Summary
Generering av rekombinanta rotavirus från plasmid-DNA är ett viktigt verktyg för studier av rotavirusreplikation och patogenes samt utveckling av rotavirusuttrycksvektorer och vacciner. Häri beskriver vi en förenklad omvänd genetik metod för att generera rekombinanta rotaviruses, inklusive stammar som uttrycker fluorescerande reporter proteiner.
Abstract
Rotaviruses är en stor och föränderlig population av segmenterade dubbelsträngade RNA-virus som orsakar svår gastroenterit hos unga däggdjur och fågelvärden, inklusive människor. Med den senaste tidens tillkomst av rotavirus omvänd genetik system, har det blivit möjligt att använda riktade mutagenesis att utforska rotavirus biologi, ändra och optimera befintliga rotavirus vacciner, och utveckla rotavirus multitarget vaccin vektorer. I denna rapport beskriver vi ett förenklat omvänt genetiksystem som möjliggör effektiv och tillförlitlig återvinning av rekombinanta rotaviruses. Systemet är baserat på co-transfection av T7 transkriptionsvektorer som uttrycker fullängds rotavirus (+)RNAs och en CMV vektorkodning av ett RNA-takenzym till BHK-celler som utgör T7 RNA-polymeras (BHK-T7). Rekombinanta rotavirus förstärks genom att övervaka de transfected BHK-T7-cellerna med MA104-celler, en apa njurcelllinje som är mycket tillåtande för virustillväxt. I denna rapport beskriver vi också en metod för att generera rekombinanta rotavirus som uttrycker en separat fluorescerande reporter protein genom införandet av en 2A translationell stop-omstart element i arvsmassan segment 7 (NSP3). Detta tillvägagångssätt undviker att ta bort eller ändra någon av de virala öppna läsramarna, vilket möjliggör produktion av rekombinanta rotavirus som behåller fullt fungerande virusproteiner samtidigt som de uttrycker ett fluorescerande protein.
Introduction
Rotavirus är de främsta orsakerna till svår gastroenterit hos spädbarn och småbarn, liksom unga i många andra däggdjurs- och fågelarter1. Som medlemmar av Familjen Reoviridae har rotavirus en segmenterad dubbelsträngad RNA-genom (dsRNA). Arvsmassan segmenten finns i en icke-utvecklad icosahedral virion bildas från tre koncentriska lager av protein2. Baserat på sekvensering och fylogenetisk analys av genomsegmenten har nio arter av rotavirus (A−D, F−J) definierats3. De stammar som består av rotavirus art A är ansvariga för den stora majoriteten av mänskliga sjukdomar4. Införandet av rotavirus vacciner i barndomen immunisering program som börjar under det senaste decenniet är korrelerad med betydande minskningar av rotavirus dödlighet och sjuklighet. Framför allt har antalet dödsfall i rotavirusrelaterade barn minskat från cirka 528 000 år 2000 till 128 500 år 2016,,5.4 Rotavirusvacciner är formulerade från levande försvagade virusstammar, med 2 till 3 doser som administreras till barn vid 6 månaders ålder. Det stora antalet genetiskt olika rotavirus stammar som cirkulerar hos människor och andra däggdjur arter, i kombination med deras förmåga att snabbt utvecklas genom mutagenes och reassortment, kan leda till antigena förändringar i de typer av rotavirus infekterar barn6,7,8. Sådana förändringar kan undergräva effekten av befintliga vacciner och kräva att de ersätts eller modifieras.
Utvecklingen av helt plasmid-baserade omvänd genetik system som möjliggör manipulering av någon av de 11 rotavirus genomet segment uppnåddes förstnyligen 9. Med tillgången på dessa system har det blivit möjligt att reda ut molekylära detaljer om rotavirusreplikation och patogenes, att utveckla förbättrade screeningmetoder med hög genomströmning för anti-rotavirusföreningar och att skapa nya potentiellt effektivare klasser av rotavirusvacciner. Under rotavirusreplikation styr rna-rna inte bara syntesen av virusproteiner utan fungerar också som mallar för syntes av avkomman dsRNA-genomsegment10,11. Alla rotavirus omvänd genetik system som beskrivits hittills förlita sig på transfection av T7 transkription vektorer i däggdjurs cellinjer som en källa till cDNA-härledda (+)RNAs används för att återvinna rekombinanta virus9,12,13. Inom transkriptionsvektorerna placeras fullängds viruscDNAs mellan en uppströms T7-promotor och nedströms hepatitdelvirus (HDV) så att virus (+)RNAs syntetiseras av T7 RNA-polymeras som innehåller äkta 5' och 3'-termini (figur 1A). I det första generationens omvänd genetiksystem gjordes rekombinanta virus genom att transfecting baby hamster njurceller uttrycker T7 RNA polymeras (BHK-T7) med 11 T7 (pT7) transkriptionsvektorer, varje regisyntes av ett unikt (+)RNA av simian SA11 virusstam, och tre CMV promotor-enhet uttryck plasmider, en kodning av aviära reovirus p10FAST fusion protein och två kodning underenheter vaccinia viruset D1R-D12L tak enzym komplex9. Rekombinanta SA11 virus som genereras i transfected BHK-T7 celler förstärktes genom att övervaka med MA104 celler, en cellinje tillåtande för rotavirus tillväxt. En modifierad version av det första generationens omvänd genetik system har beskrivits som inte längre använder stöd plasmider12. Istället genererar det modifierade systemet framgångsrikt rekombinanta rotavirus helt enkelt genom att transfecting BHK-T7 celler med 11 SA11 T7 transkription vektorer, med förbehållet att vektorer för viral fabrik (viroplasm) byggstenar (nonstructural proteiner NSP2 och NSP5) läggs till nivåer 3-faldig högre än de andra vektorerna14,15. Modifierade versioner av det omvända genetiksystemet har också utvecklats som stöder återvinning av mänskliga KU och Odelia stammar av rotavirus16,17. Rotavirusgenomet är anmärkningsvärt mottaglig för manipulation av omvänd genetik, med rekombinanta virus som genereras hittills med mutationer som införts i VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21och NSP522,23. Bland de mest användbara virus som genereras hittills är de som har konstruerats för att uttrycka fluorescerande reporter proteiner (FPs)9,12,21,24,25.
