Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Forenklet Reverse Genetics metode til at inddrive rekombinant rotavira udtrykke Reporter Proteiner

Published: April 17, 2020 doi: 10.3791/61039
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Indiana University

Summary

Generation af rekombinant rotavira fra plasmid DNA er et vigtigt redskab til undersøgelse af rotavirus replikation og patogenese, og udviklingen af rotavirus udtryk vektorer og vacciner. Heri beskriver vi en forenklet omvendt genetik tilgang til at generere rekombinant rotavira, herunder stammer, der udtrykker fluorescerende reporter proteiner.

Abstract

Rotavira er en stor og udviklende population af segmenterede dobbeltstrengede RNA-vira, der forårsager alvorlig gastroenteritis hos unge af mange pattedyr s- og fugleværtsarter, herunder mennesker. Med den nylige fremkomsten af rotavirus reverse genetik systemer, er det blevet muligt at bruge rettet mutagenese til at udforske rotavirus biologi, ændre og optimere eksisterende rotavirus vacciner, og udvikle rotavirus multitarget vaccine vektorer. I denne rapport beskriver vi et forenklet omvendt genetiksystem, der muliggør effektiv og pålidelig genopretning af rekombinant rotavira. Systemet er baseret på co-transfection af T7 transskription vektorer udtrykker fuld længde rotavirus (+) RNAs og en CMV vektor kodning en RNA capping enzym i BHK celler konstituerende producerer T7 RNA polymerase (BHK-T7). Rekombinant rotavira forstærkes ved at overså de transficerede BHK-T7-celler med MA104-celler, en abecellecellelinje, der er meget eftergivende for virusvækst. I denne rapport beskriver vi også en tilgang til generering af rekombinant rotavira, der udtrykker et separat fluorescerende reporterprotein gennem indførelsen af et 2A translationelt stop-restart element i genomsegment et (NSP3). Denne fremgangsmåde undgår at slette eller ændre nogen af de virale åbne læserammer, hvilket gør det muligt at producere rekombinant rotavira, der bevarer fuldt funktionelle virale proteiner, samtidig med at de udtrykker et fluorescerende protein.

Introduction

Rotavira er hovedårsagerne til svær gastroenteritis hos spædbørn og småbørn samt unge af mange andre pattedyrs- og fuglearter1. Som medlemmer af Reoviridae-familien har rotavira et segmenteret dobbeltstrenget RNA-genom (dsRNA). Genomsegmenterne er indeholdt i en ikke-tiltrukket icosahedral virion dannet af tre koncentriske lag protein2. Baseret på sekventering og fylogenetisk analyse af genomsegmenterne er ni arter af rotavirus (A-D, F−J) blevet defineret3. De stammer, der omfatter rotavirusarter A, er ansvarlige for langt størstedelen af sygdommen hos mennesker4. Indførelsen af rotavirus vacciner i barndommen immunisering programmer begynder i det sidste årti er korreleret med betydelige reduktioner i rotavirus dødelighed og sygelighed. Mest bemærkelsesværdigt er antallet af rotavirusrelaterede dødsfald blandt børn faldet fra ca. 528 000 i 2000 til 128.500 i 20164,5. Rotavirusvacciner er formuleret fra levende svækket virusstammer, idet 2 til 3 doser gives til børn i 6 måneders alderen. Det store antal genetisk forskelligartede rotavirusstammer, der cirkulerer hos mennesker og andre pattedyrarter, kombineret med deres evne til hurtigt at udvikle sig gennem mutagenese og reassortment, kan føre til antigene ændringer i de typer rotavira, der inficerer børn6,7,8. Sådanne ændringer kan underminere effekten af eksisterende vacciner, der kræver, at de udskiftes eller ændres.

Udviklingen af fuldt plasmidbaserede reverse genetics systemer, der muliggør manipulation af nogen af de 11 rotavirus genom segmenter blev først for nylig opnået9. Med tilgængeligheden af disse systemer, er det blevet muligt at optrævle molekylære detaljer af rotavirus replikation og patogenese, at udvikle forbedrede high-throughput screening metoder til anti-rotavirus forbindelser, og at skabe nye potentielt mere effektive klasser af rotavirus vacciner. Under rotavirus replikation, udjævnet viral (+)RNAs ikke kun guide syntesen af virale proteiner, men også tjene som skabeloner til syntese af afkom dsRNA genom segmenter10,11. Alle rotavirus reverse genetics systemer beskrevet til dato er afhængige af transfection af T7 transskription vektorer i pattedyr cellelinjer som en kilde til cDNA-afledte (+)RNAs anvendes til at inddrive rekombinant virus9,12,13. Inden for transskriptionsvektorerne er virale cDA'er i fuld længde placeret mellem en opstrøms T7-promotor og nedstrøms hepatitis deltavirus (HDV), således at virale (+)RNA'er syntetiseres af T7 RNA-polymerase, der indeholder autentiske 5' og 3'-termini (Figur 1A). I den første generation af omvendt genetik system, rekombinant virus blev foretaget ved at transfecting baby hamster nyreceller udtrykke T7 RNA polymerase (BHK-T7) med 11 T7 (pT7) transskription vektorer, hver lede syntese af en unik (+) RNA af simian SA11 virus stamme, og tre CMV promotor-drev udtryk plasmider, en kodning af aviær reovirus p10FAST fusion protein og to kodning underenheder af vaccinia virus D1R-D12L capping enzym kompleks9. Rekombinant SA11 virus genereret i transfected BHK-T7 celler blev forstærket ved overseeding med MA104 celler, en cellelinje eftergivende for rotavirus vækst. En modificeret version af den første generation omvendt genetik system er blevet beskrevet, at ikke længere bruger støtte plasmider12. I stedet, det ændrede system med succes genererer rekombinant rotavira blot ved at transfecting BHK-T7 celler med 11 SA11 T7 transskription vektorer, med det forbehold, at vektorer for den virale fabrik (viroplasm) byggesten (ikke-strukturelle proteiner NSP2 og NSP5) er tilføjet på niveauer 3-fold højere end de andre vektorer14,15. Der er også udviklet modificerede versioner af det omvendte genetiksystem , som understøtter genvindingen af de menneskelige KU- og Odelia-stammer af rotavirus16,17. Rotavirusgenomet er bemærkelsesværdigt modtageligt for manipulation ved omvendt genetik, med rekombinant virus genereret til dato med mutationer indført i VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, og NSP522,23. Blandt de mest nyttige vira , der er genereret indtil videre , er dem , der er udviklet til at udtrykke fluorescerende reporterproteiner9,12,21,24,25.

