Summary
Wir präsentieren eine Methode zur Untersuchung früher osteoarthritischer Veränderungen auf zellulärer Ebene im Gelenkknorpel mittels Atomkraftmikroskopie (AFM).
Abstract
Biomechanische Eigenschaften von Zellen und Geweben regulieren nicht nur ihre Form und Funktion, sondern sind auch entscheidend für die Erhaltung ihrer Vitalität. Veränderungen der Elastizität können sich ausbreiten oder das Auslösen von schweren Krankheiten wie Krebs oder Arthrose (OA) auslösen. Die Atomkraftmikroskopie (AFM) hat sich zu einem starken Werkzeug entwickelt, um die biomechanischen Eigenschaften spezifischer biologischer Zielstrukturen auf mikroskopischer Ebene qualitativ und quantitativ zu charakterisieren und Kräfte in einem Bereich von so klein wie dem Piconewton bis zum Mikronewton zu messen. Biomechanische Eigenschaften sind von besonderer Bedeutung bei Muskel-Skelett-Geweben, die hohen Belastungen ausgesetzt sind. OA als degenerative Erkrankung des Knorpels führt zur Störung der perizellulären Matrix (PCM) und zur räumlichen Neuanordnung der in ihre extrazelluläre Matrix (ECM) eingebetteten Chondrozyten. Störungen in PCM und ECM wurden mit Veränderungen der biomechanischen Eigenschaften des Knorpels in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Studie haben wir AFM verwendet, um diese Veränderungen in Bezug auf die spezifischen räumlichen Musteränderungen der Chondrozyten zu quantifizieren. Mit jeder Musteränderung wurden signifikante Veränderungen der Elastizität sowohl für das PCM als auch für das ECM beobachtet. Die Messung der lokalen Elastizität ermöglicht somit direkte Rückschlüsse auf den Grad der lokalen Gewebedegeneration in OA.
Introduction
Gelenkknorpel ist ein avaskuläres, aneurales Gewebe. Spärlich verstreute Chondrozyten produzieren, organisieren und pflegen eine expansive extrazelluläre Matrix (ECM), in die sie eingebettet sind. Als eigenständiger und spezialisierter Teil des ECM sind Chondrozyten von einer dünnen Schicht spezialisierter Matrix umgeben, die als perizelluläre Matrix (PCM) bekannt ist. Das PCM fungiert als mechanosensitive Zellmatrix-Schnittstelle1, die die Chondrozyten2 schützt und ihre biosynthetische Reaktion moduliert3. Wie bereits beschrieben4, sind Chondrozyten in gesunden Knorpeln in spezifischen, unterschiedlichen räumlichen Mustern angeordnet, die für jede Gewebeschicht und jedes Gelenk4,5 spezifisch sind und von gelenkspezifischen mechanischen Lademechanismen abhängen6. Diese Muster ändern sich mit Beginn der Arthrose (OA) von Paaren und Saiten im gesunden Knorpel zu Doppeltenitern. Mit dem weiteren Fortschreiten der Krankheit bilden die Chondrozyten kleine Cluster, die allmählich zu großen Clustern in fortgeschrittenen OA anwachsen. Ein vollständiger Verlust jeglicher Organisationsstruktur und Induktion von Apoptose wird in der Endstufe OA beobachtet. Somit kann Chondrozyten-Zellanordnung als bildbasierter Biomarker für OA-Progression4verwendet werden.
Biomechanische Eigenschaften von Zellen und Geweben regulieren nicht nur ihre Form und Funktion, sondern sind auch entscheidend für die Erhaltung ihrer Vitalität. Veränderungen der Elastizität können sich ausbreiten oder den Beginn von schweren Krankheiten wie Krebs oder OA auslösen. Die Atomkraftmikroskopie (AFM) hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug entwickelt, um die biomechanischen Eigenschaften spezifischer biologischer Zielstrukturen auf mikroskopischer Ebene qualitativ und quantitativ zu charakterisieren und dabei ein breites Spektrum an Kraft von Piconewton bis Mikronewton zu messen. Die Hauptanwendung von AFM ist die Messung der Oberflächentopographie und der mechanischen Eigenschaften von Proben mit Subnanometer-Auflösung7. Das Messgerät besteht aus drei Hauptkomponenten: 1) Eine AFM-Sonde, die eine scharfe Spitze ist, die auf einem Ausleger montiert ist und für die direkte Interaktion mit der Oberfläche der Probe verwendet wird. Wenn Kraft auf den Ausleger ausgeübt wird, tritt eine Verformung des letzteren entsprechend den Eigenschaften des gemessenen Gewebes auf. 2) Ein optisches System, das einen Laserstrahl auf den Ausleger projiziert, der dann auf eine Detektoreinheit reflektiert wird. 3) Ein Photodiodendetektor, der das vom Ausleger abgelenkte Licht einfängt. Es wandelt die empfangenen Informationen über die Laserverformung durch den Ausleger in eine Kraftkurve um, die analysiert werden kann.
