Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Forenklet omvendt genetikk metode for å gjenopprette rekombinant rotavirus uttrykke reporter proteiner

Published: April 17, 2020 doi: 10.3791/61039
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Indiana University

Summary

Generering av rekombinant rotavirus fra plasmid DNA gir et viktig verktøy for studiet av rotavirusreplikasjon og patogenese, og utvikling av rotavirusuttrykksvektorer og vaksiner. Her beskriver vi en forenklet omvendt genetikk tilnærming for å generere rekombinant rotavirus, inkludert stammer som uttrykker fluorescerende reporter proteiner.

Abstract

Rotavirus er en stor og utviklende populasjon av segmenterte dobbeltstrandede RNA-virus som forårsaker alvorlig gastroenteritt hos unge av mange pattedyr og fugleiske vertsarter, inkludert mennesker. Med den nylige advent av rotavirus omvendt genetikk systemer, Det har blitt mulig å bruke rettet mutagenesis å utforske rotavirus biologi, endre og optimalisere eksisterende rotavirus vaksiner, og utvikle rotavirus multitarget vaksine vektorer. I denne rapporten beskriver vi et forenklet omvendt genetikksystem som gjør det mulig å effektiv og pålitelig gjenoppretting av rekombinant rotavirus. Systemet er basert på kotransfection av T7 transkripsjon vektorer uttrykker full lengde rotavirus (+)RNAs og en CMV vektor koding en RNA capping enzym i BHK celler konstitutivt produsere T7 RNA polymerase (BHK-T7). Rekombinant rotavirus forsterkes ved å overvåke de transinfiserte BHK-T7-cellene med MA104-celler, en apenyrecellelinje som er svært tillatt for virusvekst. I denne rapporten beskriver vi også en tilnærming for å generere rekombinant rotavirus som uttrykker et eget fluorescerende reporterprotein gjennom innføringen av et 2A translasjonell stop-restart-element i genomsegment 7 (NSP3). Denne tilnærmingen unngår å slette eller modifisere noen av de virale åpne leserammene, slik at produksjonen av rekombinant rotavirus som beholder fullt funksjonelle virale proteiner samtidig som de uttrykker et fluorescerende protein.

Introduction

Rotavirus er hovedårsakene til alvorlig gastroenteritt hos spedbarn og små barn, samt de unge av mange andre pattedyr og fuglearter1. Som medlemmer av Reoviridae-familien har rotavirus et segmentert dobbeltstrandet RNA (dsRNA) genom. Genomsegmentene finnes i en ikke-omsluttet icosahedral virion dannet av tre konsentriske lag av protein2. Basert på sekvensering og fylogenetisk analyse av genomsegmentene, er ni arter av rotavirus (A−D, F-J) definert3. Disse stammene bestående av rotavirus arter A er ansvarlig for det store flertallet av menneskelig sykdom4. Innføringen av rotavirusvaksiner i barnevaksinasjonsprogrammer som begynner i det siste tiåret, er korrelert med betydelige reduksjoner i rotavirusdødelighet og sykelighet. Spesielt har antall rotavirus-tilknyttede barnedødsfall gått ned fra ca. 528 000 i 2000 til 128 500 i 20164,5. Rotavirusvaksiner er formulert fra levende attenuerte stammer av viruset, med 2 til 3 doser administrert til barn med 6 måneders alder. Det store antallet genetisk varierte rotavirusstammer som sirkulerer hos mennesker og andre pattedyrarter, kombinert med deres evne til raskt å utvikle seg gjennom mutagenesis og reassortment, kan føre til antigene endringer i typer rotavirus som smitter barn6,7,8. Slike endringer kan undergrave effekten av eksisterende vaksiner, som krever erstatning eller modifikasjon.

Utviklingen av fullt plasmidbaserte revers genetikk systemer slik at manipulering av noen av de 11 rotavirus genom segmenter ble bare nylig oppnådd9. Med tilgjengeligheten av disse systemene har det blitt mulig å avdekke molekylære detaljer om rotavirusreplikasjon og patogenese, for å utvikle forbedrede screeningmetoder for høy gjennomstrømning for antirotavirusforbindelser, og for å skape nye potensielt mer effektive klasser av rotavirusvaksiner. Under rotavirus replikering, avkortet viral (+)RNAs ikke bare veilede syntesen av virale proteiner, men også tjene som maler for syntese av avkom dsRNA genom segmenter10,11. Alle rotavirus omvendt genetikk systemer beskrevet til dags dato stole på transfection av T7 transkripsjon vektorer i pattedyr celle linjer som en kilde til cDNA-avledet (+)RNAs brukes i å gjenopprette rekombinant virus9,12,13. Innenfor transkripsjonsvektorene er virale cDNAer i full lengde plassert mellom en oppstrøms T7-promoter og nedstrøms hepatitt deltavirus (HDV) ribozyme slik at virale (+)RNAer syntetiseres av T7 RNA polymerase som inneholder autentisk 5' og 3'-termini (figur 1A). I første generasjons omvendt genetikk system, rekombinant virus ble gjort ved å transfecting baby hamster nyreceller uttrykker T7 RNA polymerase (BHK-T7) med 11 T7 (pT7) transkripsjon vektorer, hver reketisering av en unik (+)RNA av simian SA11 virus stamme, og tre CMV promotor-stasjonen uttrykk plasmids, en koding avian reovirus p10FAST fusjon protein og to koding underenheter av vaccinia virus D1R-D12L capping enzym kompleks9. Rekombinant SA11 virus generert i transfected BHK-T7 celler ble forsterket ved å overvåke med MA104 celler, en cellelinje tillatt for rotavirus vekst. En modifisert versjon av første generasjons omvendt genetikk system har blitt beskrevet som ikke lenger bruker støtte plasmids12. I stedet genererer det modifiserte systemet rekombinant rotavirus ganske enkelt ved å transfecting BHK-T7 celler med 11 SA11 T7 transkripsjon vektorer, med forbehold om at vektorer for viral fabrikken (viroplasm) byggeblokker (ikke-strukturelle proteiner NSP2 og NSP5) legges til på nivåer 3 ganger høyere enn de andre vektorer14,15. Modifiserte versjoner av det omvendte genetikksystemet er også utviklet som støtter utvinning av den menneskelige KU og Odelia stammer av rotavirus16,17. Rotavirusgenomet er bemerkelsesverdig mottagelig for manipulering av omvendt genetikk, med rekombinantvirus generert til dags dato med mutasjoner introdusert i VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, og NSP522,23. Blant de mest nyttige virusgenerert så langt er de som har blitt utviklet for å uttrykke fluorescerende reporter proteiner (FPs)9,12,21,24,25.

