Summary
Plazmid DNA'sından rekombinant rotavirüslerin üretimi, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinin incelenmesi, rotavirüs ekspresyonu vektörleri ve aşılarının geliştirilmesi için gerekli bir araçtır. Burada, floresan muhabir proteinleri ifade eden suşlar da dahil olmak üzere rekombinant rotavirüsler imal etmek için basitleştirilmiş bir ters genetik yaklaşımını tanımlıyoruz.
Abstract
Rotavirüsler, insanlar da dahil olmak üzere birçok memeli ve kuş konak türlerinin genç şiddetli gastroenterit neden segmentli çift iplikli RNA virüslerin büyük ve gelişen bir nüfustur. Rotavirüs ters genetik sistemlerinin son gelişiyle, rotavirüs biyolojisini keşfetmek, mevcut rotavirüs aşılarını değiştirmek ve optimize etmek ve rotavirüs çok hedefli aşı vektörlerini geliştirmek için yönlendirilmiş mutagenezi kullanmak mümkün hale gelmiştir. Bu raporda, rekombinant rotavirüslerin etkin ve güvenilir bir şekilde geri kazanılmasına olanak tanıyan basitleştirilmiş bir ters genetik sistemini tanımlıyoruz. Sistem, tam uzunlukta rotavirüs (+)RNA'ları ve bir RNA kapama enzimini BHK hücrelerine kodlayan bir CMV vektörünü ifade eden T7 transkripsiyon vektörlerinin eş transfeksiyonuna dayanmaktadır. Rekombinant rotavirüsler MA104 hücreleri ile transfected BHK-T7 hücreleri overseeding tarafından yükseltilir, virüs büyümesi için son derece müsamahakar bir maymun böbrek hücre hattı. Bu raporda, genom segment7 'ye (NSP3) 2A çevirisel stop-restart elementi girişi yoluyla ayrı bir floresan muhabir proteini ifade eden rekombinant rotavirüsler imal etme yaklaşımını da açıklıyoruz. Bu yaklaşım, viral açık okuma çerçevelerinin herhangi birini silerek veya değiştirmekten kaçınarak, floresan proteini ifade ederken tamamen işlevsel viral proteinleri koruyan rekombinant rotavirüslerin üretimine olanak sağlar.
Introduction
Rotavirüsler bebeklerde ve küçük çocuklarda şiddetli gastroenteritin başlıca nedenleri olduğu gibi, diğer birçok memeli ve kuştürününgenç 1. Reoviridae ailesinin üyeleri olarak, rotavirüsler parçalı çift iplikçikli RNA (dsRNA) genomuna sahiptir. Genom segmentleri, üç konsantrik protein katmanından oluşan zarfsız bir ikozahedral virion içinde bulunur2. Genom segmentlerinin dizilimi ve filogenetik analizine dayanarak dokuz rotavirüs türü (A−D, F−J)tanımlanmıştır 3. Rotavirüs türleri A oluşan bu suşları insan hastalığının büyük çoğunluğu sorumludur4. Son on yılda başlayan çocukluk çağı bağışıklama programlarına rotavirüs aşılarının getirilmesi, rotavirüs mortalitesi ve morbiditesinde önemli azalmalarla ilişkilidir. En önemlisi, rotavirüs e bağlı çocukluk ölümlerinin sayısı 2000 yılında yaklaşık 528.000'den 2016'da 128.500'e düşmüştür4,5. Rotavirüs aşıları virüsün canlı zayıflatılmış suşları formüle edilir, 2-3 doz yaş 6 ay tarafından çocuklara uygulanan ile. Insanlar ve diğer memeli türlerinde dolaşan genetik olarak çeşitli rotavirüs suşları çok sayıda, hızla mutagenez ve reassortment yoluyla gelişmek için yetenekleri ile birlikte, rotavirüslerin türleri çocuklara bulaştıran antijenik değişikliklere yol açabilir6,7,8. Bu tür değişiklikler mevcut aşıların etkinliğini zayıflatabilir, bunların değiştirilmesi veya değiştirilmesi gerektirebilir.
11 rotavirüs genom segmentinden herhangi birinin manipülasyonunu sağlayan tam plazmid tabanlı ters genetik sistemlerin geliştirilmesi ancak9. Bu sistemlerin kullanılabilirliği ile, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinmoleküler ayrıntılarını çözmek, anti-rotavirüs bileşikleri için geliştirilmiş yüksek işlemli tarama yöntemleri geliştirmek ve rotavirüs aşılarının potansiyel olarak daha etkili sınıfları oluşturmak mümkün hale gelmiştir. Rotavirüs replikasyonu sırasında, kapaklı viral (+)RNA'lar sadece viral proteinlerin sentezine rehberlik etmekle kalmıyor, aynı zamanda dsRNA genom segmentlerinin sentezi için şablon görevi de veriyor10,11. Bugüne kadar açıklanan tüm rotavirüs ters genetik sistemleri, rekombinant virüslerin kurtarılmasında kullanılan cDNA kaynaklı (+)RNA'ların kaynağı olarak Memeli hücre hatlarına T7 transkripsiyon vektörlerinin transfeksiyonuna dayanır9,12,13. Transkripsiyon vektörleri içinde, tam uzunlukta viral cDNA'lar, t7 promotörü ve aşağı akım hepatit delta virüsü (HDV) ribozyme arasında konumlandırılır, öyle ki viral (+)RNA'lar otantik 5' ve 3'-termini içeren T7 RNA polimeraz ile sentezlenirler (Şekil 1A). Birinci nesil ters genetik sistemde, rekombinant virüsler t7 RNA polimeraz (BHK-T7) ile 11 T7 (pT7) transkripsiyon vektörü ifade eden bebek hamster böbrek hücrelerinin transfecting tarafından yapılmıştır, simian SA11 virüs suşu benzersiz bir (+)RNA sentezi yönlendiren her, ve üç CMV promotör sürücü ekspresyon plazmidler, bir kuş reovirus p10FAST füzyon proteini kodlama ve vaccinia virüsü D1R-D12L kapama enzim kompleksi iki kodlama alt birimleri9. Transfected BHK-T7 hücrelerinde üretilen rekombinant SA11 virüsleri MA104 hücreleri ile overseeding tarafından güçlendirilmiştir, rotavirüs büyümesi için izin veren bir hücre hattı. İlk nesil ters genetik sisteminin değiştirilmiş bir sürümü artık destek plazmids12kullandığı tarif edilmiştir. Bunun yerine, modifiye sistemi başarıyla 11 SA11 T7 transkripsiyon vektörleri ile BHK-T7 hücreleri transfecting tarafından rekombinant rotavirüsler üretir, uyarı ile viral fabrika (viroplazm) yapı taşları (nonstructural proteinler NSP2 ve NSP5) düzeyleri 3 kat diğer vektörler14,15daha yüksek eklenir . Ters genetik sisteminin modifiye versiyonları da rotavirüs16,,17insan KU ve Odelia suşlarının kurtarma destekleyen geliştirilmiştir . Rotavirüs genomu, VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21ve NSP522,23içine tanıtılan mutasyonlar ile bugüne kadar oluşturulan rekombinant virüsler ile, ters genetik tarafından manipülasyon için son derece münasip olduğunu. Şimdiye kadar üretilen en yararlı virüsler arasında floresan muhabir proteinleri ifade etmek için tasarlanmış olanlar (FS)9,12,21,24,25.
