Summary
Presentiamo un metodo per studiare i primi cambiamenti osteoartritici a livello cellulare nella cartilagine articolare utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM).
Abstract
Le proprietà biomeccaniche di cellule e tessuti non solo ne regolano la forma e la funzione, ma sono anche cruciali per mantenere la loro vitalità. I cambiamenti nell'elasticità possono propagare o innescare l'insorgenza di gravi malattie come il cancro o l'osteoartrite (OA). La microscopia a forza atomica (AFM) è emersa come un forte strumento per caratterizzare qualitativamente e quantitativamente le proprietà biomeccaniche di specifiche strutture di target biologiche su scala microscopica, misurando le forze in un intervallo da piccolo come il piconewton al micronewton. Le proprietà biomeccaniche sono di particolare importanza nei tessuti muscolo-scheletrici, che sono soggetti ad alti livelli di ceppo. L'OA come malattia degenerativa della cartilagine provoca l'interruzione della matrice pericellulare (PCM) e la riorganizzazione spaziale dei condrociti incorporati nella loro matrice extracellulare (ECM). L'interruzione nel PCM e nell'ECM è stata associata a cambiamenti nelle proprietà biomeccaniche della cartilagine. Nel presente studio abbiamo usato l'AFM per quantificare questi cambiamenti in relazione ai cambiamenti specifici del modello spaziale dei condrociti. Con ogni cambiamento di modello, sono stati osservati cambiamenti significativi nell'elasticità sia per il PCM che per l'ECM. Misurare l'elasticità locale permette quindi di trarre conclusioni dirette sul grado di degenerazione del tessuto locale in OA.
Introduction
La cartilagine articolare è un tessuto avascolare e aneurale. Condrociti scarsamente sparsi producono, organizzano e mantengono una matrice extracellulare espansiva (ECM) in cui sono incorporati. Come parte distinta e specializzata dell'ECM, i condrociti sono circondati da un sottile strato di matrice specializzata noto come matrice pericellulare (PCM). Il PCM agisce come un'interfaccia a matrice cellulare meccanosensitive1 che protegge i condrociti2 e modula la loro risposta biosintetica3. Come descritto in precedenza4, nella cartilagine sana, i condrociti sono disposti in modelli spaziali specifici e distinti specifici per ogni strato di tessuto e giunto4,5 e dipendono da meccanismi di caricamento meccanico specifici per le articolazioni6. Questi modelli cambiano da coppie e stringhe in cartilagine sana a stringhe doppie con l'inizio dell'osteoartrite (OA). Con l'ulteriore progressione della malattia i condrociti formano piccoli cluster, aumentando gradualmente a grandi cluster nell'OA avanzato. Una perdita completa di qualsiasi struttura organizzativa e induzione di apoptosi è osservata nella fase finale OA. Pertanto, la disposizione cellulare del condrocito può essere utilizzata come biomarcatore basato sull'immagine per la progressione OA4.
Le proprietà biomeccaniche di cellule e tessuti non solo ne regolano la forma e la funzione, ma sono anche cruciali per mantenere la loro vitalità. I cambiamenti nell'elasticità possono propagarsi o innescare l'insorgenza di gravi malattie come il cancro o l'OA. La microscopia a forza atomica (AFM) è emersa come un potente strumento per caratterizzare qualitativamente e quantitativamente le proprietà biomeccaniche di specifiche strutture di bersaglio biologico su scala microscopica, misurando un'ampia gamma di forza, dal piconewton al micronewton. L'applicazione principale di AFM è quella di misurare la topografia superficiale e le proprietà meccaniche dei campioni alla risoluzione subnanometrica7. Il dispositivo di misura è costituito da tre componenti principali: 1) Una sonda AFM, che è una punta affilata montata su un sbalzo e viene utilizzata per l'interazione diretta con la superficie del campione. Quando la forza viene applicata al cantilever, la deformazione di quest'ultimo avviene in base alle proprietà del tessuto misurato. 2) Un sistema ottico che proietta un raggio laser sul cantilever, che viene poi riflesso in un'unità di rilevamento. 3) Un rilevatore di fotodiodo che cattura la luce deviata dallo sbalzo. Converte le informazioni ricevute per quanto riguarda la deflessione laser dal cantilever in una curva di forza che può essere analizzata.
