Summary
Die Generierung rekombinanter Rotaviren aus Plasmid-DNA ist ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der Rotavirus-Replikation und Pathogenese sowie für die Entwicklung von Rotavirus-Expressionsvektoren und Impfstoffen. Hierin beschreiben wir einen vereinfachten Reverse-Genetik-Ansatz zur Erzeugung rekombinanter Rotaviren, einschließlich Stämmen, die fluoreszierende Reporterproteine exdrücken.
Abstract
Rotaviren sind eine große und sich entwickelnde Population segmentierter doppelsträngiger RNA-Viren, die bei vielen Säugetier- und Vogelwirtarten, einschließlich des Menschen, eine schwere Gastroenteritis verursachen. Mit dem jüngsten Aufkommen von Rotavirus-Reverse-Genetik-Systemen ist es möglich geworden, gezielte Mutagenese zu verwenden, um die Rotavirusbiologie zu erforschen, bestehende Rotavirus-Impfstoffe zu modifizieren und zu optimieren und Rotavirus-Multitarget-Impfstoffvektoren zu entwickeln. In diesem Bericht beschreiben wir ein vereinfachtes Reverse-Genetik-System, das die effiziente und zuverlässige Wiederherstellung rekombinanter Rotaviren ermöglicht. Das System basiert auf der Kotransfektion von T7-Transkriptionsvektoren, die Rotavirus (+)RNAs exdrücken, und einem CMV-Vektor, der ein RNA-Verschlussenzym in BHK-Zellen kodiert, die konstitutiv T7-RNA-Polymerase (BHK-T7) produzieren. Rekombinante Rotaviren werden verstärkt, indem die transfizierten BHK-T7-Zellen mit MA104-Zellen übersaat werden, einer Affen-Nierenzelllinie, die für das Viruswachstum sehr freizügig ist. In diesem Bericht beschreiben wir auch einen Ansatz zur Erzeugung rekombinanter Rotaviren, die durch die Einführung eines 2A-Translational Stop-Restart-Elements in das Genomsegment 7 (NSP3) ein separates fluoreszierendes Reporterprotein ausdrücken. Dieser Ansatz vermeidet das Löschen oder Ändern eines der viralen offenen Leserahmen und ermöglicht so die Produktion rekombinanter Rotaviren, die voll funktionsfähige virale Proteine behalten und gleichzeitig ein fluoreszierendes Protein exezieren.
Introduction
Rotaviren sind Hauptursachen für schwere Gastroenteritis bei Säuglingen und Kleinkindern, sowie bei vielen anderen Säugetier- und Vogelarten1. Als Mitglieder der Reoviridae-Familie haben Rotaviren ein segmentiertes doppelsträngiges RNA-Genom (dsRNA). Die Genomsegmente sind in einem nicht umhüllten ikosaedralen Virion enthalten, das aus drei konzentrischen Schichten des Proteins2gebildet wird. Basierend auf der Sequenzierung und phylogenetischen Analyse der Genomsegmente wurden neun Arten von Rotavirus (A-D, F-J) definiert3. Die Stämme, die Rotavirus-Arten A umfassen, sind für die überwiegende Mehrheit der menschlichen Krankheit verantwortlich4. Die Einführung von Rotavirus-Impfstoffen in Impfprogramme für Kinder, die in den letzten zehn Jahren begonnen haben, korreliert mit einer signifikanten Verringerung der Sterblichkeit und Morbidität von Rotavirus. Vor allem ist die Zahl der Rotavirus-assoziierten Todesfälle im Kindesalter von etwa 528.000 im Jahr 2000 auf 128.500 im Jahr 2016gesunken 4,5. Rotavirus-Impfstoffe werden aus lebenden abgeschwächten Stämmen des Virus formuliert, wobei 2 bis 3 Dosen kindern im Alter von 6 Monaten verabreicht werden. Die große Anzahl genetisch unterschiedlicher Rotavirusstämme, die bei Menschen und anderen Säugetierarten zirkulieren, in Verbindung mit ihrer Fähigkeit, sich durch Mutagenese und Neusortierung schnell zu entwickeln, können zu antigenen Veränderungen in den Arten von Rotaviren führen, die Kinder6,7,8infizieren. Solche Änderungen können die Wirksamkeit bestehender Impfstoffe untergraben, die deren Ersatz oder Änderung erfordern.
Die Entwicklung vollständig plasmidbasierter Reverse-Genetik-Systeme, die die Manipulation eines der 11 Rotavirus-Genomsegmente ermöglichen, wurde erst vor kurzem erreicht9. Mit der Verfügbarkeit dieser Systeme ist es möglich geworden, molekulare Details der Rotavirusreplikation und Pathogenese zu entwirren, verbesserte Hochdurchsatz-Screening-Methoden für Anti-Rotavirus-Verbindungen zu entwickeln und neue potenziell effektivere Klassen von Rotavirus-Impfstoffen zu schaffen. Während der Rotavirus-Replikation leiten gekappte virale (+)RNAs nicht nur die Synthese viraler Proteine, sondern dienen auch als Vorlagen für die Synthese von Nachkommen dsRNA-Genomsegmenten10,11. Alle bisher beschriebenen Rotavirus-Reverse-Genetik-Systeme stützen sich auf die Transfektion von T7-Transkriptionsvektoren in Säugetierzelllinien als Quelle von cDNA-abgeleiteten (+)RNAs, die bei der Wiederherstellung rekombinanter Viren9,12,13verwendet werden. Innerhalb der Transkriptionsvektoren werden virale cDNAs in voller Länge zwischen einem vorgelagerten T7-Promotor und einem nachgeschalteten Hepatitis-Delta-Virus (HDV)-Ribozym positioniert, so dass virale (+)RNAs durch T7-RNA-Polymerase synthetisiert werden, die authentische 5' und 3'-termini enthalten (Abbildung 1A). Im Reverse-Genetik-System der ersten Generation wurden rekombinante Viren durch Transfizierung von Babyhamster-Nierenzellen hergestellt, die T7-RNA-Polymerase (BHK-T7) mit 11 T7 (pT7) Transkriptionsvektoren exdrücken, jede direkte Synthese einer einzigartigen (+)RNA des simians SA11-Virusstamms und drei CMV-Promotor-Antriebsexpressionsplasmiden, eines kodiert das Aviäre Reovirus p10FAST-Fusionsprotein und zwei kodierende Untereinheiten des Impfvirus D1R-D12L-Verschluss-Enzymkomplexes9. Rekombinante SA11-Viren, die in transfizierten BHK-T7-Zellen erzeugt wurden, wurden durch Übersaat mit MA104-Zellen verstärkt, einer Zelllinie, die für das Wachstum des Rotavirus freiist. Es wurde eine modifizierte Version des Reverse-Genetik-Systems der ersten Generation beschrieben, die keine Unterstützungplasmide mehr verwendet12. Stattdessen erzeugt das modifizierte System erfolgreich rekombinante Rotaviren, indem es BHK-T7-Zellen mit den 11 SA11 T7 Transkriptionsvektoren transfiziert, wobei der Vorbehalt besteht, dass Vektoren für die Bausteine der viralen Fabrik (Viroplasma) (nichtstrukturelle Proteine NSP2 und NSP5) auf Ebenen hinzugefügt werden, die 3-fach höher sind als die anderen Vektoren14,15. Modifizierte Versionen des Reverse-Genetik-Systems wurden auch entwickelt, die die Wiederherstellung der menschlichen KU- und Odelia-Stämme des Rotavirus16,17unterstützen. Das Rotavirus-Genom ist bemerkenswert anfällig für Manipulationen durch umgekehrte Genetik, mit rekombinanten Viren, die bisher mit Mutationen in VP418,NSP19, NSP219, NSP320,21und NSP522,23eingeführt wurden. Zu den nützlichsten Viren, die bisher erzeugt wurden, gehören diejenigen, die entwickelt wurden, um fluoreszierende Reporterproteine (FPs)auszudrücken 9,12,21,24,25.