Bu yayında, laboratuvarımızda kullandığımız ters genetik sisteminin protokolünü sa11 rotavirüs rekombinant suşları üretmek için sağlıyoruz. Protokolümüzün temel özelliği BHK-T7 hücrelerinin 11 pT7 transkripsiyon vektörü (pT7/NSP2SA11 ve pT7/NSP5SA11 vektörlerinin 3x seviyelerini içerecek şekilde modifiye edilmiş) ve Afrika domuz ateşi virüsünü (ASFV) NP868 capping enzim21 (2 Şekil)kodlayan bir CMV ekspresyonu vektörü ile birlikte transfeksiyonudur. Elimizde, NP868R plazmid varlığı transfected BHK-T7 hücreleri ile rekombinant virüslerin yüksek titreüretimine yol açar. Bu yayında, pT7/NSP3SA11 plazmidini, sadece segment 7 protein ürünü NSP3'ü değil, aynı zamanda ayrı bir FP'yi ifade eden rekombinant virüslerin üretilebildiği şekilde modifiye etmek için bir protokol de salıyoruz. Bu bir FP ORF (Şekil 1B)24,26tarafından takip bir downstream 2A çeviri durdurma-yeniden başlatma elemanı içeren pT7/NSP3SA11 plazmid NSP3 açık okuma çerçevesi (ORF) yeniden mühendislik tarafından gerçekleştirilir . Bu yaklaşım sayesinde, çeşitli LP'leri ifade eden rekombinant rotavirüsler oluşturduk: UnaG (yeşil), mKate (uzak kırmızı), mRuby (kırmızı), TagBFP (mavi), CFP (siyan) ve YFP (sarı)24,27,28. Bu FP ifade eden rotavirüsler NSP3 ORF silmeden yapılır, böylece işleyen viral proteinlerin tam bir tamamlayıcı kodlamak için beklenen virüsler verimli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medya hazırlama ve hücre kültürü bakımı
- T7 RNA polimeraz (BHK-T7) ve Afrika yeşil maymun böbrek MA104 hücreleri ifade bebek hamster böbrek hücreleri edinin.
NOT: BHK-T7 (veya BSR-T7) hücreleri ticari olarak mevcut değildir, ancak RNA virüs biyolojisi incelemek için ters genetik kullanan laboratuvarların ortak bir hücre hattıdır. Bu protokolde kullanılan BHK-T7 hücre hattı Dr Ursula J. Buchholz (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD, ABD), orijinal BHK hücre hattı t7 RNA polimeraz29ifade bir co-geliştirici elde edilmiştir. MA104 hücreleri Avrupa Kimlik Doğrulamalı Hücre Kültürleri Koleksiyonu'ndan (ECACC) ve American Type Culture Collection'dan (ATCC) edinilebilir. - Aşağıdaki kültür ortamını steril bir ortamda, tercihen Sınıf II biyolojik güvenlik kabinesinde hazırlayın. Medyayı 4 °C'de karanlıkta ve kullanımdan hemen önce 37 °C'ye kadar ısıtın.
NOT: Ortam bileşenlerinin kaynakları Malzeme Tablosu'ndaverilmiştir.- DMEM'i eksik orta hazırlamak için, 4,5 g/L glikoz içeren 500 mL'lik Dulbecco modifiye Eagle'ın modifiye edilmiş Eagle minimum esaslı ortamını (MEM) ve %1 glutamin ile 5 mL 100x kalem-strep'i birleştirin.
- DMEM komple orta hazırlamak için, 500 mL eksik dmem orta ile 25 mL fetal sığır serumu (FBS) birleştirin.
- GMEM'i eksik orta hazırlamak için 500 mL Glasgow minimum esansiyel ortamı, 5 mL 100x glutamin, 50 mL triptose-fosfat suyu (TPB), 5 mL 100x esansiyel olmayan amino asitleri (NEAA) ve 5 mL 100x kalem-strep'i birleştirin.
- GMEM'i komple orta hazırlamak için, 500 mL'lik eksik gmem ortamını 25 mL ısı yalıtımlı FBS ile birleştirin.
- GMEM+G komple orta sını hazırlamak için 50 mg/mL genetiği (G418) ile 500 mL tam orta 10 mL ekleyin.
- Kobİ'leri eksik orta hazırlamak için, 500 mL Joklik modifiye Kartal'ın MEM, 5 mL 100x glutamin, 50 mL TPB, 5 mL 100x NEAA ve 5 mL 100x kalem-strep birleştirir.
- Kültür MA104 hücreleri T75 veya T175 maasks 12 veya 25 mL DMEM içeren tam orta, sırasıyla. %100 biraraya gelen MA104 hücrelerini geçişiçin hücre monotabakası 2x fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın, tripsin (%0.05) ile ayrıştırın (%0.05)-EDTA (%0.1) 5 (T75 şişesi) veya 10 mL (T175 şişesi) dmem eksik ortamda yeniden askıya alınır.