I denne publikation, vi giver protokollen for den omvendte genetik system, som vi bruger i vores laboratorium til at generere rekombinant stammer af SA11 rotavirus. Det vigtigste element i vores protokol er co-transfection af BHK-T7 celler med 11 pT7 transskription vektorer (modificeret til at omfatte 3x niveauer af pT7/NSP2SA11 og pT7/NSP5SA11 vektorer) og en CMV udtryk vektor kodning af afrikansk svinepest virus (ASFV) NP868R capping enzym21 (Figur 2). I vores hænder fører tilstedeværelsen af NP868R plasmid til produktion af højere titers af rekombinant virus ved transfected BHK-T7 celler. I denne publikation, vi også give en protokol til ændring af pT7/NSP3SA11 plasmid sådan, at rekombinant virus kan genereres, der udtrykker ikke kun segmentet 7 protein produkt NSP3, men også en separat FP. Dette opnås ved at reengineeringn eNSP3 open reading frame (ORF) i pT7/NSP3SA11 plasmid for at indeholde et downstream 2A translationelt stop-restart element efterfulgt af et FP ORF (Figur 1B)24,26. Gennem denne tilgang, har vi genereret rekombinant rotavira udtrykke forskellige FPs: UnaG (grøn), mKate (langt-rød), mRuby (rød), TagBFP (blå), CFP (cyan), og YFP (gul)24,27,28. Disse FP-ekspreserende rotavira fremstilles uden at slette NSP3 ORF, hvilket giver virus, der forventes at kode et komplet supplement af fungerende virale proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vedligeholdelse af medieforberedelse og cellekultur

  1. Få baby hamster nyreceller konstituerende udtrykker T7 RNA polymerase (BHK-T7) og afrikanske grønne abe nyre MA104 celler.
    BEMÆRK: BHK-T7 (eller BSR-T7) celler er ikke kommercielt tilgængelige, men er en fælles celle linje af laboratorier ved hjælp af omvendt genetik til at studere RNA virus biologi. Bhk-T7 cellelinje, der anvendes i denne protokol blev opnået fra Dr. Ursula J. Buchholz (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), en co-udvikler af den oprindelige BHK celle linje udtrykker T7 RNA polymerase29. MA104 celler er tilgængelige fra European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) og fra American Type Culture Collection (ATCC).
  2. Forbered følgende kulturmedier i et sterilt miljø, helst et biologisk sikkerhedsskab i klasse II. Mediet opbevares i mørke ved 4 °C, og varm til 37 °C umiddelbart før brug.
    BEMÆRK: Kilder til mediekomponenter findes i Materialetabel.
    1. For at forberede DMEM ufuldstændigt medium, kombinere 500 ml dulbecco's modificerede Eagle's minimum essential medium (MEM) indeholder 4,5 g / L glukose og 1% glutamin med 5 ml 100x pen-strep.
    2. Til fremstilling af DMEM komplet medium, kombinere 500 ml DMEM ufuldstændigmedium med 25 ml føtal kvæg serum (FBS).
    3. For at forberede GMEM ufuldstændigmedium kombineres 500 ml Glasgows mindste essentielle medium, 5 ml 100x glutamin, 50 ml tryptose-fosfat bouillon (TPB), 5 ml 100x ikke-essentielle aminosyrer (NEAA) og 5 ml 100x pen-strep.
    4. For at forberede GMEM komplet medium, kombinere 500 ml GMEM ufuldstændigmedium med 25 ml varme-inaktiveret FBS.
    5. For at forberede GMEM+G komplet medium, tilsættes 10 ml 50 mg/ml genetik (G418) til 500 ml GMEM komplet medium.
    6. For at forberede Smvm ufuldstændigmedium, kombinere 500 ml af Joklik's modificerede Eagle's MEM, 5 ml 100x glutamin, 50 ml TPB, 5 ml 100x NEAA, og 5 ml 100x pen-strep.
  3. Dyrkning MA104 celler i T75 eller T175 kolber indeholdende 12 eller 25 ml DMEM komplet medium, henholdsvis. Til passage MA104 celler, der har nået 100% sammenløb, skyl cellemonolayer 2x med fosfat-buffered saltvand (PBS), dissociere med trypsin (0,05%)-EDTA (0,1%) opløsning og suspenderes i 5 (T75 kolbe) eller 10 ml (T175 kolbe) af DMEM ufuldstændigt medium.
    1. 0,5−1,0 ml resuspenderede celler anbringes i friske kolber, og det endelige volumen bringes til det relevante endelige volumen ved tilsætning af DMEM komplet medium. Kolber anbringes i en 372 °C, 5% CO 2-inkubator.
  4. Forplanter BHK-T7-celler i T75-kolber, skiftevis mellem brugen af gmem og gmem+G-komplet medium med hver passagerunde. Til subkultur BHK-T7 celler, der har nået 100% sammenløb, skyl cellen monolayer 2x med PBS, dissociate med trypsin-EDTA opløsning, og resuspenderi i 5 ml medium.
    1. Efter at have angivet 15 ml GEM eller GMEM+G komplet medium i en frisk T75 kolbe, tilsættes fire dråber resuspenderet BHK-T7 celler. Kolben anbringes i en 372 °C, 5% CO 2-inkubator.