In dieser Publikation stellen wir das Protokoll für das Reverse-Genetik-System zur Verfügung, das wir in unserem Labor verwenden, um rekombinante Stämme von SA11-Rotavirus zu erzeugen. Das Hauptmerkmal unseres Protokolls ist die Ko-Transfektion von BHK-T7-Zellen mit den 11 pT7 Transkriptionsvektoren (modifiziert um 3x Ebenen des pT7/NSP2SA11 und pT7/NSP5SA11-Vektors) und eines CMV-Expressionsvektors, der das Afrikanische Schweinepestvirus (ASFV) NP868R-Verschlussenzym21 (Abbildung 2) kodiert. In unseren Händen führt das Vorhandensein des NP868R-Plasmids zur Produktion von höheren Tittern rekombinanter Viren durch transfizierte BHK-T7-Zellen. In dieser Publikation stellen wir auch ein Protokoll zur Änderung des pT7/NSP3SA11-Plasmids bereit, so dass rekombinante Viren erzeugt werden können, die nicht nur das Segment 7-Proteinprodukt NSP3, sondern auch ein separates FP ausdrücken. Dies wird erreicht, indem der NSP3-Leserahmen (ORF) im pT7/NSP3SA11-Plasmid neu gestaltet wird, um ein nachgeschaltetes 2A-Translational Stop-Restart-Element gefolgt von einem FP ORF (Abbildung 1B)24,26. Durch diesen Ansatz haben wir rekombinante Rotaviren erzeugt, die verschiedene FpPs exdrücken: UnaG (grün), mKate (far-red), mRuby (rot), TagBFP (blau), CFP (cyan) und YFP (gelb)24,27,28. Diese FP-exemitten Rotaviren werden ohne Löschung des NSP3 ORF hergestellt, wodurch Viren entstehen, von denen erwartet wird, dass sie eine vollständige Ergänzung funktionierender viraler Proteine kodieren.
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Protocol
1. Medienaufbereitung und Zellkulturpflege
- Erhalten Sie Babyhamster-Nierenzellen, die konstitutiv T7-RNA-Polymerase (BHK-T7) und afrikanische grüne Affennieren-MA104-Zellen exemiten.
HINWEIS: BHK-T7 (oder BSR-T7) Zellen sind nicht kommerziell erhältlich, sondern sind eine gemeinsame Zelllinie von Laboratorien, die Umgekehrte Genetik verwenden, um die RNA-Virusbiologie zu untersuchen. Die in diesem Protokoll verwendete BHK-T7-Zelllinie wurde von Dr. Ursula J. Buchholz (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), einem Mitentwickler der ursprünglichen BHK-Zelllinie, die T7-RNA-Polymerase29exexzessiiert, bezogen. MA104-Zellen sind bei der European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) und bei American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich. - Bereiten Sie die folgenden Kulturmedien in einer sterilen Umgebung vor, vorzugsweise ein biologisches Sicherheitskabinett der Klasse II. Medien im Dunkeln bei 4 °C aufbewahren und unmittelbar vor gebrauchen auf 37 °C erwärmen.
HINWEIS: Quellen von Medienkomponenten sind in der Tabelle der Materialienenthalten.- Um DMEM unvollständiges Medium vorzubereiten, kombinieren Sie 500 ml des modifizierten Minimum-Essential-Mediums (MEM) von Dulbecco, das 4,5 g/L Glukose und 1% Glutamin mit 5 ml 100x Pen-Strep enthält.
- Um DMEM komplettes Medium vorzubereiten, kombinieren Sie 500 ml DMEM unvollständiges Medium mit 25 ml fetalem Rinderserum (FBS).
- Um GMEM unvollständiges Medium vorzubereiten, kombinieren Sie 500 ml Glasgow minimum essential medium, 5 ml of 100x glutamin, 50 ml tryptose-phosphate brühe (TPB), 5 ml von 100x nicht essentielle Aminosäuren (NEAA) und 5 ml 100x Pen-Strep.
- Um GMEM komplettes Medium vorzubereiten, kombinieren Sie 500 ml GMEM unvollständiges Medium mit 25 ml wärmeinaktiviertem FBS.
- Um GMEM+G komplettes Medium vorzubereiten, fügen Sie 10 ml 50 mg/ml Geneticin (G418) auf 500 ml GMEM-Gesamtmedium hinzu.
- Um das unvollständige Mittel des KmuM vorzubereiten, kombinieren Sie 500 ml von Jokliks modifiziertem Eagle es MEM, 5 ml 100x Glutamin, 50 ml TPB, 5 ml 100x NEAA und 5 ml 100x Pen-Strep.
- Kultur MA104-Zellen in T75- oder T175-Kolben, die 12 bzw. 25 ml DMEM-Gesamtmedium enthalten. Um MA104-Zellen, die 100% Koninfluenza erreicht haben, zu durchziehen, spülen Sie die Zellmonoschicht 2x mit phosphatgepufferter Saline (PBS), dissoziieren Sie mit Trypsin (0,05%)-EDTA (0,1%) 5 (T75-Kolben) oder 10 ml (T175-Kolben) dmEM-Unvollständiges Medium.