Pertanto, il principio principale dell'AFM è il rilevamento della forza che agisce tra la sonda AFM e la struttura bersaglio del campione. Le curve di forza ottenute descrivono le proprietà meccaniche delle strutture bersaglio sulla superficie del campione come elasticità, distribuzione della carica, magnetizzazione, sollecitazione della resa e dinamica di deformazione plastica elastica8. Un importante vantaggio dell'AFM rispetto ad altre tecniche di imaging è che l'AFM può essere utilizzato per misurare le proprietà meccaniche delle cellule vive in media o tessuti in uno stato nativo senza danneggiare il tessuto. AFM può operare sia in condizioni liquide che a secco. Non vi è alcun requisito per la preparazione del campione. AFM offre la possibilità di immaginare un campione e misurarne simultaneamente le proprietà meccaniche in campioni che sono condizioni quasi fisiologiche. Nel presente studio descriviamo un nuovo approccio per valutare la progressione dell'OA misurando l'elasticità del PCM e dell'ECM nella cartilagine articolare nativa. La correlazione dell'organizzazione spaziale dei condrociti con il grado di degenerazione locale dei tessuti fornisce una prospettiva completamente nuova per la diagnosi precoce dell'OA. La rilevanza funzionale di questi modelli non è stata tuttavia valutata finora. Poiché la funzione principale della cartilagine articolare è il carico che porta a basso attrito, il tessuto deve possedere proprietà elastiche. AFM permette di misurare non solo l'elasticità dell'ECM, ma anche dei modelli cellulari spaziali incorporati nel loro PCM. La correlazione osservata dell'elasticità con il cambiamento del modello spaziale dei condrociti è così forte che misurare l'elasticità da sola può consentire la stratificazione della degenerazione del tessuto locale.
La modulina elastica del PCM e dell'ECM è stata valutata in sezioni sottili sfere di 35 m utilizzando un sistema AFM integrato in un microscopio a contrasto di fase invertito che permetteva la visualizzazione simultanea del campione cartilagineo. Questo protocollo si basa su uno studio già pubblicato dal nostro laboratorio9 e descrive specificamente come caratterizzare la disposizione spaziale dei condrociti e come misurare l'elasticità dei loro PCM ed ECM associati. Con ogni cambiamento di modello dei condrociti, si possono osservare cambiamenti significativi nell'elasticità sia per il PCM che per l'ECM, consentendo di utilizzare questa tecnica per misurare direttamente lo stadio di degenerazione della cartilagine.
Questo approccio convalidato apre un nuovo modo per valutare la progressione dell'OA e gli effetti terapeutici nelle prime fasi prima che la degradazione del tessuto macroscopico inizi effettivamente ad apparire. L'esecuzione coerente delle misurazioni AFM è un processo arduo. Nel seguente protocollo viene descritto come preparare il campione da misurare con AFM, come eseguire le misurazioni AFM effettive a partire dalla preparazione del cantilever, come calibrare l'AFM e quindi come eseguire le misurazioni. Le istruzioni passo-passo forniscono un approccio chiaro e conciso per ottenere dati affidabili e fornire strategie di base per elaborarli e interpretarli. La sezione di discussione descrive anche le insidie più comuni di questo metodo rigoroso e fornisce utili suggerimenti per la risoluzione dei problemi.
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Protocol
I campioni di cartilagine umana sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a artroplastica totale del ginocchio nel Dipartimento di Chirurgia Ortopedica dell'Ospedale Universitario di Tuebingen, Germania, e l'ospedale Winghofer, Rottenburg a.N., Germania, per l'OA allo stadio finale del ginocchio. Prima dell'inizio dello studio (progetto numero 674/2016BO2). Il consenso informato scritto è stato ricevuto da tutti i pazienti prima della partecipazione. I metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approvate.
1. Preparazione del campione
- Preparazione della cartilagine per la sezionamento criotoma
- Per valutare i cambiamenti degenerativi nell'articolazione del ginocchio, prendere campioni di cartilagine articolari ottenuti dalla zona portante dei condili femorali dopo la resezione dei tessuti dai pazienti.
NOTA: I campioni studiati devono comunque contenere almeno un sottile strato di osso subcondrale per consentire una chiara identificazione dell'orientamento del tessuto rispetto alla superficie interna ed esterna, consentendo così anche un raccolto di tessuto standardizzato dello strato cartilagineo più in alto. La cartilagine può essere utilizzata per le misurazioni AFM fino a 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Il tessuto può essere immagazzinato nel mezzo dell'Aquila (DMEM) modificato senza siero con 2% (v/v) penicillina-streptomicina e 1,2% (v/v) amphotericina B prima dell'uso. Conservare i campioni per più di 24 h può causare tuttavia artefatti nelle misurazioni AFM a causa del gonfiore dei tessuti. - Tagliare la cartilagine articolare nel suo complesso dall'osso subcondrale con l'aiuto di un bisturi e successivamente incorporare il campione di cartilagine in mezzo di incorporamento solubile in acqua sulla manopola criotomi che si congela a bassa temperatura nel dispositivo criotomeo.
NOTA: Il mezzo congelato stabilizza il tessuto che avvolge. Si traduce anche nel congelamento del campione cartilagineo insieme al mezzo di incorporamento. Quando si taglia la cartilagine dall'osso, tenere traccia dell'orientamento del tessuto. Il tessuto incorporato per le criosezioni deve essere posizionato in modo tale che lo strato superiore (cioè la superficie articolare) della cartilagine faccia fronte alla lama. Si noti che il tessuto deve essere completamente coperto dal mezzo di incorporamento.