2. Plasmid forberedelse

  1. Anskaf følgende plasmider, der udtrykker rotavirus SA11 (+)RNA'er fra Addgene: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11 og pT7/NSP5SA11. Få plasmid udtrykke ASFV capping enzym (pCMV/NP868R) fra forfatterne21.
    BEMÆRK: Modificerede pT7/NSP3SA11 plasmider, der er udviklet til at udtrykke et FP gennem aktiviteten af et 2A translationelt element (pT7/NSP3-2A-3xFL-FP), kan også fås hos forfatterne24,26. pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plasmider, der udtrykker følgende fps er tilgængelige: UnaG (grøn), mKate (langt rød), mRuby (rød), TagBFP (blå), CFP (cyan), og YFP (gul)24.
  2. Omdan plasmider til kompetent E. coli DH5α og sprede bakterier på Luria bouillon agar plader, der indeholder den relevante antibiotika. Vokse bakteriekulturer plukket fra de enkelte kolonier og forberede mindre mængder af plasmid (20 μg) ved hjælp af en spin miniprep rensning kit (Tabel af materialer), i henhold til producentens anvisninger. Forbered større mængder plasmid fra bakteriekulturer ved hjælp af midi og maxi rensning kits (Tabel af materialer).
    BEMÆRK: Plasmider, der er egnede til brug i det omvendte genetiksystem, er også fremstillet sammen med andre plasmidrensesæt. Det er ikke nødvendigt at forberede plasmider ved hjælp af kits specielt designet til at generere endotoxin-frit materiale.
  3. Koncentrationer af rensede plasmider til 1 mg/ml i nukleasfrit molekylærbiologisk kvalitetsvand justeres. Kontroller plasmid renhed ved at bekræfte en 260/280 absorbans forhold på ~ 1,8 ved hjælp af et spektrofotometer. Brug også elektroforese på 0,8% agarose geler for at kontrollere, at plasmider overvejende er supercoiled.
  4. Aliquot rensede plasmider i 0,5 ml sterile mikrocentrifugerør, der hver indeholder 10 μL. Opbevar plasmider ved -80 °C.

3. Generation af rekombinant virus

BEMÆRK: Forskning i humane og animalske rotavirus, herunder generering og karakterisering af rekombinant rotavirusstammer, skal håndteres under betingelser på biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) og skal godkendes på forhånd af Udvalget for Institutionel Biosikkerhed (IBC). Passende BSL-2 laboratorieforhold er beskrevet i Biosafety i mikrobiologiske og biomedicinske laboratorier (BMBL) produceret af Centers for Disease Control and Prevention (CDC)30.

  1. Dag 1: såning af BHK-T7 celler i 12-brøndplader
    1. Et friskflydende monolag af BHK-T7-celler skylles i en T75-kolbe 2x med PBS. Cellemonolaget forstyrres med trypsin-EDTA-opløsning, og cellerne suspenderes igen i 5 ml GMEM-komplet medium.
    2. Brug en automatiseret celletæller og trypanblå opløsning til at bestemme koncentrationen af levedygtige BHK-T7-celler i mediet. Frøceller i 12-brøndcellekulturplader, hvor hver brønd indeholder 2 x 105 celler i et samlet volumen på 1 ml GMEM (G418-frit) komplet medium. Inkuber i en 37 °C, 5% CO2 inkubator. Cellerne skal nå op på 80−90% sammenløb på dag 2.
  2. Dag 2: transfection af BHK-T7 celler med plasmid blandinger
    1. For at forberede plasmidblandingen kombineres følgende i et 0,5 ml mikrocentrifugerør med plasmidlagre justeret til 1 mg/ml: 0,8 μL hver af SA11 pT7 plasmider VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 og NSP4, 2,4 μL hver af SA11 pT7 plasmider NSP2 og NSP5, og 0,8 μL pCMV/NP868R. Bland forsigtigt plasmider ved at banke på røret og indsamle indhold ved pulscentrifugering. For at forberede rekombinant virus, der udtrykker fps, skal pT7/NSP3SA11 erstattes med den relevante pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plasmid.
      BEMÆRK: Plasmid-blandinger skal opbevares på is, indtil de anvendes. Der skal fremstilles et separat rør for hver transfektion.
    2. Til fremstilling af plasmid/reduceret serummedium/transfektionsreagensblanding: Der tilsættes 110 μL fordannet (37 °C) reduceret serummedium (Materialetabel)til hver plasmidblanding og blandes ved forsigtigt at pipettere op og ned. Derefter tilsættes 32 μL transfektionsreagens (Materialetabel) til hver plasmid/reduceret serummediumblanding; dette giver en koncentration på 2,5 μL transfektionsreagens pr. μg plasmid i blandinger. Vortex blander forsigtigt og inkuberer ved stuetemperatur i 20 min.
    3. I løbet af 20 min inkubationstid skylles BHK-T7-cellerne i 12-brøndsplader (tilberedt på dag 1) én gang med 2 ml GMEM ufuldstændige medier. Derefter tilsættes 1 ml SMV'er ufuldstændigt medium til hver brønd og returnerer plader til kuvøsen.
    4. Efter inkubationstiden på 20 min tilsættes plasmid/reduceret serummedium/transfection-blanding drop-by-drop til hver brønd af 12-brøndpladerne ved hjælp af en 200 μL pipettor. Forsigtigt rock plader og vende tilbage til en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
  3. Dag 4: overseedning transinficeret BHK-T7 celler med MA104 celler
    1. Et friskflydende monolag af MA104-celler, der er indeholdt i en T75-kolbe 2x med PBS, skylles. Det enlage forstyrres ved hjælp af trypsin-EDTA-opløsning, og genopknyt cellerne i 5 ml DMEM komplet medium.
    2. Ved hjælp af en automatiseret celletæller og trypan-blå opløsning bestemmes koncentrationen af levedygtige MA104-celler i mediet. Koncentrationen til 8 x 105 MA104 celler/ml i DMEM ufuldstændigt medium og der tilsættes 0,25 ml suspenderede celler (2 x 105 celler) dråbevis til de brønde, der indeholder transfected BHK-T7-celler.
    3. Koncentrationen af trypsin (svinebugspytkirteltype IX) justeres i mediet til ~0,5 μg/ml ved at tilsætte 0,8 μL 1 mg/ml trypsinmateriale til hver brønd.
      BEMÆRK: Trypsinlagre skal fremstilles i PBS, aliquoted og opbevares ved -20 °C.
    4. Brug de resterende MA104 celler til at forberede 6-brøndplader, der vil være nødvendige på dag 7 for at forstærke rekombinant virus. For at frø 6-brøndplader, fortyndes resuspended MA104 celler til en koncentration på 1,5 x 105 celler / ml i DMEM komplet medium og sted 2 ml i hver brønd. Pladerne anbringes i en 372 °C, 5% CO 2-inkubator.
  4. Dag 7: genvinding og forstærkning af rekombinant virus fra transfected celler
    1. Emne BHK-T7/MA104 celler i 12-brøndplader til tre cyklusser af fryse-tø under sterile forhold, bevægelige plader mellem -20 °C fryser og en rumtemperatur overflade. Efter overførsel af lysater til 1,5 ml rør centrifugeres rør i 10 min ved 500 x g (4 °C) til pelletering af store celleaffald. Opsaml supernatantog opbevares ved 4 °C (kort tid) eller -20 °C (lang sigt).
    2. Vask MA104 monolag i 6-brøndplader (tilberedt på dag 4) 2x med PBS. Der anbringes 2 ml DMEM ufuldstændigt medium til hver brønd, der indeholder 0,5 μg/mL trypsin. Der tilsættes 300 μL supernatant, der er genvundet fra BHK-T7/MA104-cellelysater,2 i brønde og anbringes i en 37 °C, 5% CO 2-inkubator.
    3. Inkuberpladerne i 7 dage, eller indtil der observeres fuldstændig cytopitiske virkninger (CPE). Lyse MA104 celler i 6-brøndplader ved tre cyklusser af fryse-tø, derefter overføre lysates til 1,5 ml mikrocentrifuge rør. Pellet store cellulære snavs ved centrifugering i 10 min ved 500 x g (4 °C). De tydeliggjorte cellelysater overføres til 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 °C.

4. Plaque isolering af rekombinant virus

  1. Virus aktiveres i 100 μL af tydeliggjorte cellelysater ved at tilsætte trypsin til en endelig koncentration på 10 μg/ml og inkubere ved 37 °C i 1 time. Der fremstilles en seriel fortyndingsserie på 10-1 til 10-7 (1 ml) i DMEM ufuldstændigt medium.
  2. Skyl MA104 monolag i 6-brønds plader 2x med 2 ml PBS og én gang med DMEM ufuldstændigt medium. Der tilsættes 400 ml lysatfortyndinger i duplikere til pladerne. Pladerne inkuberes i 1 time i en2 37 °C, 5% CO 2-inkubator, vuggende hver 10-15 min for at omfordele fortyndinger på tværs af monolaget.
  3. Der fremstilles en agarose-MEM overlay-opløsning ved at kombinere lige store mængder af 2x Eagles minimale essentielle medium (EMEM; forvarmet til 37 °C) med 1,5% agarose, der er smeltet i vand ved hjælp af en mikrobølgeovn og forkølet til 45 °C. Overlejringsopløsningen holdes ved 42 °C ved hjælp af et vandbad, og der justeres til en endelig koncentration på 0,5 μg/mL trypsin umiddelbart før placering på cellerne.
  4. Lysatfortyndinger af lysat fra 6-brøndsplader trækkes af, og cellerne skylles derefter én gang med 2 ml ufuldstændig DMEM. Overlejr forsigtigt 3 ml agarose-MEM overlejringsopløsning en på cellemonolaget i hver brønd. Lad agarose overlay at hærde ved stuetemperatur, derefter returnere plader til kuvøsen.
  5. Tre dage senere fremstilles en agarose-MEM overlay-opløsning som i trin 4.3 og der til 42 °C. Umiddelbart før brug justeres overlejringsopløsningen til en endelig koncentration på 50 μg/ml neutral rød (Materialetabel).
  6. Der tilsættes 2 ml overlejringsopløsning oven på det eksisterende agaroselag i 6-brøndspladerne. Efter at have givet det nye agaroselag at hærde, skal pladerne returneres til kuvøsen. Beskyt opløsninger og plader, der indeholder neutral rød, mod lyseksponering.
  7. I løbet af de næste 6 timer, identificere rotavirus plaques i 6-brønd plader ved hjælp af en lyskasse. Pick klart definerede plaques ved hjælp af engangsoverførsel pipetter, inddrive agarose stik, der strækker sig fuldt ud til cellelaget.
  8. Udvis stikket ud i et 1,5 ml rør, der indeholder 0,5 ml DMEM ufuldstændigmedium og vortex prøven i 30 s. Amplify den plaque-isolerede virus, der er udledt i mediet ved formering på MA104 monolag i 6-brøndsplader eller T25-kolber indeholdende DMEM ufuldstændigt medium og 0,5 μg/mL trypsin.
    BEMÆRK: Yderligere oplysninger om isolering og titrering af rotavirus ved plaque-analyse findes i Arnold et al.31.

5. Gelelektroforese af viral dsRNA

  1. 600 μL af tydeliggjorte inficerede cellelysater og 400 μL guanidinium thiocyanat i 1,5 ml mikrocentrifugerør, vortex i 30 s og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Tilsæt 200 μL chloroform, vortex i 30 s og inkuberi i 3 min. Efter centrifugering i 5 min ved 13.000 x g (4 °C) overføres ~550 μL af den øvre vandige fase til friske rør.
  2. Gendan viral dsRNA fra den vandige fase ved at tilsætte 2 bind (~900 μL) kold isopropylalkohol og inverterende rør 4−6x. Centrifugerør i 10 min. centrifugeres i 10 min ved 13.000 x g (4 °C) efter inkubation ved stuetemperatur i 10 min. Kassér supernatants og bevare RNA pellets.
  3. Pillerne vaskes ved tilsætning af 1 ml 75% ethanol til røret, inverter én gang og centrifugering i 5 min ved 7.500 x g (4 °C). Efter omhyggeligt at have fjernet ethanolvasken med en pipettor skal RNA-pellets lufttørres på laboratoriebænken i 5−10 min. Opløs RNA-pellets i 15 μL nukleaserfri molekylærbiologisk e-vand og opbevares ved -20 °C.
  4. Kombiner 10 μL opløstrna-prøver med 2 μL 6x DNA-belastningsbuffer, belastning på præfabrikerede 10% polyacrylamid minigeler (eller håndstøbte ækvivalenter) og opløsning af RNA'er ved elektroforese i Tris-glycinløbebuffer i 2 timer under en konstant strøm (16 mA). Blødgør geler i 5−10 min. i vand indeholdende ~1 μg/mL ethidium bromid og detektering af rotavirusgenomsegmenter med en UV-transilluminator.

6. Genfinding og sekvensering af viral dsRNA

  1. Find virale dsRNA-bånd på polyacrylamidgeler, helst ved hjælp af lang bølgelængde UV-lys med lav intensitet, for at undgå at generere nukleinsyrecrosslinks. Ved hjælp af et frisk barberblad skæres gelfragmenter ud, der indeholder dsRNA-bånd, og overføres til 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  2. Efter tilsætning af 10−20 μL RNasefrit vand knuses hvert fragment med en RNase-fri engangspelletstøder, der er designet til at passe til et 1,5 ml mikrocentrifugerør eller ved at trække op og ned gennem en 18 G nål. Inkuberede knuste fragmenter natten over ved 4 °C.
  3. Der genvindes 3 μL væske fra rør, der indeholder knuste gelfragmenter. Generer cDA'er for de virale dsRNA'er ved hjælp af et et-trins omvendt transskriptionspolymerasekædereaktion (RT-PCR) kit (Materialstabel)og passende oligonukleotid primere.
    BEMÆRK: PCR-produkter er gel-renset med en PCR oprydning kit (Table of Materials) og sendt ud til natten sekventering, sammen med primere, af kommercielle DNA-sekvens tjenester.

7. Immunoblot analyse af virale proteiner

  1. Seed 6-brøndplader med 3 x 105 MA104 celler pr. brønd i et samlet volumen på 2 ml DMEM komplet medium. Pladerne anbringes i en 372 °C, 5 % CO 2-inkubator, og lad dem hen, indtil cellerne når sammenløbet (3−5 dage).
    BEMÆRK: Brønde med sammenflydende monolag vil indeholde ~1,2 x 106 celler.
  2. Afklarede supernatants behandles ved inkubering med 10 μg/mL trypsin ved 37 °C i 1 time for at aktivere rekombinant rotaviruspartikler, der er indeholdt i dem.
  3. Skyl MA104 monolag i 6-brønds plader 2x med 2 ml PBS. Cellerne inficeres ved hver brønd at tilsætte 200 μL inoculum indeholdende 3−5 plaque-dannende enheder (PFU) pr. celle af trypsinaktiveret rotavirus i DMEM ufuldstændigt medium. Returplader til kuvøsen.
  4. Hver 10 min, fjerne plader og forsigtigt rock at omfordele inoculum på tværs af cellen monolayer. Efter 1 time skal inoculum udskiftes med 2 ml DMEM ufuldstændigt medium.
  5. Ved 8 timers postinfektion skylles cellerne i 6-brøndsplader 2x med PBS. Skrab celler i 750 μL PBS og overfør volumen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Pladen skylles med yderligere 750 μL PBS og kombineres med den tidligere indsamlede 750 μL prøve.
  6. Pelletceller i prøven ved centrifugering ved 5.000 x g i 10 min ved 4 °C. Efter kassering af supernatant opbevares cellepiller ved -80 °C, indtil de er blevet behandlet yderligere.
  7. Klargør cellelysisbufferen indeholdende 300 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2% Triton X-100 og 1x EDTA-fri komplet proteasehæmmer. Efter tilsætning af 300 μL lysisbuffer til frosne cellepiller, kort vortex prøver og inkubere på is i 10 min.
  8. Gentag processen med vortexing og inkubering prøver på is 3x. Derefter centrifugeres prøverne ved 15.000 x g i 10 min ved 4 °C, hvorefter supernatmantitanter opsamles, hvorefter de opbevares ved -80 °C.
  9. Proteiner, der er indeholdt i 20 μL-mængder supernatantprøver, forsvinder ved elektroforese på præfabrikerede lineære 8−16% polyacrylamidminigeler og overføres til nitrocellulosemembraner. Blokmembraner ved inkubering med PBS-Tween 20 (0,02%) opløsning, der indeholder 5% fedtfri tør mælk.
  10. Sondemembraner ved inkubering med et eller flere primære antistoffer (f.eks. marsvinanti-NSP3 eller anti-VP6 antisera, monoklonal anti-Flag M2-antistof eller kaninmonoklonalt anti-PCNA antistof). Detekterer primære antistoffer ved at inkubere membraner med hesteantimuse-IgG, antimarsvin IgG eller gedeantikanini IgG peberrodperoxidase-konjugerede sekundære antistoffer, efterfulgt af det forbedrede keluminescens (ECL) peberstofchemiluminescenssubstrat. Visualiser luminescenssignaler ved hjælp af et gelbilledsystem (Table of Materials) eller røntgenfilm.

8. Levende cellebilleder af celler inficeret med FP-ekspresning af virus

  1. Seed 6-brøndplader med 3 x 105 MA104 celler pr. brønd i i alt 2 ml DMEM komplet medium. Pladerne anbringes i en 372 °C, 5 % CO 2-inkubator, og lad dem hen, indtil cellerne når sammenløbet (3−5 dage).
    BEMÆRK: Brønde med sammenflydende monolag vil indeholde ~1,2 x 106 celler.
  2. Rotavirusprøver af kendt titer aktiveres ved inkubation med 10 μg/ml trypsin ved 37 °C i 1 time.
  3. 6-brøndsplader skylles med MA104 monolag 2x med 2 ml PBS. Der nedsiminer cellerne ved at tilsætte 200 μL inoculum indeholdende 3−5 PFU pr. celle af trypsinaktiveret rotavirus i DMEM ufuldstændigt medium. Returplader til inkubatoren og forsigtigt rockplader til at omfordele inoculum på tværs af cellen monolayer hver 10 min.
    BEMÆRK: Brønde, der er mock inficeret med virus-fri DMEM inoculum bør indgå som kontrol.
  4. Efter 1 time virusadsorption skylles monolags 2x med PBS og mediet udskiftes med 0,5 ml pr. brønd af DMEM ufuldstændigt medium. Ved 7,5 timers efterinfektion skal kulturmediet erstattes med DMEM med fluorescens med lav baggrund (Materialetabel). Ved 8 h post infektion, bruge en levende celle imager til at undersøge celler ved 20x forstørrelse for grøn, rød eller blå fluorescens signal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den omvendte genetik protokol, der er beskrevet i denne artikel fortsætter gennem flere forskellige trin: (1) co-transfection af BHK-T7 celler med rotavirus pT7 transskription vektorer og en pCMV/NP868R udtryk plasmid, (2) oversåning af transficerede BHK-T7-celler med MA104-celler, 3) forstærkning af rekombinantvirus i BHK-T7/MA104-celler lysater ved hjælp af MA104-celler og 4) plaqueisolering af rekombinantvirus ved hjælp af MA104-celler (figur 2). I vores hænder, protokollen er effektiv, giver titers af rekombinant wildtype SA11 virus (rSA11/wt) i BHK-T7/MA104 celle lysates af ~ 104 PFU / ml og i forstærket MA104 celle lysates af > 1 x 107 PFU/ml. SA11 rekombinant virus genereret af omvendt genetik ved hjælp af modificeret pT7/NSP3SA11 plasmider udtrykke FPs (f.eks rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG) vokse til titers, der er ~ 4-gange mindre end rSA11/wt.

Efter den omvendte genetik protokol, genererede vi rekombinant SA11 vira, der var let identificeres ved plaque assay på MA104 celler, hvilket giver plaque isolation (Figur 3D). Vira i plaques blev plukket med en lang spids engangsoverførsel pipet og forstærket på MA104 celler. DsRNA-genomerne af plaque-renset rSA11/wt og rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG virus blev udvundet med guanidinium thiocyanat, forsvandt ved elektroforese på en 10% polyacrylamid gel, og detekteres ved farvning med ethidium bromid (Figur 3A). Som forventet migrerede segmentet 7 (NSP3) dsRNA af rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG meget langsommere end i rSA11/wt (Figur 3A) på grund af tilstedeværelsen af 2A-3xFL-UnaG-sekvenser. Segmentet 7 (NSP3) dsRNA af rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG blev gelrenset, konverteret til cDNA-form af RT-PCR og sekvenseret for at bekræfte nøjagtigheden.

For at kontrollere for ekspression af UnaG fluorescerende protein, MA104 celler i 6-brønd plader blev inficeret med 3 PFU pr celle rSA11/wt og rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. Ved 8 timers postinfektion blev dyrkningsmediet i plader erstattet med 0,5 ml DMEM med lav baggrundsfluorescens pr. brønd,2 og pladerne inkuberede i yderligere 30 minutter ved 37 °C i en CO 2-inkubator. Bagefter blev plader undersøgt for UnaG udtryk ved hjælp af en levende celle imager. Analysen viste, at rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG producerede grøn fluorescens, der verificerede unag-genets funktionalitet i rekombinantvirus (figur 3B). I modsætning hertil blev grøn fluorescens ikke påvist i celler inficeret med rSA11/wt. For at afgøre, om 2A-elementet i det modificerede segment 7 af rSA11/NSP3-2AxFL-UnaG fremmede ekspressionen af to separate proteiner (NSP3-2A og 3xFL-UnaG), blev MA104-celler inficeret med rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG og rSA11/wt. Cellelysater blev fremstillet af celler høstet ved 8 h post infektion, forsvandt ved gel elektroforese, og slettet på nitrocellulose filtre. Blots blev undersøgt med antistoffer specifikke for rotavirus VP6 og NSP3, og FLAG tag. Analysen viste, at NSP3-2A og 3xFL-UnaG blev udtrykt som separate proteiner i celler inficeret med rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG, hvilket indikerer, at 2A-elementet var funktionelt (figur 3C). Celler inficeret med rSA11/wt udtrykte ikke protein, der er anerkendt af anti-FLAG antistof. NSP3-proteinet i rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG-inficerede celler med anti-NSP3 antistof migreret lidt langsommere end NSP3 til stede i rSA11/wt-inficerede celler på grund af tilstedeværelsen af rest 2A-rester ved C-endeinus af NSP3.

Figure 1
Figur 1: Rotavirus omvendt genetik plasmider. (A) CDA'er i fuld længde af de 11 SA11 rotavirusgenomsegmenter er placeret inden for pT7-plasmider, ligated opstrøms med en promotor for T7 RNA polymerase og nedstrøms med en HDV ribozyme. Ved tilstedeværelse af T7 RNA-polymerase producerer rotavirus pT7 plasmider i fuld længde SA11 (+)RNA'er med autentisk 5' og 3' endeini. (B) Skemaer af (+)RNA- og proteinprodukter fremstillet af pT7/NSP3-2A-3xFL-UnaG plasmid. Skemaet omfatter NSP3 cDNA-sekvensen og sekvenser for svinet teschovirus 2A-lignende (2A) element, 3x FLAG (FL) tag, og den grønne fluorescerende protein UnaG. Placeringen af 2A translationel stop-restart site er angivet med en rød pil. På grund af aktiviteten af 2A-elementet producerer oversættelsen af RNA to proteiner. NSP3-delen indeholder rester af 2A-elementet, og UnaG-delen er smeltet til et 3x FLAG-mærke. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Rotavirus omvendt genetik system. BHK-T7 monolag er transfected med 11 pT7 plasmider, hver udtrykker en anden SA11 (+) RNA, og en pCMV vektor, der udtrykker den afrikanske svinepest virus (ASFV) NP868R capping enzym (pCMV/NP868R). Efter 3 dage efter infektionen (d.p.i.) oversases BHK-T7-cellerne med MA104-celler. På 7 dage efter infektion, rekombinant rotavira i BHK-T7/MA104 celle lysater forstærkes ved passage på MA104 celler, derefter isoleret ved plaque rensning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Karakteristik af de rekombinantstammer rSA11/wt og rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. (A) Elektroforetiske profiler af dsRNA-genomsegmenterne af plaqueisolerede rSA11-stammer. De 11 genomsegmenter er nummereret, og forskydningen i positionen for segment 7 (NSP3) angives med en rød linje. (B) Fluorescens påvist i rSA11-inficerede MA104 celler ved 8 h post infektion ved hjælp af en levende celle imager (20x forstørrelse) indstillet på den grønne detektionskanal. Skalabar = 100 μm. (C) Immunoblot analyse af proteiner til stede ved 8 h post infektion i MA104 celler inficeret med rSA11 stammer ved hjælp af marsvin anti-VP6 og anti-NSP3 antisera og mus anti-FLAG monoklonale antistof. (D) Plaques produceret af rSA11/wt på MA104 celler ved 3 dage efter infektion og detekteret ved neutral rød farvning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I vores laboratorium, vi rutinemæssigt stole på den omvendte genetik protokol beskrevet heri til at producere rekombinant SA11 rotavira. Med denne tilgang, personer med ringe erfaring i molekylær biologi teknikker eller arbejder med rotavira inddrive rekombinant virus selv på deres første forsøg. Vi har genereret tæt på 100 rekombinant virus efter denne protokol, herunder dem med genomer, der er blevet re-manipuleret til at udtrykke udenlandske proteiner (f.eks FPs), og som indeholder sekvens tilføjelser, sletninger, og punkt mutationer.

De betingelser og inkubationstider, der er angivet i denne protokol, gælder for genvinding af godt voksende stammer af rekombinant virus. Det bør overvejes at foretage justeringer, hvis man forsøger at genvinde SA11-vira, som på grund af genetisk modifikation kan forventes at vokse dårligt. Især fordi titer af sådanne vira i transfemected BHK-T7/MA014 celle lysates kan være lav, vi typisk fordoble mængden af lysat, der anvendes som inokulum i efterfølgende forstærkning trin. Desuden kan dårligt voksende vira ved forstærkningstrinnet kræve længere inkubationstider, før de når et niveau af CPE, der er tilstrækkelige til cellehøst. Faktisk, med sådanne vira, vi kan tillade infektioner at fortsætte i 10−14 dage, eller endnu længere, før høst celler. Endelig, dårligt voksende vira er tilbøjelige til at generere små, langsomt voksende plaques på MA104 celler. Således, at plak isolere disse vira, kan det være nødvendigt at tillade plaques at udvikle indtil 6−10 dage efter infektion før farvning celler med neutral rød og picking plaques.

Det er vores erfaring, at den vigtigste faktor i pålidelig genopretning af rekombinant rotavirus er brugen af sunde, velholdte BHK-T7-celler. I vores laboratorium, vi rutinemæssigt passage BHK-T7 celler 2x om ugen på samme fortynding ved hjælp af medium suppleret ikke kun med 10% FBS, men også med NEAA, TPB, og høje niveauer af glukose (GMEM komplet medium). De yderligere kosttilskud hjælpe BHK-T7 celler bevarer udvidet levedygtighed efter plasmid transfection, en faktor sandsynligvis afgørende for at inddrive dårligt voksende mutant rekombinant virus. Vi supplerer mediet hver anden passage med G418, et antibiotikum, der vælger til vedligeholdelse af T7 polymerase udtryk plasmid. Passage betingelser bør være sådan, at BHK-T7 celler aldrig får lov til at vokse forbi sammenløbet, betingelser, der hurtigt fører til nedsat celle levedygtighed. For os, BHK-T7 celler, der har fået lov til at overgrow udføre dårligt i den omvendte genetik protokol, selv om cellerne efterfølgende er passager passende flere gange. I stedet for at forsøge at rehabilitere tilgroede BHK-T7 celler, genstarter vi slægten med celler, der tidligere er lagret i flydende nitrogen.

Mycoplasma forurening af BHK-T7 og MA104 celler kan være en væsentlig faktor i svigt af rotavirus omvendt genetik system til at generere rekombinant virus. I vores laboratorium bruger vi et PCR-baseret mycoplasmadetektionssæt( Materialetabel ) til at kontrollere for forurening af cellelinjer, og når det opdages, er det oftest forbundet med vores BHK-T7 celler. Vi har ikke forsøgt at helbrede cellelinjer for at forurene mycoplasma, i stedet genetablere linjerne med tidligere mycoplasma-fri passager gemt i flydende nitrogen. Før du starter nye cellelinjer, kasserer vi alle tidligere anvendte medium og medium kosttilskud og grundigt dekontaminerinatinkubatorer, biologiske sikkerhedsskabe, vandbade, lab bænke, og pipetter. Vi bruger også mycoplasma detektionssæt til at kontrollere lagre af rekombinant virus for forurening. På grund af rotaviruspartiklernes resistens over for denaturering med organiske opløsningsmidler, såsom Vertrel VF32, er det muligt at frigøre viruslagre fra at forurene mycoplasma, hvilket fjerner behovet for at regenerere rekombinantvirus ved omvendt genetik. Det er vigtigt at understrege, at cellelinjer og viruspræparater, der modtages i laboratoriet, skal kontrolleres for mycoplasmakontaminering før rutinemæssig brug.

Selv om dag ind og dag ud, vi bruger den samme protokol til at generere rekombinant virus, vi ved, at visse ændringer kan foretages, som ikke vil udelukke virus opsving. For eksempel er (i) sam-transfection af pCMV/NSP868R capping-enzym plasmid med SA11 pT7 vektorer ikke nødvendig for inddrivelse af rekombinant virus. Mens tilsætning af capping plasmid giver højere virus titre i transfected BHK-T7/MA104 celle lysates, har vi været i stand til at inddrive mange vira, herunder dem, der udtrykker FPs, uden. Vi har imidlertid konkluderet, at ekspression af capping enzymet ved pCMV/NP868R kan bidrage væsentligt til inddrivelse af mindre fit virus. (ii) Vi har konstateret, at rekombinant virus kan genereres, selv om mængden af transfection reagens (Table of Materials),der anvendes i den omvendte genetik protokol er reduceret med halvdelen, en ændring, der kan reducere udgifterne betydeligt. (iii) På samme måde har vi fastslået, at M199 komplet medium kan bruges i stedet for DMEM komplet medium. (iv) Endelig er der ikke fastsat noget krav vedrørende den type vektorrygrad, der skal anvendes til fremstilling af Transskriptionsvektorer for SA11 T7. Så længe den virale cDNA i plasmider er omgivet af en opstrøms T7 promotor og en downstream HDV ribozyme og T7 terminator, plasmid kan forventes at støtte inddrivelse af rekombinant virus. Især, pGEM-, pBluescript, og pUC-baserede vektorer er blevet anvendt med succes i det omvendte genetik system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R03 AI131072 og R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, og Lawrence M. Blatt Endowment. Vi takker medlemmerne af IU Rotahoosier-laboratoriet, Ulrich Desselberger og Guido Papa for deres mange bidrag og forslag til udvikling af den omvendte genetikprotokol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) Cells Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel Bio-Rad 45608105
Cellometer AutoT4 viable cell counter Nexcelom
ChemiDoc MP Gel Imaging System Bio-Rad
Chloroform MP 194002
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate Bio-Rad 170-5060
Competent E.coli DH5alpha Bacteria Lucigen 60602-2
Complete Protease Inhibitor Pierce A32965
Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips MTC Bio P4113-11
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Lonza 12-604F
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) Quality Biological 115-073-101
Ethanol, Absolute (200 proof) Fisher Bioreagents BP2818-500
Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) Invitrogen 15585-011
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Corning 35-011-CV
Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal Sigma-Aldrich F1804
GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit Sigma NA0200-1KT
Geneticin (G-418) Invitrogen 10131-027
Gibco FluroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 DMEM with low background fluorescence
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) Gibco 11710-035
Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated Cell-Signaling Technology 7074S
Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum Patton lab lot 55068
Guinea Pig Anti-VP6 Antierum Patton lab lot 53963
Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated KPL 5220-0366
Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated Cell-Signaling Technology 7076S
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit JH Science 25235
Isopropyl alcohol Macron 3032-02
L-glutamine Solution (100x) Gibco 25030-081
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) RPI research products L24020-2000.0
Medium 199 (M199) Culture Medium Hyclone Sh30253.01
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) Lonza 04-719Q
Monkey Kidney (MA104) Cells ATCC ATCC CRL-2378.1
NanoDrop One Spectrophotometer ThermoScientific
Neutral Red Solution (0.33%) Sigma-Aldrich N2889-100ml
Non-Essential Amino Acid Solution (100x) Gibco 11140-050
Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel Invitrogen XP00102BOX
Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water Invitrogen 10977-015
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit Takara 740609.25
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985-070
Pellet pestle (RNase-free, disposable) Fisher 12-141-368
Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) Corning 30-002-Cl
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Fisher Bioreagents BP399-20
Porcine Trypsin, Type IX-S Sigma-Aldrich T0303
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1223
Qiagen Plasmid Maxi Kit Qiagen 12162
Qiagen Plasmid Midi Kit Qiagen 12143
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
SA11 pT7 Transcription Vectors Addgene 89162-89172
SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins Contact: jtpatton@iu.edu
SeaKem LE Agarose Lonza 50000 For gel electrophoresis
SeaPlaque agarose Lonza 50100 For plaque assay
Superscript III One-Step RT-PCR kit Invitrogen 12574-035
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad 170-4270
Trans-Llot Turbo Transfer System Bio-Rad
TransIT-LTI Transfection Reagent Mirus MIR2306
Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) Bio-Rad 161-0772
Triton X 100 Fisher Bioreagents BP151-500
Trizol RNA Extraction Reagent Ambion 15596026
Trypan blue Corning 25-900-CI
Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution Quality Biological 118-087-721
Tryptose Phosphate Broth Gibco 18050-039
Tween-20 VWR 0777-1L
Vertrel VF solvent Zoro G0707178
Zoe Fluorescent Live Cell Imager Bio-Rad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
  2. Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
  3. International Committee on Taxonomy of Viruses. Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release. , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019).
  4. Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, Suppl 2 96-105 (2016).
  5. Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
  6. Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
  7. McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
  8. Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
  9. Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
  10. Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
  11. Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
  12. Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
  13. Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
  14. Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
  15. Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
  16. Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
  17. Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
  18. Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
  19. Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
  20. Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
  21. Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
  22. Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
  23. Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
  24. Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
  25. Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
  26. Donnelly, M. L., et al. The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
  27. Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
  28. Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
  29. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
  30. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , HHS publication no. CDC 21-1112 (2009).
  31. Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
  32. Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).

Tags

Immunologi og infektion Problem 158 rotavirus omvendt genetik fluorescerende protein rekombinant virus rekombinant rotavira viral ekspressionsvektor
Forenklet Reverse Genetics metode til at inddrive rekombinant rotavira udtrykke Reporter Proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Philip, A. A., Dai, J., Katen, S.… More

Philip, A. A., Dai, J., Katen, S. P., Patton, J. T. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (158), e61039, doi:10.3791/61039 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter