5 दिन)।
नोट: शंख मोनोलेयर वाले कुओं में ~ 1.2 x 106 कोशिकाएं होंगी। - उनके भीतर निहित पुनः संयोजन रोटावायरस कणों को सक्रिय करने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 μg/mL ट्राइप्सिन के साथ इनक्यूबेटिंग करके स्पष्ट सुपरनेट्स का इलाज करें।
- 6-अच्छी प्लेटों में MA104 मोनोलेयर कुल्ला पीबीएस के 2 mL के साथ 2x। प्रत्येक कुएं में जोड़कर कोशिकाओं को संक्रमित करें, 200 माइक्रोन इनोकुलम युक्त 3−5 पट्टिका बनाने वाली इकाइयां (PFU) DMEM अधूरा माध्यम में ट्राइप्सिन-सक्रिय रोटावायरस की प्रति कोशिका। इनक्यूबेटर पर प्लेटें वापस करें।
- हर 10 मिन, प्लेटों को हटा दें और सेल मोनोलेयर में इनोकुलम को पुनर्वितरित करने के लिए धीरे-धीरे रॉक करें। 1 घंटे के बाद, एमडीएमएम अधूरे माध्यम के 2 मिलील के साथ इनोकुलम की जगह।
- 8 घंटे के बाद संक्रमण पर, 6 में कोशिकाओं कुल्ला-अच्छी तरह से प्लेटें पीबीएस के साथ 2x । पीबीएस के 750 माइक्रोन में कोशिकाओं को कुरेदना और एक 1.5 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब के लिए मात्रा हस्तांतरण। पीबीएस के एक और 750 μL के साथ थाली कुल्ला और पिछले एकत्र 750 μL नमूने के साथ गठबंधन।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा नमूना में पैलेट कोशिकाओं। सुपरनेटेंट को छोड़ने के बाद, आगे की प्रक्रिया तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल छर्रों को स्टोर करें।
- सेल लिसिस बफर तैयार करें जिसमें 300 एमएम एनसीएल, 100 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4, 2% ट्राइटन एक्स-100 और 1x ईटीए-फ्री कंप्लीट अवरोधक होते हैं। जमे हुए सेल छर्रों के लिए lysis बफर के ३०० μL जोड़ने के बाद, संक्षेप में भंवर नमूने और 10 min के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट ।
- बर्फ 3x पर भंवर और इनक्यूबेटिंग नमूनों की प्रक्रिया दोहराएं। बाद में, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 15,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र नमूने, फिर सुपरनेटेंट एकत्र करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- प्रीकास्ट रैखिक 8−16% पॉलीएक्रिलामाइड मिनी जैल पर इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा सुपरनेटेंट नमूनों की 20 माइक्रोन वॉल्यूम में निहित प्रोटीन को हल करें और नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित करें। पीबीएस-ट्वीन 20 (0.02%) के साथ इनक्यूबेटिंग करके झिल्ली को ब्लॉक करें 5% नॉनफैट ड्राई मिल्क युक्त समाधान।
- एक या एक से अधिक प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, गिनी पिग एंटी-एनएसपी3 या एंटी-वीपी6 एंटीसेरा, माउस मोनोक्लोनल एंटी-फ्लैग एम 2 एंटीबॉडी, या खरगोश मोनोक्लोनल एंटी-पीसीएनए एंटीबॉडी) के साथ इनक्यूबेटिंग करके झिल्ली की जांच करें। घोड़े विरोधी माउस आईजीजी, विरोधी गिनी पिग आईजीजी, या बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी सहिजन पेरोक्सिडसे-कंजुगेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेटकरके द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाएं, जिसके बाद बढ़ी हुई केमिलुमिनेसेंस (ईसीएल) सहिजन केमिलुमिनेसेंस सब्सट्रेट है। जेल इमेजिंग सिस्टम(टेबल ऑफ मैटेरियल)या एक्स-रे फिल्म का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंस संकेतों की कल्पना करें।
8. एफपी-व्यक्त वायरस से संक्रमित कोशिकाओं की लाइव-सेल इमेजिंग
- डीईएम पूर्ण माध्यम के कुल 2 मीटर में 3 x 105 एमए104 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से बीज 6-अच्छी तरह से प्लेटें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेटें रखें और कोशिकाओं तक पहुंचने तक छोड़ दें (3−5 दिन)।
नोट: शंख मोनोलेयर वाले कुओं में ~ 1.2 x 106 कोशिकाएं होंगी। - रोटावायरस के नमूनों को सक्रिय करें, ज्ञात टिटर के, 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 μg/mL ट्राइप्सिन के साथ ऊष्मायन द्वारा।
- पीबीएस के 2 mL के साथ MA104 मोनोलेयर 2x के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेटें कुल्ला। डीएमईएम अधूरे माध्यम में ट्राइप्सिन-सक्रिय रोटावायरस की प्रति कोशिका 3−5 PFU युक्त इनोकुलम के प्रत्येक कुएं में 200 माइक्रोन जोड़कर कोशिकाओं को संक्रमित करें। हर 10 मिन में सेल मोनोलेयर भर में इनोकुलम को पुनर्वितरित करने के लिए इनक्यूबेटर और धीरे-धीरे रॉक प्लेटों पर प्लेटें लौटाएं।
नोट: वायरस मुक्त DMEM inoculum से संक्रमित नकली हैं कि कुओं को नियंत्रण के रूप में शामिल किया जाना चाहिए। - वायरस सोखने के 1 घंटे के बाद, पीबीएस के साथ मोनोलेयर 2x कुल्ला और DMEM अधूरा माध्यम के प्रति अच्छी तरह से 0.5 मीटर के साथ मध्यम की जगह। 7.5 घंटे पोस्ट संक्रमण पर, संस्कृति माध्यम को डीएमईएम के साथ कम पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस(सामग्री की तालिका) केसाथ प्रतिस्थापित करें। 8 एच पोस्ट संक्रमण पर, हरे, लाल, या नीले फ्लोरेसेंस सिग्नल के लिए 20x आवर्धन पर कोशिकाओं की जांच करने के लिए एक लाइव सेल इमेजर का उपयोग करें।
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Representative Results
इस लेख में वर्णित रिवर्स जेनेटिक्स प्रोटोकॉल कई अलग कदमों के माध्यम से आय: (1) रोटावायरस pT7 ट्रांसक्रिप्शन वैक्टर और एक pCMV/NP868R अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के साथ बीएचके-T7 कोशिकाओं का सह-ट्रांसफेक्शन, (2) MA104 कोशिकाओं के साथ ट्रांससंक्रमित बीएचके-T7 कोशिकाओं का ओवरसीडिंग, (3) बीएचके-T7/MA104 कोशिकाओं में मौजूद पुनर्संयोजन वायरस का प्रवर्धन MA104 कोशिकाओं का उपयोग करके lysates, और (4) MA104 कोशिकाओं का उपयोग कर पुनर्संयोजन वायरस के पट्टिका अलगाव(चित्रा 2)। हमारे हाथों में, प्रोटोकॉल कुशल है, बीएचके-T7/MA104 में रिकॉम्बिनेंट वाइल्डटाइप SA11 वायरस (rSA11/wt) के टिटर ्स दे रहे हैं ~ 104 PFU/mL के सेल लिसेट्स और 1 x 107 PFU/mL के एम्प्लीफाइड MA104 सेल lysates में । SA11 recombinant संशोधित pT7/NSP3SA11 प्लाज्मिड्स का उपयोग कर रिवर्स जेनेटिक्स द्वारा उत्पन्न वायरस एफपीएस व्यक्त (जैसे, rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG) टिटर ्स कि ~4-गुना rSA11/wt से कम हैं ।
रिवर्स जेनेटिक्स प्रोटोकॉल के बाद, हमने पुनः संयोजन SA11 वायरस उत्पन्न किए जिन्हें आसानी से MA104 कोशिकाओं पर पट्टिका परख द्वारा पहचाना जाता था, इस प्रकार पट्टिका अलगाव(चित्रा 3 डी)की अनुमति देता है। सजीले टुकड़े में वायरस एक लंबी टिप डिस्पोजेबल हस्तांतरण पाइप के साथ उठाया गया था और MA104 कोशिकाओं पर परिलक्षित । पट्टिका के dsRNA जीनोम-शुद्ध rSA11/wt और rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG वायरस ग्वानिडिनियम thiocyanate के साथ निकाले गए थे, एक 10% पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा हल किया गया, और ethidium ब्रोमाइड(चित्रा 3A)के साथ धुंधला द्वारा पता चला । जैसा कि उम्मीद थी, आरएसए11/एनएसपी3-2ए-3xFL-UnaG का सेगमेंट 7 (एनएसपी3) डीएसआरएनए 2A-3xFL-UnaG दृश्यों की उपस्थिति के कारण आरएसए11/डब्ल्यूटी(चित्रा 3ए)की तुलना में बहुत धीमी हो गई । आरएसए11/एनएसपी3-2ए-3xFL-UnaG के खंड 7 (NSP3) dsRNA को शुद्ध किया गया था, आरटी-पीसीआर द्वारा सीडीएनए रूप में परिवर्तित किया गया था, और सटीकता की पुष्टि करने के लिए अनुक्रमित किया गया था ।