- Per valutare i cambiamenti degenerativi nell'articolazione del ginocchio, prendere campioni di cartilagine articolari ottenuti dalla zona portante dei condili femorali dopo la resezione dei tessuti dai pazienti.
- Sezione criotoma della cartilagine
- Utilizzando un criotoma standard, sezionare il tessuto a uno spessore di 35 m dallo strato più alto (cioè la superficie articolare) della cartilagine articolare che è incorporato nel mezzo di incorporamento solubile in acqua congelato.
NOTA: In totale, è possibile sezionare e utilizzare per le analisi fino a 300 m (che corrisponde a circa nove sezioni). Il limite proposto di 300 m corrisponde alla profondità di penetrazione visiva che di solito si può ottenere con la microscopia a fluorescenza nella cartilagine ialina come la cartilagine articolare. Così, è possibile ordinare la cartilagine secondo il modello spaziale locale predominante e quindi misurare questi modelli nelle sezioni corrispondenti. - Raccogliere le sezioni su uno scivolo di vetro e sciacquare le sezioni 3x con salina tampone fosfato (PBS) per rimuovere il supporto di incorporamento solubile in acqua.
- Utilizzando un criotoma standard, sezionare il tessuto a uno spessore di 35 m dallo strato più alto (cioè la superficie articolare) della cartilagine articolare che è incorporato nel mezzo di incorporamento solubile in acqua congelato.
- Incollaggio delle sezioni cartilaginee su un piatto Petri compatibile con AFM
NOTA: poiché l'AFM raccoglie i dati per rientro meccanico sul campione, le sezioni devono essere fissate in posizione per consentire misurazioni precise.- Incollare delicatamente le sezioni spesse 35 m con colla campione biocompatibile su piatti di coltura tissutale compatibili con il dispositivo AFM. Per fare questo, prendi 2/3 gocce di colla e mettile sul piatto di coltura dei tessuti nel punto in cui il bordo della sezione finirà. Ora metti la sezione cartilagine sulla colla e lascia che si attacchi saldamente alla superficie del piatto di coltura dei tessuti.
NOTA: Le sezioni spesse 35 m della cartilagine articolare ialina non sono molto soggette ad arricciatura. Tuttavia, se il curling si verifica quando si rimuovono i campioni dal supporto buffer, assicurarsi che il minor fluido possibile si attacchi ai campioni. Non appena l'acqua in eccesso si è asciugata, diffondere direttamente il tessuto sui punti dispersi della colla in modo che sia fissato alla superficie del piatto di coltura cellulare. La colla viene applicata in uno strato sottile solo ai bordi del campione e non sull'intera sezione. Misurare solo quella porzione del campione che è lontano dall'area incollata per eliminare la possibilità che la colla interferisca con le misure. - Incubare le sezioni a temperatura ambiente (RT) per 2 min per consentire alla colla e al tessuto di legarsi correttamente. Quindi coprire le sezioni con il mezzo L-15 di Leibovitz senza L-glutamine e senza bicarbonato di sodio in modo che siano completamente sommerse.
NOTA: I movimenti improvvisi del campione durante la fissazione o l'applicazione della colla insufficiente sono errori comuni che causano il distacco del tessuto dal piatto di coltura. Inoltre, l'applicazione del supporto Leibowitz dovrebbe essere fatta in modo delicato, in modo da non staccare il campione dalla superficie a causa di "onde" create dal mezzo. - Posizionare la parabola Petri con le sezioni incollate nell'incubatrice a coltura cellulare standard a 37 gradi centigradi fino a quando non vengono eseguite le misurazioni.
NOTA: Assicurarsi che le sezioni del tessuto siano stabili e non staccarle dalla superficie del piatto di coltura dei tessuti eseguendo lentamente ogni passo.
- Incollare delicatamente le sezioni spesse 35 m con colla campione biocompatibile su piatti di coltura tissutale compatibili con il dispositivo AFM. Per fare questo, prendi 2/3 gocce di colla e mettile sul piatto di coltura dei tessuti nel punto in cui il bordo della sezione finirà. Ora metti la sezione cartilagine sulla colla e lascia che si attacchi saldamente alla superficie del piatto di coltura dei tessuti.
2. Preparazione a sbalzo (incollaggio delle microsfere)
- Preparazione del dispositivo AFM e diluizione delle microsfere
- Posizionare lo sbalzo sul blocco di vetro specificato per le misurazioni dell'aria, fissarlo con la molla e montare il blocco di vetro sulla testa Dell'AFM.
- Diluire le microsfere in etanolo al 100% (100 particelle/10-L) e ultrasonicare per 10 s, in modo che le microsfere siano separate e non si aggregano insieme.
