Summary
הדור של רקומביננטי rotaviruses מ-DNA פלאמיד מספק כלי חיוני לחקר שכפול rotaviruses ו פתוגנזה, ופיתוח של וקטורים rotaviruses ביטוי וחיסונים. להלן, אנו מתארים גישה גנטית הפוכה פשוטה ליצירת רקומביננטי rotaviruses, כולל זנים המבטא חלבונים כתבת פלורסנט.
Abstract
Rotaviruses הם אוכלוסייה גדולה ומתפתחת של וירוסים כפולה ומקוטע של RNA הגורמות לדלקת במעיים חמורה בצעירים של מינים רבים ומארחים העופות, כולל בני אדם. עם הופעתו האחרונה של רוטוירוס גנטיקה הפוכה מערכות, זה הפך להיות אפשרי להשתמש מוטגנזה מכוונת כדי לחקור ביולוגיה רוטוירוס, לשנות ולמטב את הקיימים חיסונים רוטוירוס, ולפתח רוטוירוס רב היעד וקטורים החיסון. בדו ח זה, אנו מתארים מערכת גנטית הפוכה פשוטה המאפשרת התאוששות יעילה ואמינה של רקומביננטי rotaviruses. המערכת מבוססת על שיתוף הפעולה של T7 וקטורים המבטאת באורך מלא רוטוירוס (+) rnas ו-cmv קידוד וקטור האנזים הסגירה לתוך התאים bhk מכונן לייצר T7 RNA פולימראז (bhk-T7). רקומביננטי rotaviruses הם מוגברת על ידי זריעת יתר של תאים BHK-T7 מזוהמים עם תאים MA104, תא כליות קוף קו כי הוא מאוד מתירני עבור צמיחת וירוסים. בדו ח זה, אנו מתארים גם גישה ליצירת רקומביננטי rotaviruses המבטאים חלבון נפרד העיתונאי פלורסנט באמצעות המבוא של האלמנט להפסיק להפעיל מחדש באמצעות translational לקטע הגנום 7 (NSP3). גישה זו נמנעת ממחיקה או שינוי של כל מסגרות קריאה ויראלי פתוח, ובכך לאפשר ייצור של רקומביננטי rotaviruses השומרים חלבונים נגיפי פונקציונלי באופן מלא תוך הבעת ביטוי חלבון פלורסנט.
Introduction
Rotaviruses הם הגורמים העיקריים של דלקת במעיים חמורה אצל תינוקות וילדים צעירים, כמו גם צעירים של יונקים רבים אחרים העופות1. כחברים של המשפחה Reo, וירוסים יש מקוטע כפולה תקוע-RNA (dsRNA) הגנום. מגזרי הגנום כלולים בתוך וויאון לא עטוף שנוצר משלוש שכבות קונצנטריות של חלבון2. מבוסס על רצף וניתוח פילוגנטי של מקטעי הגנום, תשעה מינים של רוטוירוס (A-D, F-J) הוגדרו3. אלה זנים הכוללת מינים רוטוירוס הם אחראים לרוב המכריע של המחלה האנושית4. המבוא של חיסונים רוטוירוס לתוך תוכניות החיסון לילדות החל בעשור האחרון הוא בקורלציה עם הנחות משמעותיות בתמותה רוטוירוס ותחלואה. בעיקר, מספר מקרי המוות של הילדות rotavirus הקשורים ירדו מ כ 528,000 ב 2000 ל 128,500 ב 20164,5. חיסונים rotavirus מנוסחים זני לחיות החליש של הווירוס, עם 2 כדי 3 מינונים מנוהל לילדים על ידי גיל 6 חודשים. המספר הגדול של זנים רוטוירוס ירוס מגוונת גנטית במחזור בני אדם ומינים אחרים היונקים, בשילוב עם יכולתם להתפתח במהירות באמצעות מוטאוסיס והקצאה מראש, עלול להוביל לשינויים אנטיגניים בסוגים של רוטוירוס להדביק ילדים6,7,8. שינויים כאלה עלולים לערער את היעילות של חיסונים קיימים, המחייבים החלפת או שינוי שלהם.
התפתחות של מערכות גנטיקה הפוכה במלואו בסיס המאפשר מניפולציה של כל 11 מקטעי הגנום רוטוירוס הושגה רק לאחרונה9. עם הזמינות של מערכות אלה, זה הפך להיות אפשרי לפענח פרטים מולקולריים של שכפול רוטוירוס ו פתוגנזה, כדי לפתח שיפור תפוקה גבוהה שיטות ההקרנה עבור תרכובות אנטי-רוטוירוס, וכיצד ליצור מחלקות חדשות פוטנציאלי יותר יעיל של חיסונים רוטוירוס. במהלך שכפול רוטוירוס, הכתיר ויראלי (+) rnas לא רק מדריך סינתזה של חלבונים ויראלי, אלא גם לשמש כתבניות לסינתזה של צאצאי הגנום dsrna מגזרים10,11. כל רוטוירוס גנטיקה הפוכה מערכות שתוארו עד תאריך להסתמך על הT7 של שעתוק וקטורים לתוך שורות התא של היונקים כמקור cdna-נגזר (+) rnas בשימוש בשחזור רקומביננטי וירוסים9,12,13. בתוך וקטורים שעתוק, cDNAs באורך מלא ממוקמים בין היזם T7 במעלה למטה הפטיטיס דלתא וירוס (HDV) ריבוזים כגון זה ויראלי (+) RNAs מסונתז על ידי T7 RNA פולימראז המכילים אותנטי 5 ' ו 3 '-termini (איור 1A). במערכת הגנטיקה הפוכה של הדור הראשון, וירוסים רקומביננטי נעשו על ידי התינוק מצפה בתאי כליה אוגר ביטוי T7 RNA פולימראז (bhk-T7) עם 11 T7 (pT7) תמלול וקטורים, כל מכוון סינתזה של ייחודי (+) RNA של מאמץ SA11 וירוס קופיים, ושלושה cmv יזם-כונן ביטוי פלמידים, קידוד אחד החלבון reovirus p10FAST היתוך ושני חלבוניות קידוד של vaccinia וירוס D1R-D12L הסגירה אנזים מורכב9. וירוסים רקומביננטי SA11 שנוצרו בתאי bhk-T7 מזוהמים היו מוגבר על ידי זריעה יתר עם MA104 תאים, קו תא מתירני עבור צמיחה רוטוירוס. גירסה ששונתה של מערכת הגנטיקה הפוכה של הדור הראשון תוארה שכבר לא משתמשת ב-פלמידים תומכים12. במקום, המערכת ששונתה מייצרת בהצלחה רקומביננטי rotaviruses פשוט על ידי transfecting T7 תאים ב-hk עם 11 SA11 שעתוק וקטורים, עם האזהרה כי וקטורים עבור המפעל ויראלי (viroפלסטיות) אבני בניין (חלבונים לא מבניים NSP2 ו NSP5) מתווספים ברמות 3 מתקפל גבוה יותר מאשר וקטורים אחרים14,15. גרסאות ששונו של מערכת הגנטיקה הפוכה פותחו גם כי תמיכה ההתאוששות של קו האדם ו אודליה וזנים של רוטוירוס16,17. הגנום רוטוירוס היא קלה להפליא מניפולציה על ידי הפוך גנטיקה, עם רקומביננטי וירוסים שנוצרו עד היום עם מוטציות הציג לתוך VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, ו NSP522,23. בין הווירוסים השימושיים ביותר שנוצר עד כה הם אלה שעברו הנדסה לבטא חלבונים כתב פלורסנט (FPs)9,12,21,24,25.