I denne publikasjonen gir vi protokollen for det omvendte genetikksystemet som vi bruker i laboratoriet vårt for å generere rekombinante stammer av SA11 rotavirus. Nøkkelfunksjonen i vår protokoll er co-transfection av BHK-T7 celler med 11 pT7 transkripsjon vektorer (modifisert til å inkludere 3x nivåer av pT7/NSP2SA11 og pT7/NSP5SA11 vektorer) og en CMV uttrykk vektor koding afrikanske svinefeber virus (ASFV) NP868R capping enzym21 (Figur 2). I våre hender fører tilstedeværelsen av NP868R plasmid til produksjon av høyere titers av rekombinantvirus av transinfiserte BHK-T7-celler. I denne publikasjonen gir vi også en protokoll for endring av pT7/NSP3SA11 plasmid slik at rekombinantvirus kan genereres som ikke bare uttrykker segment 7 proteinproduktet NSP3, men også en egen FP. Dette oppnås ved å re-engineering NSP3 åpen avlesningramme (ORF) i pT7/NSP3SA11 plasmid å inneholde en nedstrøms 2A translational stop-restart element etterfulgt av en FP ORF (Figur 1B)24,26. Gjennom denne tilnærmingen har vi generert rekombinant rotavirus som uttrykker ulike FPs: UnaG (grønn), mKate (langt rød), mRuby (rød), TagBFP (blå), CFP (cyan) og YFP (gul)24,27,28. Disse FP-uttrykkende rotavirusene er laget uten å slette NSP3 ORF, og dermed gi virus som forventes å kode et komplett komplement av fungerende virusproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vedlikehold av medieforberedelse og cellekultur

  1. Få baby hamster nyreceller konstitutivt uttrykker T7 RNA polymerase (BHK-T7) og afrikanske grønne ape nyre MA104 celler.
    MERK: BHK-T7 (eller BSR-T7) celler er ikke kommersielt tilgjengelige, men er en vanlig cellelinje av laboratorier som bruker omvendt genetikk for å studere RNA-virusbiologi. BHK-T7 cellelinjen som brukes i denne protokollen ble hentet fra Dr. Ursula J. Buchholz (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), en medutvikler av den opprinnelige BHK cellelinje uttrykker T7 RNA polymerase29. MA104-celler er tilgjengelige fra European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) og American Type Culture Collection (ATCC).
  2. Forbered følgende kulturmedier i et sterilt miljø, helst et biologisk sikkerhetsskap i klasse II. Oppbevar utskriftsmaterialet i mørket ved 4 °C og varm til 37 °C umiddelbart før bruk.
    MERK: Kilder til mediekomponenter er gitt i materialtabellen.
    1. For å forberede DMEM ufullstendig medium, kombinere 500 ml Dulbeccos modifiserte Eagle's minimum essensielle medium (MEM) som inneholder 4,5 g / L glukose og 1% glutamin med 5 ml 100x penn-strep.
    2. For å forberede DMEM komplett medium, kombinere 500 ml DMEM ufullstendig medium med 25 ml føtal storfe serum (FBS).
    3. For å forberede GMEM ufullstendig medium, kombinere 500 ml Glasgow minimum viktig medium, 5 ml 100x glutamin, 50 ml tryptose-fosfat kjøttkraft (TPB), 5 ml 100x ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), og 5 ml 100x penn-strep.
    4. For å forberede GMEM komplett medium, kombinere 500 ml GMEM ufullstendig medium med 25 ml varmeinaktivert FBS.
    5. For å forberede GMEM + G komplett medium, legg til 10 ml 50 mg / ml geneticin (G418) til 500 ml GMEM komplett medium.
    6. For å forberede SMEM ufullstendig medium, kombinere 500 ml joklik modifisert Eagle's MEM, 5 ml 100x glutamin, 50 ml TPB, 5 ml 100x NEAA, og 5 ml 100x penn-strep.
  3. Kultur MA104 celler i T75 eller T175 kolber som inneholder 12 eller 25 ml DMEM komplett medium, henholdsvis. For å passere MA104 celler som har nådd 100% samløpet, skyll cellen monolayer 2x med fosfat-bufret saltvann (PBS), dissosiat med trypsin (0,05%)-EDTA (0,1%) oppløsning, og resuspend i 5 (T75 kolbe) eller 10 ml (T175 kolbe) av DMEM ufullstendig medium.
    1. Plasser 0,5–1,0 ml resuspenderte celler i ferske flasker og ta med riktig sluttvolum ved å legge til DMEM komplett medium. Plasser flasker i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
  4. Forplante BHK-T7 celler i T75 kolber, vekslende mellom bruk av GMEM og GMEM + G komplett medium med hver runde av passasjen. Til subkultur BHK-T7 celler som har nådd 100% samløpet, skyll cellen monolayer 2x med PBS, dissosiere med trypsin-EDTA løsning, og resuspend i 5 ml medium.
    1. Etter å ha plassert 15 ml GEM eller GMEM + G komplett medium i en frisk T75 kolbe, legg til fire dråper resuspended BHK-T7 celler. Plasser kolbe i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.