Das Hauptprinzip von AFM ist daher die Detektion der Kraft, die zwischen der AFM-Sonde und der Zielstruktur der Probe wirkt. Die erhaltenen Kraftkurven beschreiben die mechanischen Eigenschaften der Zielstrukturen auf der Probenoberfläche wie Elastizität, Ladungsverteilung, Magnetisierung, Streckgrenze und elastische plastische Verformungsdynamik8. Ein wichtiger Vorteil von AFM gegenüber anderen bildgebenden Verfahren ist, dass AFM verwendet werden kann, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen in mittleren oder Geweben in einem nativen Zustand zu messen, ohne das Gewebe zu beschädigen. AFM kann sowohl in flüssigen als auch trockenen Bedingungen betrieben werden. Eine Probenvorbereitung ist nicht erforderlich. AFM bietet die Möglichkeit, eine Probe abzubilden und ihre mechanischen Eigenschaften gleichzeitig in Proben zu messen, die sich in der Nähe physiologischer Bedingungen befinden. In der vorliegenden Studie beschreiben wir einen neuartigen Ansatz zur Beurteilung der OA-Progression, indem wir die Elastizität von PCM und ECM im nativen Gelenkknorpel messen. Die Korrelation der räumlichen Organisation von Chondrozyten mit dem Grad der lokalen Gewebedegeneration bietet eine völlig neue Perspektive für die Früherkennung von OA. Die funktionale Relevanz dieser Muster wurde jedoch bisher nicht bewertet. Da die Hauptfunktion des Gelenkknorpels das Tragen bei geringer Reibung ist, muss das Gewebe elastische Eigenschaften besitzen. AFM ermöglicht es, nicht nur die Elastizität des ECM zu messen, sondern auch die räumlichen zellulären Muster, die in ihr PCM eingebettet sind. Die beobachtete Korrelation der Elastizität mit der räumlichen Musteränderung der Chondrozyten ist so stark, dass die Messung der Elastizität allein eine Schichtung der lokalen Gewebedegeneration ermöglichen kann.
Die elastischen Module des PCM und des ECM wurden in 35 m dünnen Abschnitten mit einem Invertierten Phasenkontrastmikroskop untersucht, das eine gleichzeitige Visualisierung der Knorpelprobe ermöglichte. Dieses Protokoll basiert auf einer bereits aus unserem Labor9 veröffentlichten Studie und beschreibt speziell, wie die räumliche Anordnung der Chondrozyten charakterisiert und wie die Elastizität der zugehörigen PCM und ECM gemessen werden kann. Bei jeder Musteränderung der Chondrozyten können auch signifikante Veränderungen der Elastizität sowohl für das PCM als auch für das ECM beobachtet werden, so dass diese Technik verwendet werden kann, um das Stadium der Degeneration des Knorpels direkt zu messen.
Dieser validierte Ansatz eröffnet eine neue Möglichkeit, die OA-Progression und die therapeutischen Wirkungen in frühen Stadien zu bewerten, bevor der makroskopische Gewebeabbau tatsächlich auftritt. AFM-Messungen konsequent durchzuführen, ist ein mühsamer Prozess. Im folgenden Protokoll beschreiben wir, wie man die von AFM zu messende Probe vorbereitet, wie man die tatsächlichen AFM-Messungen ab der Vorbereitung des Auslegers durchführt, wie man den AFM kalibriert und wie man dann die Messungen durchführt. Schritt-für-Schritt-Anleitungen geben einen klaren und präzisen Ansatz, um zuverlässige Daten zu erhalten und grundlegende Strategien für deren Verarbeitung und Interpretation bereitzustellen. Im Diskussionsabschnitt werden auch die häufigsten Fallstricke dieser strengen Methode beschrieben und hilfreiche Tipps zur Fehlerbehebung gegeben.
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Protocol
Die menschlichen Knorpelproben wurden von Patienten entnommen, die sich einer totalen Kniearthroplastik in der Klinik für Orthopädische Chirurgie des Universitätsklinikums Tübingen und dem Winghofer-Krankenhaus Rottenburg a.N. für die Endphase des Knies unterziehen. Vor Beginn der Studie wurde die vollständige Genehmigung des Abteilungs-, institutionellen und lokalen Ethikausschusses eingeholt (Projektnummer 674/2016BO2). Vor der Teilnahme wurde von allen Patienten eine schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage eingesehen. Die Methoden wurden in Übereinstimmung mit den genehmigten Leitlinien durchgeführt.
1. Probenvorbereitung
- Vorbereitung des Knorpels für Kryotome-Sektionen
- Um degenerative Veränderungen im Kniegelenk zu bewerten, nehmen Sie Gelenkknorpelproben aus der tragenden Zone der Femoralkondylen nach Geweberesektion von den Patienten.
HINWEIS: Proben, die untersucht werden, sollten noch mindestens eine dünne Schicht subchondralen Knochens enthalten, um eine klare Identifizierung der Gewebeausrichtung in Bezug auf die innere und äußere Oberfläche zu ermöglichen und somit auch eine standardisierte Gewebeernte der obersten Knorpelschicht zu ermöglichen. Der Knorpel kann für AFM-Messungen bis 24 h nach der Operation verwendet werden. Das Gewebe kann in dem serumfreien Dulbecco-modifizierten Eagle-Medium (DMEM) mit 2% (v/v) Penicillin-Streptomycin und 1,2% (v/v) Amphotericin B vor der Anwendung gelagert werden. Die Lagerung der Proben für mehr als 24 h kann jedoch zu Artefakten in den AFM-Messungen aufgrund von Gewebeschwellungen führen. - Schneiden Sie den Gelenkknorpel als Ganzes mit Hilfe eines Skalpells aus dem subchondralen Knochen und betten Sie anschließend die Knorpelprobe in ein wasserlösliches Einbettmedium auf den Kryotomknopf, der bei niedriger Temperatur im Kryotomgerät gefriert.
HINWEIS: Das gefrorene Medium stabilisiert das Gewebe, das es umhüllt. Es führt auch zum Einfrieren der Knorpelprobe zusammen mit dem Einbettmedium. Beim Schneiden des Knorpels aus dem Knochen, verfolgen Sie die Ausrichtung des Gewebes. Das für die Kryosektionen eingebettete Gewebe muss so platziert werden, dass die obere Schicht (d. h. die Gelenkoberfläche) des Knorpels der Klinge gegenübersteht. Beachten Sie, dass das Gewebe vollständig durch das Einbettmedium abgedeckt werden muss.
- Um degenerative Veränderungen im Kniegelenk zu bewerten, nehmen Sie Gelenkknorpelproben aus der tragenden Zone der Femoralkondylen nach Geweberesektion von den Patienten.
- Kryotome-Sektion des Knorpels
- Schneiden Sie das Gewebe mit einer Dicke von 35 m mit hilfe eines Standard-Kryotomes von der obersten Schicht (d.h. der Gelenkoberfläche) des Gelenkknorpels ab, der in das gefrorene wasserlösliche Einbettmedium eingebettet ist.
HINWEIS: Insgesamt können bis zu 300 m (was etwa neun Abschnitten entspricht) geschnitten und für die Analysen verwendet werden. Die vorgeschlagene Grenze von 300 m entspricht der visuellen Eindringtiefe, die in der Regel mit Fluoreszenzmikroskopie im Hyalinknorpel wie Gelenkknorpel erreicht werden kann. So ist es möglich, Knorpel nach dem vorherrschenden lokalen Raummuster zu sortieren und diese Muster dann in den entsprechenden Abschnitten zu messen. - Sammeln Sie die Abschnitte auf einer Glasrutsche und spülen Sie die Abschnitte 3x mit phosphatgepufferter Salzsäure (PBS), um das wasserlösliche Einbettmedium zu entfernen.
- Schneiden Sie das Gewebe mit einer Dicke von 35 m mit hilfe eines Standard-Kryotomes von der obersten Schicht (d.h. der Gelenkoberfläche) des Gelenkknorpels ab, der in das gefrorene wasserlösliche Einbettmedium eingebettet ist.
- Kleben von Knorpelabschnitten auf eine AFM-kompatible Petrischale
HINWEIS: Da der AFM Daten durch mechanische eingerückte Daten auf der Probe sammelt, müssen die Abschnitte fixiert werden, um präzise Messungen zu ermöglichen.- Kleben Sie die 35 m dicken Abschnitte vorsichtig mit biokompatiblem Probenkleber auf Gewebekulturgeschirr, die mit dem AFM-Gerät kompatibel sind. Nehmen Sie dazu 2 bis 3 Tropfen des Klebers und legen Sie sie auf die Gewebekulturschale an der Stelle, an der der Rand des Abschnitts endet. Nun den Knorpelabschnitt auf den Kleber legen und fest an der Oberfläche der Gewebekulturschale kleben lassen.
HINWEIS: Die 35 m dicken Abschnitte des Hyalingelenkknorpels sind nicht sehr anfällig für Curling. Wenn jedoch beim Entfernen der Proben aus dem Puffermedium Curling auftritt, stellen Sie sicher, dass so wenig Flüssigkeit wie möglich an den Proben klebt. Sobald das überschüssige Wasser ausgetrocknet ist, das Gewebe direkt auf die verteilten Leimflecken verteilen, so dass es an der Oberfläche der Zellkulturschale befestigt wird. Der Kleber wird in einer dünnen Schicht nur an den Rändern der Probe und nicht auf den gesamten Abschnitt aufgetragen. Messen Sie nur den Teil der Probe, der weit von der geklebten Fläche entfernt ist, um die Möglichkeit zu vermeiden, dass der Kleber die Messungen stört. - Inkubieren Sie die Abschnitte bei Raumtemperatur (RT) für 2 min, damit sich Kleber und Gewebe richtig verkleben können. Dann decken Sie die Abschnitte mit Leibovitz L-15 Medium ohne L-Glutamin und ohne Natriumbicarbonat, so dass sie vollständig untergetaucht sind.
HINWEIS: Plötzliche Bewegungen der Probe während der Fixierung oder unzureichende Klebstoffanwendung sind häufige Fehler, die zur Ablösung des Gewebes von der Kulturschale führen. Darüber hinaus sollte die Anwendung des Leibowitz-Mediums auf sanfte Weise erfolgen, um die Probe nicht durch "Wellen", die durch das Medium erzeugt werden, von der Oberfläche zu lösen. - Platzieren Sie die Petrischale mit den geklebten Schnitten im Standard-Zellkultur-Inkubator bei 37 °C, bis Messungen durchgeführt werden.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Gewebeabschnitte stabil sind und sich nicht von der Oberfläche der Gewebekulturschale lösen, indem Sie jeden Schritt langsam durchführen.
- Kleben Sie die 35 m dicken Abschnitte vorsichtig mit biokompatiblem Probenkleber auf Gewebekulturgeschirr, die mit dem AFM-Gerät kompatibel sind. Nehmen Sie dazu 2 bis 3 Tropfen des Klebers und legen Sie sie auf die Gewebekulturschale an der Stelle, an der der Rand des Abschnitts endet. Nun den Knorpelabschnitt auf den Kleber legen und fest an der Oberfläche der Gewebekulturschale kleben lassen.
2. Auslegerpräparation (Verklebung der Mikrosphären)
- Vorbereitung des AFM-Geräts und Verdünnung der Mikrosphären
- Legen Sie den Ausleger auf den für Luftmessungen angegebenen Glasblock, fixieren Sie ihn mit der Feder und montieren Sie den Glasblock auf dem AFM-Kopf.
- Verdünnen Sie die Mikrosphären in 100% Ethanol (100 Partikel/10 l) und Ultraschall für 10 s, so dass die Mikrosphären getrennt werden und nicht zusammenklumpen.
- Vorbereiten des Setups für das Kleben
- Reinigen Sie einen Glasschlitten mit 70 % Ethanol und montieren Sie ihn am Probenhalter am AFM-Gerät.
HINWEIS: Die Reinigung des Dias verhindert, dass sich Staubflecken, die den Klebevorgang stören, auf der Oberfläche des Schlittens ansammeln. - Platzieren Sie 2 l der Mikrosphärensuspension in der Mitte des Dias und 2 l Leim in der Nähe der Mikrosphärensuspension.
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Mikrosphärenaufhängung und den Kleber nahe beieinander zu platzieren, um einen schnellen Übergang des Auslegers zwischen dem Kleber und den Mikrosphären zu ermöglichen. Wenn der Übergang zwischen dem Eintauchen des Auslegers in den Kleber und dem Kontakt mit einer Mikrosphäre zu lang ist, härtet der Kleber schließlich aus und verliert dadurch seine Klebeeigenschaften. - Lassen Sie das Ethanol in der Mikrosphäresuspension lufttrocken und lassen Sie die Mikrosphären an Ort und Stelle.
- Reinigen Sie einen Glasschlitten mit 70 % Ethanol und montieren Sie ihn am Probenhalter am AFM-Gerät.
- Kleben der Mikrosphären auf der Auslegerspitze
- Tauchen Sie den Ausleger manuell in den Kleber mit Hilfe des Schrittmotors in 10 m Schritten, bis die Spitze mit Kleber bedeckt ist. Führen Sie diesen Schritt schnell aus, da der Kleber schnell trocknet.
- Ziehen Sie den Ausleger wieder um 100 m zurück, bewegen Sie ihn in Richtung der Mikrosphären und positionieren Sie die Auslegerspitze direkt über einer einzigen Mikrosphäre.
- Führen Sie eine Kraftspektroskopiemessung durch, um die Auslegerspitze mit den in Tabelle 1dargestellten Parametern auf die ausgewählte Mikrosphäre zu tauchen.
HINWEIS: Durch die Ausführung dieses Schritts wird eine Messung der Oberfläche der Mikrosphäre verwendet, um den Kontakt zwischen der Spitze des Auslegers und der Mikrosphäre herzustellen. Die in Tabelle 1 dargestellte relativ lange Kontaktzeit ermöglicht eine ausreichende Verklebungszeit zwischen Kleber und Mikrosphäre. Die bei diesem Schritt erhaltene Kraft-Distanz-Kurve wird als Nebenprodukt der Verklebung der Mikrosphäre auf der Auslegerspitze erzeugt und nicht für weitere Analysen verarbeitet. - Sobald eine Mikrosphäre am Ausleger befestigt ist, ziehen Sie den Glasstein mit dem oben montierten Ausleger zurück und entfernen Sie dann den AFM-Kopf aus dem Mikroskop. Schließlich den Glasblock und auslegern vom AFM-Kopf abmontieren.
- Inkubieren Sie den Ausleger bei 65 °C für 2 h und lassen Sie ihn über Nacht bei RT trocknen, bevor Sie mit den Messungen beginnen.
HINWEIS: Die Inkubation des Auslegers verbessert die Klebstoffeigenschaften des Klebstoffs und macht den Ausleger-Mikrosphäre-Komplex stabiler.
3. Vorbereitung des AFM-Geräts für Messungen
- Stellen Sie einen Glasstein, der für die Messung in einer flüssigen Umgebung am AFM-Halter vorgesehen ist, so ein, dass die obere Oberfläche gerade und parallel zum AFM-Halter ist.
- Mit Hilfe einer Pinzette den ausgewählten Ausleger vorsichtig auf die Oberfläche des Glasblocks montieren, so dass die AFM-Spitze mit der Mikrosphäre über die polierte optische Ebene ragt.
HINWEIS: Die Spitze des Auslegers muss über die polierte Ebene ragen, um den Laser des AFM auf den Photodetektor reflektieren zu können. Seien Sie sehr vorsichtig, wenn Sie den Ausleger auf dem AFM platzieren, um die polierte optische Oberfläche des Glasblocks nicht zu zerkratzen. Das Kratzen des Glassteins kann zu Schwierigkeiten bei der Einstellung der Laserausrichtung führen und die nachfolgenden Messungen stören. - Da der Ausleger mechanischem Druck ausgesetzt ist, muss er fixiert werden. Stabilisieren Sie den Ausleger auf dem Glasstein, indem Sie die metallische Feder in die Nut des Blocks schieben und die Oberseite des Auslegers mit Hilfe einer Pinzette spannen.
- Stellen Sie den Glasstein mit dem Ausleger vorsichtig auf den AFM-Kopf und sichern Sie ihn mit dem integrierten Verriegelungsmechanismus. Stellen Sie sicher, dass die Feder nach links ausgerichtet ist, damit der Ausleger in die richtige Ausrichtung gebracht wird. Dann montieren Sie den AFM-Kopf mit dem Ausleger auf dem AFM-Gerät.
4. Laden der Probe und Kalibrierung des Auslegers
HINWEIS: Hier erfolgt die Kalibrierung des Geräts durch Ausführen einer Kraftkurve auf der sauberen Oberfläche der Petrischale, die mit Leibovitz' Medium ohne Probengewebe gefüllt ist. Die Kalibrierung kann auch mit einer separaten Steuerung AFM Schale nur mit dem AFM-Medium ohne die Probe gefüllt durchgeführt werden.
- Montage der Probe auf dem AFM-Gerät
- Legen Sie die in Schritt 1.3.3 zubereitete Petrischale auf den AFM-Probenhalter.
- Die Petrischalenheizung einschalten und auf 37 °C einstellen. Lassen Sie die Gewebekulturschale eine optimale Temperatur erreichen (d. h. 20 min).
- Legen Sie eine Schutzfolie auf die Basis der Auslegerbaugruppe, um die Kondensation des Mediums im AFM-Kopf zu vermeiden.
- Kalibrierung des Geräts
- Öffnen Sie die Software ( Tabelle der Materialien ), gefolgt vom Laserausrichtungsfenster und dem Fenster, in dem die Einstellungen derAnnäherungsparameterdargestellt werden. Schalten Sie dann den Schrittmotor, das Laserlicht und die CCD-Kamera ein.
- Verwenden Sie die CCD-Kamera am Mikroskop, um den Ausleger zu visualisieren und zu identifizieren. Senken Sie den Ausleger mit hilfe der Schrittmotorfunktion in 100 m Schritten, bis der Ausleger vollständig in das Medium getaucht ist.
HINWEIS: Das Eintauchen des Auslegers in die Flüssigkeit ist über die CCD-Kamera visuell identifizierbar. Wenn es die Wasseroberfläche bricht, erzeugt die Auslegerspitze leicht spürbare kreisförmige Reflexionen im Wasser. - Richten Sie den Laser mit den Verstellschrauben auf den Ausleger.
HINWEIS: Überwinden Sie die Schrauben nicht, da dies den Laserausrichtungsmechanismus beschädigen wird. Der Ausleger wird von unten betrachtet und der Laserstrahl kommt von oben. - Sobald der Laser auf dem Ausleger positioniert ist, stellen Sie den Laserstrahl mit Hilfe von Schrauben im AFM-Gerät ein, so dass der reflektierte Strahl auf die Mitte des Photodetektors fällt. Überwachen Sie die Position des Laserstrahls weiterhin mit der Laserausrichtungsfunktion.
HINWEIS: Der Detektor nimmt die Durchbiegung des laserstrahls auf, der vom Ausleger reflektiert wird, und wandelt ihn in ein elektrisches Signal um. - Nach der Laser-Auslegereinstellung muss das Sum-Signal 1 V oder höher sein, während die seitlichen und vertikalen Umlenkungen nahe 0 liegen müssen. Wenn diese Werte nicht ermittelt werden, stellen Sie den Photodetektor ein.
- Abrufen der Kalibrierkraftkurve
- Um die Oberfläche auf der AFM-Schale zu erreichen, um die Messungen zu starten, führen Sie einen Scanner-Ansatz mit den in Tabelle 2angegebenen Anflugparametern aus. Sobald der Boden der Gewebekulturschale erreicht ist, ziehen Sie den Ausleger um 100 m zurück.
HINWEIS: An dieser Stelle ist die Sonde genau 100 m über der Unterseite der Gewebekulturschale. - Richten Sie die RUN-Parameter ein, und passen Sie die in Tabelle 3angezeigten Parameter an. Klicken Sie auf die Schaltfläche RUN, um eine Messung zu starten und eine Kalibrierkraft-Entfernungskurve zu erhalten.
HINWEIS: Die hier erhaltene Kraftkurve ist in Abbildung 1dargestellt. - Wählen Sie in der Kalibrierkraft-Entfernungskurve den Bereich für eine lineare Anpassung der eingefahrenen Kurve in der Software aus.
HINWEIS: Die lineare Passung erfolgt, um die Empfindlichkeit des Auslegers zu messen. Sobald die lineare Passung vorhanden ist, werden die Werte von der Software gespeichert. Die federkonstante Messung oder das thermische Rauschen des Auslegers wird anschließend von der Software berechnet. - Da die Messungen in Mittel bei einer Temperatur von 37 °C durchgeführt werden, stellen Sie die Temperaturvariable auf 37 °C in der Software ein, um physiologische Bedingungen so genau wie möglich nachzuahmen.
HINWEIS: Am Ende der Kalibrierung wird die vertikale Durchbiegung gespeichert und in der Krafteinheit, dem Newton (N), anstelle von Volt (V), angezeigt, die die Einheit der ursprünglichen Registrierung durch den Photodiodendetektor ist.
- Um die Oberfläche auf der AFM-Schale zu erreichen, um die Messungen zu starten, führen Sie einen Scanner-Ansatz mit den in Tabelle 2angegebenen Anflugparametern aus. Sobald der Boden der Gewebekulturschale erreicht ist, ziehen Sie den Ausleger um 100 m zurück.
5. Biomechanische Charakterisierung von ECM und PCM durch Elastizitätsmessungen über AFM
- Identifizieren der Chondrozytenmuster im Knorpelbereich
- Beobachten Sie den Knorpelabschnitt unter einem im AFM-System integrierten Phasenkontrastmikroskop und identifizieren Sie die spezifischen zellulären Muster10 des Gelenkknorpels aus dem osteoarthritistischen Knie: einzelne Saiten (gesunde Gewebebereiche), Doppelsaiten (Anfang der Gewebedegeneration), kleine und große Cluster (beide fortgeschrittene Gewebedegeneration). Siehe Abbildung 2A–D.
- Messen Sie nach der Identifizierung des gewünschten spezifischen Musters zwei Standorte pro gewähltem Muster pro Matrixtyp (PCM oder ECM) und führen Sie neun Messwiederholungen an jeder Messstelle durch (Abbildung 2E,F). Stellen Sie eine Stichprobengröße sicher, die groß genug ist, um mögliche Ungenauigkeiten zu berücksichtigen.
HINWEIS: Für die PCM-Messungen stellen Sie den Ausleger in unmittelbarer Nähe zu den Zellen (wie die roten Kreise in Abbildung 2E,Fzeigen). Um Messungen des ECM durchzuführen, wählen Sie einen Bereich ohne Zellen aus (siehe blauer Bereich in Abbildung 2E,F), und führen Sie den Einzug wie in Schritt 5.2 beschrieben durch.
- Einrückung des Zielortes
- Führen Sie einen Ansatz mit anschließender Einziehung durch, so dass der Ausleger 100 m über dem Gewebe positioniert ist, was die Ausgangsposition für die nachfolgenden Messungen sein wird.
- Konzentrieren Sie sich auf das PCM oder ECM des zu messenden Musters und fixieren Sie die Computermaus an diesem Punkt.
HINWEIS: Die Maus dient als visuelle Markierung für die Zielort des Einzugs. Sobald sich der Fokus auf die Auslegerspitze verschiebt, werden die Gewebestrukturen ununterscheidbar oder verschwommen. - Konzentrieren Sie sich nun auf die Sonde und bewegen Sie die Spitze der Sonde auf den Punkt, der zuvor durch den Computerpfeil festgelegt wurde. Als nächstes starten Sie die Messungen mit RUN, mit dem Sollwertparameter, der durch Kalibrierung des Auslegers erhalten wird.
ANMERKUNG: Eine beispielhafte Kraftkurve, die bei der Messung des PCM einer einzelnen Zeichenfolge erhalten wird, ist in der ergänzenden Abbildung 1dargestellt.
6. Datenverarbeitung
ANMERKUNG: Die Datenanalyse oder Bestimmung des elastischen Moduls erfolgt mit einem Hertz-Modell, wie zuvor beschrieben11,12. Die Form des Einrückeers war sphärisch aufgrund der Verwendung von Mikrosphären an der Spitze und das Poisson-Verhältnis wurde auf Der Grundlage früherer Literatur13,14,15bei 0,5 gehalten.
- Öffnen Sie die Datenverarbeitungssoftware (Tabelle der Materialien), die mit den vom AFM-Gerät erhaltenen Daten kompatibel ist.
- Wählen Sie in der Software das Hertz-Modell für die Verarbeitung der Kraft-Distanz-Kurven aus. Legen Sie das Poisson-Verhältnis auf 0,5 fest, und wählen Sie die Spitzenform als kugelförmig und einen Spitzenradius von 12,5 m aus.
- Sobald alle Parameter angepasst sind, werden die Ergebnisse angepasst, und der Young-Modul wird von der Software berechnet und angezeigt.
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Representative Results
Entlang des physiopathologischen Modells von Saiten zu Doppelsaiten, zu kleinen und schließlich zu großen Clustern, verringerten sich sowohl ECM (Abbildung 3A) als auch PCM (Abbildung 3B) elastische Module zwischen jeder Musteränderung signifikant. Die einzige Ausnahme war der Unterschied im ECM zwischen Zeichenfolgen und Doppelzeichenfolgen (p = 0,072). Die Ergebnisse zeigen, dass sich das ECM/PCM-Verhältnis (Abbildung 4B) nicht wesentlich verändert hat, während eine deutliche Abnahme der absoluten Unterschiede in der Elastizität zwischen ECM und PCM beobachtet wurde (Abbildung 4A). Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse keinen signifikanten Zusammenhang in Bezug auf das ECM/PCM-Verhältnis oder die damit verbundenen zellulären räumlichen Veränderungen (r = -0,099, p = 0,281).
Abbildung 1: Schematische Darstellung einer Kraft-Entfernungskurve im AFM-Kontaktmodus. Wenn sich die Sonde der Oberfläche nähert, sind die Kräfte zu klein, um zunächst eine messbare Umlenkung der Spitze zu geben, wodurch die Spitze in ihrer ungestörten Position (1) bleibt. Wenn sich der Ausleger dann aufgrund der zwischen der Spitze und der Sonde aktiven Klebekräfte sehr nahe an der Probe befindet, schnappt sich der Ausleger tatsächlich schnell in Richtung der Probe (2). Wenn sich die Sonde weiter der Probe nähert, stellt sich die abstoßende Umlenkung dann der Richtungsbewegung, mit einer fast linearen Funktion von Höhe und Umlenkung, bis die vertikale Durchbiegung den relativen Sollwert erreicht (3). Beim Einziehen (4) sind zusätzlich zu den absenkenden Ablenkkräften auch Haftkräfte vorhanden, während der Ausleger in der Z-Achse aus der Probe zurückgezogen wird. Da die AFM-Sonde aus dem Kontakt mit der Probe gezogen wird, wird sie zunächst "stecken", bevor sie sich von der Haftung an der Schnittstelle lösen kann, was sogar zu einer kurzen negativen Durchbiegung des Auslegers führt, bevor sie wieder ihre unbeugsam neutrale Position ohne Kontakt mit der Sonde erreicht (5). Das Ausmaß der Ablenkung wird in der Kraft ausgedrückt, die am Ausleger in Nanonewtons arbeitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative räumliche Charakterisierung von Chondrozyten und AFM-Messungen der extrazellulären Matrix (ECM) und der perizellulären Matrix (PCM). (A-D) Charakterisierung der zellulären Muster: Zeichenfolgen (A), Doppelzeichenfolgen (B), kleine Cluster (C) und große Cluster (D). Die elastischen Module des PCM (rote Kreise) und ECM (blauer Bereich) (E/F) wurden auf die verschiedenen zellulären Muster im osteoarthritischen Knorpel untersucht. Die Messstellen für das ECM und PCM wurden vom Experimentator ausgewählt und durch schwarze Kreuze grafisch dargestellt. Die für die Messungen verwendete Auslegerspitze ist durch einen weißen Stern gekennzeichnet. Skalenstäbe repräsentieren 10 m (A-D) und 100 m (E/F). Die Figur wird von Danalache et al.9adaptiert und modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Vergleich der quantifizierten Young-Moduli der extrazellulären Matrix (ECM) und der perizellulären Matrix (PCM) als Funktion der räumlichen Chondrozytenorganisation. Bei der progressiven pathologischen räumlichen Chondrozytenorganisation wurde in den Boxplots sowohl für das ECM (A) als auch für das PCM (B) (*p < 0,05, ***p < 0,001) eine allmähliche Abnahme der Elastizität festgestellt. Abkürzungen: SS: einzelne Zeichenfolgen, DS: Doppelzeichenfolgen, SC: kleine Cluster, BC: große Cluster. Die Figuren stammen aus Danalache et al.9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Beziehung der Young-Moduli der extrazellulären Matrix (ECM) und der perizellulären Matrix (PCM) als Funktion der zellulären räumlichen Organisation. Eine zunehmend pathologische räumliche Chondrozyten-Organisation war mit einer Abnahme der Young-Moduli für ECM und PCM (A) verbunden. Während diese räumlichen Veränderungen stattfanden, blieb das Verhältnis von ECM- und PCM-Elastizität konstant, was keine signifikanten Veränderungen zeigte (B). Die Daten werden als Liniendiagramm mit dem Mittelwert - Standardfehler (A) und Boxplots (B) dargestellt. Abkürzungen: SS: einzelne Zeichenfolgen, DS: Doppelzeichenfolgen, SC: kleine Cluster, BC: große Cluster. Die Figuren stammen aus Danalache et al.9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Repräsentative Kraftkurve, die durch Einrückung der perizellulären Matrix (PCM) eines einzelnen Stringmusters erhalten wird, das die Anpassungsergebnisse (orangefarbener Pfeil) sowie das Restwurzelmittelquadrat (Rest-RMS; schwarzer Pfeil) zeigt. Die Anpassungsergebnisse umfassen den Kontaktpunkt zwischen Probe und Spitze, den Young-Modul us und die Baseline. Das unten angezeigte Rest-RMS beschreibt den Unterschied zwischen der Passung und den Kraftdaten und stellt damit die Qualität einer Kraftkurvenanpassung dar. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
| Tabelle 1. Parameter zum Verkleben einer Mikrosphäre auf der AFM-Sonde | |
| Parameter | Wert |
| Sollwert | 5,0 V |
| Anpassung der Basislinie | 1 |
| Zuglänge | 90,0 m |
| Z-Bewegung | Konstante Geschwindigkeit |
| Erweitern der Geschwindigkeit | 5,0 m/s |
| Verlängern der Zeit | 18,0 s |
| Kontaktzeit | 90,0 s |
| Verzögerungsmodus | Konstante Kraft |
| Abtastratrate | Hz 2000 |
Tabelle 1. Parameter zum Verkleben einer Mikrosphäre auf der AFM-Sonde.
| Tabelle 2. Annäherungsparameter | |
| Approach-Parameter | Wert |
| Ansatz IGain | 5,0 Hz |
| Ansatz PGain | 0.0002 |
| Annäherung szielhöhe | 10,0 m |
| Ansatz-Sollwert | 5,00 V |
| Ansatzbasislinie | 0,00 V |
Tabelle 2. Approach-Parameter.
| Tabelle 3. Ausführungsparameter | |
| Parameter | Wert |
| Sollwert | 1,0 V |
| Anpassung der Basislinie | 1 |
| Zuglänge | 90,0 m |
| Z-Bewegung | Konstante Geschwindigkeit |
| Erweitern der Geschwindigkeit | 5,0 m/s |
| Verlängern der Zeit | 18,0 s |
| Kontaktzeit | 0,0 s |
| Verzögerungsmodus | Konstante Kraft |
| Abtastratrate | Hz 2000 |
Tabelle 3. Führen Sie Parameter aus.
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Discussion
Mit AFM als neuartige und leistungsstarke Technik zur Messung der biomechanischen Eigenschaften biologischer Materialien auf nanoskaliger Ebene haben wir die elastischen Eigenschaften von ECM und PCM im menschlichen osteoarthritischen Gelenkknorpel gemessen. Knorpelproben wurden nach ihrem vorherrschenden räumlichen Muster der Chondrozytenorganisation als bildbasierter Biomarker für die lokale Gewebedegeneration ausgewählt. Erwartungsgemäß wurde ein starker Rückgang der Elastizitätswerte sowohl von ECM als auch von PCM während der räumlichen Chondrozytenreorganisation beobachtet. Diese Beobachtungen machen deutlich, dass die Abweichungen in der räumlichen Anordnung von Chondrozyten nicht nur mit Veränderungen der elastischen Eigenschaften der zellulären Mikroumgebung (PCM), sondern auch im gesamten Knorpel (ECM) verbunden waren. Darüber hinaus zeigte das ECM/PCM-Verhältnis trotz der robusten Veränderungen der elastischen Moduli von PCM und ECM während der OA keine signifikanten Veränderungen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Veränderungen der mechanischen Eigenschaften des ECM und des PCM unidirektional und gleichzeitig erfolgten, was bedeuten könnte, dass die Art der fortschreitenden Zerstörung sowohl für das PCM als auch für das ECM ähnlich ist. OA-Initiierung und -Progression löst somit eine signifikante PCM- und ECM-Degradation und letztlich Zerstörung aus. Beide Verluste waren mit einem erheblichen Verlust biomechanischer Eigenschaften des Gelenkknorpels verbunden, wie aus der vorliegenden Studie hervorgeht. Dies unterstreicht die funktionale Relevanz der räumlichen Organisation von Chondrozyten als Marker für biomechanische Eigenschaften. Umgekehrt ermöglicht es uns, lokale Elastizitätsmessungen zu verwenden, um Rückschlüsse auf die lokal vorherrschenden räumlichen Muster und damit auf die lokale Gewebedegeneration des Knorpels zu ziehen.
Die Atomkraftmikroskopie (AFM) hat sich als hochauflösendes Werkzeug zur zerstörungsfreien Untersuchung von Geweben herausgestellt. Es arbeitet, indem es Proben mit einem zarten und biegsamen Ausleger, der einen Laser auf eine Photodiode reflektiert, physisch untersucht. Alle Änderungen in dieser Reflexion werden registriert und in ein elektrisches Signal umgewandelt. AFM ist zwar ein leistungsfähiges Werkzeug, um nanoskalige Messungen durchzuführen, aber es kommt nicht ohne seine Einschränkungen und Fallstricke. Besonders kritisch ist die Auslegerpräparation durch Verkleben der Mikrosphären. Im Rahmen dieser Methode werden Mikrosphären verwendet, um die Einzugstiefe und den lokalen Druck während der Messungen zu ändern. Die Verwendung kleiner Mikrosphären, die an der Spitze der Sonde befestigt sind, ermöglicht die Messung der biomechanischen Eigenschaften eines Fasernetzes und nicht die Elastizität einzelner Fasern, wenn die Spitze allein verwendet wird. Es verhindert auch Gewebeschäden während des Messprozesses. Aufgrund der empfindlichen Natur der Auslegersensoren muss eine sorgfältige und sorgfältige Vorbereitungsweise eingerichtet werden, um konsistente und genaue Messungen zu erhalten. Um zu verhindern, dass sich die Mikrosphären von der Sensorspitze lösen, empfehlen wir frisch gemischten Kleber, der nicht älter als eine Woche ist. Darüber hinaus ist es für die Funktionalität des Sensors von entscheidender Bedeutung, die Mikrosphäre in der Mitte der Spitze zu platzieren, da die seitliche Abweichung in der Mikrosphärenbefestigung leicht zu inkonsistenten Messungen führt.
Das Platzieren des Auslegers auf dem Glasblock und dessen Befestigung mit einer passenden Feder ist ein empfindlicher und fehleranfälliger Prozess, der sorgfältige Aufmerksamkeit und ruhige Hände erfordert. Da Freischwinger sehr wahrscheinlich von ungeschulten Bedienern zerstört werden, empfehlen wir, mehrere Testläufe durchzuführen und zu üben, um die leicht zerbrechlichen Komponenten des AFM bequem zu handhaben.
Ein sauberer Glasblock ist unerlässlich, um das Gerät richtig zu kalibrieren und zuverlässige Messungen zu erhalten. Schmutz oder Staub auf der optischen Oberfläche des Blocks kann eine ordnungsgemäße Laserausrichtung auf dem Photodetektor verhindern. Wenn also probleme bei der Laserausrichtung auftreten, kann es notwendig sein, den Glasstein ein zweites Mal mit Ethanol abzuwaschen.
Die Datenanalyse oder Bestimmung des elastischen Moduls kann mit dem Hertz-Modell wie zuvorbeschrieben 11,12durchgeführt werden. Kurz gesagt, die durch Deninden erzeugten Daten sind Kraftdiagramme über die Bewegung der Auslegerspitze. Während der Messungen wird der Ausleger in Richtung der Probe bewegt. Dies führt dazu, dass der Ausleger mit der Probe in Kontakt bringt und anschließend in die entgegengesetzte Richtung zu der, in der er sich ursprünglich bewegte, gebogen wird. Gleichzeitig erfolgt ein Einrückeinzug der Probe um eine bestimmte Menge. Um das Hertz-Fit-Modell verwenden zu können, muss der Einzug der Probe berechnet und angepasst werden, um den Biegeparameter des Auslegers zu isolieren. Der Parameter, der die Probe beschreibt, ist Poissons Verhältnis, das vom untersuchten Material abhängt. Bei weichen biologischen Proben wird poissons Verhältnis oft auf 0,515gesetzt. Wie oben erwähnt, ist die Form des verwendeten Eindrters für die Berechnung des Young-Moduls relevant, da er die Erweiterungen diktiert, die an die ursprüngliche Hertz-Gleichung vorgenommen werden müssen. Im Falle des beschriebenen Experiments wird aufgrund der Verwendung von Mikrosphären eine kugelförmige Eindrungensform angenommen.
Während AFM neue und interessante Möglichkeiten der Datenerfassung bieten kann, hängt die Konsistenz und Zuverlässigkeit der erbrachten Daten stark von der Erfahrung des jeweiligen Betreibers ab. Einige der oben beschriebenen Schritte sind anfällig für menschliches Versagen und erfordern Geduld und Akribie, um sie richtig auszuführen.
Aufgrund der vielen empfindlichen Variablen, die messergebnisse beeinflussen können, können die in dieser Studie gemeldeten absoluten Kraftwerte nicht verallgemeinert werden, sondern sind eher spezifisch für unseren Versuchsaufbau. Bei der Verwendung dieser Technik zur Bewertung der Gewebedegeneration von Knorpeln müssen zunächst einige normalisierende Messungen an verschiedenen räumlichen Mustern durchgeführt werden, um die Ergebnisse auf die vorhandenen spezifischen experimentellen Messeinstellungen zu skalieren. Die Beziehung zwischen den verschiedenen Elastizitätsmodulen und den räumlichen Mustern wird jedoch nicht beeinträchtigt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken unseren Co-Autoren aus der Originalpublikation für ihre Hilfe und Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
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