בפרסום זה, אנו מספקים את הפרוטוקול עבור מערכת הגנטיקה הפוכה שאנו משתמשים במעבדה שלנו כדי לייצר רקומביננטי זנים של SA11 rotavirus. התכונה המפתח של הפרוטוקול שלנו היא שיתוף של התאים BHK-T7 עם 11 pT7 וקטורים (שונה לכלול רמות 3x של pT7/NSP2SA11 ו pT7/NSP5SA11 וקטורים) ו-CMV ביטוי קידוד וקטור החזירים האפריקאי (ASFV) NP868R סגירה אנזים21 (איור 2). בידינו, נוכחות של NP868R באמצע מוביל את הייצור של מגדל גבוה יותר של וירוסים רקומביננטי על ידי מנוכר bhk-T7 תאים. בפרסום זה, אנו מספקים גם פרוטוקול עבור שינוי pT7/NSP3SA11 הפלמיד כגון הרקומביננטי וירוסים ניתן ליצור כי לבטא לא רק את המוצר 7 מוצר חלבון NSP3 אלא גם FP נפרד. זה מושגת על ידי מחדש הנדסה NSP3 פתוח מסגרת הקריאה (orf) ב pT7/NSP3SA11 פלמיד להכיל במורד הזרם 2a לעצור הפעלה מחדש האלמנט ואחריו FP (איור 1b)24,26. באמצעות גישה זו, יצרנו רקומביננטי rotaviruses ביטוי FPs שונים: unag (ירוק), mkate (רחוק-אדום), mkate (אדום), tagbfp (כחול), CFP (ציאן), ו-yfp (צהוב)24,27,28. אלה וירוסים FP ביטוי זה נעשים מבלי למחוק את NSP3 ORF, ובכך וירוסים מניבים כי צפויים לקודד השלמה מלאה של התפקוד חלבונים נגיפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מדיה ותחזוקת תרבות תאים
- להשיג כליות אוגר התינוק בתאי ביטוי מבחינה T7 RNA פולימראז (BHK-T7) ו אפריקה ירוק כליות הקוף MA104 תאים.
הערה: BHK-T7 (או בסר-T7) תאים אינם זמינים מסחרית, אבל הם קו התא המשותף של מעבדות באמצעות גנטיקה הפוכה ללמוד ביולוגיה של וירוס RNA. קו BHK-T7 בשימוש בפרוטוקול זה הושג ד ר. אורסולה בוכהולץ (המכון הלאומי לבריאות, בת, MD, ארה ב), מפתח משותף של קו התאים BHK המקורי המבטא T7 RNA פולימראז29. תאים MA104 זמינים מאוסף האירופאי של תרביות תאים מאומתים (ECACC) ומאוסף התרבות האמריקנית (ATCC). - הכינו את מדיית התרבות הבאה בסביבה סטרילית, עדיף ארון בטיחות ביולוגי מסוג Class II. מאחסנים מדיה בחשכה ב-4 ° צ' וחמים עד 37 ° c מייד לפני השימוש.
הערה: מקורות של רכיבי מדיה ניתנים ברשימת חומרים.- כדי להכין בינונית DMEM לאה, לשלב 500 mL של מדיום חיוני מינימלי של הנשר של Dulbecco (הגברת) המכיל 4.5 g/L גלוקוז ו 1% גלוטמין עם 5 מ ל של 100x עט.
- כדי להכין את dmem דיום להשלים השלם, לשלב 500 mL של המדיום DMEM לא שלם עם 25 מ ל של סרום העוברי העובר (FBS).
- כדי להכין בינונית GMEM לאה, לשלב 500 mL של מדיום חיוני מינימלי של גלאזגו, 5 מ ל גלוטמין 100x, 50 מ ל של טריז-פוספט ציר (TPB), 5 מ ל של 100x חומצות אמינו לא הכרחית (NEAA), ו 5 מ ל של 100x עט.
- כדי להכין את GMEM דיום להשלים, לשלב 500 mL של המדיום השלם gmem דיה עם 25 מ ל של FBS חום מופעל.
- כדי להכין GMEM + G להשלים בינונית, להוסיף 10 מ ל של 50 mg/mL ג ' ל/מ"ל (G418) כדי 500 mL של המדיום השלם GMEM זיכרון.
- כדי להכין את המדיום הבלתי מושלם, לשלב 500 mL של הנשר שונה של יוליק, 5 מ ל גלוטמין 100x, 50 mL של TPB, 5 מ ל של 100x NEAA, ו 5 מ"ל של 100 x עט-דלקת.
- תרבות MA104 תאים ב T75 או T175 צלוחיות המכילות 12 או 25 מ ל של מדיום השלם Dמאמ, בהתאמה. כדי מעבר MA104 תאים שהגיעו 100% השטף, לשטוף את התא מונאולייר 2x עם מלוחים פוספט באגירה (PBS), הנתק עם טריפסין (0.05%)-EDTA (0.1%) פתרון, ולהשעות מחדש ב-5 (T75 תרמוס) או 10 מ ל (T175 בקבוקון) של בינוני לא שלם של DMEM דיה.
- מקום 0.5-1.0 mL של תאים מושעה מחדש מבחנות טריים ולהביא את הנפח הסופי המתאים על ידי הוספת DMEM דיום השלם. בקבוקי מקום ב 37 ° c, 5% חממה2 .
- הפצת BHK-T7 תאים ב T75 מבחנות, לסירוגין בין השימוש של GMEM ו GMEM גברת + G בינונית להשלים עם כל סיבוב של מעבר. כדי תת-תרבות BHK-T7 תאים שהגיעו 100% השטף, לשטוף את התאים מונאולייר 2x עם PBS, לנתק עם הפתרון טריפסין-EDTA, ולהשעות מחדש 5 מ ל של בינוני.
- לאחר הצבת 15 מ ל של פנינה או GMEM דיום + G להשלים בינונית T75 בקבוקון טרי, להוסיף ארבע טיפות של BHK-T7 תאים השעיית מחדש. מניחים בקבוקון 37 ° c, 5% חממה2 .
2. הכנה פלסמיד
- השג את הפלמידים הבאים המבטאים את רוטוירוס SA11 (+) rnas מ-addgene: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/, NSP3SA11/,/pT7,/NSP4SA11. השג את הפלסמיד המבטא את האנזים הסגירה ASFV (pCMV/NP868R) מהמחברים21.
הערה: הpT7/NSP3SA11 פלמידים שעברו הנדסה כדי לבטא FP באמצעות הפעילות של אלמנט של 2a (pT7/NSP3-2a-3xfl-FP) ניתן גם לקבל מן המחברים24,26. pT7/NSP3-2A-3xFL-FP מבטאים את הFPs הבאים זמינים: UnaG (ירוק), mKate (רחוק-אדום), Mkate (אדום), TagBFP (כחול), CFP (ציאן), ו-YFP (צהוב)24. - הפוך את הפלמידים לתוך Eהמוסמכת. coli DH5α והפיצו חיידקים ללוחות מרק לוריא אגר המכילים את האנטיביוטיקה המתאימה. לגדל תרבויות חיידקי לאסוף ממושבות בודדות ולהכין כמויות קטנות יותר של פלפרמיד (20 μg) באמצעות ערכת טיהור מיני הכנה לטווח (טבלת חומרים), על פי הוראות היצרן. הכינו כמויות גדולות יותר של פלסטלינה מתרבויות חיידקית באמצעות ערכות טיהור midi ומקסי (טבלת חומרים).
הערה: פלמידים המתאימים לשימוש במערכת הגנטיקה הפוכה הוכנו גם עם ערכות טיהור אחרות. אין צורך להכין פלמידים באמצעות ערכות שתוכננו במיוחד כדי ליצור חומרים אנטוקסין-חינם. - כוונן ריכוזים של פלמידים מטוהרים ל 1 מ"ג/mL ב nuclease-חינם ביולוגיה מולקולרית מים כיתה. בדוק את טוהר הפלמיד על ידי אישור יחס הספיגה 260/280 של ~ 1.8 באמצעות ספקטרוסקופיה. כמו כן, להשתמש באלקטרופורזה על 0.8% agarose עלה ג'ל כדי לוודא כי הפלמיונים הם בעיקר מתפתל על ידי.
- Aliquot מטוהרים הפלמידים לתוך 0.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה סטרילי צינורות, כל אחד המכיל 10 μL. Store פלמידים ב-80 ° c.
3. דור של וירוס רקומביננטי
הערה: מחקר רוטוירוס אדם ובעלי חיים, כולל הדור והאפיון של זנים רקומביננטי רוטוירוס, חייב להיות מטופל תחת רמת biosafety טיחות 2 (bsl-2) התנאים ידרוש אישור מראש על ידי ועדת biosafety טיחות מוסדית (IBC). התנאים המתאימים BSL-2 המעבדה מתוארים בביובטיחות במעבדות מיקרוביולוגית וביורפואית (bmbl) המיוצר על ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעה (CDC)30.
- יום 1: זריעת תאים BHK-T7 לצלחות 12-טוב
- לשטוף מונאולייר טרי שוטפת של BHK-T7 תאים הכלולים T75 בקבוקון 2x עם PBS. השבש את התא מונאולייר עם פתרון טריפסין-EDTA והשהה מחדש את התאים ב-5 מ ל של מדיום שלם של GMEM דיה.
- השתמש במונה תאים אוטומטיים ובפתרון טרינטן-כחול כדי לקבוע את הריכוז של תאים קיימא BHK-T7 במדיום. תאים הזרע לתוך 12-היטב לוחיות התרבות התא, עם כל הכיל 2 x 105 תאים בנפח כולל של 1 מ ל של gmem (G418-free) מדיום להשלים. דגירה ב 37 ° c, 5% חממה2 . התאים אמורים להגיע ל-80-90 אחוז שליטה ביום 2.
- יום 2: העברה של תאים BHK-T7 עם תערובות פלמיד
- כדי להכין את תערובת, הפלסאמצע לשלב את הפרטים הבאים בצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 mL באמצעות מניות פלביניים מותאם ל 1 מ"ג/mL: 0.8 μL כל אחד SA11 pT7 פלמידים VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 ו NSP4, 2.4 μL כל אחד SA11 pT7 ב וNSP2, ו0.8 μL של pCMV/NSP5. בעדינות לערבב פלמידים על ידי הקשה על הצינור ולאסוף את התוכן על ידי דופק צנטריפוגה. כדי להכין וירוסים רקומביננטי ביטוי FPs, להחליף pT7/NSP3SA11 עם pT7 המתאים/NSP3-2A-3xFL-FP בינוני.
הערה: תערובות פלביניים יש לאחסן על הקרח עד שימוש. צינור נפרד צריך להיות מוכן לכל העברה. - כדי להכין את הסרום הפלסטי בינוני/מופחת התרכובת הכימית: הוסף 110 μL של טרום התחממות (37 ° c) סרום מופחת (טבלת חומרים) על כל תערובת פלסטלינה לערבב על ידי בעדינות ליטוף למעלה ולמטה. לאחר מכן, להוסיף 32 μL של מגיב העברה (טבלת חומרים) על כל הפלסטיק הפחתת בינוני/סרום מופחת; זה התשואות ריכוז של 2.5 μL של החצייה מגיב לכל μg של פלפמיד בתערובות. תערובות מערבולת בעדינות ומודרות בטמפרטורת החדר עבור 20 דקות.