2. Plasmid forberedelse

  1. Få følgende plasmider som uttrykker rotavirus SA11 (+)RNAs fra Addgene: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11 og pT7/NSP5SA11. Få plasmid uttrykke ASFV capping enzymet (pCMV/NP868R) fra forfatterne21.
    MERK: Modifisert pT7/NSP3SA11 plasmider konstruert for å uttrykke en FP gjennom aktiviteten til et 2A translasjonell element (pT7/NSP3-2A-3xFL-FP) kan også hentes fra forfatterne24,26. pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plasmids som uttrykker følgende FP-er er tilgjengelige: UnaG (grønn), mKate (fjernrød), mRuby (rød), TagBFP (blå), CFP (cyan) og YFP (gul)24.
  2. Forvandle plasmids til kompetent E. coli (andre er i DH5α og spre bakterier på Luria buljong agar plater som inneholder riktig antibiotika. Vokse bakterielle kulturer plukket fra individuelle kolonier og forberede mindre mengder plasmid (20 μg) ved hjelp av en spin miniprep rensing kit (Table of Materials), i henhold til produsentens instruksjoner. Forbered større mengder plasmid fra bakterielle kulturer ved hjelp av midi og maxi rensesett (Table of Materials).
    MERK: Plasmids egnet for bruk i det omvendte genetikksystemet er også utarbeidet med andre plasmid rensesett. Det er ikke nødvendig å forberede plasmids ved hjelp av kits spesielt designet for å generere endotoksinfritt materiale.
  3. Juster konsentrasjonene av rensede plasmider til 1 mg/ml i kjernefri molekylærbiologigrader. Kontroller plasmid renhet ved å bekrefte et 260/280 absorbansforhold på ~ 1,8 ved hjelp av et spektrotometer. Bruk også elektroforese på 0,8% agarose geler for å bekrefte at plasmider hovedsakelig er supercoiled.
  4. Aliquot renset plasmids i 0,5 ml sterile mikrocentrifuge rør, hver inneholder 10 μL. Lagre plasmids ved -80 °C.

3. Generasjon av rekombinant virus

MERK: Forskning på humant og dyr rotavirus, inkludert generering og karakterisering av rekombinant rotavirusstammer, må håndteres under biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) og vil kreve forhåndsgodkjenning av Institutional Biosafety Committee (IBC). Passende BSL-2 laboratorieforhold er beskrevet i Biosafety i mikrobiologiske og biomedisinske laboratorier (BMBL) produsert av Centers for Disease Control and Prevention (CDC)30.

  1. Dag 1: seeding av BHK-T7 celler i 12-brønnplater
    1. Skyll en nysammensløpsmonolayer av BHK-T7-celler som finnes i en T75 kolbe 2x med PBS. Forstyrre cellemonolayer med trypsin-EDTA løsning og resuspendcellene i 5 ml GMEM komplett medium.
    2. Bruk en automatisert celleteller og trypan-blå løsning for å bestemme konsentrasjonen av levedyktige BHK-T7-celler i mediet. Frøceller i 12-brønncellekulturplater, med hver brønn som inneholder 2 x 105 celler i et totalt volum på 1 ml GMEM (G418-fritt) komplett medium. Inkuber i en 37 °C, 5% CO2 inkubator. Cellene skal nå 80−90% samløpet etter dag 2.
  2. Dag 2: transfection av BHK-T7 celler med plasmid blandinger
    1. For å forberede plasmidblandingen, kombiner følgende i et 0,5 ml mikrosentrifugerør ved hjelp av plasmidbestander justert til 1 mg/ml: 0,8 μL hver av SA11 pT7 plasmids VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 og NSP4, 2,4 μL hver av SA11 pT7 plasmids NSP2 og NSP5, og 0,8 μL pCMV/NP868R. Bland forsiktig plasmider ved å trykke på røret og samle innholdet ved pulssentrifugering. For å forberede rekombinantvirus som uttrykker FPs, erstatt pT7/NSP3SA11 med riktig pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plasmid.
      MERK: Plasmidblandinger skal oppbevares på is til de brukes. Et separat rør bør tilberedes for hver transfection.
    2. For å forberede plasmid/redusert serummedium/transfection reagensblanding: Tilsett 110 μL førwarmed (37 °C) redusert serummedium (Materialbord) til hver plasmidblanding og bland ved å forsiktig pipetting opp og ned. Etterpå tilsett 32 μL transfection reagens (Materialtabellen) til hver plasmid/redusert serummedium blanding; Dette gir en konsentrasjon på 2,5 μL transfection reagens per μg plasmid i blandinger. Vortex blandinger forsiktig og inkuberved romtemperatur i 20 min.
    3. I løpet av 20 min inkubasjonsperioden, skyll BHK-T7 celler i 12-brønnplater (tilberedt på dag 1) en gang med 2 ml GMEM ufullstendige medier. Etterpå legger du til 1 ml SMEM ufullstendig medium til hver brønn og returnerer plater til inkubatoren.
    4. Etter 20 min inkubasjonsperioden, tilsett plasmid /redusert serummedium/transfection blanding drop-by-drop til hver brønn av 12-brønnplater ved hjelp av en 200 μL pipettor. Steinplater og gå tilbake til en 37 °C, 5 % CO2 inkubator.
  3. Dag 4: overvåke transinfiserte BHK-T7-celler med MA104-celler
    1. Skyll en nysammensløpsmonolayer av MA104 celler som finnes i en T75 kolbe 2x med PBS. Forstyrre monolayer ved hjelp av trypsin-EDTA løsning og resuspendceller i 5 ml DMEM komplett medium.
    2. Ved hjelp av en automatisert celleteller og trypan-blå løsning, bestem konsentrasjonen av levedyktige MA104-celler i mediet. Juster konsentrasjonen til 8 x 105 MA104 celler/ml i DMEM ufullstendig medium og tilsett 0,25 ml suspenderte celler (2 x 105 celler) dropwise til brønnene som inneholder transfected BHK-T7 celler.
    3. Juster konsentrasjonen av trypsin (svinepankreastype IX) i mediet til ~ 0,5 μg/ml ved å tilsette 0,8 μL av 1 mg/ml trypsinlager til hver brønn.
      MERK: Trypsin aksjer bør fremstilles i PBS, aliquoted, og lagres på -20 °C.
    4. Bruk de resterende MA104-cellene til å forberede 6-brønnplater som vil være nødvendig på dag 7 for å forsterke rekombinantvirus. For å frø 6-brønnplater, fortynn resuspenderte MA104-celler til en konsentrasjon på 1,5 x 105 celler / ml i DMEM komplett medium og plasser 2 ml i hver brønn. Legg plater i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
  4. Dag 7: gjenoppretting og forsterkning av rekombinantvirus fra transinfiserte celler
    1. Subjekt BHK-T7/MA104 celler i 12-brønnplater til tre sykluser med fryse-tine under sterile forhold, bevegelige plater mellom -20 °C fryser og en romtemperaturoverflate. Etter overføring av lysates til 1,5 ml rør, sentrifugerør i 10 min ved 500 x g (4 °C) til pellet store cellulære rusk. Samle supernatant og lagre ved 4 °C (kort sikt) eller -20 °C (lang sikt).
    2. Vask MA104 monolag i 6-brønnplater (tilberedt på dag 4) 2x med PBS. Plasser 2 ml DMEM ufullstendig medium til hver brønn som inneholder 0,5 μg/ml trypsin. Tilsett 300 μL supernatant utvinnes fra BHK-T7/MA104 celle lysates i brønner og plasser plater i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
    3. Inkuber plater i 7 dager eller til fullstendige cytopatiske effekter (CPE) observeres. Lyse MA104 celler i 6-brønnplater med tre sykluser med fryse-tine, deretter overføre lysates til 1,5 ml mikrocentrifuge rør. Pellet store cellulære rusk ved sentrifugering i 10 min ved 500 x g (4 °C). Overfør de avklarede cellelysatene til 1,5 ml mikrocentrifugerør og oppbevar esi kl.