I denna publikation tillhandahåller vi protokollet för det omvända genetiksystemet som vi använder i vårt laboratorium för att generera rekombinanta stammar av SA11 rotavirus. Det viktigaste inslaget i vårt protokoll är samtransfekt av BHK-T7 celler med 11 pT7 transkription vektorer (ändras för att inkludera 3x nivåer av pT7/NSP2SA11 och pT7/NSP5SA11 vektorer) och en CMV uttryck vektor kodning den afrikanska svinpest-virus (ASFV) NP868R tak enzym21 (Figur 2). I våra händer leder närvaron av NP868R plasmid till produktion av högre titers av rekombinanta virus av transfected BHK-T7 celler. I denna publikation tillhandahåller vi också ett protokoll för att ändra pT7/NSP3SA11 plasmid så att rekombinanta virus kan genereras som uttrycker inte bara segmentet 7 proteinprodukt NSP3 men också en separat FP. Detta åstadkoms genom att re-engineering NSP3 öppen läsram (ORF) i pT7/NSP3SA11 plasmid att innehålla en nedströms 2A translationell stop-omstart element följt av en FP ORF(Figur 1B)24,26. Genom detta tillvägagångssätt har vi genererat rekombinanta rotavirus som uttrycker olika FPs: UnaG (grön), mKate (långröd), mRuby (röd), TagBFP (blå), CFP (cyan) och YFP (gul)24,27,28. Dessa FP-uttrycker rotavirus görs utan att ta bort NSP3 ORF, vilket ger virus som förväntas koda ett komplett komplement av fungerande virala proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Underhåll av medieberedning och cellkultur
- Få baby hamster njure celler som utgör T7 RNA polymeras (BHK-T7) och afrikanska gröna apa njure MA104 celler.
OBS: BHK-T7 (eller BSR-T7) celler är inte kommersiellt tillgängliga, men är en gemensam cellinje av laboratorier som använder omvänd genetik för att studera RNA-virusbiologi. BHK-T7 cellinje som används i detta protokoll erhölls från Dr Ursula J. Buchholz (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), en co-utvecklare av den ursprungliga BHK cellinje uttrycker T7 RNA polymeras29. MA104 celler finns tillgängliga från European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) och american type culture collection (ATCC). - Förbered följande odlingsmedia i en steril miljö, helst ett biologiskt säkerhetsskåp av klass II. Förvara media i mörker vid 4 °C och värm till 37 °C omedelbart före användning.
Obs: Källor till mediekomponenter finns i tabell över material.- För att förbereda DMEM ofullständigt medium, kombinera 500 ml Dulbecco modifierade Eagle minsta väsentliga medium (MEM) som innehåller 4,5 g/L glukos och 1% glutamin med 5 ml 100x penna-strep.
- För att förbereda DMEM komplett medium, kombinera 500 ml DMEM ofullständigt medium med 25 ml fetala nötkreatur serum (FBS).
- För att förbereda GMEM ofullständigt medium, kombinera 500 ml Glasgow minsta väsentliga medium, 5 ml 100x glutamin, 50 ml tryptose-fosfatbuljong (TPB), 5 ml 100x nonessential aminosyror (NEAA), och 5 ml 100x pen-strep.
- För att förbereda GMEM komplett medium, kombinera 500 ml GMEM ofullständigt medium med 25 ml värme-inaktiverade FBS.
- För att förbereda GMEM+G komplett medium, tillsätt 10 ml 50 mg/ml genetik (G418) till 500 ml GMEM komplett medium.
- För att förbereda SMEM ofullständigt medium, kombinera 500 ml Joklik modifierade Eagle's MEM, 5 ml 100x glutamin, 50 ml TPB, 5 ml 100x NEAA, och 5 ml 100x penna-strep.
- Odling MA104-celler i T75- eller T175-flaskor som innehåller 12 respektive 25 ml DMEM-komplett medium. För passage MA104 celler som har nått 100% konfluensa, skölj cellen monolayer 2x med fosfat-buffrad saltlösning (PBS), separera med trypsin (0,05%)-EDTA (0,1%) lösning och återsuspend i 5 (T75 kolv) eller 10 ml (T175 kolv) av DMEM ofullständigt medium.
- Placera 0,5−1,0 ml återsuspenderade celler i färska kolvar och föra till lämplig slutvolym genom att lägga till DMEM komplett medium. Placera kolvar i en 37 °C,2 5% CO 2-inkubator.
- Föröka BHK-T7-celler i T75-flaskor, omväxlande mellan användningen av GMEM och GMEM+G komplett medium med varje passagerunda. Till subkultur BHK-T7 celler som har nått 100% konfluensa, skölj cellen monolayer 2x med PBS, separera med trypsin-EDTA lösning, och återsuspend i 5 ml medium.
- Efter att ha placerat 15 ml GEM eller GMEM+G komplett medium i en färsk T75-kolv, tillsätt fyra droppar återsuspenderade BHK-T7-celler. Placera kolven i en 37 °C, 5% CO 2-inkubator.2
2. Plasmid förberedelse
- Få följande plasmider som uttrycker rotavirus SA11 (+)RNAs från Addgene: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11 och pT7/NSP5SA11. Få plasmid uttrycker ASFV tak enzym (pCMV/NP868R) från författarna21.
OBS: Modifierade pT7/NSP3SA11 plasmider konstruerade för att uttrycka en FP genom aktiviteten hos en 2A translationell element (pT7/NSP3-2A-3xFL-FP) kan också erhållas från författarna24,26. pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plasmider som uttrycker följande FPs finns: UnaG (grön), mKate (långröd), mRuby (röd), TagBFP (blå), CFP (cyan) och YFP (gul)24. - Förvandla plasmider till kompetent E. coli (påt) DH5α och sprida bakterier på Luria buljongagarplattor som innehåller lämpligt antibiotikum. Odla bakteriekulturer plockas från enskilda kolonier och förbereda mindre mängder plasmid (20 μg) med hjälp av en spin miniprep rening kit (Tabell av material), enligt tillverkarens instruktioner. Förbered större mängder plasmid från bakteriekulturer med midi- och maxireningssatser (Tabell över material).
OBS: Plasmider som är lämpliga för användning i det omvända genetiksystemet har också beretts med andra plasmidreningssatser. Det är inte nödvändigt att förbereda plasmider med hjälp av kit speciellt utformade för att generera endotoxinfritt material. - Justera koncentrationerna av renat plasmider till 1 mg/ml i nukleasfritt molekylärbiologiskt vatten. Kontrollera plasmid renhet genom att bekräfta en 260/280 absorbans förhållande på ~ 1,8 med hjälp av en spektrofotometer. Använd också elektrofores på 0,8% agaros geler för att kontrollera att plasmider är övervägande supercoiled.
- Aliquot renade plasmider i 0,5 ml sterila mikrocentrifugrör, var och en innehållande 10 μL. Förvara plasmider vid -80 °C.
3. Generering av rekombinant virus
OBS: Forskning om rotavirus för människor och djur, inklusive generering och karakterisering av rekombinanta rotavirusstammar, måste hanteras under biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) och kommer att kräva förhandsgodkännande från den institutionella biosäkerhetskommittén (IBC). Lämpliga BSL-2 laboratorieförhållanden beskrivs i biosäkerhet i mikrobiologiska och biomedicinska laboratorier (BMBL) som produceras av Centers for Disease Control and Prevention (CDC)30.
- Dag 1: sådd av BHK-T7 celler i 12-brunnsplattor
- Skölj en nykonfluent monolager av BHK-T7 celler som finns i en T75-kolv 2x med PBS. Stör cellmonolayern med trypsin-EDTA-lösning och återsuspend cellerna i 5 ml GMEM komplett medium.
- Använd en automatiserad cellräknare och trypan-blå lösning för att bestämma koncentrationen av livskraftiga BHK-T7-celler i mediet. Fröceller till 12-brunnscellodlingsplattor, där varje brunn innehåller 2 x 105 celler i en total volym på 1 ml GMEM (G418-fritt) komplett medium. Inkubera i en 37 °C, 5% CO2 inkubator. Cellerna bör nå 80−90% sammanflödet dag 2.
- Dag 2: transinfektion av BHK-T7 celler med plasmidblandningar
- För att förbereda plasmidblandningen, kombinera följande i ett 0,5 ml mikrocentrifugrör med plasmidlager justerade till 1 mg/ml: 0,8 μL vardera av SA11 pT7 plasmider VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 och NSP4, 2,4 μL vardera av SA11 pT7 plasmider NSP2 och NSP5 och 0,8 μL pCMV/NP868R. Blanda försiktigt plasmider genom att knacka på röret och samla in innehåll genom pulscentrifugering. För att förbereda rekombinanta virus som uttrycker FPs, byt ut pT7/NSP3SA11 med lämplig pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plasmid.
OBS: Plasmidblandningar ska förvaras på is tills de används. Ett separat rör bör beredas för varje transfection. - För att förbereda plasmid/reducerad serum medium/transfection reagens blandning: Tillsätt 110 μL förkrigstiden (37 °C) reducerat serummedium (Tabell över material) till varje plasmidblandning och blanda genom att försiktigt pipettera upp och ner. Tillsätt därefter 32 μl transfsektionsreagens (Tabell över material) till varje plasmid/reducerad serummediumblandning. Detta ger en koncentration på 2,5 μl transfinfektionsreage per μg plasmid i blandningar. Virvelblandningar försiktigt och inkubera i rumstemperatur i 20 min.
- Under inkubationstiden på 20 minuter, skölj BHK-T7-cellerna i 12-brunnsplattor (beredda dag 1) en gång med 2 ml GMEM-ofullständiga medier. Därefter, tillsätt 1 ml SMEM ofullständigt medium till varje brunn och returnera plattor till inkubatorn.
- Efter inkubationstiden på 20 minuter tillsätt plasmid/reducerad serummedium/transfection blandning droppe-för-fall till varje brunn av 12-brunnsplattorna med en 200 μL pipettor. Försiktigt bergplattor och återgå till en 37 °C, 5% CO 2-inkubator.2
- För att förbereda plasmidblandningen, kombinera följande i ett 0,5 ml mikrocentrifugrör med plasmidlager justerade till 1 mg/ml: 0,8 μL vardera av SA11 pT7 plasmider VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 och NSP4, 2,4 μL vardera av SA11 pT7 plasmider NSP2 och NSP5 och 0,8 μL pCMV/NP868R. Blanda försiktigt plasmider genom att knacka på röret och samla in innehåll genom pulscentrifugering. För att förbereda rekombinanta virus som uttrycker FPs, byt ut pT7/NSP3SA11 med lämplig pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plasmid.
- Dag 4: övervaka transfected BHK-T7 celler med MA104 celler
- Skölj en nykonfluent monolager av MA104-celler som finns i en T75-kol 2x med PBS. Stör monolayern med trypsin-EDTA-lösningen och återsuspend celler i 5 ml DMEM komplett medium.
- Med hjälp av en automatiserad cellräknare och trypan-blå lösning, bestämma koncentrationen av livskraftiga MA104 celler i mediet. Justera koncentrationen till 8 x 105 MA104 celler/ml i DMEM ofullständigt medium och tillsätt 0,25 ml suspenderade celler (2 x 105 celler) dropwise till brunnarna som innehåller transfected BHK-T7-celler.
- Justera koncentrationen av trypsin (svin bukspottskörteln typ IX) i medium till ~0,5 μg/ml genom att lägga till 0,8 μL av 1 mg/ml trypsin lager till varje brunn.
OBS: Trypsinlager bör beredas i PBS, alikvoterade, och lagras vid -20 °C. - Använd de återstående MA104-cellerna för att förbereda 6-brunnsplattor som kommer att behövas dag 7 för att förstärka rekombinanta virus. För att så 6-brunnsplattor, späd resuspended MA104 celler till en koncentration av 1,5 x 105 celler /ml i DMEM komplett medium och placera 2 ml i varje brunn. Placera plattorna i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Dag 7: återvinning och förstärkning av rekombinant virus från transfected celler
- Anse BHK-T7/MA104 celler i 12-brunnsplattor på tre cykler av frys-töväder under sterila förhållanden, rörliga plattor mellan -20 °C frys och en rumstemperaturyta. Efter överföring av lysates till 1,5 ml-rör, centrifugrör i 10 min vid 500 x g (4 °C) till pellet stora cellulära skräp. Samla upp supernatant och förvara vid 4 °C (kortvarig) eller -20 °C (lång sikt).
- Tvätta MA104 monolayers i 6-brunnsplattor (beredda dag 4) 2x med PBS. Placera 2 ml DMEM ofullständigt medium till varje brunn som innehåller 0,5 μg/ml trypsin. Tillsätt 300 μl supernatant som återvunns från BHK-T7/MA104-celllystetter i brunnar2 och placera plattorna i en 37 °C, 5% CO 2-inkubator.
- Inkubera plattor i 7 dagar eller tills fullständiga cytopatiska effekter (CPE) observeras. Lyse MA104 celler i 6-brunnsplattor med tre cykler av frys-tö, överför sedan lysates till 1,5 ml mikrocentrifugrör. Pellet stora cellulära skräp genom centrifugering i 10 min vid 500 x g (4 °C). Överför de klarlagda celllysterna till 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid °C -20° C.
4. Plack isolering av rekombinanta virus
- Aktivera virus i 100 μL klargator av klargjorda celllystetter genom att lägga till trypsin till en slutlig koncentration på 10 μg/ml och inkubera vid 37 °C i 1 h. Förbered en 10-faldig seriell utspädningsserie från 10-1 till 10 -7 (1 ml vardera) i DMEM ofullständigt medium.
- Skölj MA104 monolayers i 6-brunnsplattor 2x med 2 ml PBS och en gång med DMEM ofullständigt medium. Tillsätt 400 ml lysate utspädningar i två exemplar till plattorna. Inkubera plattorna i 1 h i en 372 °C, 5% CO 2-inkubator, gunga var 10−15:e minut för att omfördela utspädningar över monolager.
- Förbered en agarose-MEM overlay lösning genom att kombinera lika volymer av 2x Eagle minimalt viktigt medium (EMEM; förvärvat till 37 °C) med 1,5% agaros som har smälts i vatten med hjälp av en mikrovågsugn och förkyld till 45 °C. Håll överläggslösningen vid 42 °C med hjälp av ett vattenbad och anpassa dig till en slutlig koncentration på 0,5 μg/ml trypsin omedelbart innan cellerna släpps ut.
- Dra av lysate utspädningar från 6-brunnsplattor, skölj sedan cellerna en gång med 2 ml ofullständig DMEM. Försiktigt överlagra 3 ml av agarose-MEM overlay-lösningen på cellen monolayer som finns i varje brunn. Låt agarose overlay att härda i rumstemperatur, sedan tillbaka plattorna till inkubatorn.
- Tre dagar senare, förbereda en agarose-MEM overlay lösning som i steg 4.3 och ta till 42 °C . Omedelbart före användning, justera överläggslösningen till en slutlig koncentration av 50 μg/ml neutral röd (Tabell över material).
- Tillsätt 2 ml av överläggslösningen ovanpå det befintliga agarosskiktet i 6-brunnsplattorna. Efter att ha låtit det nya agatlagret härda, returnera plattorna till inkubatorn. Skydda lösningar och plattor som innehåller neutralt rött från exponering för ljus.
- Under de kommande 6 h, identifiera rotavirusplacketter i 6-brunnsplattorna med hjälp av en ljuslåda. Plocka tydligt definierade plack med engångsöverföring pipets, återvinna agarose pluggar som sträcker sig helt till cellskiktet.
- Fördriv kontakten i ett 1,5 ml-rör som innehåller 0,5 ml DMEM-ofullständigt medium och virvel provet för 30 s. Förstärka det plakettisolerade viruset som elueras till mediet genom förökning på MA104-monolager i 6-brunnsplattor eller T25-flaskor som innehåller DMEM-ofullständigt medium och 0,5 μg/mL trypsin.
OBS: Ytterligare information om isolering och titering av rotavirus genom plackanalys finns i Arnold et al.31.
5. Gel elektrofores av viral dsRNA
- Placera 600 μL klartryckt infekterade celllystetter och 400 μl guanidiniumtiocyanat i 1,5 ml mikrocentrifugrör, virvel för 30 s och inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Tillsätt 200 μL kloroform, virvel för 30 s och inkubera i 3 min. Efter centrifugering i 5 min vid 13 000 x g (4 °C) överför du ~550 μL av den övre vattenfasen till färska rör.
- Återvinn virusdsRNA från vattenfasen genom att tillsätta 2 volymer (~900 μL) kall isopropylalkohol och inverterande rör 4−6x. Efter inkubering vid rumstemperatur i 10 min, centrifugrör i 10 min vid 13 000 x g (4 °C). Kassera supernatanter och behåll RNA-pelletsen.
- Tvätta pelletsen genom att tillsätta 1 ml 75 % etanol till röret, invertera en gång och centrifugering i 5 min vid 7 500 x g (4 °C). Efter att försiktigt ha tagit bort etanoltvätten med en pipett, låt RNA-pellets lufttorka på labbbänken i 5−10 min. Lös upp RNA-pellets i 15 μL nukleafria molekylärbiologiska vatten och förvara på -20 °C.
- Kombinera 10 μl upplösta RNA-prover med 2 μL 6x DNA-laddningsbuffert, lasta på prefabricerade 10% polyakristnatron minigeler (eller handgjutna motsvarigheter) och lös RNAs med elektrofores i Tris-glycin körbuffert för 2 h under en konstant ström (16 mA). Blötlägg geler i 5−10 min i vatten som innehåller ~1 μg/mL ethidiumbromid och detekterar rotavirusgenomsegment med en UV-transilluminator.
6. Återvinning och sekvensering av virusdsRNA
- Lokalisera virala dsRNA-band på polyakrylamidgeler, helst med lågintensivt långt våglängd UV-ljus, för att undvika att generera nukleinsyror tvärtlänkar. Med hjälp av ett färskt rakblad, skär ut gelfragment som innehåller dsRNA-band och överför till 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Efter att ha lagt till 10−20 μl RNase-fritt vatten, krossa varje fragment med en RNase-fri engångs pelletsfarteljon utformad för att passa ett 1,5 ml mikrocentrifugrör eller genom att dra upp och ner genom en 18 G-nål. Inkubera krossade fragment över natten vid 4 °C.
- Återvinn 3 μl vätska från rör som innehåller krossade gelfragment. Generera cDNAs av virala dsRNAs med hjälp av en ett steg omvänd transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR) kit (Tabell över material) och lämpliga oligonukleotidprimer.
OBS: PCR-produkter är gel-renas med en PCR sanering kit (Tabell av material) och skickas ut för natten sekvensering, tillsammans med primers, av kommersiella DNA-sekvens tjänster.
7. Immunoblot analys av virusproteiner
- Frö 6-brunnsplattor med 3 x 105 MA104-celler per brunn i en total volym på 2 ml DMEM komplett medium. Placera plattorna i en 37 °C, 5% CO2-inkubator och låt stå tills cellerna når confluency (3−5 dagar).
OBS: Brunnar med konfluenta monolager kommer att innehålla ~ 1,2 x 106 celler. - Behandla klargjorda supernatanter genom att ruva med 10 μg/ml trypsin vid 37 °C i 1 h för att aktivera rekombinanta rotaviruspartiklar som finns i dem.
- Skölj MA104 monolayers i 6-brunnsplattor 2x med 2 ml PBS. Infektera celler genom att till varje brunn tillsätta 200 μl inokulat innehållande 3−5 plackbildande enheter (PFU) per cell av trypsinaktiverat rotavirus i DMEM ofullständigt medium. Återför plattorna till inkubatorn.
- Var 10:e minut, ta bort plattorna och stena försiktigt för att omfördela inokulat över cellens monolager. Efter 1 h, byt inokulat med 2 ml DMEM ofullständigt medium.
- Vid 8 h post infektion, skölj cellerna i 6-brunnsplattor 2x med PBS. Skrapa cellerna i 750 μl PBS och överför volymen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Skölj plattan med ytterligare 750 μl PBS och kombinera med det tidigare insamlade 750 μl provet.
- Pelletceller i prov genom centrifugering vid 5 000 x g i 10 min vid 4 °C. Efter kassering av supernatant, förvara cellpellets vid -80 °C tills de bearbetas vidare.
- Förbered celllysbuffert som innehåller 300 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2% Triton X-100 och 1x EDTA-fri komplett proteashämmare. Efter att ha lagt till 300 μL lysbuffert till frysta cellpellets, kort virvelprover och inkubera på is i 10 min.
- Upprepa processen för att virvla och ruva prover på is 3x. Därefter centrifugprover vid 15 000 x g i 10 min vid 4 °C, samla sedan upp supernatanter och förvara vid -80 °C.
- Lös proteiner som finns i 20 μL volymer av supernatantprover med elektrofores på prefabricerade linjära 8−16% polyakrylamid minigeler och överföra till nitrocellulosamembran. Blockera membran genom att inkubera med PBS-Tween 20 (0,02%) lösning som innehåller 5 % fettfri torr mjölk.
- Sondmembran genom att inkubera med en eller flera primära antikroppar (t.ex. marsvin anti-NSP3 eller anti-VP6 antisera, mus monoklonala anti-Flag M2-antikroppar eller kanin monoklonala anti-PCNA-antikroppar). Detektera primära antikroppar genom att inkubera membran med hästantimus IgG, anti-marsvin IgG eller get anti-kanin IgG pepparrot peroxidaskonjugerade sekundära antikroppar, följt av den förbättrade chemiluminescence (ECL) pepparrot chemiluminescence substrat. Visualisera luminescenssignaler med hjälp av ett gelavbildningssystem (Table of Materials) eller röntgenfilm.
8. Live-cell imaging av celler infekterade med FP-uttrycker virus
- Frö 6-brunnsplattor med 3 x 105 MA104-celler per brunn i totalt 2 ml DMEM komplett medium. Placera plattorna i en 37 °C, 5% CO2-inkubator och låt stå tills cellerna når confluency (3−5 dagar).
OBS: Brunnar med konfluenta monolager kommer att innehålla ~ 1,2 x 106 celler. - Aktivera rotavirusprover, av känd titer, genom inkubation med 10 μg/ml trypsin vid 37 °C i 1 h.
- Skölj 6-brunnsplattor med MA104 monolager 2x med 2 ml PBS. Infektera celler genom att till varje brunn lägga till 200 μl inokulat som innehåller 3−5 PFU per cell trypsinaktiverat rotavirus i DMEM ofullständigt medium. Återför plattorna till inkubatorn och stenplattorna försiktigt för att omfördela inokulat över cellens monolager var 10:e minut.
OBS: Brunnar som är mock infekterade med virusfria DMEM inoculum bör ingå som kontroller. - Efter 1 h virus adsorption, skölj monolayer 2x med PBS och ersätta medium med 0,5 ml per brunn DMEM ofullständigt medium. Vid 7,5 h post infektion, ersätta odlingsmedium med DMEM med låg bakgrund fluorescens (Tabell av material). Vid 8 h post infektion, använd en levande cell imager för att undersöka celler vid 20x förstoring för grön, röd eller blå fluorescens signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det omvända genetikprotokollet som beskrivs i denna artikel fortsätter genom flera olika steg: (1) samtransfekt av BHK-T7-celler med rotavirus pT7 transkriptionsvektorer och ett pCMV/NP868R-uttryck plasmid, (2) övervakande av transfected BHK-T7 celler med MA104 celler, (3) förstärkning av rekombinanta virus som finns i BHK-T7/MA104 celler lysates med MA104 celler, och (4) plack isolering av rekombinanta virus med MA104 celler (figur 2). I våra händer är protokollet effektivt, vilket ger titrar av rekombinant wildtype SA11 virus (rSA11/wt) i BHK-T7/MA104 cell lysates av ~ 104 PFU/mL och i förstärkt MA104 cell lysates av >1 x 107 PFU/mL. SA11 rekombinanta virus som genereras av omvänd genetik med modifierad pT7/NSP3SA11 plasmider som uttrycker FPs (t.ex. rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG) växer till titrar som är ~4-faldig mindre än rSA11/wt.
Efter det omvända genetikprotokollet genererade vi rekombinanta SA11-virus som lätt identifierades genom plackanalys på MA104-celler, vilket möjliggjorde plackisolering (figur 3D). Virus i plack plockades med en lång spets engångsöverföring pipet och förstärks på MA104 celler. DsRNA-genomen av plakett-renade rSA11/wt och rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG virus extraherades med guanidinium tiocyanat, löstes med elektrofores på en 10% polyalamryid gel, och detekterades genom färgning med ethidium bromid (figur 3A). Som väntat migrerade segmentet 7 (NSP3) dsRNA av rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG mycket långsammare än rSA11/wt (figur 3A) på grund av närvaron av 2A-3xFL-UnaG-sekvenser. Segmentet 7 (NSP3) dsRNA av rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG var gel renas, omvandlas till cDNA form av RT-PCR, och sekvenserade för att bekräfta noggrannhet.
För att kontrollera om det unag fluorescerande proteinet uttrycks var MA104-celler i 6-brunnsplattor infekterade med 3 PFU per cell av rSA11/wt och rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. Vid 8 h post infektion, odling medium i plattor ersattes med 0,5 ml DMEM med låg bakgrund fluorescens per brunn och plattorna inkuberas i ytterligare 30 min vid 37 °C i en CO2 inkubator. Därefter undersöktes plattor för UnaG-uttryck med hjälp av en levande cellbildare. Analysen visade att rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG producerade grön fluorescens, vilket verifierade unag-genens funktionalitet i det rekombinanta viruset (figur 3B). Däremot upptäcktes inte grön fluorescens i celler infekterade med rSA11/wt. För att ta itu med om 2A-elementet i det modifierade segmentet 7 av rSA11/NSP3-2AxFL-UnaG främjade uttrycket av två separata proteiner (NSP3-2A och 3xFL-UnaG), ma104 celler var infekterade med rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG och rSA11/wt. Cell lysates var beredd från celler skördas vid 8 h post infektion, lösas av gel elektrofores och blottade på nitrocellulosa filter. Blots var sonderade med antikroppar som är specifika för rotavirus VP6 och NSP3 och FLAG taggen. Analysen visade att NSP3-2A och 3xFL-UnaG uttrycktes som separata proteiner i celler infekterade med rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG, vilket indikerar att 2A-elementet var funktionellt (figur 3C). Celler infekterade med rSA11/wt uttryckte inte protein som erkänns av anti-FLAG antikroppar. NSP3-proteinet som finns i rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG-infekterade celler av anti-NSP3-antikroppar migrerade något långsammare än NSP3 som finns i rSA11/wt-infekterade celler på grund av förekomsten av kvarleva 2A rester vid C-ändstationen av NSP3.
Figur 1: Rotavirus omvänd genetik plasmider. (A)Fulllängds cDNAs av 11 SA11 rotavirusgenom segmenten är placerade inom pT7 plasmider, ligated uppströms med en promotor för T7 RNA polymeras och nedströms med en HDV ribozyme. I närvaro av T7 RNA-polymeras producerar rotavirus pT7 plasmider fullängds SA11 (+)RNAs med autentiska 5' och 3'termini. (B)Scheman för (+)RNA- och proteinprodukter tillverkade av pT7/NSP3-2A-3xFL-UnaG plasmid. Schemat innehåller NSP3 cDNA-sekvensen och sekvenser för svinteschovirus 2A-liknande (2A) element, taggen 3x FLAG (FL) och det gröna fluorescerande proteinet UnaG. Positionen för 2A translationell stop-restart-plats indikeras med en röd pil. På grund av aktiviteten hos 2A-elementet producerar översättningen av RNA två proteiner. NSP3-delen innehåller rester av 2A-elementet och UnaG-delen är smält till en 3x FLAG-tagg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Rotavirus omvänd genetik system. BHK-T7 monolayers transfektas med 11 pT7 plasmider, var och en uttrycker en annan SA11 (+)RNA, och en pCMV vektor som uttrycker afrikansk svinpest virus (ASFV) NP868R tak enzym (pCMV/NP868R). Vid 3 dagar efter infektion (d.p.i.), BHK-T7 cellerna övervakas med MA104 celler. Vid 7 dagar efter infektion, rekombinanta rotaviruses i BHK-T7/MA104 cell lysates förstärks av passage på MA104 celler, sedan isoleras genom plack rening. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Egenskaper hos de rekombinanta stammarna rSA11/wt och rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. (A)Elektroforesiska profiler av segmenten dsRNA-genom av plakettisolerade rSA11-stammar. Segmenten 11 genom är numrerade och förskjutningen i positionen för segment 7 (NSP3) indikeras med en röd linje. (B)Fluorescens som detekteras i rSA11-infekterade MA104-celler vid 8 h postinfektion med hjälp av en levande cellbildare (20x förstoring) inställd på den gröna detektionskanalen. Skala bar = 100 μm.(C)Immunoblot analys av proteiner som finns vid 8 h post infektion i MA104 celler infekterade med rSA11 stammar med marsvin anti-VP6 och anti-NSP3 antisera och mus anti-FLAG monoklonala antikroppar. (D)Plack som produceras av rSA11/wt på MA104 celler vid 3 dagar efter infektion och upptäcks genom neutral röd färgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vårt laboratorium förlitar vi oss rutinmässigt på det omvända genetikprotokollet som beskrivs häri för att producera rekombinanta SA11 rotaviruses. Med detta tillvägagångssätt, individer med liten erfarenhet av molekylärbiologiska tekniker eller arbetar med rotavirus återhämta rekombinanta virus även på deras första försök. Vi har genererat nära 100 rekombinanta virus efter detta protokoll, inklusive de med genom som har omarbetats för att uttrycka främmande proteiner (t.ex. FPs) och som innehåller sekvens tillägg, borttagningar och punkt mutationer.
De tillstånd och inkubationstider som anges i detta protokoll gäller för återvinning av väl växande stammar av rekombinanta virus. Justeringar bör övervägas om man försöker återvinna SA11-virus som på grund av genetisk modifiering kan förväntas växa dåligt. I synnerhet, eftersom titer av sådana virus i transfected BHK-T7/MA014 cell lysates kan vara låg, vi vanligtvis fördubbla mängden lysate används som inokulat i efterföljande förstärkning steg. Dessutom, vid förstärkningssteget, kan dåligt växande virus kräva längre inkubationstider innan de når nivåer av CPE som är tillräckliga för cellskörd. Med sådana virus kan vi tillåta att infektioner fortsätter i 10−14 dagar, eller ännu längre, innan vi skördar celler. Slutligen, dåligt växande virus kommer sannolikt att generera små, långsamt växande plack på MA104 celler. Således, för att plack isolera dessa virus, kan det vara nödvändigt att tillåta plack att utvecklas fram till 6−10 dagar efter infektion innan färgning celler med neutralt rött och plockplack.