- במהלך 20 דקות דגירה התקופה, לשטוף BHK-T7 תאים ב 12-היטב צלחות (מוכן ביום 1) פעם עם 2 מ ל של מדיה לא מלאה של GMEM. לאחר מכן, יש להוסיף 1 מ ל של סמימ בינונית לא מלאה לכל הבאר ולהחזיר את הצלחות לחממה.
- אחרי 20 דקות דגירה הזמן, להוסיף את הסרום בינוני/מופחת התערובת בינונית/העברה ירידה על ידי ירידה לכל הבאר של 12-לוחות היטב באמצעות הצינורות 200 μL. בעדינות צלחות סלע ולחזור 37 ° c, 5% החממה2 .
- כדי להכין את תערובת, הפלסאמצע לשלב את הפרטים הבאים בצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 mL באמצעות מניות פלביניים מותאם ל 1 מ"ג/mL: 0.8 μL כל אחד SA11 pT7 פלמידים VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 ו NSP4, 2.4 μL כל אחד SA11 pT7 ב וNSP2, ו0.8 μL של pCMV/NSP5. בעדינות לערבב פלמידים על ידי הקשה על הצינור ולאסוף את התוכן על ידי דופק צנטריפוגה. כדי להכין וירוסים רקומביננטי ביטוי FPs, להחליף pT7/NSP3SA11 עם pT7 המתאים/NSP3-2A-3xFL-FP בינוני.
- יום 4: הT7 בתאי הMA104
- לשטוף מונאולייר טרי שוטפת של תאים MA104 הכלולים T75 בקבוקון 2x עם PBS. ששבש את המונאולייר באמצעות פתרון טריפסין-EDTA והשהה מחדש את התאים ב-5 מ ל של מדיום שלם של DMEM דיה.
- באמצעות מונה תא אוטומטי ופתרון טרימין כחול, לקבוע את הריכוז של תאים MA104 קיימא במדיום. להתאים את הריכוז 8 x 105 MA104 תאים/mL ב-dmem בינונית לא מלאה ולהוסיף 0.25 mL של תאים מושעה (2 x 105 תאים) dropwise אל הבארות המכילים בתאי bhk-T7.
- להתאים את הריכוז של טריפסין (porcine הלבלב סוג IX) במדיום כדי ~ 0.5 μg/mL על ידי הוספת 0.8 μL של 1 מ"ג/mL טריפסין מניות לכל באר.
הערה: מניות טריפסין צריכות להיות מוכנות ב-PBS, מצוטט ומאוחסנות ב-20 ° c. - השתמש בתאי MA104 הנותרים כדי להכין לוחות 6-היטב כי יהיה צורך ביום 7 כדי להגביר רקומביננטי וירוסים. כדי זרע 6-צלחות היטב, לדלל מחדש את התאים MA104 לריכוז של 1.5 x 105 תאים/ML ב dmem דיום להשלים ומקום 2 mL בכל טוב. לוחות מניחים ב 37 ° c, 5% חממה2 .
- יום 7: התאוששות והגברה של וירוס מרקומביננטי מתאים מזוהמים
- הנושא BHK-T7/MA104 תאים 12-לוחות לשלושה מחזורים של הקפאת ההפשרה תחת תנאים סטריליים, הזזת צלחות בין-20 ° c מקפיא ומשטח טמפרטורת החדר. לאחר העברת lysates כדי 1.5 mL, צינורות צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 500 x g (4 ° c) כדי גלולה פסולת תאית גדולה. לאסוף את הסופרנטנט ולאחסן ב -4 ° צ' (טווח קצר) או-20 ° צ' (טווח ארוך).
- לשטוף MA104 monolayers ב 6-היטב צלחות (מוכן ביום 4) 2x עם PBS. מניחים 2 מ ל של המדיום השלם DMEM לאה לכל טוב המכיל 0.5 μg/mL טריפסין. הוסף 300 μL של סופרנטנט התאושש מ-BHK-T7/MA104 תא lysates לתוך בארות ומקום לוחות ב 37 ° c, 5% ושות חממה2 .
- הצלחות דגירה של 7 ימים או עד להשלמת אפקט ציטופתי אפקטים (cpe) הם נצפו. Lyse MA104 תאים 6-צלחות היטב על ידי שלושה מחזורים של הקפאת ההפשרה, ולאחר מכן להעביר lysates כדי 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות. גלולה פסולת תאית גדולה על ידי צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 500 x g (4 ° c). העבר את lysates התא הבהיר לתוך הצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ולאחסן ב-20 ° c.
4. פלאק בידוד של וירוסים רקומביננטי
- הפעל וירוסים ב-100 μL הבהיר תא ליטים על ידי הוספת טריפסין לריכוז הסופי של 10 μg/mL ו דגירה ב 37 ° c עבור 1 h. הכינו סדרת דילול טורי 10 מקפלים החל מ -10-1 עד 10-7 (1 מ"ל כל אחד) במדיום dmem לא שלם.
- לשטוף MA104 monolayers ב 6-היטב צלחות 2x עם 2 מ ל של PBS ופעם עם DMEM דיום לא מושלם. הוסף 400 mL של מדלל הליפוסט בשכפול ללוחות. מודקות את הצלחות עבור 1 h ב 37 ° c, 5% החממה2 , נדנדה כל 10 עד 15 דקות כדי להפיץ את הדילול על פני המונאולייר.
- הכינו פתרון של שכבת-על על-ידי שילוב של כרכים שווים של מדיום חיוני של 2x איגל (EMEM; מראש עד 37 ° c) עם 1.5% הצמח שנמס במים באמצעות תנור מיקרוגל ומקורר ל 45 ° c. שמרו על פתרון הכיסוי ב42 ° c באמצעות אמבט מים והתאימו לריכוז הסופי של 0.5 μg/mL באופן מיידי לפני הנחת התאים.
- לצייר לחות מתוך 6-טוב צלחות, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם 2 מ ל של DMEM שלם. שכבת-על בעדינות 3 מ ל של הפתרון של כיסוי הראש של הצמח אל המונאולייר הכלול בכל באר. הניחו לשכבת-העל להיות מרדן בטמפרטורת החדר ולאחר מכן החזר צלחות לחממה.
- שלושה ימים לאחר מכן, הכינו פתרון של שכבת-על של agarose כמו בשלב 4.3 והביאו ל-42 ° c. מיד לפני השימוש, להתאים את הפתרון כיסוי לריכוז הסופי של 50 μg/mL ניטרלי אדום (טבלת חומרים).
- הוסף 2 מ ל של פתרון שכבת-העל מעל השכבה הקיימת של הצמח בצלחות 6-היטב. לאחר התרת שכבת האגרה החדשה להארדן, החזר צלחות לחממה. הגנה על פתרונות וצלחות המכילות אדום נייטרלי מחשיפה לאור.
- במהלך 6 ה ' הבאה, לזהות שלטים רוטוירוס בצלחות 6-היטב בעזרת תיבת אור. בחר לוחיות מוגדרות בבהירות באמצעות pipets העברה חד פעמיות, שחזור אטמי agarose כי להאריך לחלוטין את שכבת התא.
- לגרש את התקע לתוך צינור 1.5 mL המכיל 0.5 mL של המדיום השלם DMEM ומערבולת המדגם עבור 30 s. להגביר את הפלאק וירוס מבודד לתוך המדיום על ידי התפשטות על MA104 monolayers ב 6-היטב צלחות או T25 מבחנות המכילים DMEM בינוני לא שלם ו 0.5 μg/mL טריפסין.
הערה: מידע נוסף הנוגע לבידוד ולניתוק של רוטוירוס באמצעות שיטת הפלאק זמין בארנולד ואח '31.
5. ג'ל אלקטרופורזה של dsRNA נגיפי
- מקום 600 μL הבהיר תא נגוע lysates ו 400 μL של guanidinium thiocyanate ב 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות, מערבולת עבור 30 s, ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. הוסף 200 μL של כלורופורם, מערבולת עבור 30 s, ו דגירה עבור 3 דקות. לאחר תפרידו עבור 5 דקות ב 13,000 x g (4 ° c), העברה ~ 550 μl של השלב העליון מימית לתוך צינורות טריים.
- שחזור dsRNA ויראלי מן השלב מימית על ידי הוספת 2 אמצעי אחסון (~ 900 μL) של אלכוהול איזופרופילי קר ו היפוך צינורות 4-6x. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות, צינורות צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 13,000 x g (4 ° c). להיפטר supernatants ולשמור את כדורי RNA.
- לשטוף את כדורי על ידי הוספת 1 מ ל של 75% אתנול לצינור, היפוך פעם אחת, ו תפרידו עבור 5 דקות ב 7,500 x g (4 ° c). לאחר הסרת בזהירות את שטיפת האתנול עם פיפטורים, לאפשר כדורי RNA לאוויר יבש על הספסל במעבדה עבור 5-10 דקות. התמוססות כדורי RNA ב 15 μL של nuclease-חינם ביולוגיה מולקולרית בכיתה וחנות ב-20 ° c.
- לשלב 10 μL של דגימות RNA מומס עם 2 μL של 6x מאגר הטעינה של ה-DNA, טען אל מיני ג ' ל 10% פוליאקרילמיד מיניבר (או יד יצוקה שווי), ולפתור RNAs על ידי אלקטרופורזה ב טריס-גליצין פועל מאגר עבור 2 h תחת זרם קבוע (16 mA). לטבול ג'ל עבור 5-10 דקות במים המכילים ~ 1 μg/mL אתידיום ברומיד ולזהות מקטעי הגנום רוטוירוס עם מעבר UV.
6. שחזור ורצף של dsRNA ויראלי
- אתר להקות ויראליות dsRNA על ג'ל פוליאקרילאמיד רצוי באמצעות עוצמה נמוכה אורך גל UV אור, כדי למנוע יצירת הצלב חומצה גרעין. באמצעות להב תער טרי, גזור שברי ג'ל המכיל להקות dsRNA ולהעביר לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
- לאחר הוספת 10 של20 μL of RNase-מים ללא תשלום, למחוץ כל רסיס עם הגלולה RNase-חינם כדור אחד שנועד להתאים שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL או על ידי ציור למעלה ולמטה דרך מחט 18 G. מודצת שברי כתוש לילה ב 4 ° c.
- לשחזר 3 μL של נוזל מצינורות המכילים שברי ג'ל כתוש. צור cDNAs של dsRNAs נגיפי באמצעות הפוכה צעד אחד הפוך תגובת שרשרת פולימראז (RT-PCR) ערכת (טבלת חומרים) ומתאים לשימוש בצבעי היסוד.
הערה: מוצרי PCR מטוהרים בעזרת ערכת ניקוי של ה-PCR (טבלת חומרים) ונשלחת לרצף לילה, יחד עם התחל, על-ידי שירותי רצף DNA מסחריים.
7. ניתוח חיסוני של חלבונים ויראליות
- זרעים 6-צלחות עם 3 x 105 MA104 תאים לכל טוב בנפח כולל של 2 מ ל של מדיום להשלים dמאמ. לוחות מניחים ב 37 ° c, 5% בחממה2 ולעזוב עד התאים להגיע שליטה (3-5 ימים).
הערה: בארות עם מונולאיירס מכיל ~ 1.2 x 106 תאים. - הטיפול הבהיר סופרנטנים על ידי הדגירה עם 10 μg/mL טריפסין ב 37 ° c עבור 1 h כדי להפעיל חלקיקים רקומביננטי רוטוירוס הכלולים בתוכם.
- לשטוף MA104 monolayers ב 6-טוב צלחות 2x עם 2 מ ל PBS. להדביק את התאים על ידי הוספת, לכל באר, 200 μl של היווצרות המכיל 3-5 הפלאק להרכיב יחידות (pfu) לכל תא של טריפסין מופעל רוטוירוס ב dmem בינוני לא שלם. . החזר צלחות לחממה
- כל 10 דקות, להסיר צלחות וסלעים בעדינות כדי להפיץ מפצה על פני מונאולייר התא. לאחר 1 h, החלף את האינויית עם 2 מ ל של בינוני לא שלם של DMEM.
- ב 8 הפוסט לאחר זיהום, לשטוף את התאים 6-היטב צלחות 2x עם PBS. לגרד תאים לתוך 750 μL של PBS והעברת נפח לשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. לשטוף את הצלחת עם אחר 750 μL של PBS ולשלב עם הקודם שנאסף 750 μL לדוגמה.
- גלולה תאים במדגם על ידי תפרידו ב 5,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. לאחר השלכת supernatant, לאחסן כדורי תא ב-80 ° c עד מעובד יותר.
- הכן מאגר פירוק תאים המכיל 300 מ"מ הנאל, 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2% טריטון X-100, ו-1x EDTA ללא מעכב פרוטאז מלאה. לאחר הוספת 300 μL של מאגר הליזה כדי כדורי תא קפואים, בקצרה דוגמאות מערבולת ו-דגירה על הקרח עבור 10 דקות.
- חזור על התהליך של וורטקנג ודגימות הדגירה על 3x קרח. לאחר מכן, דגימות צנטריפוגה ב 15,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c, ואז לאסוף סופרנטנים ולאחסן ב-80 ° c.
- לפתור חלבונים הכלולים 20 כרכים μL של דגימות סופרנטאנט על-ידי אלקטרופורזה על מיני ליניארי 8-16% פוליאקרילאמיד המיני ג'ל והעברת לממברנות תאית. ממברנות לחסום על ידי דגירה עם הערוץ 20 (0.02%) תמיסה המכילה 5% חלב יבש ללא שומן.
- ממברנות בדיקה על ידי הדגירה עם אחד או יותר נוגדנים העיקרי (למשל, חזיר גיניאה anti-NSP3 או anti-VP6 antisera, העכבר מונושבטיים נגד הדגל M2 נוגדן, או הארנב מונושבטיים אנטי PCNA נוגדן). לזהות נוגדנים ראשוניים על ידי ממברנות ה, עם סוס נגד עכבר IgG, anti-גיניאה חזיר IgG, או עז נגד ארנב IgG חזרת peroxidase-מעלה מעלה נוגדנים משניים, ואחריו משופרת כימויומינינציה (ECL) חזרת כימוהמצע. המחש באופן חזותי אותות באמצעות מערכת הדמיה ג'ל (טבלת חומרים) או צילום רנטגן.
8. תאים לחיות הדמיה של תאים נגועים בווירוסים ביטוי FP
- זרעים 6-צלחות עם 3 x 105 MA104 תאים לכל היותר בסכום של 2 מ ל של המדיום השלם Dמאמ. לוחות מניחים ב 37 ° c, 5% בחממה2 ולעזוב עד התאים להגיע שליטה (3-5 ימים).
הערה: בארות עם מונולאיירס מכיל ~ 1.2 x 106 תאים. - הפעל דגימות רוטוירוס, של titer ידוע, על ידי דגירה עם 10 μg/mL טריפסין ב 37 ° c עבור 1 h.
- לשטוף 6-היטב צלחות עם MA104 monolayers 2x עם 2 מ ל של PBS. להדביק את התאים על ידי הוספת כל טוב 200 μL של הרשת המכילה 3-5 PFU לכל תא של טריפסין מופעל הנגיף במדיום DMEM לאה. החזר צלחות לחממה ולוחות אבן בעדינות לפיזור הפצה משני התאים ברחבי התא כל 10 דקות.
הערה: בארות שאינן נגועות בווירוסים הנגועים בווירוס בחינם, יש לכלול כפקדים. - לאחר 1 שעות של וירוס ספיחה, לשטוף מונאולייר 2x עם PBS ולהחליף בינוני עם 0.5 mL לכל טוב של המדיום השלם DMEM דיה. ב 7.5 h לאחר זיהום, להחליף בינוני תרבות עם DMEM עם זריחה נמוכה ברקע (טבלת חומרים). ב 8 h לאחר ההדבקה, להשתמש הטלפון הנייד לחיות כדי לבדוק את התאים בהגדלה 20x עבור הירוק, אדום, או כחול האות זריחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול הגנטי הפוך המתואר במאמר זה ההכנסות דרך מספר שלבים מובחנת: (1) שיתוף הפעולה של תאים bhk-T7 עם וקטורים שעתוק רוטוירוס pT7 ו pcmv/NP868R ביטוי פלאמאמצע, (2) זריעת יתר של תאים מזוהמים bhk-T7 עם MA104 תאים, (3) הגברה של רקומביננטי וירוסים הנמצאים bhk-T7/MA104 תאים lysates באמצעות תאים MA104, ו (4) פלאק בידוד של רקומביננטי וירוס באמצעות תאים MA104 (איור 2). בידינו, הפרוטוקול הוא יעיל, מניבים מניב של רקומביננטי wildtype SA11 וירוס (rSA11/wt) ב BHK-T7/MA104 תאים lysates של ~ 104 Pfu/mL ו ב מוגבר MA104 התא ליטים של > 1 x 107 pfu/mL. SA11 רקומביננטי וירוסים שנוצרו על ידי גנטיקה הפוכה באמצעות שונה pT7/NSP3SA11 פלמיטידים ביטוי FPs (למשל, rSA11/NSP3-2a-3xfl-unag) לגדול כדי מגדל כי הם ~ 4 קיפול פחות מ rSA11/wt.
בעקבות הפרוטוקול גנטיקה הפוכה, יצרנו וירוסים רקומביננטי SA11 שזוהו בקלות על ידי שיטת הפלאק על התאים MA104, ובכך לאפשר בידוד פלאק (איור 3D). וירוסים בפלאק נלקחו עם העברת הרבה טיפ חד פעמי pipet ו הוגדל על MA104 תאים. Dsrna גנום של פלאק-מטוהרים rSA11/wt ו rSA11/NSP3-2a-3xfl-unag וירוסים חולצו עם guanidinium thiocyanate, נפתר על-ידי אלקטרופורזה על 10% פוליאקרילאמיד ג'ל, וזיהה על ידי כתמים עם אתידיום ברומיד (איור 3xfl). כצפוי, קטע 7 (NSP3) dsRNA של rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG הועברו הרבה יותר לאט מאשר זה של rSA11/wt (איור 3Xfl) בשל נוכחותם של 2A-3Xfl-unag רצפים. קטע 7 (NSP3) dsRNA של rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG היה ג'ל מטוהרים, המרה ל-cDNA טופס על ידי RT-PCR, וברצף כדי לאשר דיוק.
כדי לבדוק אם הביטוי של חלבון פלורסנט UnaG, MA104 תאים ב 6-טוב צלחות נדבקו 3 PFU לכל תא של rSA11/wt ו rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. ב 8 הפוסט h זיהום, בינוני התרבות בצלחות הוחלפו עם 0.5 mL של DMEM עם הזריחה ברקע נמוך לבין לוחות מודלוניים עבור 30 דקות נוספות ב 37 ° c בחממה CO2 . לאחר מכן, הצלחות נבדקו עבור ביטוי UnaG באמצעות האנג'ר תא חי. הניתוח הראה כי rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG הפיק פלואורסצנטית ירוק, אימות הפונקציונליות של הגן UnaG בווירוס רקומביננטי (איור 3Xfl). לעומת זאת, זריחה ירוקה לא זוהתה בתאים נגועים rSA11/wt. כדי להתייחס אם האלמנט השני בקטע שהשתנה 7 של rSA11/NSP3-2AxFL-UnaG קידם את הביטוי של שני חלבונים נפרדים (NSP3-2A ו-3xFL-UnaG), תאים MA104 נדבקו rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG ו rSA11/wt. תאים lysates היו מוכנים תאים שנקטפו ב 8 הפוסט h זיהום, נפתרה על ידי ג'ל אלקטרופורזה, ו מחק על המסננים ניטרוצלולוזה. הגושים היו בנחקר עם נוגדנים ספציפיים עבור רוטוירוס VP6 ו NSP3, ואת דגל תג. הניתוח הראה כי NSP3-2A ו-3xFL-UnaG הביעו חלבונים נפרדים בתאים נגועים rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG, המציין כי אלמנט 2A היה פונקציונלי (איור 3Xfl). תאים נגועים rSA11/wt לא הביע חלבון מזוהה על ידי נוגדן נגד דגל. חלבון NSP3 הנוכחי rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG תאים נגועים על ידי אנטי NSP3 נוגדן הועברו מעט לאט יותר מאשר NSP3 הנוכחי rSA11/wt נגועים בתאים בשל נוכחותם של שארית 2A שאריות ב C-הטרמינוס של NSP3.
איור 1: מפעלי הגנטיקה הפוכה של Rotavirus. (א) cdnas באורך מלא של 11 SA11 רוטוירוס ירוס מגזרים הגנום ממוקמים בתוך pT7 פלמידים, ליגנט במעלה עם מיזם עבור T7 RNA פולימראז ו במורד הזרם עם ה-HDV ribozyme. בנוכחות T7 RNA פולימראז, רוטוירוס pT7 פלמידים לייצר SA11 באורך מלא (+) rnas עם אותנטי 5 ' ו 3 ' termini. (ב) תרשימים של (+) RNA ומוצרי חלבון שבוצעו על-ידי PT7/NSP3-2A-3Xfl-unag פלמיד. הסכמטי כולל את הרצף NSP3 cdna, ורצפים של האלמנט השני (2a) של חזירי וירוס (2 א), תג 3x דגל (FL), ואת חלבון פלורסנט ירוק unag. המיקום של האתר השני להפעלה מחדש של עצירת העברה מסומן בחץ אדום. בשל הפעילות של אלמנט 2A, התרגום של ה-RNA מייצר שני חלבונים. החלק NSP3 מכיל שרידים של הרכיב 2A והחלק של UnaG מותך לתג הדגל של 3x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מערכת הגנטיקה הפוכה Rotavirus. BHK-T7 monolayers הם מצוידים עם 11 pT7 פלמידים, כל אחד מביע SA11 שונים (+) RNA, ו וקטור pCMV מביע וירוס קדחת החזירים האפריקאי (ASFV) NP868R סגירה אנזים (pCMV/NP868R). במהלך 3 ימים זיהום לאחר (d.p.i.), התאים BHK-T7 הם שנזרע עם MA104 תאים. ב 7 ימים לאחר הזיהום, רקומביננטי rotaviruses ב BHK-T7/MA104 cell ליטים הם מוגברת על ידי מעבר על תאים MA104, ולאחר מכן מבודדים על ידי טיהור פלאק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מאפייני רקומביננטי זנים rSA11/wt ו rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. (A) הפרופילים אלקטרופזיים של מקטעי הגנום dsRNA של הפלאק-מבודדים rSA11 זנים. 11 מגזרי הגנום ממוספרים ואת המשמרת במיקום של קטע 7 (NSP3) מצוין עם קו אדום. (ב) הקרינה הפלואורסצנטית זוהה ב rSA11-נגועים MA104 תאים ב 8 הפוסט h זיהום באמצעות הודעה תא חי (20x הגדלה) להגדיר בערוץ גילוי ירוק. סרגל קנה מידה = 100 μm. (C) כתמי חיסוני ניתוח של חלבונים הנוכחים ב 8 הפוסט h זיהום בתאי MA104 נגוע rSA11 זנים באמצעות חזיר גינאה anti-VP6 ו anti-NSP3 קטריולוגיה ועכבר נגד הדגל מונושבטיים נוגדן. (ד) שלטים המיוצרים על ידי rSA11/WT על MA104 תאים ב 3 ימים לאחר הזיהום מזוהה על ידי כתמים אדומים ניטרליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במעבדה שלנו, אנו סומכים באופן שגרתי על הפרוטוקול גנטיקה הפוכה המתוארת בזאת כדי לייצר רקומביננטי SA11 rotaviruses. עם גישה זו, אנשים עם ניסיון קטן בטכניקות ביולוגיה מולקולרית או עבודה עם rotaviruses לשחזר וירוסים רקומביננטי גם בניסיון הראשון שלהם. יצרנו קרוב 100 וירוסים רקומביננטי בעקבות פרוטוקול זה, כולל אלה עם גנום שעברו הנדסה מחדש כדי לבטא חלבונים זרים (למשל, FPs) וזה מכיל התוספות רצף, מחיקות, ומוטציות נקודה.
התנאים וזמני הדגירה שניתנו בפרוטוקול זה חלים על ההתאוששות של זנים הגדלים היטב של וירוסים רקומביננטי. התאמות צריך להיחשב אם מנסה לשחזר וירוסים SA11 כי, עקב שינוי גנטי, עשוי להיות צפוי לצמוח גרוע. בפרט, בגלל סיכוייו של וירוסים כגון ב-bhk-T7/MA014 cell לlysates עשוי להיות נמוך, אנחנו בדרך כלל כפול כמות של ליפוסט בשימוש בעקבות שלבי הגברה. יתר על כן, בשלב הגברה, וירוסים הגוברת גרוע עשוי לדרוש פעמים ארוכות יותר של דגירה לפני שהגיע רמות של CPE מספיק עבור קצירת תאים. אכן, עם וירוסים כאלה, אנו עשויים לאפשר לזיהומים להמשיך במשך 10-14 ימים, או אפילו יותר, לפני איסוף תאים. לבסוף, וירוסים הגוברת לקוי צפויים לייצר קטן, שלטים הגדלים לאט על MA104 תאים. לכן, כדי לבודד וירוסים אלה, ייתכן שיהיה צורך לאפשר לוחיות להתפתח עד 6-10 ימים לאחר זיהום לפני צביעת תאים עם הפלאק אדום נייטרלי ולקטוף.
בניסיון שלנו, הגורם החשוב ביותר בהתאוששות אמין של רקומביננטי רוטוירוס הוא השימוש בריא, מתוחזק היטב, bhk-T7 תאים. במעבדה שלנו, אנחנו בדרך כלל מעבר BHK-T7 תאים 2x בשבוע בדילול אותו באמצעות בינוני בתוספת לא רק עם 10% FBS, אבל גם עם NEAA, TPB, ורמות גבוהות של גלוקוז (GMEM בינוני מלא). תוספות נוספות לסייע BHK-T7 תאים לשמור על הכדאיות המורחבת בעקבות הזיהום הפלמיד, מקדם סביר להניח חיוני לשחזור וירוסים מוטציה הגוברת רקומביננטי. אנו משלימים את המדיום כל מעבר אחר עם G418, אנטיביוטיקה אשר בוחרת לתחזוקה של הביטוי T7 פולימראז פלמיד. תנאי מעבר צריך להיות כזה BHK-T7 תאים לעולם אינם מורשים לצמוח בעבר בשטף, התנאים כי במהירות להוביל הכדאיות התא ירד. בשבילנו, BHK-T7 תאים אשר הורשו לגדול יתר על המידה בפרוטוקול גנטיקה הפוכה, גם אם התאים מופיעים לאחר מכן מספר פעמים מרובות. במקום לנסות לשקם בתאי BHK-T7 מגודלים, אנו מחדש את שושלת היוחסין עם תאים שאוחסנו בעבר בחנקן נוזלי.
זיהום mycoplasma של bhk-T7 ו MA104 תאים יכול להיות גורם מרכזי בכישלון של המערכת גנטיקה הפוכה רוטוירוס להפקת וירוס רקומביננטי. במעבדה שלנו, אנו משתמשים בערכה המבוססת על ה-PCR מבוססי mycoplasma (טבלת חומרים) כדי לבדוק זיהום של קווי תאים, וכאשר זוהה, הוא משויך לרוב עם bhk-T7 תאים שלנו. לא ניסינו לרפא קווי תאים של מזהם mycoplasma, במקום לבסס מחדש את הקווים עם מוקדם יותר mycoplasma-מקטעים חינם המאוחסנים חנקן נוזלי. לפני תחילת קווי הסלולר החדשים, אנו מתעלם מכל התוספות המדיום והמדיום ששימשו בעבר ומטהרים אינקובטורים, ארונות בטיחות ביולוגיים, אמבטיות מים, ספסלי מעבדה ופיפטורים. אנחנו גם משתמשים בערכות זיהוי mycoplasma כדי לבדוק מניות של וירוסים רקומביננטי לזיהום. בגלל ההתנגדות של חלקיקים רוטוירוס כדי דנטורציה על ידי ממיסים אורגניים, כגון vertrel vf32, אפשר חינם וירוס מניות מזהם mycoplasma, שלילת הצורך להתחדש וירוסים רקומביננטי ידי הפוכה גנטיקה. חשוב להדגיש כי קווי התא וההכנות וירוס שהתקבלו למעבדה צריך להיבדק עבור זיהום mycoplasma לפני שימוש שגרתי.
למרות היום והיום החוצה, אנו משתמשים באותו פרוטוקול כדי ליצור וירוסים רקומביננטי, אנו יודעים כי שינויים מסוימים ניתן לעשות אשר לא למנוע שחזור וירוסים. לדוגמה, (i) שיתוף הקשר של הסגירה pCMV/NSP868R-אנזים האנזימים עם SA11 pT7 וקטורים אינו נדרש להתאוששות של רקומביננטי וירוסים. בעוד התוספת של הסגירה באמצע תשואות וירוסים גבוה יותר מגדל ב-bhk-T7/MA104 cell lysates, הצלחנו לשחזר וירוסים רבים, כולל אלה ביטוי FPs, בלעדיו. עם זאת, הגענו למסקנה כי הביטוי של האנזים הסגירה על ידי pCMV/NP868R עשוי לתרום באופן משמעותי להתאוששות של וירוסים פחות בכושר. (ii) גילינו כי ניתן ליצור וירוסים רקומביננטי גם אם כמות החומר המופק מגיב (טבלת חומרים) המשמש בפרוטוקול גנטיקה הפוכה מופחת על ידי חצי, שינוי שיכול להפחית באופן משמעותי את ההוצאות. (3) באופן דומה, קבענו כי M199 השלם בינוני ניתן להשתמש במקום DMEM דיום להשלים. (iv) לבסוף, אין דרישה להגדיר בנוגע לסוג של השדרה הווקטורית כי יש להשתמש בהפקת SA11 T7 שעתוק וקטורים. כל עוד cDNA ויראלי בתוך הפלבאמצע הוא מוקף היזם T7 במעלה ו-HDV המטה הריבוזים ו T7 שליחות קטלנית, הפלמיד יכול להיות צפוי לתמוך התאוששות של רקומביננטי וירוס. בעיקר, pGEM-, pBluescript, ו pUC מבוססי וקטורים שימשו בהצלחה במערכת הגנטיקה הפוכה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענקים R03 AI131072 ו R21 AI144881, מימון הסטארט-Up של אוניברסיטת אינדיאנה, ואת קרן לורנס M.. אנו מודים לחברי מעבדת הרנטגן של המעבדה, אולריך דסלברגר, וגואידו פאפא בגין תרומותיהם הרבות והצעותיהם בפיתוח פרוטוקול הגנטיקה הפוכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
References
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- International Committee on Taxonomy of Viruses. Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release. , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019).
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, Suppl 2 96-105 (2016).
- Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
- Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
- McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
- Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
- Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
- Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
- Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
- Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
- Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
- Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
- Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
- Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
- Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
- Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
- Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
- Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
- Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
- Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
- Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
- Donnelly, M. L., et al. The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
- Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , HHS publication no. CDC 21-1112 (2009).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
- Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).