4. Plakkisolering av rekombinantvirus

  1. Aktiver virus i 100 μL av avklart celle lysates ved å legge trypsin til en endelig konsentrasjon på 10 μg / ml og inkubere ved 37 ° C i 1 h. Forbered en 10-fold serie fortynning fra 10-1 til 10-7 (1 ml hver) i DMEM ufullstendig medium.
  2. Skyll MA104 monolag i 6-brønnplater 2x med 2 ml PBS og én gang med DMEM ufullstendig medium. Tilsett 400 ml lysatefortynninger i duplikat til platene. Inkuber platene i 1 time i en 37 °C, 5% CO2 inkubator, gynge hver 10-15 min for å omfordele fortynninger over monolayer.
  3. Forbered en agarose-MEM-overleggsløsning ved å kombinere like volumer av 2x Eagles minimale essensielle medium (EMEM; førvarmet til 37 °C) med 1,5 % agarose som har blitt smeltet i vann ved hjelp av en mikrobølgeovn og forhåndskjølt til 45 °C. Vedlikehold overleggsoppløsningen ved 42 °C ved hjelp av et vannbad og juster til en endelig konsentrasjon på 0,5 μg/ml trypsin umiddelbart før du plasserer på celler.
  4. Trekk av lysate fortynninger fra 6-brønnplater, skyll deretter celler en gang med 2 ml ufullstendig DMEM. Overlegg forsiktig 3 ml agarose-MEM overleggsløsning på cellemonolaget som finnes i hver brønn. La agaroseoverlegget herdes ved romtemperatur, og returner deretter platene til inkubatoren.
  5. Tre dager senere, forberede en agarose-MEM overlegg løsning som i trinn 4.3 og bringe til 42 °C. Umiddelbart før bruk justerer du overleggeoppløsningen til en endelig konsentrasjon på 50 μg/ml nøytral rød (Materialtabell).
  6. Tilsett 2 ml overleggsløsning på toppen av det eksisterende agaroselaget i de 6-brønnplatene. Etter å ha tillatt det nye agaroselaget å herde, returner plater til inkubatoren. Beskytt løsninger og plater som inneholder nøytral rød mot lyseksponering.
  7. I løpet av de neste 6 t, identifisere rotavirus plakk i 6-brønnplater ved hjelp av en lysboks. Velg klart definerte plakk ved hjelp av engangsoverføringsrør, gjenopprette agarose plugger som strekker seg fullt ut til cellelaget.
  8. Utvis pluggen i et 1,5 ml rør som inneholder 0,5 ml DMEM ufullstendig medium og vortex prøven i 30 s. Forsterke det plakkisolerte viruset som er eluted inn i mediet ved forplantning på MA104 monolag i 6-brønnplater eller T25 kolber som inneholder DMEM ufullstendig medium og 0,5 μg/ml trypsin.
    MERK: Ytterligere informasjon om isolasjon og titering av rotavirus med plakkanalyse er tilgjengelig i Arnold et al.31.