Enligt vår erfarenhet är den enskilt viktigaste faktorn för tillförlitlig återhämtning av rekombinanta rotavirus användningen av friska, välskötta BHK-T7-celler. I vårt laboratorium, vi rutinmässigt passage BHK-T7 celler 2x i veckan vid samma utspädning med medium kompletteras inte bara med 10% FBS, men också med NEAA, TPB, och höga nivåer av glukos (GMEM komplett medium). De ytterligare kosttillskott hjälpa BHK-T7 celler behålla utökad lönsamhet efter plasmid transfection, en faktor som sannolikt är avgörande för att återvinna dåligt växande muterade rekombinanta virus. Vi kompletterar mediet varannan passage med G418, ett antibiotikum som väljer för underhåll av T7 polymeras uttryck plasmid. Passage villkor bör vara sådana att BHK-T7 celler aldrig får växa förbi sammanflödet, förhållanden som snabbt leder till minskad cell livskraft. För oss, BHK-T7 celler som har tillåtits att växa för mycket fungerar dåligt i omvänd genetik protokollet, även om cellerna är därefter passagede lämpligt flera gånger. Istället för att försöka rehabilitera igenvuxna BHK-T7-celler startar vi om härstamningen med celler som tidigare lagrats i flytande kväve.
Mycoplasma kontaminering av BHK-T7 och MA104 celler kan vara en viktig faktor i misslyckandet med rotavirus omvänd genetik systemet att generera rekombinant virus. I vårt laboratorium använder vi en PCR-baserad mykoplasma detektionssats (Table of Materials) för att kontrollera kontaminering av cellinjer, och när det upptäcks är det oftast förknippas med våra BHK-T7-celler. Vi har inte försökt att bota cellinjer för att förorena mykoplasma, utan i stället återupprätta linjerna med tidigare mykoplasmafria passager lagrade i flytande kväve. Innan vi börjar nya cellinjer kasserar vi alla tidigare använda medel- och medeltillskott och sanerar grundligt inkubatorer, biologiska säkerhetsskåp, vattenbad, labbbänkar och pipettors. Vi använder också mycoplasma detektion kit för att kontrollera lager av rekombinanta virus för kontaminering. På grund av resistensen hos rotaviruspartiklarna mot denaturering av organiska lösningsmedel, såsom Vertrel VF32,är det möjligt att befria viruslager från att förorena mykoplasma, vilket motverkar behovet av att regenerera rekombinanta virus genom omvänd genetik. Det är viktigt att betona att cellinjer och viruspreparat som tas emot i laboratoriet bör kontrolleras med hänsyn till mykoplasmakontaminering före rutinmässig användning.
Även dag in och dag ut, använder vi samma protokoll för att generera rekombinanta virus, vi vet att vissa ändringar kan göras som inte kommer att hindra virusåtervinning. Till exempel (i) co-transfection av pCMV/NSP868R capping-enzym plasmid med SA11 pT7 vektorer krävs inte för återvinning av rekombinanta virus. Medan tillägg av tak plasmid ger högre virus titers i transfected BHK-T7/MA104 cell lysates, har vi kunnat återvinna många virus, inklusive de som uttrycker FPs, utan den. Vi har dock dragit slutsatsen att uttryck för tak enzym av pCMV/NP868R kan bidra avsevärt till återvinning av mindre lämpliga virus. (ii) Vi har funnit att rekombinanta virus kan genereras även om mängden transfection reagens (Tabell över material) som används i omvänd genetik protokollet minskas med en halv, en ändring som avsevärt kan minska kostnaderna. (iii) På samma sätt har vi fastställt att M199 komplett medium kan användas i stället för DMEM komplett medium. iv) Slutligen finns det inget fastställt krav på vilken typ av vektorstamnät som måste användas vid framställning av sa11 T7-transkriptionsvektorer. Så länge den virala cDNA i plasmid är omgiven av en uppströms T7 promotor och en nedströms HDV ribozyme och T7 terminator, plasmid kan förväntas stödja återvinning av rekombinanta virus. Noterbart är att pGEM-, pBluescript och pUC-baserade vektorer har använts framgångsrikt i det omvända genetiksystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag R03 AI131072 och R21 AI144881, Indiana University Start-Up Finansiering, och Lawrence M. Blatt Endowment. Vi tackar medlemmar av IU Rotahoosier laboratoriet, Ulrich Desselberger, och Guido Papa för deras många bidrag och förslag för att utveckla omvänd genetik protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
References
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- International Committee on Taxonomy of Viruses. Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release. , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019).
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, Suppl 2 96-105 (2016).
- Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
- Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
- McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
- Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
- Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
- Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
- Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
- Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
- Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
- Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
- Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
- Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
- Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
- Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
- Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
- Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
- Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
- Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
- Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
- Donnelly, M. L., et al. The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
- Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , HHS publication no. CDC 21-1112 (2009).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
- Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).