- Preparazione della configurazione per l'incollaggio
- Pulire uno scivolo di vetro con il 70% di etanolo e montarlo sul supporto del campione sul dispositivo AFM.
NOTA: La pulizia del vetrino impedisce l'accumulo di macchie di polvere che potrebbero interferire con il processo di incollaggio sulla superficie del vetrino. - Posizionare 2 - L della sospensione della microsfera al centro del vetrino e 2 - L di colla vicino alla sospensione della microsfera.
NOTA: Si raccomanda di posizionare la sospensione della microsfera e la colla l'una vicino all'altra per consentire una rapida transizione dello sbalzo tra la colla e le microsfere. Se la transizione tra immergere lo sbalzo nella colla e entrare in contatto con una microsfera è troppo lunga, la colla alla fine si indurisce, perdendo così le sue proprietà adesive. - Lasciare asciugare il liquido etanolo nella microsfera, lasciando le microsfere in posizione.
- Pulire uno scivolo di vetro con il 70% di etanolo e montarlo sul supporto del campione sul dispositivo AFM.
- Incollare le microsfere sulla punta a sbalzo
- Immergere il cantilever manualmente nella colla con l'aiuto del motore stepper in 10 gradini fino a quando la punta è coperta dalla colla. Eseguire questo passaggio rapidamente, come la colla si asciuga velocemente.
- Ritrarre di nuovo il cantilever di 100 m, spostarlo verso le microsfere e posizionare la punta a sbalzo direttamente sopra una singola microsfera.
- Eseguire una misurazione della spettroscopia di forza per immergere la punta a sbalzo sulla microsfera selezionata con i parametri mostrati nella Tabella 1.
NOTA: Eseguendo questo passaggio, viene utilizzata una misurazione della superficie della microsfera per stabilire il contatto tra la punta del cantilever e la microsfera. Il tempo di contatto relativamente lungo mostrato nella Tabella 1 consente un ampio tempo di incollaggio tra la colla e la microsfera. La curva forza-distanza ottenuta durante questa fase viene generata come sottoprodotto dell'incollaggio della microsfera sulla punta a sbalzo e non viene elaborata per ulteriori analisi. - Una volta che una microsfera è attaccata al cantilever, ritrarre il blocco di vetro con il cantilever montato sulla parte superiore e quindi rimuovere la testa AFM dal microscopio. Infine, smontare il blocco di vetro e sbalzare dalla testa AFM.
- Incubare lo sbalzo a 65 gradi centigradi per 2 ore e lasciarlo asciugare durante la notte al RT prima di iniziare le misurazioni.
NOTA: L'incubazione del cantilever migliora le proprietà adesive della colla, rendendo la stabilità a sbalzo-microsfera.
3. Preparazione del dispositivo AFM per le misurazioni
- Regolare un blocco di vetro specificato per la misurazione in un ambiente liquido sul supporto AFM in modo che la superficie superiore sia dritta e parallela al supporto AFM.
- Con l'aiuto di una pinzetta, montare con attenzione il cantilever selezionato sulla superficie del blocco di vetro, in modo che la punta AFM con la microsfera sporge sul piano ottico lucido.
NOTA: La punta del cantilever deve sporgere sul piano lucido per essere in grado di riflettere il laser dell'AFM sul fotodetector. Fare molta attenzione quando si posiziona lo sbalzo sull'AFM in modo da non graffiare la superficie ottica lucidata del blocco di vetro. Graffiare il blocco di vetro può causare difficoltà nella regolazione dell'allineamento laser e può interferire con le misurazioni successive. - Poiché lo sbalzo sarà soggetto a pressione meccanica, deve essere fissato in posizione. Stabilizzare il cantilever sul blocco di vetro facendo scorrere la molla metallica nella scanalatura del blocco e bloccando la parte superiore del cantilever con la molla con l'aiuto di pinzette.
- Posizionare con attenzione il blocco di vetro con lo sbalzo sulla testa dell'AFM e fissarlo con il meccanismo di bloccaggio integrato. Assicurarsi che la molla sia rivolta verso il lato sinistro in modo che lo sbalzo sia posizionato nell'orientamento corretto. Quindi montare la testa AFM con il cantilever sul dispositivo AFM.
4. Caricamento del campione e calibrazione del
NOTA: Qui, la calibrazione del dispositivo viene eseguita eseguendo una curva di forza sulla superficie pulita del piatto Petri riempito con il mezzo di Leibovitz senza alcun tessuto campione. La calibrazione può essere eseguita anche utilizzando un piatto AFM di controllo separato riempito solo con il mezzo AFM senza il campione.
- Montaggio del campione sul dispositivo AFM
- Posizionare il piatto Petri preparato al punto 1.3.3 sul supporto del campione AFM.