5. Gel elektroforese av viral dsRNA

  1. Plasser 600 μL av avklart infiserte cellelysater og 400 μL guanidiniumtiocyanat i 1,5 ml mikrocentrifugerør, vortex i 30 s og inkuber ved romtemperatur i 5 min. Tilsett 200 μL kloroform, vortex i 30 s og inkuber i 3 min. Etter sentrifuging i 5 min ved 13 000 x g (4 °C), overføre ~550 μL av den øvre vandige fasen i friske rør.
  2. Gjenopprett viral dsRNA fra vandig fase ved å legge til 2 volumer (~ 900 μL) kald isopropylalkohol og inverterende rør 4-6x. Etter inkubering ved romtemperatur i 10 min, sentrifugerør i 10 min ved 13 000 x g . Kast supernativa og behold RNA-pellets.
  3. Vask pellets ved å tilsette 1 ml 75% etanol til røret, invertere en gang, og sentrifuging i 5 min ved 7500 x g (4 °C). Etter å ha fjernet etanolvasken forsiktig med en pipettor, la RNA-pellets lufttørke på laboratoriebenken i 5–10 min. Løs opp RNA-pellets i 15 μL n av kjernevann i stofffri molekylærbiologi og oppbevar ved -20 °C.
  4. Kombiner 10 μL oppløste RNA-prøver med 2 μL 6x DNA-lastebuffer, last på precast 10% polyakrylamid minigeler (eller håndstøpte ekvivalenter), og løs RNAs ved elektroforese i Tris-glycine løpebuffer i 2 timer under konstant strøm (16 mA). Bløtlegg geler i 5–10 min i vann som inneholder ~1 μg/ml ethidiumbromid og påvis rotavirusgenomsegmenter med en UV-transilluminator.

6. Gjenoppretting og sekvensering av viral dsRNA

  1. Finn virale dsRNA-bånd på polyakrylamidgeler fortrinnsvis ved hjelp av lavintensitets langbølgelengde UV-lys, for å unngå å generere nukleinsyrekrysskoblinger. Bruk et friskt barberblad, kutt ut gelfragmenter som inneholder dsRNA-bånd og overføres til 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  2. Etter å ha tilsett 10-20 μL RNase-fritt vann, knus hvert fragment med en RNase-fri engangspelletpestle designet for å passe et 1,5 ml mikrosentrifugerør eller ved å tegne opp og ned gjennom en 18 G nål. Inkuber knuste fragmenter over natten ved 4 °C.
  3. Gjenopprett 3 μL væske fra rør som inneholder knuste gelfragmenter. Generer cDNAs av viral dsRNAs ved hjelp av en ett-trinns omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) kit (Materialtabell) og passende oligonucleotide primers.
    MERK: PCR-produkter er gel-renset med en PCR opprydding kit(Table of Materials) og sendt ut for overnatting sekvensering, sammen med primere, av kommersielle DNA sekvenstjenester.

7. Immunoblot analyse av virale proteiner

  1. Frø 6-brønnplater med 3 x 105 MA104-celler per brønn i et totalt volum på 2 ml DMEM komplett medium. Plasser platene i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator og la det stå til cellene når samløpet (3–5 dager).
    MERK: Brønner med sammenflytende monolag inneholder ~ 1,2 x 106 celler.
  2. Behandle avklarede supernativa ved å inkubere med 10 μg/ml trypsin ved 37 °C i 1 time for å aktivere rekombinante rotaviruspartikler som finnes i dem.
  3. Skyll MA104 monolag i 6-brønnplater 2x med 2 ml PBS. Infisere celler ved å legge til, til hver brønn, 200 μL inoculum som inneholder 3-5 plakkdannende enheter (PFU) per celle av trypsin-aktivert rotavirus i DMEM ufullstendig medium. Returner plater til inkubatoren.
  4. Hver 10 min, fjern plater og forsiktig stein for å omfordele inoculum over cellen monolayer. Etter 1 t, erstatt inoculum med 2 ml DMEM ufullstendig medium.
  5. Ved 8 h post infeksjon, skyll celler i 6-brønnplater 2x med PBS. Skrap celler i 750 μL PBS og overfør volumet til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Skyll platen med ytterligere 750 μL PBS og kombiner med den forrige innsamlede 750 μL-prøven.
  6. Pelletceller i prøve ved sentrifuging ved 5000 x g i 10 min ved 4 °C. Etter å ha kastet supernatant, oppbevar cellepellets ved -80 °C til videre behandlet.
  7. Forbered cellelysisbufferen som inneholder 300 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2% Triton X-100 og 1x EDTA-fri komplett proteasehemmer. Etter å ha tilsett 300 μL lysis buffer til frosne cellepellets, kort vortex prøver og inkubere på is i 10 min.
  8. Gjenta prosessen med virvlende og inkuberende prøver på is 3x. Etterpå, sentrifuge prøver på 15.000 x g i 10 min ved 4 °C, deretter samle supernatants og lagre på -80 °C.
  9. Løs proteiner som finnes i 20 μL-volumer av supernatantprøver ved elektroforese på precast lineære 8-16% polyakrylamid minigeler og overføring til nitrocellulosemembraner. Blokker membraner ved å inkubere med PBS-Tween 20 (0,02%) oppløsning som inneholder 5% fettfri tørr melk.
  10. Probemembraner ved å inkubere med ett eller flere primære antistoffer (f.eks. marsvin anti-NSP3 eller anti-VP6 antisera, mus monoklonalt anti-flagg M2 antistoff, eller kanin monoklonal anti-PCNA antistoff). Oppdag primære antistoffer ved å inkubere membraner med hesteantimus IgG, antimarsvin IgG eller geitantikaninig pepperrot peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer, etterfulgt av forbedret chemiluminescence (ECL) pepperrot chemiluminescence substrat. Visualiser armatursignaler ved hjelp av et gelbildesystem (Table of Materials) eller røntgenfilm.

