Summary
Vi præsenterer en metode til at undersøge tidlige osteoarthritiske ændringer på celleniveau i ledbrusk ved hjælp af atomkraftmikroskopi (AFM).
Abstract
Biomekaniske egenskaber af celler og væv ikke kun regulere deres form og funktion, men er også afgørende for at bevare deres vitalitet. Ændringer i elasticitet kan udbrede eller udløse udbrud af større sygdomme som kræft eller slidgigt (OA). Atomic force mikroskopi (AFM) har vist sig som et stærkt redskab til kvalitativt og kvantitativt at karakterisere de biomekaniske egenskaber af specifikke biologiske målstrukturer på en mikroskopisk skala, måle kræfter i en række fra så lille som piconewton til mikronewton. Biomekaniske egenskaber er af særlig betydning i muskel- og skeletvæv, som udsættes for høje belastningsniveauer. OA som en degenerativ sygdom i brusk resulterer i afbrydelse af den pericellulære matrix (PCM) og den rumlige omlægning af chondrocytter indlejret i deres ekstracellulære matrix (ECM). Disruption i PCM og ECM har været forbundet med ændringer i bruskens biomekaniske egenskaber. I denne undersøgelse brugte vi AFM til at kvantificere disse ændringer i forhold til de specifikke ændringer i rumlige mønstre af chondrocytterne. Ved hver mønsterændring blev der observeret betydelige ændringer i elasticiteten for både PCM og ECM. Måling af den lokale elasticitet giver således mulighed for at drage direkte konklusioner om graden af lokal vævsdegeneration i OA.
Introduction
Ledbrusk er en avaskulær, aneuralvæv. Sparsomt spredte chondrocytter producere, organisere og vedligeholde en ekspansiv ekstracellulær matrix (ECM), hvor de er indlejret. Som en særskilt og specialiseret del af ECM, chondrocytter er omgivet af et tyndt lag af specialiserede matrix kendt som pericellulære matrix (PCM). PCM fungerer som en mechanosensitive celle-matrix interface1, der beskytter chondrocytes2 og modulerer deres biosyntetiske respons3. Som tidligere beskrevet4, i sund brusk, chondrocytter er arrangeret i specifikke, forskellige rumlige mønstre, der er specifikke for hvert væv lag og fælles4,5 og afhænger af fælles-specifikke mekaniske lastning mekanismer6. Disse mønstre skifter fra par og strenge i sund brusk til dobbelte strenge med debut af slidgigt (OA). Med yderligere progression af sygdommen danner chondrocytter små klynger, stigende gradvist i størrelse til store klynger i avanceret OA. Et fuldstændigt tab af enhver organisatorisk struktur og induktion af apoptose er observeret i slutstadiet OA. Således, chondrocyt cellulære arrangement kan bruges som et billede-baseret biomarkør for OA progression4.
Biomekaniske egenskaber af celler og væv ikke kun regulere deres form og funktion, men er også afgørende for at bevare deres vitalitet. Ændringer i elasticitet kan udbrede eller udløse udbrud af større sygdomme som kræft eller OA. Atomic force mikroskopi (AFM) har vist sig som et kraftfuldt redskab til kvalitativt og kvantitativt karakterisere de biomekaniske egenskaber af specifikke biologiske målstrukturer på en mikroskopisk skala, der måler en bred vifte af kraft, fra piconewton til mikronewton. Den vigtigste anvendelse af AFM er at måle overfladetopografien og de mekaniske egenskaber af prøver ved opløsning 7 af subnanometer. Måleanordningen består af tre hovedkomponenter: 1) En AFM-sonde, som er en skarp spids monteret på en cantilever og anvendes til direkte interaktion med prøvens overflade. Når der påføres kraft på kantiler, deformation af sidstnævnte sker i henhold til den målte vævs egenskaber. 2) Et optisk system, der projicerer en laserstråle på cantilever, som derefter afspejles til en detektorenhed. 3) En fotodiodedetektor, der fanger lyset afbøjet fra cantilever. Det konverterer de modtagne oplysninger om laser afbøjning af cantilever i en kraft kurve, der kan analyseres.
Hovedprincippet i AFM er således påvisning af den kraft, der virker mellem AFM-sonden og prøvens målstruktur. De opnåede kraftkurver beskriver målstrukturernes mekaniske egenskaber på prøveoverfladen som elasticitet, ladningsfordeling, magnetisering, udbyttestress og elastisk plastdeformationsdynamik8. En vigtig fordel ved AFM i forhold til andre billeddannelse teknikker er, at AFM kan bruges til at måle de mekaniske egenskaber af levende celler i medium eller væv i en indfødt tilstand uden at beskadige vævet. AFM kan fungere både under flydende eller tørre forhold. Der er ikke noget krav om forberedelse af prøver. AFM giver mulighed for at afbilde en prøve og måle dens mekaniske egenskaber samtidigt i prøver, der er tæt på fysiologiske forhold. I denne undersøgelse beskriver vi en ny tilgang til at vurdere OA progression ved at måle elasticiteten af PCM og ECM i indfødte ledbrusk. Korrelationen mellem rumlig organisering af chondrocytter med graden af lokal vævsdegeneration giver et helt nyt perspektiv for tidlig påvisning af OA. Den funktionelle relevans af disse mønstre er imidlertid endnu ikke blevet evalueret. Fordi den vigtigste funktion af ledbrusk er bærende ved lav friktion, skal vævet have elastiske egenskaber. AFM gør det muligt at måle ikke blot ecm'ens elasticitet, men også de rumlige cellemønstre, der er indlejret i deres PCM. Den observerede korrelation mellem elasticitet og rumlig mønsterændring af chondrocytterne er så stærk, at måling af elasticitet alene kan tillade stratificering af lokal vævsdegeneration.
Elastisk moduli af PCM og ECM blev vurderet i 35 μm tynde sektioner ved hjælp af et AFM-system integreret i et omvendt fasekontrastmikroskop, der tillod samtidig visualisering af bruskprøven. Denne protokol er baseret på en undersøgelse, der allerede er offentliggjort fra vores laboratorium9 og specifikt beskriver, hvordan man karakteriserer den rumlige arrangement af chondrocytter og hvordan man kan måle elasticiteten i deres tilknyttede PCM og ECM. Ved hver mønsterændring af chondrocytterne kan der også observeres betydelige ændringer i elasticiteten for både PCM og ECM, hvilket gør det muligt at bruge denne teknik til direkte at måle bruskstadens degeneration.
Denne validerede tilgang åbner en ny måde at evaluere OA progression og terapeutiske virkninger på tidlige stadier, før makroskopisk væv nedbrydning faktisk begynder at dukke op. Udførelse af AFM målinger konsekvent er en vanskelig proces. I den følgende protokol beskriver vi, hvordan du forbereder prøven, der skal måles ved AFM, hvordan man udfører de faktiske AFM målinger startende med forberedelse af cantilever, hvordan man kalibrerer AFM, og derefter hvordan man udfører målingerne. Trinvise instruktioner giver en klar og præcis tilgang til at opnå pålidelige data og tilvejebringe grundlæggende strategier for behandling og fortolkning af dem. Diskussionsafsnittet beskriver også de mest almindelige faldgruber ved denne strenge metode og indeholder nyttige fejlfindingstip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De menneskelige brusk prøver blev fremstillet fra patienter, der gennemgår total knæ artroplastik i Department of Ortopædkirurgi af Universitetshospitalet i Tuebingen, Tyskland, og Winghofer-hospital, Rottenburg a.N., Tyskland, for slutstadiet OA i knæet. Fuld godkendelse af instituttets, institutions- og lokale etiske udvalg blev opnået, inden undersøgelsen påbegyndes (projektnummer 674/2016BO2). Der blev modtaget skriftligt informeret samtykke fra alle patienter før deltagelse. Metoderne blev udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer.
1. Forberedelse af prøver
- Forberedelse af brusk til kryotomskæring
- For at vurdere degenerative ændringer i knæleddet skal der tages ledbruserprøver fra den bærende zone af femorale kondyler efter vævsresektion fra patienterne.
BEMÆRK: Prøver, der undersøges, bør stadig indeholde mindst et tyndt lag subchondral knogle for at muliggøre en klar identifikation af vævsorienteringen med hensyn til den indre og ydre overflade, hvilket også giver mulighed for en standardiseret vævshøst af det øverste brusklag. Brusen kan bruges til AFM målinger indtil 24 timer efter operationen. Vævet kan opbevares i serum-fri Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) med 2% (v / v) penicillin-streptomycin og 1,2% (v / v) amphotericin B før brug. Opbevaring af prøverne i mere end 24 timer kan forårsage artefakter i AFM målinger på grund af væv hævelse, dog. - Skær ledbruslen som helhed fra subchondral knoglen ved hjælp af en skalpel og derefter integrere brusk prøve i vandopløselige indlejring medium på kryotomknop, der fryser under lav temperatur i kryotomenheden.
BEMÆRK: Det frosne medium stabiliserer det væv, det omslutter. Det resulterer også i frysning af bruskprøven sammen med indlejringsmediet. Når du skærer brusk fra knoglen, spore orienteringen af vævet. Vævet, der er indlejret til kryosektionerne, skal placeres på en sådan måde, at brusens øverste lag (dvs. ledfladen) vender mod klingen. Bemærk, at vævet skal være fuldt dækket af indlejringsmediet.