- Legen Sie 0,5 bis 1,0 ml resuspendierte Zellen in frische Kolben und bringen Sie das entsprechende Endvolumen durch Hinzufügen von DMEM-Gesamtmedium. Kolben in einen 37 °C,2 5% CO2-Inkubator stellen.
- Vermehren Sie BHK-T7-Zellen in T75-Flaschen, abwechselnd zwischen der Verwendung von GMEM und GMEM+G komplettem Medium mit jeder Durchgangsrunde. Um BHK-T7-Zellen, die eine 100%ige Konfluenz erreicht haben, zu subkulturieren, spülen Sie die Zellmonoschicht 2x mit PBS, distanzieren Sie sich mit der Trypsin-EDTA-Lösung und setzen Sie sich in 5 ml Medium aus.
- Nachdem Sie 15 ml GEM oder GMEM+G komplettin einen frischen T75-Kolben platziert haben, fügen Sie vier Tropfen resuspendierter BHK-T7-Zellen hinzu. Kolben in einen 37 °C,2 5% CO2-Inkubator stellen.
2. Plasmid-Vorbereitung
- Erhalten Sie die folgenden Plasmide, die Rotavirus SA11 (+)RNAs von Addgene exzieren: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11 und pT7/NSP5SA11. Beziehen Sie das Plasmid, das das ASFV-Verschlussenzym (pCMV/NP868R) exzessient, von den Autoren21.
HINWEIS: Modifizierte pT7/NSP3SA11 Plasmide, die entwickelt wurden, um ein FP durch die Aktivität eines 2A-Translationalelements (pT7/NSP3-2A-3xFL-FP) auszudrücken, können auch von den Autoren24,26bezogen werden. pT7/NSP3-2A-3xFL-FP Plasmide, die die folgenden FP exdrücken, sind verfügbar: UnaG (grün), mKate (far-red), mRuby (rot), TagBFP (blau), CFP (cyan) und YFP (gelb)24. - Verwandeln Sie Plasmide in kompetente E. coli UND verbreiten Sie Bakterien auf Luria Brühe AgarPlatten, die das entsprechende Antibiotikum enthalten. Wachsen Sie Bakterienkulturen aus einzelnen Kolonien und bereiten kleinere Mengen an Plasmid (20 g) mit einem Spin Miniprep Reinigungssatz (Tabelle der Materialien), nach den Anweisungen des Herstellers. Bereiten Sie größere Mengen an Plasmid aus Bakterienkulturen mit Midi- und Maxi-Reinigungskits(Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Plasmide, die für den Einsatz im Reverse-Genetik-System geeignet sind, wurden auch mit anderen Plasmid-Reinigungskits hergestellt. Es ist nicht notwendig, Plasmide mit Kits vorzubereiten, die speziell entwickelt wurden, um Endotoxinfreies Material zu erzeugen. - Stellen Sie die Konzentrationen von gereinigten Plasmiden auf 1 mg/ml in nukleasefreiem molekularbiologischem Wasser ein. Überprüfen Sie die Plasmidreinheit, indem Sie mit einem Spektralphotometer ein Absorptionsverhältnis von 260/280 von 1,8 € bestätigen. Verwenden Sie außerdem die Elektrophorese an 0,8% Agarose-Gelen, um zu überprüfen, ob Plasmide überwiegend übergewickelt sind.
- Aliquot gereinigte Plasmide in 0,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen, die jeweils 10 l enthalten. Plasmide bei -80 °C lagern.
3. Generierung des rekombinanten Virus
HINWEIS: Die Forschung an rotavirus, einschließlich der Erzeugung und Charakterisierung rekombinanter Rotavirusstämme, muss unter den Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) behandelt werden und bedarf der vorherigen Genehmigung durch den Institutional Biosafety Committee (IBC). Geeignete BSL-2 Laborbedingungen werden in Biosafety in Mikrobiologischen und biomedizinischen Laboratorien (BMBL) beschrieben, die von den Centers for Disease Control and Prevention (CDC)30produziert werden.
- Tag 1: Aussaat von BHK-T7-Zellen in 12-Well-Platten
- Spülen Sie eine frisch konfluente Monoschicht von BHK-T7-Zellen, die in einem T75-Kolben 2x mit PBS enthalten sind. Unterbrechen Sie die Zellmonolayer mit Trypsin-EDTA-Lösung und setzen Sie die Zellen in 5 ml GMEM-Gesamtmedium wieder aus.
- Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler und eine trypan-blaue Lösung, um die Konzentration lebensfähiger BHK-T7-Zellen im Medium zu bestimmen. Samenzellen in 12-Well-Zellkulturplatten, wobei jeder Brunnen 2 x 105 Zellen in einem Gesamtvolumen von 1 ml GMEM (G418-frei) komplettem Medium enthält. Inkubieren Sie in einem 372 °C, 5% CO2-Inkubator. Die Zellen sollten bis Tag 2 80 bis 90 % konfluenz erreichen.
- Tag 2: Transfektion von BHK-T7-Zellen mit Plasmidmischungen
- Zur Herstellung des Plasmidgemischs folgendes in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit Plasmidvorräten zu kombinieren, die auf 1 mg/ml eingestellt sind: 0,8 l pro SA11 pT7-Plasmids VP1; VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 und NSP4, je 2,4 L sA11 pT7 Plasmide NSP2 und NSP5 und 0,8 l pCMV/NP868R. Mischen Sie Plasmide vorsichtig, indem Sie auf das Rohr tippen und Inhalte durch Pulszentrifugation sammeln. Um rekombinante Viren vorzubereiten, die Fpps exezieren, ersetzen Sie pT7/NSP3SA11 durch das entsprechende pT7/NSP3-2A-3xFL-FP-Plasmid.
HINWEIS: Plasmidmischungen sollten auf Eis gelagert werden, bis sie verwendet werden. Für jede Transfektion sollte ein separates Rohr vorbereitet werden. - Zur Herstellung des Plasmid/reduzierten Serummediums/Transfektionsreagenzgemisches: 110 L vorgewärmtes (37 °C) reduziertes Serummedium(Materialtabelle) zu jedem Plasmidgemisch hinzufügen und durch sanftes Pipetieren nach oben und unten mischen. Danach fügen Sie jedem Plasmid/reduzierten Serummedium-Gemisch 32 L Transfektionsreagenz (Materialtabelle) hinzu; Dies ergibt eine Konzentration von 2,5 l Transfektionsreagenz pro g Plasmid in Mischungen. Wirbelmischungen sanft und inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min.