8. Live-celle avbildning av celler infisert med FP-uttrykkende virus

  1. Frø 6-brønnplater med 3 x 105 MA104-celler per brønn i totalt 2 ml DMEM komplett medium. Plasser platene i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator og la det stå til cellene når samløpet (3–5 dager).
    MERK: Brønner med sammenflytende monolag inneholder ~ 1,2 x 106 celler.
  2. Aktiver rotavirusprøver, av kjent titer, ved inkubasjon med 10 μg/ml trypsin ved 37 °C i 1 time.
  3. Skyll 6-brønnplater med MA104 monolag 2x med 2 ml PBS. Inmitter celler ved å legge til hver brønn 200 μL inoculum som inneholder 3-5 PFU per celle av trypsinaktivert rotavirus i DMEM ufullstendig medium. Returner plater til inkubatoren og forsiktig steinplater for å omfordele inoculum over cellemonolaget hvert 10.
    MERK: Brønner som er latterlig infisert med virusfri DMEM inokulat bør inkluderes som kontroller.
  4. Etter 1 t virus adsorpsjon, skyll monolayer 2x med PBS og erstatte medium med 0,5 ml per brønn av DMEM ufullstendig medium. Ved 7,5 timer etter infeksjon, erstatt kulturmedium med DMEM med lav bakgrunn fluorescens(Materialtabellen). Ved 8 h post infeksjon, bruk en levende celle imager for å undersøke celler ved 20x forstørrelse for grønn, rød eller blå fluorescens signal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den omvendte genetikkprotokollen som er beskrevet i denne artikkelen, fortsetter gjennom flere forskjellige trinn: (1) co-transfection av BHK-T7-celler med rotavirus pT7 transkripsjonsvektorer og en pCMV/NP868R-uttrykkplasmid, (2) tilsyn med transinfiserte BHK-T7-celler med MA104-celler, (3) forsterkning av rekombinantvirus som finnes i BHK-T7/MA104-celler ved hjelp av MA104-celler, og (4) plakkisolering av rekombinantvirus ved bruk av MA104-celler (Figur 2). I våre hender er protokollen effektiv, noe som gir titers av rekombinant wildtype SA11 virus (rSA11/wt) i BHK-T7/MA104 celle lysates av ~ 104 PFU / ml og i forsterket MA104 celle lysates av > 1 x 107 PFU / ml. SA11 rekombinant virus generert av omvendt genetikk ved hjelp av modifisert pT7/NSP3SA11 plasmids uttrykke FPs (f.eks rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG) vokse til titers som er ~ 4-fold mindre enn rSA11/wt.

Etter den omvendte genetikkprotokollen genererte vi rekombinant SA11-virus som lett ble identifisert av plakkanalyse på MA104-celler, og dermed tillater plakkisolasjon (figur 3D). Virus i plakk ble plukket med en lang-tip engangs overføringsrør og forsterket på MA104 celler. DsRNA-genomene til plakkrensede rSA11/wt og rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG-virus ble ekstrahert med guanidiniumtiocyanat, løst av elektroforese på en 10% polyakrylamidgel, og oppdages ved farging med ethidiumbromid (figur 3A). Som forventet migrerte segmentet 7 (NSP3) dsRNA av rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG mye langsommere enn for rSA11/wt (figur 3A) på grunn av tilstedeværelsen av 2A-3xFL-UnaG-sekvenser. Segmentet 7 (NSP3) dsRNA av rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG ble gel renset, konvertert til cDNA-form av RT-PCR, og sekvensert for å bekrefte nøyaktigheten.

For å se etter uttrykk for UnaG fluorescerende protein, ble MA104-celler i 6-brønnplater smittet med 3 PFU per celle av rSA11/wt og rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. Ved 8 h post infeksjon, kultur medium i plater ble erstattet med 0,5 ml DMEM med lav bakgrunn fluorescens per brønn og platene inkubert i ytterligere 30 min ved 37 °C i en CO2 inkubator. Etterpå ble platene undersøkt for UnaG-uttrykk ved hjelp av en levende celleimager. Analysen viste at rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG produserte grønn fluorescens, og bekreftet funksjonaliteten til UnaG-genet i rekombinantviruset (figur 3B). I motsetning ble grønn fluorescens ikke oppdaget i celler infisert med rSA11/wt. For å løse om 2A-elementet i det modifiserte segmentet 7 av rSA11/NSP3-2AxFL-UnaG fremmet uttrykket for to separate proteiner (NSP3-2A og 3xFL-UnaG), ble MA104-celler infisert med rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG og rSA11/wt. Cellelysates ble utarbeidet fra celler høstet ved 8 h post infeksjon, løst av gel elektroforese, og blotted på nitrocellulose filtre. Blots ble undersøkt med antistoffer spesifikke for rotavirus VP6 og NSP3, og FLAG tag. Analysen viste at NSP3-2A og 3xFL-UnaG ble uttrykt som separate proteiner i celler infisert med rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG, noe som indikerer at 2A-elementet var funksjonelt (figur 3C). Celler infisert med rSA11/wt uttrykte ikke protein anerkjent av anti-FLAG antistoff. NSP3-proteinet som finnes i rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG-infiserte celler med anti-NSP3-antistoff migrert litt langsommere enn NSP3 tilstede i rSA11/wt-infiserte celler på grunn av tilstedeværelsen av rest 2A-rester ved C-terminus i NSP3.