- Accendere il riscaldatore del piatto Petri e impostarlo a 37 gradi centigradi. Lasciare che il piatto di coltura dei tessuti raggiunga la temperatura ottimale (ad es. 20 min).
- Posizionare un foglio di protezione sulla base dell'assieme a sbalzo per evitare la condensazione del mezzo nella testa AFM.
- Calibrazione del dispositivo
- Aprire il software (Tabella dei materiali), seguito dalla finestra di allineamento laser e dalla finestra che rappresenta le impostazioni dei parametri di approccio. Quindi accendere il motore stepper, la luce laser e la ccd-camera.
- Utilizzare la telecamera CCD al microscopio per visualizzare e identificare il cantilever. Utilizzando la funzione motoria stepper, abbassare il cantilever a 100 gradini fino a quando il cantilever è completamente sommerso nel mezzo.
NOTA: L'unione del cantilever nel liquido è visivamente identificabile tramite la telecamera CCD. Quando si rompe la superficie dell'acqua, la punta a sbalzo crea riflessi circolari facilmente evidenti nell'acqua. - Dirigere il laser sulla parte superiore del cantilever utilizzando le viti di regolazione.
NOTA: Non sovraavvolgere le viti, in quanto ciò danneggerà il meccanismo di allineamento laser. Il sbalzo è visto dal basso e il raggio laser viene dall'alto. - Una volta che il laser è posizionato sul cantilever, regolare il fascio laser con l'aiuto di viti nel dispositivo AFM in modo che il fascio riflesso cade sul centro del fotodetector. Continuare a monitorare la posizione del raggio laser utilizzando la funzione di allineamento laser.
NOTA: Il rilevatore rileva la deviazione del raggio laser riflesso dal cantilever e lo converte in un segnale elettrico. - Dopo la regolazione laser-cantilever, il segnale Sum deve essere 1 V o superiore, mentre le deviazioni laterali e verticali devono essere vicine a 0. Se questi valori non vengono ottenuti, regolare il fotodetector.
- Ottenere la curva di forza di calibrazione
- Per raggiungere la superficie del piatto AFM per avviare le misurazioni, eseguire uno scanner Approach con i parametri di approccio indicati nella tabella 2. Una volta raggiunto il fondo del piatto di coltura dei tessuti, ritrarre lo sbalzo di 100 m.
NOTA: A questo punto la sonda si trova esattamente a 100 m sopra dal fondo del piatto di coltura dei tessuti. - Impostare i parametri RUN e regolare i parametri visualizzati nella tabella 3. Fare clic sul pulsante RUN per avviare una misurazione e ottenere una curva di distanza della forza di calibrazione.
NOTA: La curva di forza ottenuta qui è illustrata nella Figura 1. - Nella curva di distanza della forza di calibrazione, selezionare la regione per un adattamento lineare della curva retratta nel software.
NOTA: La vestibilità lineare viene eseguita per misurare la sensibilità del cantilever. Una volta che la misura lineare è in atto, i valori verranno salvati dal software. La misurazione costante della molla o il rumore termico dello sbalzo viene calcolato dal software in seguito. - Poiché le misurazioni vengono eseguite in media ad una temperatura di 37 gradi centigradi, impostare la variabile di temperatura a 37 gradi centigradi nel software per imitare le condizioni fisiologiche il più fedelmente possibile.
NOTA: Alla fine della calibrazione, la deviazione verticale viene salvata e visualizzata nell'unità di forza, il Newton (N), invece di volt (V), che è l'unità della registrazione originale da parte del rilevatore fotodiode.
- Per raggiungere la superficie del piatto AFM per avviare le misurazioni, eseguire uno scanner Approach con i parametri di approccio indicati nella tabella 2. Una volta raggiunto il fondo del piatto di coltura dei tessuti, ritrarre lo sbalzo di 100 m.
5. Caratterizzazione biomeccanica di ECM e PCM eseguendo misurazioni di elasticità tramite AFM
- Identificazione dei modelli di condrociti nella sezione cartilagine
- Osservare la sezione cartilagine sotto un microscopio a contrasto di fase integrato nel sistema AFM e identificare i modelli cellulari specifici10 della cartilagine articolare dal ginocchio osteoartritico: corde singole (aree del tessuto sano), stringhe doppie (inizio degenerazione del tessuto), piccoli e grandi ammassi (entrambi avanzati degenerazione dei tessuti). Vedere la figura 2A–D.
- Una volta identificato il modello specifico desiderato, misurare due siti per modello scelto per tipo di matrice (PCM o ECM) ed eseguire nove ripetizioni di misurazione su ciascun sito di misurazione (Figura 2E,F). Garantire una dimensione del campione sufficientemente grande da tenere conto di possibili imprecisioni.
NOTA: Per le misurazioni PCM, posizionare il cantilever in prossimità delle celle (come mostrato dai cerchi rossi nella Figura 2E, F). Per eseguire le misurazioni dell'ECM, selezionare una regione senza celle (illustrata dall'area blu nella Figura 2E,F)ed eseguire il rientro come descritto nel passaggio 5.2.
- Rientro del sito di destinazione
- Eseguire un approccio seguito da una retrazione in modo che il cantilever sia posizionato 100 m sopra il tessuto, che sarà la posizione di partenza per le misurazioni successive.
- Concentrarsi sul PCM o ECM del modello da misurare e fissare il mouse del computer in quel punto.
NOTA: il mouse fungerà da indicatore visivo per il sito di destinazione del rientro. Una volta che la messa a fuoco si sposta sulla punta a sbalzo, le strutture del tessuto diventeranno indistinguibili o sfocate. - Ora concentrati sulla sonda e sposta la punta della sonda sul punto precedentemente fissato dalla freccia del computer. Successivamente, iniziare le misurazioni con RUN, utilizzando il parametro set point ottenuto per calibrazione del cantilever.
NOTA: una curva di forza esemplare ottenuta misurando il PCM di una singola stringa è illustrata nella figura supplementare 1.
6. Trattamento dei dati
NOTA: L'analisi dei dati o la determinazione del modulo elastico viene eseguita utilizzando un modello Hertz come descritto in precedenza11,12. La forma dell'indienter era sferica a causa dell'uso di microsfere sulla punta e il rapporto di Poisson era mantenuto a 0,5 sulla base della letteratura precedente13,14,15.
- Aprire il softwaredielaborazione dati ( Tabella dei materiali ) compatibile con i dati ottenuti dal dispositivo AFM.
- Selezionare il modello Hertz nel software per l'elaborazione delle curve di distanza di forza. Impostare il rapporto di Poisson su 0,5 e selezionare la forma della punta come sferica e un raggio di punta di 12,5 m.
- Una volta regolati tutti i parametri, i risultati vengono montati e il modulo del Young viene calcolato e visualizzato dal software.
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Representative Results
Lungo il modello fisiopatologico dalle stringhe alle stringhe doppie, ai piccoli e infine ai grandi cluster, sia ECM (Figura 3A) che PCM (Figura 3B) elastico diminuito in modo significativo tra ogni modifica del modello. L'unica eccezione è stata la differenza in ECM tra le stringhe e le stringhe doppie (p - 0,072). I risultati mostrano che il rapporto ECM/PCM (Figura 4B) non è cambiato in modo significativo, mentre è stata osservata una netta diminuzione delle differenze assolute di elasticità tra ECM e PCM (Figura 4A). Inoltre, i risultati non mostrano alcuna associazione significativa per quanto riguarda il rapporto ECM/PCM o le modifiche spaziali cellulari associate (r - -0,099, p - 0,281).
Figura 1: Rappresentazione schematica di una curva di distanza di forza nella modalità di contatto AFM. Quando la sonda si avvicina alla superficie, le forze sono troppo piccole per dare una deviazione misurabile della punta all'inizio, lasciando così la punta nella sua posizione indisturbata (1). Quindi, quando il cantilever è molto vicino al campione, a causa delle forze adesive attive tra la punta e la sonda, il cantilever in realtà si blocca rapidamente verso il campione (2). Con la sonda che si avvicina ulteriormente al campione, la deflessione repulsiva si affaccia poi contro il movimento di direzione, con una funzione quasi lineare di altezza e deflessione fino a quando la deviazione verticale raggiunge il valore del set point relativo (3). Quando si ritrae (4), oltre alle forze di deflessione di abbassamento, sono presenti anche forze di adesione mentre lo sbalzo viene ritratto nell'asse z dal campione. Poiché la sonda AFM viene estratta dal contatto con il campione, prima viene "bloccata" prima di essere in grado di allentarsi dall'adesione all'interfaccia, portando anche a una breve deviazione negativa del cantilever, prima di raggiungere nuovamente la sua posizione neutra non piegata senza contatto con la sonda (5). L'entità della deflessione è espressa nella forza che lavora sul cantilever espressa nei nanonewton. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: caratterizzazione spaziale rappresentativa dei condrociti e delle misurazioni AFM della matrice extracellulare (ECM) e della matrice pericellulare (PCM). (A-D) Caratterizzazione dei modelli cellulari: stringhe (A), stringhe doppie (B), cluster di piccole dimensioni (C) e cluster di grandi dimensioni (D). L'elastico del PCM (forma cerchi rossi) e ECM (area blu) (E/F) sono stati valutati per i diversi modelli cellulari nella cartilagine osteoartritica. I siti di misura per eCM e PCM sono stati selezionati dallo sperimentatore e sono indicati graficamente da croci nere. La punta a sbalzo utilizzata per le misurazioni è contrassegnata da una stella bianca. Le barre della scala rappresentano 10 m (A-D) e 100 m (E/F). La figura è adattata e modificata da Danalache et al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto del quantificato moduli di Young della matrice extracellulare (ECM) e della matrice pericellulare (PCM) in funzione dell'organizzazione condrociti spaziali. Con l'organizzazione progressiva dei condriociti spaziali patologici, è stata rilevata una graduale diminuzione dell'elasticità nei boxplot sia per ECM (A) che per il PCM (B) ( . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Abbreviazioni: SS: singole stringhe, DS: doppie stringhe, SC: cluster di piccole dimensioni, BC: grandi cluster. Le cifre sono tratte da Danalache etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Relazione del modulidelo del Giovane della matrice extracellulare (ECM) e della matrice pericellulare (PCM) in funzione dell'organizzazione spaziale cellulare. Un'organizzazione di condrociti spaziali sempre più patologica è stata associata a una diminuzione del modulio dei Young sia per ECM che per PCM (A). Mentre questi cambiamenti spaziali hanno avuto luogo, il rapporto di elasticità ECM e PCM è rimasto costante, senza mostrare cambiamenti significativi (B). I dati vengono presentati come un diagramma di linea con errore medio , standard (A) e boxplot (B). Abbreviazioni: SS: singole stringhe, DS: doppie stringhe, SC: cluster di piccole dimensioni, BC: grandi cluster. Le cifre sono tratte da Danalache etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: curva di forza rappresentativa ottenuta mediante rientro della matrice pericellulare (PCM) di un singolo modello di stringa che mostra i risultati di adattamento (freccia arancione) e il quadrato medio della radice residua (RMS residuo; freccia nera). I risultati dell'adattamento includono il punto di contatto tra il campione e la punta, il modulo del giovane e la linea di base. Il RMS residuo visualizzato di seguito descrive la differenza tra l'adattamento e i dati di forza, rappresentando in tal modo la qualità di un adattamento della curva di forza. Clicca qui per scaricare questa figura.
| Tabella 1. Parametri per incollare una microsfera sulla sonda AFM | |
| Parametri | Valore |
| Setpoint | 5,0 V |
| Regola linea di base | 1 |
| Lunghezza del pull | 90,0 m |
| Movimento di z | Velocità costante |
| Estendi velocità | 5,0 m/s |
| Estendere il tempo | 18,0 s |
| Tempo di contatto | 90,0 s |
| Modalità ritardo | Forza costante |
| Frequenza di campionamento | 2000 Hz |
Tabella 1. Parametri per l'incollaggio di una microsfera sulla sonda AFM.
| Tabella 2. Parametri di avvicinamento | |
| Parametri di avvicinamento | Valore |
| Approccio IGain | 5,0 Hz |
| Avvicinati a PGain | 0.0002 |
| Altezza obiettivo avvicinamento | 10,0 m |
| Setpoint di avvicinamento | 5.00 V |
| Approccio basale | 0,00 V |
Tabella 2. Parametri di avvicinamento.
| Tabella 3. Parametri di esecuzione | |
| Parametri | Valore |
| Setpoint | 1,0 V |
| Regola linea di base | 1 |
| Lunghezza del pull | 90,0 m |
| Movimento di z | Velocità costante |
| Estendi velocità | 5,0 m/s |
| Estendere il tempo | 18,0 s |
| Tempo di contatto | 0,0 s |
| Modalità ritardo | Forza costante |
| Frequenza di campionamento | 2000 Hz |
Tabella 3. Eseguire i parametri.
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Discussion
Utilizzando L'AFM come nuova e potente tecnica per misurare le proprietà biomeccaniche dei materiali biologici a livello su nanoscala, abbiamo misurato le proprietà elastiche dell'ECM e del PCM nella cartilagine articolare osteoartritica umana. I campioni della cartilagine sono stati selezionati in base al loro modello spaziale predominante dell'organizzazione dei condrociti come biomarcatore basato su immagini per la degenerazione dei tessuti locali. Come previsto, è stato osservato un forte calo dei valori di elasticità sia di ECM che di PCM lungo la riorganizzazione spaziale dei condrociti. Queste osservazioni evidenziano chiaramente che le deviazioni nella disposizione spaziale dei condrociti non sono state associate solo a cambiamenti nelle proprietà elastiche del microambiente cellulare (PCM), ma anche in tutta la cartilagine (ECM). Inoltre, il rapporto ECM/PCM non ha mostrato cambiamenti significativi nonostante i robusti cambiamenti nella moduli elastica di PCM ed ECM durante OA. Questi risultati indicano che i cambiamenti nelle proprietà meccaniche dell'ECM e del PCM si sono verificati in modo ilidirezionale e allo stesso tempo, il che potrebbe significare che la natura della distruzione progressiva è simile sia per il PCM che per l'ECM. L'inizio e la progressione dell'OA provocano quindi una significativa degradazione di PCM ed ECM e, in ultima analisi, la distruzione. Entrambe le perdite sono state associate a una perdita significativa di proprietà biomeccaniche della cartilagine articolare come la sua elasticità, come mostrato nel presente studio. Questo sottolinea la rilevanza funzionale dell'organizzazione spaziale dei condrociti come marcatore per le proprietà biomeccaniche. Al contrario, ci permette di utilizzare misurazioni di elasticità locali per trarre conclusioni sui modelli spaziali prevalenti e quindi sulla degenerazione dei tessuti locali della cartilagine.