- Taze şişelere 0,5−1,0 mL'lik yeniden askıda kalmış hücreler yerleştirin ve DMEM tam orta sını ekleyerek uygun son hacme getirin. Şişeleri 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesine yerleştirin.
- BhK-T7 hücrelerini T75 şişelerinde yayıklayın, Her geçiş turunda GMEM ve GMEM+G tam orta sıyrık ları arasında gidip gelir. %100 biraraya gelmiş BHK-T7 hücrelerini alt kültüre getirmek için hücre monolayer 2x'ini PBS ile durulayın, tripsin-EDTA solüsyonuyla ayırın ve 5 mL orta alanda yeniden askıya alın.
- Taze bir T75 şişesine 15 mL GEM veya GMEM+G komple orta yerleştirdikten sonra, dört damla yeniden askıya alınmış BHK-T7 hücresi ekleyin. Şişeyi 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesine yerleştirin.
2. Plazmid hazırlığı
- Addgene'den rotavirüs SA11 (+)RNA'ları ifade eden aşağıdaki plazmidleri edinin: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11 ve pT7/NSP5SA11. 21.yazarlardan ASFV kapama enzimini (pCMV/NP868R) ifade eden plazmidi edinin.
NOT: Modifiye pT7/NSP3SA11 plazmidler 2A çeviri elemanı (pT7/NSP3-2A-3xFL-FP) etkinliği ile fp ifade etmek için tasarlanmış da yazarlar24,,26elde edilebilir . pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plazmidler aşağıdaki FP'leri ifade edektedir: UnaG (yeşil), mKate (uzak kırmızı), mRuby (kırmızı), TagBFP (mavi), CFP (zil) ve YFP (sarı)24. - Plazmidleri yetkin E'yedönüştürün. coli DH5α ve uygun antibiyotik içeren Luria suyu agar plakaları üzerine bakteri yayıldı. Üreticinin talimatlarına göre, tek tek kolonilerden alınan bakteri kültürlerini büyütün ve spin miniprep arıtma kiti(Malzeme Tablosu)kullanarak daha az miktarda plazmid (20 μg) hazırlayın. Midi ve maxi arıtma kitleri(Tablo Malzemeler)kullanarak bakteri kültürlerinden daha büyük miktarda plazmid hazırlayın.
NOT: Ters genetik sistemde kullanıma uygun plazmidler diğer plazmid arıtma kitleri ile de hazırlanmıştır. Endotoksinsiz malzeme üretmek için özel olarak tasarlanmış kitleri kullanarak plazmidler hazırlamak gerekli değildir. - Çekirdeksiz moleküler biyoloji sınıf suyunda saflaştırılmış plazmid konsantrasyonlarını 1 mg/mL'ye ayarlayın. Bir spektrofotometre kullanarak ~1.8'in 260/280 emicilik oranını onaylayarak plazmid saflığını kontrol edin. Ayrıca, plazmidlerin ağırlıklı olarak supercoiled olduğunu doğrulamak için% 0.8 agarose jelleri elektroforez kullanın.
- Aliquot, her biri 10 μL içeren 0,5 mL steril mikrosantrifüj tüpü içine plazmidleri saflaştırılmış.
3. Rekombinant virüs üretimi
NOT: Rekombinant rotavirüs suşlarının üretimi ve karakterizasyonu da dahil olmak üzere insan ve hayvan saldirisi araştırmaları Biyogüvenlik Düzey 2 (BSL-2) koşulları altında yapılmalı ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) tarafından önceden onaylanmalıdır. Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri(CDC)tarafından üretilen Mikrobiyolojik ve Biyomedikal Laboratuvarlarda (BMBL) Biyogüvenlik'te uygun BSL-2 laboratuvar koşulları tanımlanmıştır.
- 1. Gün: BHK-T7 hücrelerinin 12 kuyulu plakalara tohumlanması
- PBS ile bir T75 şişesi 2x bulunan BHK-T7 hücrelerinin taze bir confluent monolayer durulayın. Hücre monotabakasını tripsin-EDTA çözeltisi ile bozun ve 5 mL GMEM tam ortamda ki hücreleri yeniden askıya alın.
- Ortamda ki canlı BHK-T7 hücrelerinin konsantrasyonunun belirlenmesi için otomatik bir hücre sayacı ve trypan-blue solüsyonu kullanın. 12-iyi hücre kültür plakaları içine tohum hücreleri, her iyi 1 mL GMEM (G418-free) tam orta toplam hacmi nde 2 x 105 hücre içeren. 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesinde kuluçka. Hücreler 2.
- 2. Gün: BHK-T7 hücrelerinin plazmid karışımları ile transfeksiyonu
- Plazmid karışımını hazırlamak için, 1 mg/mL'ye ayarlanmış plazmid stokları kullanılarak 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünde aşağıdakileri birleştirin: 0,8 μL her biri SA11 pT7 plazmidvp1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 ve NSP4, 2.4 μL her SA11 pT7 plazmids NSP2 ve NSP5 ve 0.8 μL pCMV/NP868R. Plazmidleri tüpe dokunarak hafifçe karıştırın ve darbe santrifüjünden içeriği toplayın. FP'leri ifade eden rekombinant virüsler hazırlamak için pT7/NSP3SA11'i uygun pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plazmidi ile değiştirin.
NOT: Plazmid karışımları kullanılana kadar buz üzerinde saklanmalıdır. Her transfeksiyon için ayrı bir tüp hazırlanmalıdır. - Plazmid/azaltılmış serum orta/transfeksiyon reaktif karışımını hazırlamak için: Her plazmid karışımına önceden ısıtılmış (37 °C) azaltılmış serum ortamını(Malzeme Tablosu)110 μL ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı borular ile karıştırın. Daha sonra, her plazmid/azaltılmış serum orta karışımına 32 μL transfeksiyon reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin; karışımlarda plazmid başına 2,5 μL transfeksiyon reaktifi konsantrasyonu verir. Girdap karışımları yavaşça ve 20 dakika oda sıcaklığında inkübün.
- 20 dk kuluçka süresi boyunca, 12 kuyuplakalarında BHK-T7 hücrelerini (1. günde hazırlanmış) 2 mL'lik Eksik ortamla durulayın. Daha sonra, her kuyuya 1 mL eksik Orta Ekle nin ve plakaları kuvöze geri verin.
- 20 dk kuluçka süresinden sonra, 200 μL pipettor kullanarak 12 kuyulu plakaların her bir kuyusuna plazmid/azaltılmış serum ortamı/transfeksiyon karışımını damla damla ekleyin. Yavaşça kaya plakaları ve 37 °C, 5% CO2 kuluçka geri dönün.
- Plazmid karışımını hazırlamak için, 1 mg/mL'ye ayarlanmış plazmid stokları kullanılarak 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünde aşağıdakileri birleştirin: 0,8 μL her biri SA11 pT7 plazmidvp1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 ve NSP4, 2.4 μL her SA11 pT7 plazmids NSP2 ve NSP5 ve 0.8 μL pCMV/NP868R. Plazmidleri tüpe dokunarak hafifçe karıştırın ve darbe santrifüjünden içeriği toplayın. FP'leri ifade eden rekombinant virüsler hazırlamak için pT7/NSP3SA11'i uygun pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plazmidi ile değiştirin.
- 4. Gün: MA104 hücreleri ile transfected BHK-T7 hücreleri overseeding
- PBS ile bir T75 şişesi 2x bulunan MA104 hücrelerinin taze bir confluent monolayer durulayın. Tripsin-EDTA çözeltisi kullanarak monolayer'ı bozun ve 5 mL DMEM tam ortamda hücreleri yeniden askıya alın.
- Otomatik bir hücre sayacı ve trippan-mavi çözelti kullanarak, ortamda canlı MA104 hücrelerinin konsantrasyonu belirlemek. Konsantrasyonu DMEM'de 8 x 105 MA104 hücre/mL'ye ayarlayın ve transfected BHK-T7 hücreleri içeren kuyulara 0,25 mL askıda hücre (2 x 105 hücre) ekleyin.
- Orta daki tripsin konsantrasyonu (domuz pankreas tipi IX) konsantrasyonu 0,5 g/mL'ye ayarlayarak her kuyuya 0,8 μL 1 mg/mL trypsin stoku ekleyin.
NOT: Tripsin stokları PBS'de hazırlanmalı, -20 °C'de depolanmalıdır. - Rekombinant virüsleri yükseltmek için 7. 6 kuyuplakaları tohumlamak için, resuspended MA104 hücrelerini DMEM'de 1,5 x 105 hücre/mL konsantrasyonuna seyreltin ve her kuyuya 2 mL yerleştirin. Plakaları 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesine yerleştirin.
- 7. Gün: transfected hücrelerden rekombinant virüsün geri kazanımı ve amplifikasyonu
- 12 kuyulu plakalarda BHK-T7/MA104 hücreleri steril koşullar altında üç çevrim donma-çözülme, -20 °C dondurucu ve oda sıcaklığında yüzey arasında plakaları hareketli. Lysates 1,5 mL tüplere aktarDıktan sonra, 500 x g (4 °C) ile 10 dk'lık santrifüj tüpleri büyük hücresel enkazlara aktarır. Supernatant toplayın ve 4 °C (kısa vadeli) veya -20 °C (uzun süreli) olarak saklayın.
- MA104 monolayers 6-well plakalar (gün 4 hazırlanan) 2x PBS ile yıkayın. 0,5 g/mL tripsin içeren her kuyuya 2 mL eksik DMEM eksik ortam yerleştirin. BHK-T7/MA104 hücreli lysatlardan elde edilen 300 μL supernatant'ı kuyulara ekleyin ve plakaları 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesine yerleştirin.
- 7 gün veya tam sitopatik etkiler (CPE) gözlenene kadar kuluçka plakaları. Lyse MA104 hücreleri 6-iyi plakalarda üç çevrim donma-çözülme ile, daha sonra 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri lysates aktarır. Pelet büyük hücresel enkaz santrifüj tarafından 10 dakika 500 x g (4 °C) de. Açıklığa kavuşturulan hücre lisatlarını 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve -20 °C'de saklayın.
4. Rekombinant virüslerin plak izolasyonu
- 10μg/mL'lik son konsantrasyona tripsin ekleyerek ve 37 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatarak 100 μL'lik hücre lysates'inde virüsleri-1 etkinleştirin.-7
- MA104 monolayers 6-iyi plakalar 2 mL PBS ve bir kez DMEM eksik orta ile 2x durulayın. Plakalara 400 mL lysate seyreltme ekleyin. Plakaları 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesinde 1 saat kuluçkaya yatırın ve seyreltmeleri monotabaka boyunca yeniden dağıtmak için her 10−15 dakikada bir sallayın.
- 2x Eagle'ın minimal esansiyel ortamının (EMEM; önceden 37 °C'ye ısınmış) eşit hacimlerde mikrodalga fırın kullanılarak suda eritilmiş ve 45 °C'ye önceden soğutulmuş agarose ile eşit hacimlerde biraraya rakarak bir agarose-MEM kaplama çözeltisi hazırlayın. Bir su banyosu kullanarak 42 °C'de bindirme çözeltisini koruyun ve hücrelere yerleştirmeden hemen önce 0,5 g/mL tripsin son konsantrasyonuna ayarlayın.
- 6 kuyulu plakalardan lysate seyreltmeleri çekin, sonra 2 mL eksik DMEM ile hücreleri bir kez durulayın. Agarose-MEM kaplama çözeltisinin 3 mL'sini her kuyuda bulunan hücre monokatmanına yavaşça bötürleyin. Agarose kaplamaoda sıcaklığında sertleştirmek için izin verin, sonra kuvöz plakaları iade.
- Üç gün sonra, adım 4.3'te olduğu gibi bir agarose-MEM kaplama çözeltisi hazırlayın ve 42 °C'ye getirin. Kullanmadan hemen önce, bindirme çözeltisini 50 μg/mL nötr kırmızı(Malzeme Tablosu)son konsantrasyonuna ayarlayın.
- 6 kuyulu plakalarda mevcut agarose tabakasının üzerine 2 mL kaplama çözeltisi ekleyin. Yeni agarose tabakasının sertlemesine izin vererek plakaları kuvöze geri verin. Nötr kırmızı içeren çözeltileri ve plakaları ışığa maruz kalmaktan koruyun.
- Sonraki 6 saat boyunca, bir ışık kutusu yardımı ile 6-iyi plakalar rotavirüs plakları tanımlayın. Hücre tabakasına kadar uzanan agarose fişleri geri kazanarak, tek kullanımlık aktarım pipetleri kullanarak net bir şekilde tanımlanmış plakları seçin.
- 0,5 mL DMEM eksik orta ve girdap için örnek içeren 1.5 mL tüp fişi çıkarmak 30 s. Ma104 monolayers üzerinde 6-well plakalar veya T25 şişeler üzerinde propagation tarafından orta eluted plak-izole virüs yükseltmek eksik orta ve 0.5 μg/mL trypsin.
NOT: Rotavirüs'ün izolasyon ve plak testi ile titreşme ile ilgili ek bilgiler Arnold ve ark.31'demevcuttur.
5. Viral dsRNA jel elektroforezi
- 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere 600 μL enfekte hücre lisatları ve 400 μL guanidinium tiyosiyanat, 30 sl girdap ve 5 dakika oda sıcaklığında kuluçka yerleştirin. 13.000 x g (4 °C) ile 5 dk santrifüj yaptıktan sonra, üst sulu fazın ~550 μL'sini taze tüplere aktarın.
- 2 cilt (~900 μL) soğuk isopropil alkol ve ters borular 4−6x ekleyerek sulu fazdan viral dsRNA'yı kurtarın. 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yattıktan sonra, 13.000 x g (4 °C) sıcaklıkta 10 dk santrifüj tüpleri. Süpernatantları atın ve RNA peletlerini koruyun.
- Tüpe 1 mL %75 etanol ekleyerek, bir kez ters çevirerek ve 7.500 x g (4 °C) 5 dakika santrifüj ederek peletleri yıkayın. Etanol yıkamayı bir pipettor ile dikkatlice çıkardıktan sonra, RNA peletlerinin laboratuvar tezgahında 5−10 dakika boyunca hava kurmasını bekleyin.
- 10 μL çözünmüş RNA örneklerini 2 μL 6x DNA yükleme tamponu ile birleştirin, prekast %10 poliakrilamid mini jellere (veya el döküm eşdeğerleri) yükleyin ve Tris-glisin çalışan tamponu 2 saat sabit bir akım (16 mA) altında elektroforez ile RNA'ları çözünür. Jelleri ~1 μg/mL ethidium bromür içeren suda 5−10 dk bekletin ve UV transilluminator ile rotavirüs genom segmentlerini tespit edin.
6. Kurtarma ve viral dsRNA dizilimi
- Nükleik asit çapraz bağlantıları nın oluşmasını önlemek için tercihen düşük yoğunluklu uzun dalga boyu UV ışığı kullanarak poliakrilamid jellerde viral dsRNA bantları bulun. Taze bir jilet kullanarak, dsRNA bantları içeren jel parçalarını kesip 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
- 10−20 μL RNase içermeyen su ekledikten sonra, her parçayı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne uyacak şekilde tasarlanmış rnase içermeyen tek kullanımlık pelet havanezlesi ile veya 18 G iğneden yukarı ve aşağı doğru çizerek ezin. İnkütme parçaları bir gecede 4 °C'de ezilmiş.
- Ezilmiş jel parçaları içeren tüplerden 3 μL sıvı yıkurtarın. Tek adımlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kiti(Tablo Malzemeler)ve uygun oligonükleotid astarlar kullanarak viral dsRNA'ların CD'lerini oluşturun.
NOT: PCR ürünleri bir PCR temizleme kiti(Malzeme Tablosu)ile jel-saflaştırılmış ve ticari DNA dizisi hizmetleri ile astar ile birlikte, gece sıralama için dışarı gönderilir.
7. Viral proteinlerin immünoblot analizi
- Toplam 2 mL DMEM tam orta hacminde her kuyuda 3 x 105 MA104 hücreli 6 kuyulu tabaklar. Plakaları 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesine yerleştirin ve hücreler birleştiği yere ulaşana kadar (3−5 gün) bırakın.
NOT: Enakıcı monokatmanlı kuyular ~1.2 x 106 hücre içerecektir. - 37 °C'de 10 μg/mL tripsin ile 1 saat boyunca 1 saat içinde bulunan rekombinant rotavirüs partiküllerini aktive ederek açıklığa kavuşturulmuş süpernatanları tedavi edin.
- MA104 monolayers 6-iyi plakalar 2 mL PBS ile 2x durular. DMEM'de tripsin aktive edilmiş rotavirüs hücre başına 3−5 plak oluşturan ünite (PFU) içeren 200 μL inoküli her kuyuya ekleyerek hücreleri enfekte edin. Plakaları kuvöze geri ver.
- Her 10 dakika, plakaları çıkarın ve yavaşça hücre monolayer arasında inoculum yeniden dağıtmak için kaya. 1 saat sonra inoculumu 2 mL DMEM eksik orta ile değiştirin.
- 8 saat sonrası enfeksiyon, 6-iyi plakalar 2x PBS ile hücreleri durular. Hücreleri 750 μL PBS'ye kazıyın ve hacmi 1,5 mL mikrosentrifuge tüpüne aktarın. Plakayı 750 μL'lik başka bir PBS ile durulayın ve önceki toplanan 750 μL numuneyle birleştirin.
- 4 °C'de 10 dk için 5.000 x g santrifüj ederek numunedeki pelet hücreleri. Supernatant'ı attıktan sonra hücre peletlerini -80 °C'de daha fazla işlenene kadar saklayın.
- 300 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, %2 Triton X-100 ve 1x EDTA içermeyen komple proteaz inhibitörü içeren hücre lisis tamponunu hazırlayın. Dondurulmuş hücre peletlerine 300 μL lysis tamponu ekledikten sonra, kısa bir süre girdap örnekleri ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
- Buz 3x üzerinde girdap ve kuluçka örnekleri sürecini tekrarlayın. Daha sonra, 4 °C'de 10 dakika 15.000 x g'lık santrifüj numuneleri toplayıp -80 °C'de saklayın.
- Prekast lineer %8−16 poliakrilamid mini jellerde elektroforez ile 20 μL süpernatant numunelerde bulunan proteinleri çözün ve nitroselüloz membranlara aktarın. PBS-Tween 20 (%0.02) ile kuluçkaya yatarak membranblok % 5 yağsız kuru süt içeren çözelti.
- Bir veya daha fazla birincil antikorla kuluçkaya yatarak prob membranları (örneğin, kobay anti-NSP3 veya anti-VP6 antisera, fare monoklonal anti-Flag M2 antikor, veya tavşan monoklonal anti-PCNA antikor). At anti-fare IgG ile membranlar inkübatarak birincil antikorları tespit, anti-kobay IgG, veya keçi anti-tavşan IgG horse-rabbit peroksidaz konjuge ikincil antikorlar, gelişmiş kemilüminesans takip (ECL) horseradish kemilüminesans substrat. Bir jel görüntüleme sistemi(Tablo Malzemeler)veya X-Ray filmi kullanarak parlaklık sinyallerini görselleştirin.
8. FP-ekspres virüsler ile enfekte hücrelerin canlı hücre görüntüleme
- Toplam da 3 x 105 MA104 hücreli tohum 6-iyi plakalar toplam 2 mL DMEM komple orta. Plakaları 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesine yerleştirin ve hücreler birleştiği yere ulaşana kadar (3−5 gün) bırakın.
NOT: Enakıcı monokatmanlı kuyular ~1.2 x 106 hücre içerecektir. - 37 °C'de 10 μg/mL tripsin ile 10 μg/mL tripsin ile 1 saat boyunca kuluçka ya da bilinen titrekli rotavirüs örneklerini etkinleştirin.
- MA104 monolayers 2x 2 mL PBS ile 6 kuyulu plakaları durula. DMEM'de tripsin ile aktive edilmiş rotavirüs hücre başına 3−5 PFU içeren her kuyuya 200 μL inokül ekleyerek hücreleri enfekte edin. Her 10 dakikada bir inoculumu hücre monokatmanı na yeniden dağıtmak için plakaları kuvöze ve hafifçe kaya plakalarına geri döndürün.
NOT: Virüssüz DMEM inoculum ile enfekte olan kuyular kontrol olarak eklenmelidir. - 1 saat virüs adsorpsiyonundan sonra monolayer 2x'i PBS ile durulayın ve orta ortamı dmem'in eksik orta sı için 0,5 mL ile değiştirin. 7.5 saat enfeksiyon sonrası, düşük arka plan floresan(Malzeme Tablosu)ile DMEM ile kültür ortamı değiştirin. 8 saat sonrası enfeksiyon, yeşil, kırmızı veya mavi floresan sinyali için 20x büyütme hücreleri incelemek için canlı bir hücre görüntüleyici kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede açıklanan ters genetik protokolü birden fazla farklı adımda devam eder: (1) BHK-T7 hücrelerinin rotavirüs pT7 transkripsiyon vektörleri ve pCMV/NP868R ekspresyonu plazmidi ile birlikte transfeksiyonu, (2) MA104 hücreleri ile transfected BHK-T7 hücrelerinin overseeding, (3) BHK-T7/MA104 hücreleri lysates bulunan rekombinant virüslerin amplifikasyon ma104 hücreleri kullanarak, ve (4) MA104 hücreleri kullanarak rekombinant virüsün plak izolasyonu(Şekil 2). Bizim elimizde protokol verimlidir, bhk-T7/MA104 hücre lysates rekombinant wildtype SA11 virüsü (rSA11/wt) verimli titreleri ~ 104 PFU/mL ve amplifiye MA104 hücre lisates >1 x 107 PFU/mL. FP'leri ifade eden modifiye pT7/NSP3SA11 plazmidleri kullanılarak ters genetiğin ürettiği SA11 rekombinant virüsleri (örneğin, rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG) rSA11/wt'den ~4 kat daha az olan titrelere büyür.
Ters genetik protokolü takip ederek, MA104 hücrelerinde plak testini kolayca tespit edilebilen rekombinant SA11 virüsleri ürettik ve böylece plak izolasyonuna izin verdik(Şekil 3D). Plaklardaki virüsler uzun uçlu tek kullanımlık transfer pipeti ile seçilmiş ve MA104 hücrelerinde yükseltilmiştir. Plak saflaştırılmış rSA11/wt ve rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG virüslerinin dsRNA genomları guanidinium tiyokyanat ile çıkarıldı, elektroforezi ile %10 poliakrilamid jel üzerinde çözüldü ve ethidyum bromürle boyanarak tespit edildi (Şekil 3A). Beklendiği gibi rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG segmenti 7 (NSP3) dsRNA 2A-3xFL-UnaG dizilerinin varlığı nedeniyle rSA11/wt(Şekil 3A)segmenti çok daha yavaş göç etti. rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG segment7 (NSP3) dsRNA jel saflaştırılmış, RT-PCR tarafından cDNA formuna dönüştürülmüş ve doğruluğu doğrulamak için sıralanmış.
UnaG floresan proteininin ekspresyonunu kontrol etmek için, 6 kuyulu plakalı MA104 hücreleri rSA11/wt ve rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG hücre başına 3 PFU ile enfekte edildi. 8 saat sonrası enfeksiyonda, tabaktaki kültür ortamı, kuyu başına düşük arka plan floresansı olan 0,5 mL DMEM ile değiştirildi ve plakalar 37 °C'de co2 kuluçka makinesinde 30 dakika daha kuluçkaya yatırıldı. Daha sonra, plakalar canlı hücre görüntüleyici kullanılarak UnaG ifade için incelendi. Analiz, rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG'nin yeşil floresan ürettiğini ve rekombinant virüsteki UnaG geninin işlevselliğini doğruladığını göstermiştir(Şekil 3B). Buna karşılık rSA11/wt ile enfekte olan hücrelerde yeşil floresan saptamadı. rSA11/NSP3-2AxFL-UnaG'ın modifiye segment7'deki 2A elementinin iki ayrı proteinin (NSP3-2A ve 3xFL-UnaG) ekspresyonunu teşvik edip etmediğini gidermek için MA104 hücreleri rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG ve rSA11/wt ile enfekte oldu. Hücre lizileri 8 saat sonrası enfeksiyon sonrası hasat edilen hücrelerden hazırlandı, jel elektroforezi ile çözüldü ve nitroselüloz filtrelere saklandı. Lekeler rotavirus VP6 ve NSP3'e özgü antikorlar ve FLAG etiketi ile incelendi. Analiz, NSP3-2A ve 3xFL-UnaG'nin rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG ile enfekte olmuş hücrelerde ayrı protein olarak ifade edildiğini göstermiş ve 2A elemanının fonksiyonel olduğunu göstermiştir(Şekil 3C). rSA11/wt ile enfekte olan hücreler anti-FLAG antikor tarafından tanınan proteini ifade etmediler. RSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG-enfekte hücrelerde bulunan Anti-NSP3 antikor ile bulunan NSP3 proteini, NSP3'ün C-terminusunda kalıntı 2A kalıntısı varlığı nedeniyle rSA11/wt enfekte hücrelerde bulunan NSP3'ten biraz daha yavaş göç etti.
Şekil 1: Rotavirüs ters genetik plazmidler. (A) 11 SA11 rotavirüs genom segmentlerinin tam uzunlukta KISNA'ları pT7 plazmidleri içinde konumlandırılır, T7 RNA polimeraz için bir promotör ile yukarı doğru ve HDV ribozyme ile akıntıya karşı lanır. T7 RNA polimeraz varlığında, rotavirus pT7 plazmidler otantik 5' ve 3' termini ile tam uzunlukta SA11 (+)RNA'lar üretir. (B) PT7/NSP3-2A-3xFL-UnaG plazmidi tarafından yapılan (+)RNA ve protein ürünlerinin şemaları. Şematik NSP3 cDNA dizisi içerir, ve domuz teschovirus için dizileri 2A benzeri (2A) eleman, 3x FLAG (FL) etiketi, ve yeşil floresan protein UnaG. 2A çevirici stop-restart sitesinin konumu kırmızı okla gösterilir. 2A elementinin aktivitesi nedeniyle RNA'nın çevirisi iki protein üretir. NSP3 kısmı 2A öğesinin kalıntılarını içerir ve UnaG kısmı 3x FLAG etiketine eritilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Rotavirüs ters genetik sistemi. BHK-T7 monolayers 11 pT7 plazmids ile transfected, her farklı bir SA11 ifade (+)RNA, ve Afrika domuz ateşi virüsü ifade bir pCMV vektör (ASFV) NP868R kapama enzimi (pCMV/NP868R). 3 gün sonra enfeksiyon sonrası (d.p.i.), BHK-T7 hücreleri MA104 hücreleri ile overseeded vardır. 7 gün sonrası enfeksiyon, BHK-T7/MA104 hücre lisates rekombinant rotavirüsler MA104 hücreleri üzerinde geçiş ile güçlendirilmiş, daha sonra plak arıtma ile izole edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RSA11/wt ve rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG rekombinant suşlarının özellikleri. (A) Plak-izole rSA11 suşlarının dsRNA genom segmentlerinin elektroforetik profilleri. 11 genom segmenti numaralandırılır ve 7. (B) RSA11 enfekte MA104 hücrelerinde 8 saat sonrası enfeksiyonda yeşil algılama kanalında bulunan canlı hücre görüntüleyicisi (20x büyütme) kullanılarak floresan saptanmıştır. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) Ma104 hücrelerinde 8 saat sonrası enfeksiyonda bulunan proteinlerin immünblot analizi kobay anti-VP6 ve anti-NSP3 anti-FLAG monoklonal antikor kullanarak rSA11 suşları ile enfekte. (D) MA104 hücrelerinde rSA11/wt tarafından 3 gün sonra enfeksiyon sonrası üretilen ve nötr kırmızı boyama ile saptanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laboratuvarımızda, rekombinant SA11 rotavirüsleri üretmek için burada tanımlanan ters genetik protokolüne rutin olarak güveniyoruz. Bu yaklaşımla, moleküler biyoloji teknikleri konusunda çok az deneyimi olan veya rotavirüslerle çalışan bireyler ilk denemelerinde bile rekombinant virüsleri kurtarırlar. Bu protokolü takip eden 100'e yakın rekombinant virüs ürettik, yabancı proteinleri (örneğin, FP'leri) ifade etmek için yeniden tasarlanmış genomlara sahip olanlar ve dizi eklemeleri, silmeler ve nokta mutasyonları içeren genomlara sahip olanlar da dahil.
Bu protokolde verilen koşullar ve kuluçka süreleri rekombinant virüslerin iyi büyüyen suşlarının geri kazanımı için geçerlidir. Genetik modifikasyon nedeniyle kötü büyümesi beklenebilecek SA11 virüslerini kurtarmaya çalışırken ayarlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. Özellikle, transfected BHK-T7/MA014 hücre lisatlarında bu tür virüslerin titreşme oranı düşük olabileceğinden, genellikle sonraki amplifikasyon adımlarında inokül olarak kullanılan lysat miktarını iki katına çıkarız. Ayrıca, amplifikasyon adım, kötü büyüyen virüsler hücre hasat için yeterli CPE seviyelerine ulaşmadan önce kuluçka daha uzun süre gerektirebilir. Gerçekten de, bu tür virüsler ile, biz enfeksiyonların 10−14 gün, hatta daha uzun süre, hücreleri hasat önce devam etmesine izin verebilir. Son olarak, kötü büyüyen virüsler MA104 hücrelerinde küçük, yavaş büyüyen plaklar oluşturmak olasıdır. Bu nedenle, plak bu virüsleri izole etmek için, nötr kırmızı ile hücreleri boyama ve plak toplama önce plaklar 6−10 gün sonrası enfeksiyon kadar geliştirmek için izin vermek gerekebilir.
Deneyimlerimize göre, rekombinant rotavirüs güvenilir kurtarma tek en önemli faktör sağlıklı kullanımı, bakımlı BHK-T7 hücrelerinin. Laboratuvarımızda, bhk-T7 hücrelerini sadece %10 FBS ile değil, aynı zamanda NEAA, TPB ve yüksek glikoz (GMEM komple orta) ile de tamamlanarak aynı seyreltme de haftada 2 x geçiş yapıyoruz. Ek takviyeleri BHK-T7 hücreleri plazmid transfeksiyon aşağıdaki genişletilmiş canlılık korumak yardımcı, bir faktör muhtemelen kötü büyüyen mutant rekombinant virüsleri kurtarmak için çok önemli. Biz G418 ile orta her pasaj takviyesi, T7 polimeraz ekspresyonu plazmid bakımı için seçen bir antibiyotik. Geçiş koşulları bhk-T7 hücrelerinin yakın fluency büyümeye izin asla böyle olmalıdır, hızla hücre canlılığı azalmaya yol açan koşullar. Bizim için, bhk-T7 hücreleri daha sonra uygun birden çok kez geçit olsa bile, ters genetik protokolü kötü performans izin verilmiştir. Aşırı büyümüş BHK-T7 hücrelerini rehabilite etmeye çalışmak yerine, daha önce sıvı nitrojende depolanan hücrelerle soyu yeniden başlatıyoruz.
BHK-T7 ve MA104 hücrelerinin mikoplazma kontaminasyonu, rotavirüs ters genetik sisteminin rekombinant virüs üretememesinde önemli bir faktör olabilir. Laboratuvarımızda, hücre hatlarının kontaminasyonunu kontrol etmek için PCR tabanlı mikoplazma algılama kiti(Tablo)kullanıyoruz ve tespit edildiğinde genellikle BHK-T7 hücrelerimizle ilişkilidir. Mikoplazmayı kirleten hücre hatlarını tedavi etmeye kalkışmadık, bunun yerine sıvı nitrojende depolanan daha önceki mikoplazmasız geçitlerle hatları yeniden oluşturduk. Yeni hücre hatları başlamadan önce, biz tüm önceden kullanılan orta ve orta takviyeleri atmak ve iyice dekontamine kuvözler, biyolojik güvenlik dolapları, su banyoları, laboratuvar bankları, ve pipettors. Ayrıca kontaminasyon için rekombinant virüs stokları kontrol etmek için mikoplazma algılama kitleri kullanın. Vertrel VF32gibi organik çözücüler tarafından denatürasyon rotavirüs parçacıklarının direnci nedeniyle, ters genetik ile rekombinant virüsleri yeniden oluşturma ihtiyacını inkâr, mikoplazma kirletici gelen virüs stokları serbest etmek mümkündür. Laboratuvara alınan hücre hatlarının ve virüs preparatların rutin kullanımdan önce mikoplazma kontaminasyonu için kontrol edilmesi gerektiğini vurgulamak önemlidir.
Her ne kadar gün içinde ve her gün, biz rekombinant virüsler oluşturmak için aynı protokolü kullanmak, biz bazı değişiklikler virüs kurtarma engellemeyecek yapılabilir biliyorum. Örneğin, (i) pCMV/NSP868R kapama enzimplazmidinin SA11 pT7 vektörleri ile birlikte transfeksiyonu rekombinant virüslerin iyileşmesi için gerekli değildir. Transfected BHK-T7/MA104 hücre lysates kapama plazmid verimleri daha yüksek virüs titreleri yanı sıra, biz bu olmadan, LP ifade olanlar da dahil olmak üzere çok sayıda virüs kurtarmak mümkün olmuştur. Ancak, pCMV/NP868R ile kapama enziminin ekspresyonunun daha az formda olan virüslerin iyileşmesine önemli ölçüde katkıda bulunabileceği sonucuna vardık. (ii) Ters genetik protokolünde kullanılan transfeksiyon reaktifi(Malzeme Tablosu)miktarı yarı yarıya azalsa bile rekombinant virüslerin üretilebildiği ve bu değişikliklerin giderleri önemli ölçüde azaltabildiği tespit edilmiştir. (iii) Benzer şekilde, M199 komple ortamının DMEM komple orta yerine kullanılabileceğini belirledik. (iv) Son olarak, SA11 T7 transkripsiyon vektörlerinin üretiminde kullanılması gereken vektör omurgasının türü ile ilgili bir ayar şartı yoktur. Plazmiddeki viral cDNA bir upstream T7 organizatörü ve bir downstream HDV ribozyme ve T7 terminatör ile çevrili olduğu sürece, plazmid rekombinant virüsün iyileşmesini desteklemek için beklenebilir. Özellikle, pGEM-, pBluescript ve pUC tabanlı vektörler ters genetik sistemde başarıyla kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH'nin R03 AI131072 ve R21 AI144881, Indiana Üniversitesi Start-Up Finansmanı ve Lawrence M. Blatt Vakfı tarafından desteklenmiştir. IU Rotahoosier laboratuvarı üyelerine, Ulrich Desselberger'e ve Guido Papa'ya ters genetik protokolünün geliştirilmesine yaptıkları birçok katkı ve öneri için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
References
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- International Committee on Taxonomy of Viruses. Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release. , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019).
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, Suppl 2 96-105 (2016).
- Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
- Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
- McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
- Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
- Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
- Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
- Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
- Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
- Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
- Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
- Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
- Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
- Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
- Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
- Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
- Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
- Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
- Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
- Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
- Donnelly, M. L., et al. The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
- Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , HHS publication no. CDC 21-1112 (2009).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
- Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).