- Während der 20 min Inkubationszeit spülen BHK-T7-Zellen in 12-Well-Platten (vorbereitet am 1. Tag) einmal mit 2 ml GMEM unvollständigen Medien. Fügen Sie anschließend 1 ml SMEM unvollständiges Medium zu jedem Brunnen hinzu und geben Sie Platten an den Inkubator zurück.
- Nach der 20 min Inkubationszeit fügen Sie das Plasmid/reduzierte Serummedium/Transfektionsgemisch Tropfen für Tropfen zu jedem Bohrkörper der 12-Well-Platten mit einem 200-L-Pipettor hinzu. Leicht Gesteinsplatten und kehren Sie zu einem2 37 °C, 5% CO2-Inkubator zurück.
- Zur Herstellung des Plasmidgemischs folgendes in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit Plasmidvorräten zu kombinieren, die auf 1 mg/ml eingestellt sind: 0,8 l pro SA11 pT7-Plasmids VP1; VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 und NSP4, je 2,4 L sA11 pT7 Plasmide NSP2 und NSP5 und 0,8 l pCMV/NP868R. Mischen Sie Plasmide vorsichtig, indem Sie auf das Rohr tippen und Inhalte durch Pulszentrifugation sammeln. Um rekombinante Viren vorzubereiten, die Fpps exezieren, ersetzen Sie pT7/NSP3SA11 durch das entsprechende pT7/NSP3-2A-3xFL-FP-Plasmid.
- Tag 4: Übersaat transfizierter BHK-T7-Zellen mit MA104-Zellen
- Spülen Sie eine frisch konfluente Monoschicht von MA104-Zellen, die in einem T75-Kolben 2x mit PBS enthalten sind. Unterbrechen Sie die Monoschicht mit Trypsin-EDTA-Lösung und setzen Sie Zellen in 5 ml DMEM-Gesamtmedium wieder auf.
- Mit hilfe einer automatisierten Zellzähler und Trypan-Blau-Lösung, bestimmen Sie die Konzentration der lebensfähigen MA104-Zellen im Medium. Stellen Sie die Konzentration auf 8 x 105 MA104-Zellen/ml in DMEM-Unvollständigen medium ein und fügen Sie 0,25 ml suspendierte Zellen (2 x 105 Zellen) tropfenweise zu den Brunnen hinzu, die transfizierte BHK-T7-Zellen enthalten.
- Passen Sie die Konzentration von Trypsin (SchweinepankreasTyp IX) im Medium auf 0,5 g/ml an, indem Sie jedem Bohrgut 0,8 l von 1 mg/ml Trypsin-Bestand hinzufügen.
HINWEIS: Trypsin-Bestände sollten in PBS hergestellt, aliquoted und bei -20 °C gelagert werden. - Verwenden Sie die verbleibenden MA104-Zellen, um 6-Well-Platten vorzubereiten, die an Tag 7 benötigt werden, um rekombinante Viren zu verstärken. Um 6-Well-Platten auszusäen, resuspendierte MA104-Zellen auf eine Konzentration von 1,5 x 105 Zellen/ml in DMEM-Gesamtmedium verdünnen und 2 ml in jedem Brunnen platzieren. Platten in einen 37 °C,2 5% CO2-Inkubator legen.
- Tag 7: Rückgewinnung und Verstärkung von rekombinanten Viren aus transfizierten Zellen
- Unter sterilen Bedingungen BHK-T7/MA104-Zellen in 12-Well-Platten drei Zyklen Gefriertau unter sterilen Bedingungen, bewegliche Platten zwischen -20 °C Gefrierschrank und Raumtemperaturoberfläche. Nach der Übertragung von Lysaten auf 1,5 ml-Rohre, Zentrifugenrohre für 10 min bei 500 x g (4 °C) zu Pellet großen zellulären Schmutz. Überstand sammeln und bei 4 °C (kurzfristig) oder -20 °C (langfristig) lagern.
- MA104 Monolayer in 6-Well-Platten (vorbereitet an Tag 4) 2x mit PBS waschen. Platzieren Sie 2 ml DMEM unvollständiges Medium zu jedem Brunnen, der 0,5 g/ml Trypsin enthält. Fügen Sie 300 L Überstand, der aus BHK-T7/MA104-Zelllysaten zurückgewonnen wurde, in Brunnen2 einundund legen Sie Platten in einen 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
- Inkubationsplatten für 7 Tage oder bis vollständige zytopathische Wirkungen (CPE) beobachtet werden. Lyse MA104-Zellen in 6-Well-Platten durch drei Zyklen Gefriertau, dann übertragen Lysate auf 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre. Pellet große zelluläre Ablagerungen durch Zentrifugation für 10 min bei 500 x g (4 °C). Die geklärten Zelllysate in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und bei -20 °C lagern.
4. Plaque-Isolierung von rekombinanten Viren
- Aktivieren Sie Viren in 100 l geklärter Zelllysate, indem Sie Trypsin zu einer Endkonzentration von 10 g/ml hinzufügen und bei 37 °C für 1 h inkubieren. Bereiten Sie eine 10-fache serielle Verdünnungsserie von 10-1 bis 10-7 (jeweils 1 ml) in DMEM-Unvollständiges Medium vor.
- MA104 Monolayer in 6-Well-Platten 2x mit 2 ml PBS und einmal mit DMEM unvollständigem Medium spülen. Fügen Sie 400 ml Lysatverdünnungen in Doppeltarbeit zu den Platten hinzu. Inkubieren Sie die Platten für 1 h in2 einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator, Schaukeln alle 10 bis 15 min, um Verdünnungen über die Monoschicht umzuverteilen.
- Bereiten Sie eine Agarose-MEM-Overlay-Lösung vor, indem Sie gleiche Volumina des minimalen essentiellen Mediums 2x Eagle (EMEM; vorgewärmt auf 37 °C) mit 1,5% Agarose kombinieren, die mit einer Mikrowelle in Wasser geschmolzen und auf 45 °C vorgekühlt wurde. Halten Sie die Overlay-Lösung bei 42 °C mit einem Wasserbad und stellen Sie sich unmittelbar vor dem Auflegen auf die Zellen auf eine Endkonzentration von 0,5 g/ml Trypsin ein.