La microscopia a forza atomica (AFM) è emersa come uno strumento ad alta risoluzione per studiare i tessuti in modo non distruttivo. Funziona sondando fisicamente campioni con un cantilever delicato e flessibile che riflette un laser su un fotodiode. Eventuali modifiche in questa riflessione vengono registrate e convertite in un segnale elettrico. Mentre AFM è un potente strumento per condurre misurazioni su nanoscala, non viene senza i suoi limiti e insidie. Particolarmente critica è la preparazione a sbalzo incollando le microsfere. Nel contesto di questo metodo, le microsfere vengono utilizzate per modificare la profondità di indentazione e la pressione locale durante le misurazioni. L'utilizzo di piccole microsfere attaccate alla punta della sonda consente di misurazione delle proprietà biomeccaniche di una rete di fibre piuttosto che dell'elasticità di una singola fibra quando si utilizza la punta da sola. Previene inoltre danni ai tessuti durante il processo di misurazione. Grazie alla delicatezza dei sensori a sbalzo, è necessario stabilire un modo attento e attento di preparazione per ottenere misurazioni coerenti e accurate. Per evitare che le microsfere si stacchino dalla punta del sensore, si consiglia colla appena miscelata non più vecchia di una settimana. Inoltre, è fondamentale per la funzionalità del sensore posizionare la microsfera al centro della punta, poiché la deviazione laterale nell'attacco della microsfera si traduce facilmente in misurazioni incoerenti.
Posizionare il cantilever sul blocco di vetro e fissarlo con una molla adatta è un processo delicato e soggetto a errori che richiede un'attenzione meticolosa e mani ferme. Poiché è molto probabile che gli sbalzi vengano distrutti da operatori non addestrati, si consiglia di condurre diverse corse di prova e praticare per gestire comodamente i componenti facilmente infrangibili dell'AFM.
Un blocco di vetro pulito è indispensabile per calibrare correttamente il dispositivo e ottenere misurazioni affidabili. Lo sporco o la polvere sulla superficie ottica del blocco possono impedire un corretto allineamento laser sul fotodetector. Pertanto, se si verificano problemi durante l'allineamento laser, potrebbe essere necessario lavare il blocco di vetro con etanolo una seconda volta.
L'analisi dei dati o la determinazione del modulo elastico può essere eseguita utilizzando il modello Hertz come descritto in precedenza11,12. In breve, i dati generati dal rientro sono grafici di forza sul movimento della punta a sbalzo. Durante le misurazioni, il cantilever viene spostato nella direzione del campione. Questo porta al cantilever entrare in contatto con il campione e successivamente alla sua flessione nella direzione opposta a quella in cui originariamente si muoveva. Contemporaneamente, si verifica un rientro del campione di una certa quantità. Per utilizzare il modello Hertz-fit, il rientro del campione deve essere calcolato e regolato per isolare il parametro di piegatura a sbalzo. Il parametro che descrive il campione è il rapporto di Poisson, che dipende dal materiale studiato. Per i campioni biologici morbidi, il rapporto di Poisson è spesso impostato su 0,515. Come accennato in precedenza, la forma dell'indenter usato è rilevante per il calcolo del modulo di Young, in quanto detta le estensioni che devono essere fatte all'equazione originale di Hertz. Nel caso dell'esperimento descritto, si assume una forma di indenter sferico a causa dell'uso di microsfere.
Mentre AFM può offrire nuove e interessanti possibilità di raccolta dei dati, la coerenza e l'affidabilità dei dati restituiti dipendono fortemente dall'esperienza del rispettivo operatore. Molti dei passaggi descritti sopra sono inclini all'errore umano e richiedono pazienza e meticolosità per eseguirli correttamente.
A causa delle numerose variabili sensibili che possono influenzare i risultati della misurazione, i valori di forza assoluti riportati in questo studio non possono essere generalizzati, ma sono piuttosto specifici per la nostra configurazione sperimentale. Quando si utilizza questa tecnica per valutare la degenerazione tissutale della cartilagine, alcune misurazioni di normalizzazione su diversi modelli spaziali devono prima essere eseguite per scalare i risultati alle specifiche impostazioni di misurazione sperimentale presenti. Tuttavia, la relazione tra la diversa elasticità e i modelli spaziali non sarà influenzata.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i nostri co-autori della pubblicazione originale per il loro aiuto e supporto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
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