UnaG फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए, 6-अच्छी प्लेटों में MA104 कोशिकाओं को rSA11/wt और rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG की प्रति सेल 3 PFU से संक्रमित थे । 8 घंटे के बाद संक्रमण पर, प्लेटों में संस्कृति माध्यम को डीएमईएम के 0.5 मिलील के साथ प्रति अच्छी तरह से कम पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस के साथ प्रति अच्छी तरह से प्रति वर्ष और प्लेटों को सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 30 मीटर के लिए इनक्यूबेट किया गया था। बाद में, एक लाइव सेल इमेजर का उपयोग करके UnaG अभिव्यक्ति के लिए प्लेटों की जांच की गई। विश्लेषण से पता चला है कि rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG हरी फ्लोरेसेंस का उत्पादन किया, recombinant वायरस में UnaG जीन की कार्यक्षमता की पुष्टि(चित्रा 3B)। इसके विपरीत, rSA11/wt से संक्रमित कोशिकाओं में हरी फ्लोरेसेंस का पता नहीं चला । यह पता लगाने के लिए कि क्या आरएसए11/एनएसपी3-2एक्सएफएल-UnaG के संशोधित खंड 7 में 2ए तत्व ने दो अलग प्रोटीन (NSP3-2A और 3xFL-UnaG) की अभिव्यक्ति को बढ़ावा दिया, MA104 कोशिकाएं आरएसए11/एनएसपी3-2ए-3xFL-UnaG और rSA11/wt से संक्रमित थीं । सेल लिसेट 8 घंटे पोस्ट संक्रमण पर काटा कोशिकाओं से तैयार किए गए थे, जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा हल किया गया था, और नाइट्रोसेल्यूलोस फिल्टर पर दागदिया गया था। दाग रोटावायरस VP6 और NSP3, और फ्लैग टैग के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ जांच की गई । विश्लेषण से पता चला है कि NSP3-2A और 3xFL-UnaG rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG से संक्रमित कोशिकाओं में अलग प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया गया, यह दर्शाता है कि 2A तत्व कार्यात्मक था(चित्रा 3 C)। rSA11/wt से संक्रमित कोशिकाओं को विरोधी झंडा एंटीबॉडी द्वारा मांयता प्राप्त प्रोटीन व्यक्त नहीं किया । NSP3 के सी-टर्मिनस में अवशेष 2ए अवशेषों की उपस्थिति के कारण आर एसए11/डब्ल्यूटी-संक्रमित कोशिकाओं द्वारा rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG-संक्रमित कोशिकाओं में मौजूद NSP3 प्रोटीन RSA11/wt-संक्रमित कोशिकाओं में मौजूद NSP3 की तुलना में थोड़ा धीमा चले गए ।
चित्रा 1: रोटावायरस रिवर्स जेनेटिक्स प्लाज्मिड्स। (A)11 SA11 रोटावायरस जीनोम खंडों की पूर्ण लंबाई सीडीएनएएस pT7 प्लाज्मिड्स के भीतर तैनात हैं, जो एक एचडीवी रिबोज़ीमे के साथ T7 आरएनए बहुलक और डाउनस्ट्रीम के लिए प्रमोटर के साथ अपस्ट्रीम हैं। T7 आरएनए बहुलीकरण की उपस्थिति में, रोटावायरस pT7 प्लाज्मिड प्रामाणिक 5 ' और 3 ' टर्मिनी के साथ पूर्ण लंबाई SA11 (+) RNAs का उत्पादन करते हैं । (ख)pT7/NSP3-2A-3xFL-UnaG प्लाज्मिड द्वारा बनाई गई (+) आरएनए और प्रोटीन उत्पादों की योजनाबद्ध । योजनाबद्ध में एनएसपी 3 सीडीएनए अनुक्रम, और पोर्सिन टेस्कोवायरस 2ए जैसे (2ए) तत्व, 3x फ्लैग (एफएल) टैग और हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन अनग के लिए दृश्य शामिल हैं। 2A ट्रांसलेशनल स्टॉप-रीस्टार्ट साइट की स्थिति लाल तीर के साथ इंगित की गई है। 2A तत्व की गतिविधि के कारण, आरएनए का अनुवाद दो प्रोटीन पैदा करता है। NSP3 भाग में 2A तत्व के अवशेष होते हैं और अनंग भाग को 3x फ्लैग टैग से जुड़ा हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: रोटावायरस रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम। बीएचके-T7 मोनोलेयर 11 pT7 प्लाज्मिड से ट्रांस्पर होते हैं, प्रत्येक एक अलग SA11 (+) आरएनए व्यक्त करते हैं, और अफ्रीकी स्वाइन फीवर वायरस (एएसएफवी) NP868R कैपिंग एंजाइम (pCMV/NP868R) को व्यक्त करने वाला एक pCMV वेक्टर। 