- Lysatverdünnungen von 6-Well-Platten abziehen, dann Zellen einmal mit 2 ml unvollständigem DMEM abspülen. Überlagern Sie 3 ml der Agarose-MEM-Overlay-Lösung vorsichtig auf die in jedem Brunnen enthaltene Zellmonolayer. Lassen Sie die Agarose-Overlay bei Raumtemperatur aushärten und dann Dieplatten zum Inkubator zurückgeben.
- Drei Tage später eine Agarose-MEM-Overlay-Lösung wie in Schritt 4.3 vorbereiten und auf 42 °C bringen. Stellen Sie die Überlagerungslösung unmittelbar vor der Verwendung auf eine Endkonzentration von 50 g/ml neutral rot ein (Materialtabelle).
- Fügen Sie 2 ml der Overlay-Lösung auf die vorhandene Agarose-Schicht in die 6-Well-Platten. Nachdem Sie die neue Agaroseschicht aushärten lassen, geben Sie die Platten zum Inkubator zurück. Schützen Sie Lösungen und Platten, die neutrales Rot enthalten, vor Lichteinwirkung.
- Identifizieren Sie in den nächsten 6 h Rotavirus-Plaques in den 6-Well-Platten mit Hilfe eines Leuchtkastens. Wählen Sie klar definierte Plaques mit Einweg-Transferpipetten, die Agarose-Stecker wiederherstellen, die sich vollständig auf die Zellschicht erstrecken.
- Den Stecker in ein 1,5 ml-Rohr mit 0,5 ml DMEM-Unvollständigem Medium austreiben und die Probe für 30 s wirbeln lassen. Verstärken Sie das plaqueisolierte Virus, das durch Vermehrung auf MA104-Monolayern in 6-Well-Platten oder T25-Kolben mit DMEM-Unvollständigem Medium und 0,5 g/mL Trypsin in das Medium eluiert wird.
HINWEIS: Weitere Informationen zur Isolierung und Titering von Rotavirus durch Plaque-Assay sind in Arnold et al.31verfügbar.
5. Gelelektrophorese der viralen dsRNA
- Legen Sie 600 l geklärte infizierte Zelllysate und 400 l Guanidiniumthiocyanat in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren, Wirbel für 30 s und inkubieren Bei Raumtemperatur für 5 min. Fügen Sie 200 l Chloroform, Wirbel für 30 s und inkubieren für 3 min. Nach zentrifugieren für 5 min bei 13.000 x g (4 °C), übertragen Sie die obere wässrige Phase in frische Schläuche.
- Recyre virale dsRNA aus der wässrigen Phase, indem du 2 Volumina (ca. 900'L) kalten Isopropylalkohol und invertierende Röhren 4x 6x hinzufügen. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min Zentrifugenrohre für 10 min bei 13.000 x g (4 °C). Überstand entsorgen und die RNA-Pellets behalten.
- Waschen Sie die Pellets, indem Sie 1 ml 75% Ethanol in das Rohr geben, einmal invertieren und 5 min bei 7.500 x g (4 °C) zentrifugieren. Nach sorgfältigem Entfernen des Ethanolwaschens mit einem Pipetten lassen Sie RNA-Pellets auf der Laborbank für 5 bis 10 min lufttrocknen. Lösen Sie RNA-Pellets in 15 l nukleasefreiem molekularbiologischem Wasser und lagern Sie sie bei -20 °C.
- Kombinieren Sie 10 l gelöste RNA-Proben mit 2 l 6x DNA-Ladepuffer, Last auf vorgegossene 10% Polyacrylamid-Minigele (oder Handguss-Äquivalente) und lösen Sie RNAs durch Elektrophorese im Tris-Glycin-Laufpuffer für 2 h unter einem konstanten Strom (16 mA). Einweichen Sie Gele für 5 x 10 min in Wasser, das Ethidiumbromid mit einem Wert von 1 g/ml enthält, und detektieren Sie Rotavirus-Genomsegmente mit einem UV-Transilluminator.
6. Rückgewinnung und Sequenzierung viraler dsRNA
- Suchen Sie virale dsRNA-Bänder auf Polyacrylamid-Gelen vorzugsweise mit schwacher Intensität langwelligem UV-Licht, um die Erzeugung von Nukleinsäure-Kreuzverbindungen zu vermeiden. Mit einer frischen Rasierklinge Gelfragmente mit dsRNA-Bändern ausschneiden und in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren übertragen.
- Nach Zugabe von 10 x 20 l RNase-freiem Wasser zerkleinern Sie jedes Fragment mit einem RNase-freien Einweg-Pellet-Pestle, das für ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr ausgelegt ist, oder indem Sie durch eine 18 G-Nadel auf und ab ziehen. Zerkleinerte Fragmente über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Lassen Sie 3 l Flüssigkeit aus Rohren mit zerkleinerten Gelfragmenten zurück. Generieren Sie cDNAs der viralen dsRNAs mit einem einstufigen Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktions-Kit (RT-PCR)(Tabelle der Materialien) und geeigneten Oligonukleotid-Primern.
HINWEIS: PCR-Produkte werden mit einem PCR-Reinigungskit(Tabelle der Materialien) gelgereinigt und zusammen mit Primern von kommerziellen DNA-Sequenzdiensten zur Nächtlichen Sequenzierung zusammen mit Primern versandt.
7. Immunoblot-Analyse viraler Proteine
- Säen Sie 6-Well-Platten mit 3 x 105 MA104 Zellen pro Brunnen in einem Gesamtvolumen von 2 ml DMEM-Gesamtmedium. Platten in einen 37 °C,2 5% CO2-Inkubator legen und lassen, bis die Zellen die Konfluenz erreichen (3 bis 5 Tage).
HINWEIS: Brunnen mit konfluenten Monolayern enthalten 1,2 x 106 Zellen. - Behandeln Sie geklärte Überräube, indem Sie mit 10 g/ml Trypsin bei 37 °C für 1 h die darin enthaltenen rekombinanten Rotaviruspartikel inkubieren.
- MA104 Monolayer in 6-Well-Platten 2x mit 2 ml PBS spülen. Infizieren Sie Zellen, indem Sie jedem Brunnen 200 L Inokulum mit 3-5 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Zelle des Trypsin-aktivierten Rotavirus in DMEM-unvollständigem Medium hinzufügen. Platten zum Inkubator zurückgeben.
- Entfernen Sie alle 10 min Platten und schaukeln Sie sanft, um Inokulum über die Zellmonoschicht umzuverteilen. Nach 1 h inokulum durch 2 ml DMEM unvollständiges Medium ersetzen.
- Bei 8 h nach der Infektion, spülen Zellen in 6-Well-Platten 2x mit PBS. Schrottzellen in 750 l PBS und übertragen Volumen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Spülen Sie die Platte mit weiteren 750 L PBS und kombinieren Sie mit der vorherigen gesammelten 750-L-Probe.
- Pelletzellen in der Probe durch Zentrifugieren bei 5.000 x g für 10 min bei 4 °C. Nach dem Wegwerfen von Überstand Zellpellets bei -80 °C lagern, bis sie weiterverarbeitet werden.
- Bereiten Sie einen Zelllysepuffer mit 300 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2% Triton X-100 und 1x EDTA-freiem Vollständigen Proteaseinhibitor vor. Nach Zugabe von 300 l Lysepuffer zu gefrorenen Zellpellets kurz Wirbelproben und 10 min auf Eis inkubieren.
- Wiederholen Sie den Prozess der Wirbel- und Inkubationsproben auf Eis 3x. Anschließend Zentrifugenproben bei 15.000 x g für 10 min bei 4 °C, dann Überstand sammeln und bei -80 °C lagern.
- Lösen Sie Proteine, die in 20 L Volumen von überstäudigen Proben enthalten sind, durch Elektrophorese auf vorgefertigten linearen 8-16% Polyacrylamid-Minigelen und Übertragung auf Nitrozellulosemembranen auf. Blockmembranen durch Inkubation mit PBS-Tween 20 (0,02%) 5% fettfreie Trockenmilch.
- Sondenmembranen durch Inkubation mit einem oder mehreren primären Antikörpern (z. B. Meerschweinchen-Anti-NSP3- oder Anti-VP6-Antisera, Maus monoklonaler Anti-Flag-M2-Antikörper oder monoklonaler Anti-PCNA-Antikörper von Kaninchen). Entdecken Sie primäre Antikörper durch Inkubation von Membranen mit Pferd Anti-Maus-IgG, Anti-Meerschweinchen-Schwein IgG, oder Ziege Anti-Kaninchen IgG Meerrettich peroxidase-konjugierte sekundäre Antikörper, gefolgt von der verbesserten Chemilumineszenz (ECL) Meerrettich Chemilumineszenz Substrat. Visualisieren Sie Lumineszenzsignale mit einem Gel-Bildgebungssystem (Tabelle der Materialien) oder Röntgenfilm.
8. Live-Zell-Bildgebung von Zellen, die mit FP-exezierenden Viren infiziert sind
- Säen Sie 6-Well-Platten mit 3 x 105 MA104 Zellen pro Brunnen in insgesamt 2 ml DMEM-Gesamtmedium. Platten in einen 37 °C,2 5% CO2-Inkubator legen und lassen, bis die Zellen die Konfluenz erreichen (3 bis 5 Tage).
HINWEIS: Brunnen mit konfluenten Monolayern enthalten 1,2 x 106 Zellen. - Aktivieren Sie Rotavirus-Proben von bekannten Titern durch Inkubation mit 10 g/ml Trypsin bei 37 °C für 1 h.
- 6-Well-Platten mit MA104 Monolayern 2x mit 2 ml PBS spülen. Infizieren Sie Zellen, indem Sie jedem Brunnen 200 L Inokulum hinzufügen, das 3,5 PFU pro Zelle des Trypsin-aktivierten Rotavirus in DMEM-unvollständigem Medium enthält. Geben Sie Platten zum Inkubator zurück und schaukeln Sie die Platten sanft, um Inokulum alle 10 min über die Zellmonoschicht umzuverteilen.
HINWEIS: Brunnen, die mit virenfreiem DMEM-Inoculum infiziert sind, sollten als Kontrollen einbezogen werden. - Nach 1 h Virusadsorption Monolayer 2x mit PBS ausspülen und Medium mit 0,5 ml pro Bohrung des DMEM unvollständigen Mediums ersetzen. Bei 7,5 h nach der Infektion, ersetzen Kulturmedium mit DMEM mit niedrigem Hintergrund Fluoreszenz (Tabelle der Materialien). Verwenden Sie bei 8 h nach der Infektion einen Live-Zell-Imager, um Zellen bei 20-facher Vergrößerung auf grünes, rotes oder blaues Fluoreszenzsignal zu untersuchen.
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Representative Results
Das in diesem Artikel beschriebene Reverse-Genetik-Protokoll führt mehrere verschiedene Schritte durch: (1) Ko-Transfektion von BHK-T7-Zellen mit Rotavirus pT7-Transkriptionsvektoren und einem pCMV/NP868R-Expressionsplasmid, (2) Übersaat von transfizierten BHK-T7-Zellen mit MA104-Zellen, (3) Amplifikation rekombinanter Viren in BHK-T7/MA104-Zellen lysiert mit MA104-Zellen und (4) Plaque-Isolierung des rekombinanten Virus mit MA104-Zellen (Abbildung 2). In unseren Händen ist das Protokoll effizient und liefert Titter des rekombinanten Wildtyps SA11 Virus (rSA11/wt) in BHK-T7/MA104 Zelllysaten von 104 PFU/ml und in verstärkten MA104-Zelllysaten von >1 x 107 PFU/ml. SA11 rekombinante Viren, die durch Reverse Genetik erzeugt werden, indem modifizierte pT7/NSP3SA11-Plasmide verwendet werden, die FPs exzessizieren (z. B. rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG), wachsen zu Tittern, die 4-fach weniger als rSA11/wt sind.
Nach dem Reverse-Genetik-Protokoll erzeugten wir rekombinante SA11-Viren, die durch Plaque-Assay an MA104-Zellen leicht identifiziert wurden, wodurch eine Plaque-Isolierung möglich wurde (Abbildung 3D). Viren in Plaques wurden mit einer Langspitzen-Einweg-Transferpipette gepflückt und auf MA104-Zellen verstärkt. Die dsRNA-Genome von plaquegereinigten rSA11/wt- und rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG-Viren wurden mit Guanidiniumthiocyanat extrahiert, durch Elektrophorese auf einem 10% Polyacrylamidgel aufgelöst und durch Färbung mit Ethidiumbromid nachgewiesen (Abbildung 3A). Wie erwartet, migrierte das Segment 7 (NSP3) dsRNA von rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG aufgrund von 2A-3xFL-UnaG-Sequenzen viel langsamer als das von rSA11/wt (Abbildung 3A). Das Segment 7 (NSP3) dsRNA von rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG wurde gelgereinigt, per RT-PCR in cDNA-Form umgewandelt und sequenziert, um die Genauigkeit zu bestätigen.
Um die Expression des UnaG-Fluoreszenzproteins zu überprüfen, wurden MA104-Zellen in 6-Well-Platten mit 3 PFU pro Zelle rSA11/wt und rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG infiziert. Bei 8 h nach der Infektion wurde das Kulturmedium in Platten durch 0,5 ml DMEM mit geringer Hintergrundfluoreszenz pro Brunnen ersetzt und2 die Platten zusätzlich 30 min bei 37 °C in einem CO2-Inkubator inkubiert. Anschließend wurden Platten mit einem Live-Zell-Imager auf UnaG-Expression untersucht. Die Analyse zeigte, dass rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG grüne Fluoreszenz erzeugte und die Funktionalität des UnaG-Gens im rekombinanten Virus überprüfte (Abbildung 3B). Im Gegensatz dazu wurde grüne Fluoreszenz in Zellen, die mit rSA11/wt infiziert waren, nicht nachgewiesen. Um zu untersuchen, ob das 2A-Element im modifizierten Segment 7 von rSA11/NSP3-2AxFL-UnaG die Expression von zwei separaten Proteinen (NSP3-2A und 3xFL-UnaG) förderte, wurden MA104-Zellen mit rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG und rSA11/wt infiziert. Zelllysate wurden aus Zellen hergestellt, die nach einer 8 h nach der Infektion geerntet, durch Gelelektrophorese gelöst und auf Nitrozellulosefilter gefleckt wurden. Die Flecken wurden mit Antikörpern speziell für Rotavirus VP6 und NSP3 und FLAG-Tag untersucht. Die Analyse zeigte, dass NSP3-2A und 3xFL-UnaG als separate Proteine in Zellen exprimiert wurden, die mit rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG infiziert waren, was darauf hindeutet, dass das 2A-Element funktionsfähig war (Abbildung 3C). Zellen, die mit rSA11/wt infiziert sind, drückten kein Protein aus, das von Anti-FLAG-Antikörpern erkannt wurde. Das NSP3-Protein, das in rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG-infizierten Zellen durch Anti-NSP3-Antikörper enthalten ist, wanderte etwas langsamer als NSP3 in rSA11/wt-infizierten Zellen aufgrund des Vorhandenseins von Restrückständen 2A am C-Terminus von NSP3.
Abbildung 1: Rotavirus-Reverse-Genetik-Plasmide. (A) CDNAs in voller Länge der 11 SA11-Rotavirus-Genomsegmente sind in pT7-Plasmiden positioniert, vorgelagert mit einem Promotor für T7-RNA-Polymerase und nachgeschaltet mit einem HDV-Ribozym. In Gegenwart von T7-RNA-Polymerase produzieren die Rotavirus-pT7-Plasmide sA11 (+)RNAs mit authentischen 5' und 3' Termini. (B) Schemata der (+)RNA- und Proteinprodukte des pT7/NSP3-2A-3xFL-UnaG-Plasmids. Das Schaltplan enthält die NSP3-cDNA-Sequenz und Sequenzen für das Schweineteschovirus 2A-ähnliches (2A)-Element, das 3x FLAG (FL)-Tag und das grüne fluoreszierende Protein UnaG. Die Position der 2A-Übersetzungs-Stop-Restart-Site wird mit einem roten Pfeil angezeigt. Durch die Aktivität des 2A-Elements erzeugt die Translation der RNA zwei Proteine. Der NSP3-Teil enthält Reste des 2A-Elements, und der UnaG-Teil wird mit einem 3x FLAG-Tag verschmolzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Rotavirus-Reverse-Genetik-System. BHK-T7-Monolayer werden mit 11 pT7-Plasmiden transfiziert, die jeweils eine andere SA11 (+)RNA exdrücken, und einem pCMV-Vektor, der das NP868R-Verschlussenzym (pCMV/NP868R) exemittiert. Nach 3 Tagen nach der Infektion (d.p.i.) werden die BHK-T7-Zellen mit MA104-Zellen übersät. Nach 7 Tagen nach der Infektion werden rekombinante Rotaviren in BHK-T7/MA104-Zelllysaten durch Passage auf MA104-Zellen verstärkt und dann durch Plaquereinigung isoliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Eigenschaften der rekombinanten Stämme rSA11/wt und rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. (A) Elektrophoretische Profile der dsRNA-Genomsegmente plaqueisolierter rSA11-Stämme. Die 11 Genomsegmente sind nummeriert und die Verschiebung der Position von Segment 7 (NSP3) wird mit einer roten Linie angezeigt. (B) Fluoreszenz, die in rSA11-infizierten MA104-Zellen bei 8 h nach der Infektion mit einem Live-Zell-Imager (20-fache Vergrößerung) auf dem grünen Detektionskanal nachgewiesen wurde. Skala bar = 100 m. (C) Immunoblot-Analyse von Proteinen bei 8 h nach der Infektion in MA104-Zellen mit rSA11-Stämmen mit Meerschweinchen Anti-VP6 und Anti-NSP3 Antisera und Maus Anti-FLAG monoklonalen Antikörper infiziert. (D) Plaques, die von rSA11/wt auf MA104-Zellen nach einer 3-tägigen Infektion hergestellt und durch neutrale rote Färbung nachgewiesen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In unserem Labor verlassen wir uns routinemäßig auf das hier beschriebene Reverse-Genetik-Protokoll, um rekombinante SA11-Rotaviren zu produzieren. Mit diesem Ansatz erholen sich Personen mit wenig Erfahrung in molekularbiologischen Techniken oder der Arbeit mit Rotaviren rekombinante Viren auch beim ersten Versuch. Wir haben nach diesem Protokoll fast 100 rekombinante Viren erzeugt, einschließlich derer mit Genomen, die überarbeitet wurden, um fremde Proteine (z. B. FPs) auszudrücken, die Sequenzadditionen, Löschungen und Punktmutationen enthalten.