- For at vurdere degenerative ændringer i knæleddet skal der tages ledbruserprøver fra den bærende zone af femorale kondyler efter vævsresektion fra patienterne.
- Cryotome skæring af brusk
- Ved hjælp af en standard kryotom, del vævet i en tykkelse på 35 μm fra det øverste lag (dvs. leddelt overflade) af ledbrusk, der er indlejret i det frosne vandopløselige embedding medium.
BEMÆRK: I alt kan op til 300 μm (hvilket svarer til ca. ni sektioner) sektionsopdelt og anvendes til analyserne. Den foreslåede grænse på 300 μm svarer til den visuelle indtrængningsdybde, der normalt kan opnås med fluorescensmikroskopi i hyalinbrusk, såsom ledbrusk. Det er således muligt at sortere brusk efter det fremherskende lokale rumlige mønster og derefter måle disse mønstre i de tilsvarende sektioner. - Sektionerne samles på en glasrutsjebane, og sektionerne skylles 3x med fosfat-bufferet saltvand (PBS) for at fjerne det vandopløselige indlejringsmedium.
- Ved hjælp af en standard kryotom, del vævet i en tykkelse på 35 μm fra det øverste lag (dvs. leddelt overflade) af ledbrusk, der er indlejret i det frosne vandopløselige embedding medium.
- Limning af brusksektioner på en AFM-kompatibel petriskål
BEMÆRK: Da AFM'en indsamler data ved mekanisk indrykning af prøven, skal sektionerne fastgøres for at muliggøre præcise målinger.- Lim forsigtigt de 35 μm tykke sektioner med biokompatibel prøvelim på vævskulturretter, der er kompatible med AFM-enheden. For at gøre dette skal du tage 2−3 dråber lim og sætte dem på vævskulturskålen på det sted, hvor kanten af sektionen ender. Nu sætte brusk sektion på limen og lad det holde fast til overfladen af vævskultur parabol.
BEMÆRK: De 35 μm tykke dele af hyaline ledbrusning er ikke særlig tilbøjelige til curling. Men hvis der opstår curling, når prøverne fjernes fra buffermediet, skal du sørge for, at så lidt væske som muligt klæber til prøverne. Så snart det overskydende vand er tørret op, direkte sprede væv på de spredte pletter af lim, så det er fastgjort til overfladen af cellekultur parabol. Limen påføres kun i et tyndt lag ved kanterne af prøven og ikke på hele sektionen. Mål kun den del af prøven, der er langt fra det limede område for at eliminere muligheden for, at limen forstyrrer målingerne. - Inkuber sektionerne ved stuetemperatur (RT) i 2 minutter for at lade lim og væv binde ordentligt. Derefter dække sektioner med Leibovitz's L-15 medium uden L-glutamin og uden natriumbikarbonat, så de er helt nedsænket.
BEMÆRK: Pludselige bevægelser af prøven under fiksering eller utilstrækkelig limpåføring er almindelige fejl, der resulterer i vævets løsrivelse fra dyrkningsskålen. Endvidere bør anvendelsen af Leibowitz-mediet ske på en skånsom måde for ikke at frigøre prøven fra overfladen på grund af "bølger", der er skabt af mediet. - Petriskålen anbringes med de limede sektioner i standardcellekulturkuvøsen ved 37 °C, indtil der foretages målinger.
BEMÆRK: Sørg for, at vævssektionerne er stabile og ikke løsner sig fra vævskulturskålens overflade ved at udføre hvert trin langsomt.
- Lim forsigtigt de 35 μm tykke sektioner med biokompatibel prøvelim på vævskulturretter, der er kompatible med AFM-enheden. For at gøre dette skal du tage 2−3 dråber lim og sætte dem på vævskulturskålen på det sted, hvor kanten af sektionen ender. Nu sætte brusk sektion på limen og lad det holde fast til overfladen af vævskultur parabol.
2. Cantilever forberedelse (limning mikrosfærerne)
- Forberedelse af AFM-enheden og fortynding af mikrosfærerne
- Anbring den cantilever på glasblokken, der er specificeret til luftmålinger, fastgør den med fjederen, og monter glasblokken på AFM-hovedet.
- Mikrosfærerne fortyndes i 100% ethanol (100 partikler/10 μL) og ultralyderes i 10 s, så mikrosfærerne adskilles og ikke klumper sammen.
- Forberedelse af opsætningen til limning
- Rengør et glasglasmed 70 % ethanol, og monter den på prøveholderen på AFM-enheden.
BEMÆRK: Udrensningen af slæden forhindrer støvpletter, der kan forstyrre limningsprocessen, i at akkumulere på slidens overflade. - 2 μL af mikrosfæresuspensionen anbringes midt på slæden og 2 μL lim i nærheden af mikrosfæresuspensionen.
BEMÆRK: Det anbefales at placere mikrosfæresuspensionen og limen tæt på hinanden for at muliggøre en hurtig overgang af kantilen mellem limen og mikrosfærerne. Hvis overgangen mellem dyppe cantilever i limen og komme i kontakt med en mikrosfære er for lang, vil limen i sidste ende hærde, og dermed miste sine klæbende egenskaber. - Lad ethanolvæsken i mikrosfæresuspensionen lufttørre, så mikrosfærerne er på plads.
- Rengør et glasglasmed 70 % ethanol, og monter den på prøveholderen på AFM-enheden.
- Limning af mikrosfærerne på kantilspidsen
- Dyp kantilen manuelt ind i limen ved hjælp af steppermotoren i 10 μm trin, indtil spidsen er dækket af lim. Udfør dette trin hurtigt, da limen tørrer hurtigt.
- Træk kantilen tilbage igen med 100 μm, flyt den mod mikrosfærerne, og placer kantilspidsen direkte over en enkelt mikrosfære.
- Der køres en kraftspektroskopimåling for at dyppe kantilspidsen på den valgte mikrosfære med de parametre, der er vist i tabel 1.
BEMÆRK: Ved at udføre dette trin anvendes en måling af mikrosfærens overflade til at etablere kontakt mellem kandens spids og mikrosfæren. Den relativt lange kontakttid, der er vist i tabel 1, giver mulighed for rigelig bindingstid mellem lim og mikrosfære. Den kraftafstandskurve, der opnås under dette trin, genereres som et biprodukt af limning af mikrosfæren på cantilever-spidsen og behandles ikke til yderligere analyse. - Når en mikrosfære er fastgjort til cantilever, trække glasblokken med cantilever monteret på toppen og derefter fjerne AFM hovedet fra mikroskopet. Endelig afmontere sneberen og cantilever fra AFM hovedet.
- Indvøse kantilen ved 65 °C i 2 timer og lad den tørre natten over ved RT, før målingerne påbegyndes.
BEMÆRK: Inkubation af cantilever forbedrer limens klæbende egenskaber, hvilket gør det cantilever-mikrosfære-kompleks mere stabilt.
3. Forberedelse af AFM-anordningen til målinger
- En glasblok, der er specificeret til måling i et flydende miljø på AFM-holderen, justeres således, at den øverste overflade er lige og parallelt med AFM-holderen.
- Ved hjælp af en pincet monteres den valgte cantilever omhyggeligt på glasblokkens overflade, så AFM-spidsen med mikrosfæren rager over det polerede optiske plan.
BEMÆRK: Den cantilever spids skal stikke ud over poleret plan for at kunne afspejle AFM's laser på fotodetektor. Vær meget forsigtig, når du placerer cantilever på AFM for ikke at ridse den polerede optiske overflade af glasblokken. Ridser glasblokken kan medføre problemer med at justere laserjusteringen og kan forstyrre de efterfølgende målinger. - Fordi cantilever vil blive udsat for mekanisk tryk, det skal fastsættes på plads. Stabilisere cantilever på glasblokken ved at skubbe den metalliske fjeder ind i rillen af blokken og fastspænding toppen af cantilever med foråret ved hjælp af pincet.
- Anbring forsigtigt glasblokken med kantilen på AFM-hovedet og fastgør den med den integrerede låsemekanisme. Sørg for, at fjederen vender mod venstre side, så kantileren er placeret i den korrekte retning. Monter derefter AFM-hovedet med cantilever på AFM-enheden.
4. Indlæsning af prøven og kalibrering af den, der kan
BEMÆRK: Her udføres kalibrering af enheden ved at køre en kraftkurve på den rene overflade af petriskålen fyldt med Leibovitz' medium uden prøvevæv. Kalibrering kan også udføres ved hjælp af en separat kontrol AFM skål kun fyldt med AFM medium uden prøven.
- Montering af prøven på AFM-enheden
- Petriskålen, der er tilberedt i trin 1.3.3, anbringes på PRØVEholderen af AFM.
- Tænd for petriskålvarmeren og sæt den til 37 °C. Lad vævskulturskålen nå optimal temperatur (dvs. 20 min).
- Placer en beskyttende folie på bunden af cantilever forsamling for at undgå kondensering af medium i AFM hovedet.
- Kalibrering af enheden
- Åbn softwaren ( Materialetabel ) efterfulgt aflaserjusteringsvinduetog vinduet, der viser indstillingerne for approachparameteren. Tænd derefter for steppermotoren, laserlyset og CCD-kameraet.
- Brug CCD-kameraet på mikroskopet til at visualisere og identificere cantilever. Ved hjælp af steppermotorfunktionen sænkes cantilever i trin på 100 μm, indtil kantileren er helt nedsænket i mediet.
BEMÆRK: Nedsænkningen af kantilen i væsken kan identificeres visuelt via CCD-kameraet. Når det bryder vandets overflade, kanden spidsen skaber let mærkbarcirkulære refleksioner i vandet. - Ret laseren oven på kantudkanden ved hjælp af justeringsskruerne.
BEMÆRK: Skruerne må ikke spoles over, da dette vil beskadige laserjusteringsmekanismen. Den cantilever ses nedefra og laserstrålen kommer ovenfra. - Når laseren er placeret på cantilever, justere laserstrålen ved hjælp af skruer i AFM enheden, således at den reflekterede stråle falder på midten af fotodetektor. Hold overvågning placeringen af laserstrålen ved hjælp af laser justering funktion.
BEMÆRK: Detektoren opfanger afbøjningen af laserstrålen, der reflekteres af den cantilever og konverterer den til et elektrisk signal. - Efter lasercantilever justering Sum skal Sum-signalet være 1 V eller derover, mens de laterale og lodrette afbøjninger skal være tæt på 0. Hvis disse værdier ikke opnås, skal fotodetektoren justeres.
- Indhentning af kalibreringskraftkurven
- For at nå overfladen på AFM skålen for at starte målingerne, skal du køre en scanner Approach med indflyvningsparametrene i tabel 2. Når bunden af vævskulturskålen er nået, trækkes kantilen tilbage med 100 μm.
BEMÆRK: På dette tidspunkt er sonden nøjagtigt 100 μm over fra bunden af vævskulturskålen. - Konfigurer RUN-parametrene, og juster de parametre, der vises i tabel 3. Klik på knappen KØR for at starte en måling og få en kurve for kalibreringskraftdistance.
BEMÆRK: Den kraftkurve, der opnås her,er vist i figur 1 . - På kalibreringskraft-afstandskurven skal du vælge området for en lineær tilpasning af den tilbagetrukkete kurve i softwaren.
BEMÆRK: Den lineære pasform udføres for at måle kandens følsomhed. Når den lineære pasform er på plads, gemmes værdierne af softwaren. Den fjederkonstante måling eller den termiske støj fra kantiler beregnes af softwaren bagefter. - Da målingerne udføres i medium ved en temperatur på 37 °C, indstilles temperaturvariablen til 37 °C i softwaren for at efterligne fysiologiske forhold så tæt som muligt.
BEMÆRK: Ved afslutningen af kalibreringen gemmes den lodrette afbøjning og vises i kraftenheden Newton (N) i stedet for volt (V), som er den enhed, som fotodiodedetektoren oprindeligt har registreret.
- For at nå overfladen på AFM skålen for at starte målingerne, skal du køre en scanner Approach med indflyvningsparametrene i tabel 2. Når bunden af vævskulturskålen er nået, trækkes kantilen tilbage med 100 μm.
5. Biomekanisk karakterisering af ECM og PCM ved at udføre elasticitetsmålinger via AFM
- Identifikation af chondrocytmønstrene i brusksektionen
- Overhold brusksektionen under et fasekontrastmikroskop integreret i AFM-systemet og identificere de specifikke cellulære mønstre10 af ledbrusk fra osteoarthritic knæet: enkeltstrenge (sunde vævsområder), dobbelte strenge (begynder vævdegeneration), små og store klynger (begge avancerede vævsdegeneration). Se figur 2A-D.
- Når det ønskede mønster er identificeret, måles to steder pr. valgt mønster pr. matrixtype (PCM eller ECM) og udføre ni målegentagelser på hvert målested (Figur 2E,F). Sørg for, at en stikprøvestørrelse er stor nok til at tage højde for eventuelle unøjagtigheder.
BEMÆRK: Ved PCM-målingerne placeres kantileren tæt på cellerne (som vist af de røde cirkler i figur 2E,F). For at foretage målinger af ECM skal du vælge et område uden celler (vist med det blå område i figur 2E,F) og udføre indrykningen som beskrevet i trin 5.2.
- Indrykning af det målrettede websted
- Der udføres en indflyvning efterfulgt af en tilbagetrækning, således at kantilerplaceret 100 μm over vævet, som vil være udgangspositionen for de efterfølgende målinger.
- Fokuser på PCM eller ECM af det mønster, der skal måles, og fastgør computermusen på det pågældende tidspunkt.
BEMÆRK: Musen fungerer som en visuel markør for målstedet for indrykning. Når fokus skifter til cantilever spidsen, vil vævsstrukturerne blive uadskillelige eller slørede. - Fokuser nu på sonden og flyt spidsen af sonden til det punkt, der tidligere var fastsat af computerpilen. Start derefter målingerne med RUNved hjælp af den indstillede punktparameter, der opnås ved kalibrering af cantilever.
BEMÆRK: En eksemplarisk kraftkurve opnået ved måling af PCM i en enkelt streng er vist i supplerende figur 1.
6. Databehandling
BEMÆRK: Dataanalysen eller bestemmelsen af den elastiske modulus udføres ved hjælp af en Hertz-model som beskrevet tidligere11,12. Indenters form var sfærisk på grund af brugen af mikrosfærer på spidsen , og Poissons forhold blev holdt på 0,5 baseret på tidligere litteratur13,14,15.
- Åbn databehandlingssoftwaren (Materialiststabel),der er kompatibel med de data, der er indhentet fra AFM-enheden.
- Vælg Hertz-modellen i softwaren til behandling af kraft-afstandskurverne. Indstil Poisson-forholdet til 0,5, og vælg spidsformen som kugleformet og en spidsradius på 12,5 μm.
- Når alle parametre er justeret, er resultaterne monteret, og Young's modulus beregnes og vises af softwaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Langs den fysiopatologiske model fra strenge til dobbelte strenge, til små og endelig til store klynger, både ECM (Figur 3A) og PCM (Figur 3B) elastisk moduli faldt betydeligt mellem hvert mønster ændring. Den eneste undtagelse var forskellen i ECM mellem strenge og dobbelte strenge (p = 0,072). Resultaterne viser, at ECM/PCM-forholdet (figur 4B) ikke ændrede sig væsentligt, mens der blev observeret et markant fald i de absolutte forskelle i elasticitet mellem ECM og PCM (figur 4A). Desuden viser resultaterne ingen signifikant tilknytning vedrørende ECM/PCM-forholdet eller tilknyttede cellulære rumlige ændringer (r = -0,099, p = 0,281).
Figur 1: Skematisk repræsentation af en kraftafstandskurve i AFM-kontakttilstand. Når sonden nærmer sig overfladen, er kræfterne for små til først at give en målbar afbøjning af spidsen, hvorved spidsen efterlades i uforstyrret position (1). Derefter, når cantilever er meget tæt på prøven, på grund af klæbende kræfter aktive mellem spidsen og sonden, cantilever faktisk hurtigt klikker mod prøven (2). Når sonden nærmer sig prøven yderligere, vender den frastødende afbøjning mod retningsbevægelsen med en næsten lineær funktion af højde og afbøjning, indtil den lodrette afbøjning når den relative setpunktsværdi (3). Ved tilbagetrækning (4) er der ud over de sænkende afbøjningskræfter også til stede, mens kantilertrækket i Z-aksen fra prøven. Da AFM-sonden trækkes af kontakten med prøven, bliver den først "fast" før den er i stand til at løsne sig fra vedhæftningen ved grænsefladen, selv hvilket fører til en kort negativ afbøjning af cantilever, før den igen når sin ubøjelige neutrale position uden kontakt med sonden (5). Omfanget af afbøjning udtrykkes i den kraft, der arbejder på cantilever udtrykt i nanonewtons. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentativ rumlig karakterisering af chondrocytter og AFM-målinger af den ekstracellulære matrix (ECM) og pericellulære matrix (PCM). (A-D) Karakterisering af de cellulære mønstre: strenge (A), dobbelte strenge (B), små klynger (C), og store klynger (D). Den elastiske moduli af PCM (røde cirkler) og ECM (blåt område) (E/F) blev vurderet for de forskellige cellulære mønstre i osteoarthritic brusk. Målestederne for ECM og PCM blev udvalgt af eksperimentatoren og er grafisk angivet med sorte kors. Den cantilever tip, der anvendes til målingerne er markeret med en hvid stjerne. Skalastænger ne repræsenterer 10 μm (A-D) og 100 μm (E/F). Figuren tilpasses og ændres fra Danalache et al.9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Sammenligning af den kvantificerede Young's moduli af den ekstracellulære matrix (ECM) og den pericellulære matrix (PCM) som en funktion af rumlige chondrocyte organisation. Med progressiv patologisk rumlig chondrocyt organisation, en gradvis reduktion af elasticitet blev bemærket i boxplots for både ECM (A) og PCM (B) (* p < 0,05, *** p < 0,001). Forkortelser: SS: enkelt strenge, DS: dobbelt strenge, SC: små klynger, BC: store klynger. Tallene er taget fra Danalache et al.9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Forholdet mellem de unges moduli af den ekstracellulære matrix (ECM) og den pericellulære matrix (PCM) som en funktion af cellulære rumlige organisation. En stadig mere patologisk rumlig chondrocyt organisation var forbundet med et fald i Young's moduli for både ECM og PCM (A). Mens disse rumlige ændringer fandt sted, forblev forholdet mellem ECM og PCM elasticitet konstant, hvilket ikke viste nogen væsentlige ændringer (B). Dataene præsenteres som et linjediagram med middel ± standardfejl (A) og boxplots (B). Forkortelser: SS: enkelt strenge, DS: dobbelt strenge, SC: små klynger, BC: store klynger. Tallene er taget fra Danalache et al.9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Repræsentativ kraftkurve opnået ved indrykning af den pericellulære matrix (PCM) af et enkelt strengmønster, der viser pasformsresultaterne (orange pil) samt den resterende rodmiddelfirkant (resterende RMS; sort pil). Fit-resultaterne omfatter kontaktpunktet mellem prøve og spids, Young's Modulus og grundlinjen. Den resterende RMS, der vises nedenfor, beskriver forskellen mellem pasformen og kraftdataene og repræsenterer dermed kvaliteten af en kraftkurvepasform. Klik her for at downloade dette tal.
| Tabel 1. Parametre for limning af en mikrosfære på AFM-sonden | |
| Parametre | Værdi |
| Setpoint | 5.0 V |
| Justere grundlinje | 1 |
| Trække længde | 90,0 μm |
| Z bevægelse | Konstant hastighed |
| Udvid hastigheden | 5,0 μm/s |
| Udvid tid | 18,0 s |
| Kontakttid | 90,0 s |
| Forsinkelsestilstand | Konstant kraft |
| Prøvehastighed | 2000 Hz |
Tabel 1. Parametre for limning af en mikrosfære på AFM-sonden.
| Tabel 2. Approachparametre | |
| Approach-parametre | Værdi |
| Tilgang iGain | 5,0 Hz |
| Tilgang PGain | 0.0002 |
| Indflyvning målhøjde | 10,0 μm |
| Tilgang setpoint | 5.00 V |
| Basislinje for indtoingen | 0.00 V |
Tabel 2. Approachparametre.
| Tabel 3. Kør parametre | |
| Parametre | Værdi |
| Setpoint | 1.0 V |
| Justere grundlinje | 1 |
| Trække længde | 90,0 μm |
| Z bevægelse | Konstant hastighed |
| Udvid hastigheden | 5,0 μm/s |
| Udvid tid | 18,0 s |
| Kontakttid | 0,0 s |
| Forsinkelsestilstand | Konstant kraft |
| Prøvehastighed | 2000 Hz |
Tabel 3. Kør parametre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af AFM som en ny og kraftfuld teknik til at måle biologiske materialers biomekaniske egenskaber på nanoskalaniveau målte vi ECM'ens og PCM's elastiske egenskaber i den menneskelige osteoarthritiske ledbrusk. Bruskprøver blev udvalgt i henhold til deres fremherskende rumlige mønster af chondrocyt organisation som en billedbaseret biomarkør for lokal vævdegeneration. Som forventet blev der observeret et kraftigt fald i værdierne for elasticitet i både ECM og PCM langs den rumlige reorganisering af chondrocyte. Disse observationer klart fremhæve, at afvigelserne i rumlige arrangement af chondrocytter var ikke kun forbundet med ændringer i de elastiske egenskaber af cellulære mikromiljø (PCM), men også i hele brusk (ECM). Desuden viste ECM/PCM-forholdet ingen væsentlige ændringer på trods af de robuste ændringer i pcm'ens elastiske moduli og ECM under OA. Disse resultater tyder på, at ændringerne i ECM's og PCM's mekaniske egenskaber fandt sted envejs og samtidig, hvilket kan betyde, at arten af gradvis destruktion er den samme for både PCM og ECM. OA indledning og progression udløser således betydelige PCM og ECM nedbrydning og i sidste ende ødelæggelse. Begge tab var forbundet med et betydeligt tab af biomekaniske egenskaber af ledbrusning, såsom dens elasticitet, som det fremgår af denne undersøgelse. Dette understreger den funktionelle relevans af den rumlige organisation af chondrocytter som en markør for biomekaniske egenskaber. Omvendt giver det os mulighed for at bruge lokale elasticitetsmålinger til at drage konklusioner om de lokalt fremherskende rumlige mønstre og dermed den lokale vævsdegeneration af brusen.
Atomic force mikroskopi (AFM) har vist sig som et højopløsningsværktøj til at studere væv på en ikke-destruktiv måde. Det fungerer ved fysisk sondering prøver med en delikat og bøjelig cantilever, der afspejler en laser på en fotodiode. Eventuelle ændringer i denne refleksion registreres og omdannes til et elektrisk signal. Mens AFM er et kraftfuldt værktøj til at foretage målinger i nanoskala, kommer det ikke uden sine begrænsninger og faldgruber. Særligt kritisk er den cantilever forberedelse ved limning mikrosfærerne. I forbindelse med denne metode anvendes mikrosfærer til at ændre indrykningsdybden og det lokale tryk under målinger. Ved hjælp af små mikrosfærer fastgjort til spidsen af sonden giver mulighed for måling af de biomekaniske egenskaber af et fibernetværk snarere end elasticiteten af enkelt fiber, når du bruger spidsen alene. Det forhindrer også vævsskader under måleprocessen. På grund af de cantilever sensorers delikate karakter skal der etableres en opmærksom og omhyggelig tilberedningsmåde for at opnå ensartede og præcise målinger. For at forhindre mikrosfærerne i at løsne sig fra sensorens spids anbefaler vi friskblandet lim, der ikke er ældre end en uge. Desuden er det afgørende for sensorens funktionalitet at placere mikrosfæren i spidsens centrum som lateral afvigelse i mikrosfæretilbehøret resulterer nemt i inkonsekvente målinger.
Placering af cantilever på glasblok og fastsættelse det med en passende fjeder er en delikat og fejlbehæftet proces, der kræver omhyggelig opmærksomhed og stabile hænder. Da der er stor sandsynlighed for, at cantilevers vil blive ødelagt af utrænede operatører, anbefaler vi, at der udføres flere testkørsler og praksis for komfortabelt at håndtere AFM's let brudbare komponenter.
En ren glasblok er afgørende for korrekt kalibrering af enheden og opnå pålidelige målinger. Snavs eller støv på blokkens optiske overflade kan forhindre korrekt laserjustering på fotodetektoren. Hvis der opstår problemer under laserjusteringen, kan det derfor være nødvendigt at vaske glasblokken af med ethanol en anden gang.
Dataanalyse eller bestemmelse af den elastiske modulus kan udføres ved hjælp af Hertz-modellen som beskrevet tidligere11,12. Kort sagt, de data, der genereres af indrykning er plots af kraft over bevægelse af cantilever spidsen. Under målingerne flyttes kanden i prøvens retning. Dette fører til, at den cantilever kommer i kontakt med prøven og efterfølgende til dens bøjning i den modsatte retning af den, hvor den oprindeligt bevægede sig. Samtidig forekommer der en indrykning af prøven med en vis mængde. For at kunne bruge Hertz-fit-modellen skal prøvens indrykning beregnes og justeres for at isolere den cantilever bøjningsparameter. Den parameter, der beskriver prøven, er Poissons forhold, som afhænger af det undersøgte materiale. For bløde biologiske prøver er Poissons forhold ofte sat til 0,515. Som nævnt ovenfor er formen af den anvendte indenter relevant for beregningen af Youngs modulus, da den dikterer de udvidelser, der skal foretages i den oprindelige Hertz-ligning. I tilfælde af det beskrevne eksperiment antages en sfærisk indenterform på grund af brugen af mikrosfærer.
Selv om AFM kan tilbyde nye og interessante muligheder for at indsamle data, afhænger konsistensen og pålideligheden af de producerede data i høj grad af den pågældende operatørs erfaringer. Flere af de trin, der er skitseret ovenfor, er tilbøjelige til menneskelige fejl og kræver tålmodighed og omhyggelighed til at udføre dem ordentligt.
På grund af de mange følsomme variabler, der kan påvirke måleresultaterne, kan de absolutte kraftværdier, der rapporteres i denne undersøgelse, ikke generaliseres, men er ret specifikke for vores eksperimentelle opsætning. Når du bruger denne teknik til at evaluere vævdegeneration af brusk, skal der først udføres nogle normaliserende målinger på forskellige rumlige mønstre for at skalere resultaterne til de specifikke eksperimentelle måleindstillinger. Forholdet mellem de forskellige elasticitetsmoduli og de rumlige mønstre vil dog ikke blive påvirket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker vores medforfattere fra den oprindelige publikation for deres hjælp og støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. Ramalingam, M., Ramakrishna, S. , Woodhead Publishing. Cambridge, UK. 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