3 दिनों के बाद संक्रमण (d.p.i.), बीएचके-T7 कोशिकाओं MA104 कोशिकाओं के साथ अति बीज हैं । संक्रमण के बाद 7 दिनों में, बीएचके-T7/MA104 कोशिका ओं में पुनः संयोजन रोटावायरस MA104 कोशिकाओं पर पारित होने से परिलक्षित होते हैं, फिर पट्टिका शुद्धिकरण द्वारा अलग किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: recombinant उपभेदों rSA11/wt और rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG की विशेषताएं । (A)पट्टिका-अलग rSA11 उपभेदों के dsRNA जीनोम खंडों के इलेक्ट्रोफोरेटिक प्रोफाइल । 11 जीनोम सेगमेंट गिने जाते हैं और सेगमेंट 7 (एनएसपी3) की स्थिति में बदलाव को लाल रेखा के साथ दर्शाया गया है । (ख)ग्रीन डिटेक्शन चैनल पर सेट लाइव सेल इमेजर (20x आवर्धन) का उपयोग करके 8 घंटे के बाद संक्रमण पर आरएसए11-संक्रमित MA104 कोशिकाओं में फ्लोरेसेंस का पता चला । स्केल बार = 100 माइक्रोन।(सी)एमए104 कोशिकाओं में 8 घंटे के बाद संक्रमण में मौजूद प्रोटीन का इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण गिनी पिग एंटी-वीपी6 और एंटी-एनएसपी3 एंटीसेरा और माउस एंटी-फ्लैग मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके आरएसए11 उपभेदों से संक्रमित कोशिकाओं में 8 एच पोस्ट संक्रमण में मौजूद है। (D)RSA11/wt द्वारा 3 दिन में MA104 कोशिकाओं पर उत्पादित सजीले टुकड़े संक्रमण के बाद 3 और तटस्थ लाल धुंधला द्वारा पता चला । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
हमारी प्रयोगशाला में, हम नियमित रूप से रिवर्स जेनेटिक्स प्रोटोकॉल पर भरोसा करते हैं जो यहां वर्णित है ताकि पुनः संयोजन SA11 रोटावायरस का उत्पादन किया जा सके। इस दृष्टिकोण के साथ, आणविक जीव विज्ञान तकनीकों में थोड़ा अनुभव वाले व्यक्ति या रोटावायरस के साथ काम करने से भी अपने पहले प्रयास पर पुनः संयोजन वायरस ठीक हो जाते हैं। हमने इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए 100 रिकॉम्बिनेंट वायरस उत्पन्न किए हैं, जिनमें जीनोम शामिल हैं जिन्हें विदेशी प्रोटीन (जैसे, एफपीएस) व्यक्त करने के लिए फिर से इंजीनियर किया गया है और जिनमें अनुक्रम परिवर्धन, विलोपन और बिंदु उत्परिवर्तन शामिल हैं।
इस प्रोटोकॉल में दी गई स्थितियां और ऊष्मायन समय पुनः संयोजन वायरस के अच्छी तरह से बढ़ते उपभेदों की वसूली पर लागू होते हैं। समायोजन पर विचार किया जाना चाहिए अगर SA11 वायरस है कि, आनुवंशिक संशोधन के कारण, खराब बढ़ने की उंमीद की जा सकती है ठीक करने का प्रयास । विशेष रूप से, क्योंकि ट्रांससंक्रमित बीएचके-T7/MA014 सेल lysates में इस तरह के वायरस के टिटर कम हो सकता है, हम आम तौर पर बाद के प्रवर्धन चरणों में inoculum के रूप में इस्तेमाल lysate की मात्रा दोगुनी । इसके अलावा, प्रवर्धन कदम पर, खराब बढ़ते वायरस को सेल हार्वेस्टिंग के लिए पर्याप्त सीपीई के स्तर तक पहुंचने से पहले ऊष्मायन के लंबे समय की आवश्यकता हो सकती है। दरअसल, इस तरह के वायरस के साथ, हम कोशिकाओं की कटाई से पहले संक्रमण को 10−14 दिनों या उससे भी अधिक समय तक आगे बढ़ने की अनुमति दे सकते हैं। अंत में, खराब बढ़ते वायरस MA104 कोशिकाओं पर छोटे, धीमी गति से बढ़ती सजीले टुकड़े उत्पन्न करने की संभावना है । इस प्रकार, इन वायरसों को अलग करने के लिए, तटस्थ लाल और चुनने वाली सजीले टुकड़े के साथ कोशिकाओं को धुंधला करने से पहले 6−10 दिनों के बाद संक्रमण के बाद तक सजीले टुकड़े विकसित करने की अनुमति देना आवश्यक हो सकता है।
हमारे अनुभव में, पुनः संयोजन रोटावायरस की विश्वसनीय वसूली में एक सबसे महत्वपूर्ण कारक स्वस्थ, अच्छी तरह से बनाए रखा बीएचके-T7 कोशिकाओं का उपयोग है। हमारी प्रयोगशाला में, हम नियमित रूप से बीएचके-T7 कोशिकाओं को एक सप्ताह में एक ही कमजोर पड़ने पर न केवल 10% एफबीएस के साथ मध्यम पूरक का उपयोग करके, बल्कि एनईए, टीपीबी और ग्लूकोज के उच्च स्तर (जीएमईएम पूर्ण माध्यम) के साथ भी पारित होते हैं। अतिरिक्त पूरक बीएचके-T7 कोशिकाओं को प्लाज्मिड ट्रांसफेक्शन के बाद विस्तारित व्यवहार्यता बनाए रखने में मदद करते हैं, जो खराब बढ़ते उत्परिवर्ती रिकॉम्बिनेंट वायरस को ठीक करने के लिए महत्वपूर्ण कारक है। हम G418 के साथ हर दूसरे मार्ग के माध्यम को पूरक करते हैं, एक एंटीबायोटिक जो T7 बहुलक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के रखरखाव के लिए चयन करता है। पारित होने की स्थिति ऐसी होनी चाहिए कि बीएचके-टी7 कोशिकाओं को पिछले कन्फ्लन्यबढ़ने की अनुमति कभी नहीं दी जाती है, ऐसी स्थितियां जो तेजी से सेल व्यवहार्यता में कमी का कारण बनती हैं। हमारे लिए, बीएचके-T7 कोशिकाओं है कि रिवर्स आनुवंशिकी प्रोटोकॉल में खराब प्रदर्शन करने की अनुमति दी गई है, भले ही कोशिकाओं को बाद में उचित कई बार पारित कर रहे हैं । इसके बजाय ऊंचा हो गया BHK-T7 कोशिकाओं के पुनर्वास के प्रयास के, हम पहले तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत कोशिकाओं के साथ वंश पुनः आरंभ ।
बीएचके-टी7 और एमए104 कोशिकाओं का माइकोप्लाज्मा संदूषण रेकॉम्बिनेंट वायरस उत्पन्न करने के लिए रोटावायरस रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम की विफलता में एक प्रमुख कारक हो सकता है। हमारी प्रयोगशाला में, हम सेल लाइनों के संदूषण की जांच करने के लिए पीसीआर-आधारित माइकोप्लाज्मा डिटेक्शन किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करते हैं, और जब पता चला जाता है, तो यह अक्सर हमारे बीएचके-T7 कोशिकाओं से जुड़ा होता है। हमने माइकोप्लाज्मा को दूषित करने की सेल लाइनों का इलाज करने का प्रयास नहीं किया है, इसके बजाय तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत पहले माइकोप्लाज्मा-मुक्त मार्ग के साथ लाइनों को फिर से स्थापित किया है। नई सेल लाइनें शुरू करने से पहले, हम पहले इस्तेमाल किए गए सभी मध्यम और मध्यम पूरक को त्यागते हैं और इनक्यूबेटर, जैविक सुरक्षा अलमारियाँ, पानी के स्नान, प्रयोगशाला बेंच और पाइप्टर को अच्छी तरह से दूषित करते हैं। हम संदूषण के लिए पुनः संयोजन वायरस के स्टॉक की जांच करने के लिए माइकोप्लाज्मा डिटेक्शन किट का भी उपयोग करते हैं। वर्ट्रेल वीएफ32जैसे कार्बनिक सॉल्वैंट्स द्वारा डेनटाग्राशन के लिए रोटावायरस कणों के प्रतिरोध के कारण, माइकोप्लाज्मा को दूषित करने से वायरस स्टॉक को मुक्त करना संभव है, जो रिवर्स जेनेटिक्स द्वारा पुनर्जीवित वायरस को पुनर्जीवित करने की आवश्यकता को नकारता है। इस बात पर जोर देना महत्वपूर्ण है कि प्रयोगशाला में प्राप्त सेल लाइनों और वायरस की तैयारी को नियमित उपयोग से पहले माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए जांच की जानी चाहिए।
हालांकि दिन में और दिन-बाहर, हम एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए पुनः संयोजन वायरस उत्पन्न, हम जानते है कि कुछ संशोधनों जो वायरस वसूली बाधा नहीं होगा बनाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, (i) sA1p7 वैक्टर के साथ pCMV/NSP868R कैपिंग-एंजाइम प्लाज्मिड के सह-ट्रांसफेक्शन की आवश्यकता नहीं है। जबकि कैपिंग प्लाज्मिड के अलावा ट्रांससंक्रमित बीएचके-T7/MA104 सेल lysates में उच्च वायरस टिटर पैदावार, हम इसके बिना, FPs व्यक्त करने वालों सहित कई वायरस, ठीक करने में सक्षम है । हालांकि, हमने निष्कर्ष निकाला है कि pCMV/NP868R द्वारा कैपिंग एंजाइम की अभिव्यक्ति कम फिट वायरस की वसूली में महत्वपूर्ण योगदान दे सकती है । (ii) हमने पाया है कि रिवर्स जेनेटिक्स प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किए जाने वाले ट्रांसफेक्शन रिएजेंट(टेबल ऑफमैटेरियल) की मात्रा में डेढ़-डेढ़ की कमी होने पर भी रिकॉम्बिनेंट वायरस पैदा किए जा सकते हैं, एक संशोधन जो खर्चों को काफी कम कर सकता है । (iii) इसी प्रकार, हमने यह निर्धारित किया है कि डीएमईएम पूर्ण माध्यम के स्थान पर M199 पूर्ण माध्यम का उपयोग किया जा सकता है । (iv) अंत में, वेक्टर रीढ़ की हड्डी के प्रकार से संबंधित कोई निर्धारित आवश्यकता नहीं है जिसका उपयोग SA1T T7 प्रतिलेखन वेक्टर के उत्पादन में किया जाना चाहिए । जब तक प्लाज्मिड में वायरल सीडीएनए एक अपस्ट्रीम T7 प्रमोटर और एक डाउनस्ट्रीम HDV ribozyme और T7 टर्मिनेटर से घिरा हुआ है, प्लाज्मिड को रिकॉम्बिनेंट वायरस की वसूली का समर्थन करने की उम्मीद की जा सकती है । विशेष रूप से, pGEM-, pBluescript, और पीयूसी आधारित वेक्टर रिवर्स जेनेटिक्स प्रणाली में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है ।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को NIH अनुदान R03 AI131072 और R21 AI144881, इंडियाना विश्वविद्यालय स्टार्ट-अप फंडिंग, और लॉरेंस एम ब्लैट एंडोमेंट द्वारा समर्थित किया गया था। हम रिवर्स जेनेटिक्स प्रोटोकॉल विकसित करने में उनके कई योगदान और सुझावों के लिए आईयू रोटाहुसियर प्रयोगशाला, उल्रिच डेस्सलबर्जर और गुइडो पापा के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
Chloroform | MP | 194002 | |
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
References
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- International Committee on Taxonomy of Viruses. Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release. , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019).
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, Suppl 2 96-105 (2016).
- Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
- Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
- McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
- Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
- Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
- Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
- Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
- Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
- Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
- Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
- Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
- Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
- Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
- Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
- Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
- Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
- Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
- Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
- Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
- Donnelly, M. L., et al. The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
- Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , HHS publication no. CDC 21-1112 (2009).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
- Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).