Die in diesem Protokoll angegebenen Bedingungen und Inkubationszeiten gelten für die Wiederherstellung gut wachsender Stämme rekombinanter Viren. Anpassungen sollten in Betracht gezogen werden, wenn man versucht, SA11-Viren wiederherzustellen, von denen aufgrund genetischer Veränderungen ein schlechtes Wachstum zu erwarten ist. Insbesondere, weil der Titer solcher Viren in transfizierten BHK-T7/MA014-Zelllysaten gering sein kann, verdoppeln wir in der Regel die Menge an Lysat, die als Inokulum in nachfolgenden Amplifikationsschritten verwendet wird. Darüber hinaus können bei der Amplifikation schlecht wachsende Viren längere Inkubationszeiten erfordern, bevor sie ein CPE-Niveau erreichen, das für die Zellernte ausreicht. Tatsächlich können wir bei solchen Viren zulassen, dass Infektionen 10 bis 14 Tage oder sogar länger vor der Ernte von Zellen fortlaufen. Schließlich werden schlecht wachsende Viren wahrscheinlich kleine, langsam wachsende Plaques an MA104-Zellen erzeugen. So, Plaque isolieren diese Viren, kann es notwendig sein, Plaques zu ermöglichen, bis 6-10 Tage nach der Infektion zu entwickeln, bevor Zellen mit neutralen roten und Pflücken Plaques färben.
Unserer Erfahrung nach ist der wichtigste Faktor bei der zuverlässigen Wiederherstellung des rekombinanten Rotavirus die Verwendung gesunder, gut gepflegter BHK-T7-Zellen. In unserem Labor durchgehen wir routinemäßig BHK-T7-Zellen 2x pro Woche bei der gleichen Verdünnung mit Medium, das nicht nur mit 10% FBS, sondern auch mit NEAA, TPB und hohem Glukosespiegel (GMEM Complete Medium) ergänzt wird. Die zusätzlichen Ergänzungen helfen BHK-T7-Zellen, die erweiterte Lebensfähigkeit nach der Plasmidtransfektion zu behalten, ein Faktor, der wahrscheinlich entscheidend für die Wiederherstellung schlecht wachsender mutierter rekombinanter Viren ist. Wir ergänzen das Medium jede andere Passage mit G418, einem Antibiotikum, das zur Aufrechterhaltung des T7-Polymerase-Expressionsplasmids ausgewählt wird. Durchgangsbedingungen sollten so sein, dass BHK-T7-Zellen niemals über die Konfluenz hinaus wachsen dürfen, Bedingungen, die schnell zu einer verminderten Zelllebensfähigkeit führen. Für uns schneiden BHK-T7-Zellen, die überwuchern durften, im Reverse-Genetik-Protokoll schlecht ab, auch wenn die Zellen anschließend mehrmals entsprechend durchzogen werden. Anstatt zu versuchen, überwucherte BHK-T7-Zellen zu rehabilitieren, starten wir die Linie mit Zellen neu, die zuvor in flüssigem Stickstoff gelagert wurden.
Die Mykoplasmenkontamination von BHK-T7- und MA104-Zellen kann ein wichtiger Faktor für das Versagen des Rotavirus-Reverse-Genetik-Systems sein, rekombinantes Virus zu erzeugen. In unserem Labor verwenden wir ein PCR-basiertes Mykoplasmen-Detektionskit(Tabelle der Materialien), um die Kontamination von Zelllinien zu überprüfen, und wenn es erkannt wird, wird es am häufigsten mit unseren BHK-T7-Zellen in Verbindung gebracht. Wir haben nicht versucht, Zelllinien von kontaminierenden Mykoplasmen zu heilen, sondern die Linien mit früheren mykoplasmafreien Passagen, die in flüssigem Stickstoff gespeichert sind, wiederherzustellen. Bevor wir mit neuen Zelllinien beginnen, entsorgen wir alle bisher verwendeten Mittel- und Mittelzusätze und dekontaminieren Inkubatoren, biologische Sicherheitsschränke, Wasserbäder, Laborbänke und Pipetten. Wir verwenden auch Mycoplasma-Detektionskits, um Bestände an rekombinanten Viren auf Kontamination zu überprüfen. Aufgrund der Resistenz der Rotaviruspartikel gegen die Denaturierung durch organische Lösungsmittel wie Vertrel VF32ist es möglich, Virusbestände von der Kontamination von Mykoplasmen zu befreien, wodurch die Notwendigkeit, rekombinante Viren durch umgekehrte Genetik zu regenerieren, negiert wird. Es ist wichtig zu betonen, dass Zelllinien und Viruspräparate, die in das Labor aufgenommen werden, vor der Routineanwendung auf Mykoplasmenkontamination überprüft werden sollten.
Obwohl wir Tag für Tag und Tag verwenden, verwenden wir dasselbe Protokoll, um rekombinante Viren zu erzeugen, wir wissen, dass bestimmte Änderungen vorgenommen werden können, die eine Viruswiederherstellung nicht ausschließen. Beispielsweise ist (i) die Kotransfektion des pCMV/NSP868R-Verschlussenzymplasmids mit SA11 pT7-Vektoren für die Wiederherstellung rekombinanter Viren nicht erforderlich. Während die Zugabe des Verschlussplasmids höhere Virustitter in transfizierten BHK-T7/MA104-Zelllysaten liefert, konnten wir zahlreiche Viren, einschließlich derer, die FPs exezieren, ohne sie wiederherstellen. Wir sind jedoch zu dem Schluss gekommen, dass die Expression des Verschlussenzyms durch pCMV/NP868R erheblich zur Wiederherstellung von weniger fitten Viren beitragen kann. ii) Wir haben festgestellt, dass rekombinante Viren auch dann erzeugt werden können, wenn die Menge des im Reverse-Genetik-Protokoll verwendeten Transfektionsreagenzes (Materialtabelle) um die Hälfte reduziert wird, eine Änderung, die die Kosten erheblich senken kann. iii) Ebenso haben wir festgestellt, dass M199 komplettes Medium anstelle des DMEM-Gesamtmediums verwendet werden kann. iv) Schließlich gibt es keine festgelegte Anforderung hinsichtlich der Art des Vektor-Backbones, die bei der Herstellung von SA11 T7-Transkriptionsvektoren verwendet werden muss. Solange die virale cDNA im Plasmid von einem vorgelagerten T7-Promotor und einem nachgeschalteten HDV-Ribozym und T7-Terminator umgeben ist, kann erwartet werden, dass das Plasmid die Wiederherstellung des rekombinanten Virus unterstützt. Insbesondere wurden pGEM-, pBluescript und pUC-basierte Vektoren erfolgreich im Reverse-Genetik-System eingesetzt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien R03 AI131072 und R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding und das Lawrence M. Blatt Endowment unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des Labors der IU Rotahoosier, Ulrich Desselberger, und Guido Papa für ihre vielen Beiträge und Anregungen bei der Entwicklung des Reverse Genetics Protokolls.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
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