Figure 1
Figur 1: Rotavirus reversere genetikk plasmids. (A) Full lengde cDNAs av 11 SA11 rotavirus genom segmenter er plassert i pT7 plasmids, ligated oppstrøms med en promotor for T7 RNA polymerase og nedstrøms med en HDV ribozyme. I nærvær av T7 RNA polymerase produserer rotavirus pT7 plasmids full lengde SA11 (+)RNAs med autentisk5' og 3' termini. (B) Skjemaer av (+)RNA og proteinprodukter laget av pT7/NSP3-2A-3xFL-UnaG plasmid. Den skjematiske inkluderer NSP3 cDNA-sekvensen, og sekvenser for svineteschovirus 2A-lignende (2A) element, 3x FLAG (FL) tag, og det grønne fluorescerende proteinet UnaG. Posisjonen til 2A translational stop-restart nettstedet er angitt med en rød pil. På grunn av aktiviteten til 2A-elementet produserer oversettelsen av RNA to proteiner. NSP3-delen inneholder rester av 2A-elementet, og UnaG-delen er smeltet sammen til en 3x FLAG-kode. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Rotavirus omvendt genetikk system. BHK-T7 monolayers er transfected med 11 pT7 plasmids, hver uttrykker en annen SA11 (+)RNA, og en pCMV vektor uttrykker afrikanske svinefeber virus (ASFV) NP868R capping enzymet (pCMV / NP868R). Ved 3 dager etter infeksjon (d.p.i.), BHK-T7 cellene er overseeded med MA104 celler. Ved 7 dager etter infeksjon forsterkes rekombinant rotavirus i BHK-T7/MA104 cellelysater ved passasje på MA104-celler, deretter isolert av plakkrensing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kjennetegn på rekombinantstammene rSA11/wt og rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. (A) Elektroforetiske profiler av dsRNA genom segmenter av plakk-isolerte rSA11 stammer. De 11 genomsegmentene er nummerert og skiftet i posisjonen til segment 7 (NSP3) er angitt med en rød linje. (B) Fluorescens oppdaget i rSA11-infiserte MA104-celler ved 8 h post infeksjon ved hjelp av en levende celle imager (20x forstørrelse) satt på den grønne deteksjonskanalen. Skala bar = 100 μm. (C) Immunoblot analyse av proteiner tilstede på 8 h post infeksjon i MA104 celler infisert med rSA11 stammer ved hjelp av marsvin anti-VP6 og anti-NSP3 antisera og mus anti-FLAG monoklonalt antistoff. (D) Plakk produsert av rSA11/wt på MA104-celler ved 3 dager etter infeksjon og oppdaget ved nøytral rød farging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I vårt laboratorium er vi rutinemessig avhengige av den omvendte genetikkprotokollen som er beskrevet her for å produsere rekombinant SA11 rotavirus. Med denne tilnærmingen gjenoppretter personer med liten erfaring i molekylærbiologiteknikker eller arbeider med rotavirus rekombinantvirus selv på deres første forsøk. Vi har generert nærmere 100 rekombinantvirus etter denne protokollen, inkludert de med genomer som har blitt re-konstruert for å uttrykke utenlandske proteiner (f.eks. FPs) og som inneholder sekvenstillegg, slettinger og punktmutasjoner.

Forholdene og inkubasjonstidene gitt i denne protokollen gjelder for gjenoppretting av godt voksende stammer av rekombinantvirus. Justeringer bør vurderes hvis du forsøker å gjenopprette SA11 virus som, på grunn av genetisk modifikasjon, kan forventes å vokse dårlig. Spesielt fordi titer av slike virus i transfected BHK-T7/MA014 celle lysates kan være lav, vi vanligvis doble mengden lysat som brukes som inokulum i påfølgende forsterkning trinn. Videre, på forsterkningstrinnet, kan dårlig voksende virus kreve lengre tider med inkubasjon før de når nivåer av CPE tilstrekkelig for cellehøsting. Faktisk, med slike virus, kan vi tillate infeksjoner å fortsette i 10-14 dager, eller enda lenger, før høsting av celler. Til slutt, dårlig voksende virus er sannsynlig å generere små, sakte voksende plakk på MA104 celler. Derfor, for å plakk isolere disse virusene, kan det være nødvendig å tillate plakk å utvikle seg til 6-10 dager etter infeksjon før farging av celler med nøytrale røde og plukke plakk.

Etter vår erfaring er den viktigste faktoren i pålitelig gjenoppretting av rekombinant rotavirus bruk av sunne, godt vedlikeholdte BHK-T7-celler. I vårt laboratorium passerer vi rutinemessig BHK-T7-celler 2x i uken ved samme fortynning ved hjelp av medium supplert ikke bare med 10% FBS, men også med NEAA, TPB og høye nivåer av glukose (GMEM komplett medium). De ekstra kosttilskudd hjelpe BHK-T7 celler beholde utvidet levedyktighet etter plasmid transfection, en faktor sannsynligvis avgjørende for å gjenopprette dårlig voksende mutant rekombinant virus. Vi supplerer mediet annenhver passasje med G418, et antibiotikum som velger for vedlikehold av T7 polymerase uttrykk plasmid. Passasjeforhold bør være slik at BHK-T7-celler aldri får lov til å vokse forbi samløpet, forhold som raskt fører til redusert cellelevedyktighet. For oss, BHK-T7 celler som har fått lov til å overvokse utføre dårlig i omvendt genetikk protokollen, selv om cellene blir senere passasje riktig flere ganger. I stedet for å forsøke å rehabilitere overgrodde BHK-T7-celler, starter vi slektslinjen med celler som tidligere er lagret i flytende nitrogen.

Mycoplasma forurensning av BHK-T7 og MA104 celler kan være en viktig faktor i svikt i rotavirus omvendt genetikk system for å generere rekombinant virus. I laboratoriet vårt bruker vi et PCR-basert mycoplasma deteksjonssett (Table of Materials) for å se etter kontaminering av cellelinjer, og når det oppdages, er det oftest forbundet med våre BHK-T7-celler. Vi har ikke forsøkt å kurere cellelinjer med forurensende mycoplasma, i stedet re-etablere linjene med tidligere mycoplasma-frie passasjer lagret i flytende nitrogen. Før vi starter nye cellelinjer, kaster vi alle tidligere brukte medium og middels kosttilskudd og grundig dekontaminere inkubatorer, biologiske sikkerhetsskap, vannbad, laboratoriebenker og pipettorer. Vi bruker også mycoplasma deteksjonssett for å sjekke bestander av rekombinantvirus for forurensning. På grunn av resistensen av rotaviruspartiklene til denaturering av organiske løsemidler, som Vertrel VF32,er det mulig å frigjøre virusbestander fra å forurense mycoplasma, negating behovet for å regenerere rekombinant virus ved omvendt genetikk. Det er viktig å understreke at cellelinjer og viruspreparater mottatt i laboratoriet bør kontrolleres for mycoplasmaforurensning før rutinemessig bruk.

Selv om dag inn og dag ut, bruker vi den samme protokollen for å generere rekombinant virus, vi vet at visse endringer kan gjøres som ikke vil utelukke virusutvinning. (i) kotransfection av pCMV/NSP868R capping-enzymet plasmid med SA11 pT7 vektorer er ikke nødvendig for gjenoppretting av rekombinant virus. Mens tillegg av capping plasmid gir høyere virus titers i transfected BHK-T7/MA104 celle lysates, vi har vært i stand til å gjenopprette mange virus, inkludert de som uttrykker FPs, uten det. Vi har imidlertid konkludert med at uttrykk for capping enzymet ved pCMV / NP868R kan bidra betydelig til utvinning av mindre passe virus. (ii) Vi har funnet ut at rekombinantvirus kan genereres selv om mengden av transfection reagens (Table of Materials) som brukes i omvendt genetikk protokollen reduseres med en halv, en endring som kan redusere utgifter betydelig. (iii) På samme måte har vi fastslått at M199 komplett medium kan brukes i stedet for DMEM komplett medium. (iv) Til slutt er det ikke noe krav til hvilken type vektorryggrad som må brukes til å produsere SA11 T7 transkripsjonsvektorer. Så lenge viral cDNA i plasmid er omgitt av en oppstrøms T7 arrangør og en nedstrøms HDV ribozyme og T7 terminator, plasmid kan forventes å støtte utvinning av rekombinant virus. Spesielt pGEM-, pBluescript og pUC-baserte vektorer har blitt brukt med hell i det omvendte genetikksystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R03 AI131072 og R21 AI144881, Indiana University Oppstart Funding, og Lawrence M. Blatt Begavelse. Vi takker medlemmer av IU Rotahoosier-laboratoriet, Ulrich Desselberger og Guido Papa for deres mange bidrag og forslag til å utvikle den omvendte genetikkprotokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) Cells Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel Bio-Rad 45608105
Cellometer AutoT4 viable cell counter Nexcelom
ChemiDoc MP Gel Imaging System Bio-Rad
Chloroform MP 194002
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate Bio-Rad 170-5060
Competent E.coli DH5alpha Bacteria Lucigen 60602-2
Complete Protease Inhibitor Pierce A32965
Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips MTC Bio P4113-11
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Lonza 12-604F
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) Quality Biological 115-073-101
Ethanol, Absolute (200 proof) Fisher Bioreagents BP2818-500
Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) Invitrogen 15585-011
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Corning 35-011-CV
Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal Sigma-Aldrich F1804
GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit Sigma NA0200-1KT
Geneticin (G-418) Invitrogen 10131-027
Gibco FluroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 DMEM with low background fluorescence
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) Gibco 11710-035
Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated Cell-Signaling Technology 7074S
Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum Patton lab lot 55068
Guinea Pig Anti-VP6 Antierum Patton lab lot 53963
Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated KPL 5220-0366
Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated Cell-Signaling Technology 7076S
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit JH Science 25235
Isopropyl alcohol Macron 3032-02
L-glutamine Solution (100x) Gibco 25030-081
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) RPI research products L24020-2000.0
Medium 199 (M199) Culture Medium Hyclone Sh30253.01
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) Lonza 04-719Q
Monkey Kidney (MA104) Cells ATCC ATCC CRL-2378.1
NanoDrop One Spectrophotometer ThermoScientific
Neutral Red Solution (0.33%) Sigma-Aldrich N2889-100ml
Non-Essential Amino Acid Solution (100x) Gibco 11140-050
Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel Invitrogen XP00102BOX
Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water Invitrogen 10977-015
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit Takara 740609.25
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985-070
Pellet pestle (RNase-free, disposable) Fisher 12-141-368
Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) Corning 30-002-Cl
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Fisher Bioreagents BP399-20
Porcine Trypsin, Type IX-S Sigma-Aldrich T0303
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1223
Qiagen Plasmid Maxi Kit Qiagen 12162
Qiagen Plasmid Midi Kit Qiagen 12143
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
SA11 pT7 Transcription Vectors Addgene 89162-89172
SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins Contact: jtpatton@iu.edu
SeaKem LE Agarose Lonza 50000 For gel electrophoresis
SeaPlaque agarose Lonza 50100 For plaque assay
Superscript III One-Step RT-PCR kit Invitrogen 12574-035
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad 170-4270
Trans-Llot Turbo Transfer System Bio-Rad
TransIT-LTI Transfection Reagent Mirus MIR2306
Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) Bio-Rad 161-0772
Triton X 100 Fisher Bioreagents BP151-500
Trizol RNA Extraction Reagent Ambion 15596026
Trypan blue Corning 25-900-CI
Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution Quality Biological 118-087-721
Tryptose Phosphate Broth Gibco 18050-039
Tween-20 VWR 0777-1L
Vertrel VF solvent Zoro G0707178
Zoe Fluorescent Live Cell Imager Bio-Rad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
  2. Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
  3. International Committee on Taxonomy of Viruses. Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release. , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019).
  4. Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, Suppl 2 96-105 (2016).
  5. Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
  6. Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
  7. McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
  8. Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
  9. Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
  10. Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
  11. Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
  12. Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
  13. Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
  14. Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
  15. Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
  16. Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
  17. Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
  18. Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
  19. Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
  20. Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
  21. Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
  22. Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
  23. Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
  24. Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
  25. Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
  26. Donnelly, M. L., et al. The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
  27. Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
  28. Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
  29. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
  30. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , HHS publication no. CDC 21-1112 (2009).
  31. Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
  32. Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 158 rotavirus omvendt genetikk fluorescerende protein rekombinant virus rekombinant rotavirus viral uttrykk vektor
Forenklet omvendt genetikk metode for å gjenopprette rekombinant rotavirus uttrykke reporter proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Philip, A. A., Dai, J., Katen, S.… More

Philip, A. A., Dai, J., Katen, S. P., Patton, J. T. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (158), e61039, doi:10.3791/61039 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter