Summary
Apresentamos um método para investigar alterações osteoartríticas precoces no nível celular na cartilagem articular usando microscopia de força atômica (AFM).
Abstract
As propriedades biomecânicas das células e tecidos não apenas regulam sua forma e função, mas também são cruciais para manter sua vitalidade. Mudanças na elasticidade podem propagar ou desencadear o início de doenças graves como câncer ou osteoartrite (OA). A microscopia de força atômica (AFM) emergiu como uma forte ferramenta para caracterizar qualitativamente e quantitativamente as propriedades biomecânicas de estruturas-alvo biológicas específicas em escala microscópica, medindo forças em uma faixa tão pequena quanto o piconewton até o micronewton. As propriedades biomecânicas são de especial importância nos tecidos musculoesqueléticos, que são submetidos a altos níveis de tensão. AA como uma doença degenerativa da cartilagem resulta na ruptura da matriz pericelular (PcM) e no rearranjo espacial dos condrócitos incorporados em sua matriz extracelular (ECM). A interrupção no PCM e no ECM tem sido associada a alterações nas propriedades biomecânicas da cartilagem. No presente estudo utilizou-se a AFM para quantificar essas alterações em relação às mudanças específicas do padrão espacial dos condrócitos. A cada mudança de padrão, foram observadas mudanças significativas na elasticidade tanto para o PCM quanto para o ECM. Medir a elasticidade local permite, assim, tirar conclusões diretas sobre o grau de degeneração do tecido local em OA.
Introduction
Cartilagem articular é um tecido avascular, aneural. Os condrócitos pouco dispersos produzem, organizam e mantêm uma matriz extracelular expansiva (ECM) na qual estão incorporados. Como parte distinta e especializada do ECM, os condrócitos são cercados por uma fina camada de matriz especializada conhecida como matriz pericelular (PCM). O PCM atua como uma interface mecanosensível de matriz celular1 que protege os condrócitos2 e modula sua resposta biossintética3. Como descrito anteriormente4, na cartilagem saudável, os condrócitos são dispostos em padrões espaciais específicos e distintos que são específicos para cada camada tecidual e articulação4,5 e dependem de mecanismos de carga mecânicos específicos da articulação6. Esses padrões mudam de pares e cordas em cartilagem saudável para cordas duplas com o início da osteoartrite (OA). Com a progressão da doença, os condrócitos formam pequenos aglomerados, aumentando gradualmente em tamanho para grandes aglomerados em OA avançado. Observa-se uma perda completa de qualquer estrutura organizacional e indução de apoptose no estágio final. Assim, o arranjo celular condrócito pode ser usado como um biomarcador baseado em imagem para progressão de OA4.
As propriedades biomecânicas das células e tecidos não apenas regulam sua forma e função, mas também são cruciais para manter sua vitalidade. Mudanças na elasticidade podem propagar ou desencadear o início de doenças graves como câncer ou OA. A microscopia de força atômica (AFM) emergiu como uma poderosa ferramenta para caracterizar qualitativamente e quantitativamente as propriedades biomecânicas de estruturas-alvo biológicas específicas em escala microscópica, medindo uma ampla gama de força, do piconewton ao micronewton. A principal aplicação da AFM é medir a topografia superficial e as propriedades mecânicas das amostras na resolução subnanômetro7. O dispositivo de medição consiste em três componentes principais: 1) Uma sonda AFM, que é uma ponta afiada montada em um cantilever e é usada para a interação direta com a superfície da amostra. Quando a força é aplicada ao cantilever, a deformação deste último ocorre de acordo com as propriedades do tecido medido. 2) Um sistema óptico que projeta um raio laser no cantilever, que é então refletido em uma unidade detectora. 3) Um detector de fotodiodo que capta a luz desviada do cantilever. Ele converte as informações recebidas sobre a deflexão do laser pelo cantilever em uma curva de força que pode ser analisada.
Assim, o princípio principal da AFM é a detecção da força atuando entre a sonda AFM e a estrutura-alvo da amostra. As curvas de força obtidas descrevem as propriedades mecânicas das estruturas-alvo na superfície da amostra como elasticidade, distribuição de carga, magnetização, estresse de rendimento e dinâmica de deformação plástica elástica8. Uma vantagem importante da AFM em relação a outras técnicas de imagem é que a AFM pode ser usada para medir as propriedades mecânicas das células vivas em médio ou tecido em um estado nativo sem danificar o tecido. A AFM pode operar tanto em condições líquidas quanto secas. Não há necessidade de preparação da amostra. A AFM oferece a possibilidade de visualizar um espécime e medir suas propriedades mecânicas simultaneamente em espécimes próximos a condições fisiológicas. No presente estudo descrevemos uma nova abordagem para avaliar a progressão da OA medindo a elasticidade do PCM e do ECM na cartilagem articular nativa. A correlação da organização espacial dos condrócitos com o grau de degeneração do tecido local fornece uma perspectiva completamente nova para a detecção precoce de OA. A relevância funcional desses padrões não foi avaliada até agora, no entanto. Como a principal função da cartilagem articular é o rolamento de carga em baixo atrito, o tecido deve possuir propriedades elásticas. A AFM permite medir não apenas a elasticidade do ECM, mas também os padrões celulares espaciais incorporados em seu PCM. A correlação observada de elasticidade com a mudança de padrão espacial dos condrócitos é tão forte que medir a elasticidade sozinha pode permitir a estratificação da degeneração do tecido local.
Moduli elástico do PCM e ECM foram avaliados em seções de 35 μm-thin utilizando um sistema AFM integrado em um microscópio de contraste de fase invertido que permitiu a visualização simultânea da amostra de cartilagem. Este protocolo baseia-se em um estudo já publicado em nosso laboratório9 e descreve especificamente como caracterizar o arranjo espacial dos condrócitos e como medir a elasticidade de seu PCM e ECM associados. A cada mudança de padrão dos condrócitos, mudanças significativas na elasticidade também podem ser observadas tanto para o PCM quanto para o ECM, permitindo que essa técnica seja usada para medir diretamente o estágio de degeneração da cartilagem.
Esta abordagem validada abre uma nova maneira de avaliar a progressão da OA e os efeitos terapêuticos em estágios iniciais antes que a degradação do tecido macroscópico realmente comece a aparecer. Realizar medições de AFM de forma consistente é um processo árduo. No protocolo a seguir descrevemos como preparar a amostra a ser medida pela AFM, como realizar as medições aftosas reais começando com a preparação do cantilever, como calibrar o AFM e, em seguida, como realizar as medições. As instruções passo a passo fornecem uma abordagem clara e concisa para obter dados confiáveis e fornecer estratégias básicas para processá-los e interpretá-los. A seção de discussão também descreve as armadilhas mais comuns deste método rigoroso e fornece dicas úteis para solucionar problemas.
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Protocol
As amostras de cartilagem humana foram obtidas de pacientes submetidos a artroplastia total do joelho no Departamento de Cirurgia Ortopédica do Hospital Universitário de Tuebingen, Alemanha, e no Hospital Winghofer, Rottenburg a.N., Alemanha, para o estágio final do joelho. A aprovação do comitê de ética departamental, institucional e local foi obtida antes do início do estudo (projeto nº 674/2016BO2). O consentimento informado por escrito foi recebido de todos os pacientes antes da participação. Os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas.
1. Preparação da amostra
- Preparando a cartilagem para secção criotome
- Para avaliar as alterações degenerativas na articulação do joelho, leve amostras de cartilagem articular obtidas da zona de suporte de carga dos condículos femorais após a ressecção tecidual dos pacientes.
NOTA: As amostras investigadas ainda devem conter pelo menos uma fina camada de osso subcondral para permitir a identificação clara da orientação tecidual em relação à superfície interna e externa, permitindo também uma colheita padronizada de tecido da camada superior da cartilagem. A cartilagem pode ser usada para medições de AFM até 24h após a cirurgia. O tecido pode ser armazenado no meio de Águia (DMEM) modificado de Dulbecco com 2% (v/v) de penicilina-estreptomicina e 1,2% (v/v) de anfotericina B antes do uso. O armazenamento das amostras por mais de 24 h pode causar artefatos nas medidas de AFM devido ao inchaço do tecido, no entanto. - Corte a cartilagem articular como um todo do osso subcondral com a ajuda de um bisturi e depois incorpore a amostra de cartilagem em meio de incorporação solúvel em água no botão criotome que congela sob baixa temperatura no dispositivo criotome.
NOTA: O meio congelado estabiliza o tecido que envolve. Também resulta no congelamento da amostra de cartilagem junto com o meio de incorporação. Ao cortar a cartilagem do osso, acompanhe a orientação do tecido. O tecido embutido para as criosesessecções deve ser colocado de tal forma que a camada superior (ou seja, superfície articular) da cartilagem enfrente a lâmina. Observe que o tecido deve estar totalmente coberto pelo meio de incorporação.
- Para avaliar as alterações degenerativas na articulação do joelho, leve amostras de cartilagem articular obtidas da zona de suporte de carga dos condículos femorais após a ressecção tecidual dos pacientes.
- Secção criotome da cartilagem
- Utilizando um criotomo padrão, seção do tecido a uma espessura de 35 μm da camada superior (ou seja, superfície articular) da cartilagem articular que está embutida no meio de incorporação de água congelada solúvel.
NOTA: No total, até 300 μm (o que corresponde a cerca de nove seções) podem ser seccionados e utilizados para as análises. O limite proposto de 300 μm corresponde à profundidade de penetração visual que geralmente pode ser obtida com microscopia de fluorescência na cartilagem hialina, como cartilagem articular. Assim, é possível classificar a cartilagem de acordo com o padrão espacial local predominante e, em seguida, medir esses padrões nas seções correspondentes. - Coletar as seções em uma lâmina de vidro e enxaguar as seções 3x com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o meio de incorporação solúvel em água.
- Utilizando um criotomo padrão, seção do tecido a uma espessura de 35 μm da camada superior (ou seja, superfície articular) da cartilagem articular que está embutida no meio de incorporação de água congelada solúvel.
- Colagem de seções de cartilagem em uma placa de Petri compatível com AFM
NOTA: Como a AFM coleta dados por recuo mecânico na amostra, as seções precisam ser fixadas no local para permitir medições precisas.- Cole suavemente as seções de 35 μm de espessura com cola de amostra biocompatível em pratos de cultura de tecido compatíveis com o dispositivo AFM. Para fazer isso, pegue 2-3 gotas da cola e coloque-as no prato de cultura de tecido no local onde a borda da seção vai acabar. Agora coloque a seção de cartilagem na cola e deixe-a grudar firmemente na superfície do prato de cultura de tecido.
NOTA: As seções de 35 μm de espessura da cartilagem articular hialina não são muito propensas a enrolar. No entanto, se ocorrer curling ao remover as amostras do meio tampão, certifique-se de que o mínimo de fluido possível grude nas amostras. Assim que o excesso de água secou, espalhe diretamente o tecido nos pontos dispersos de cola para que ele seja fixado à superfície do prato de cultura celular. A cola é aplicada em uma camada fina apenas nas bordas da amostra e não em toda a seção. Medir apenas a porção da amostra que está longe da área colada para eliminar a possibilidade da cola interferir nas medidas. - Incubar as seções à temperatura ambiente (RT) por 2 min para permitir que a cola e o tecido se conectem corretamente. Em seguida, cubra as seções com o meio L-15 de Leibovitz sem L-glutamina e sem bicarbonato de sódio para que estejam totalmente submersos.
NOTA: Movimentos repentinos da amostra durante a fixação ou aplicação insuficiente da cola são erros comuns que resultam no desprendimento do tecido do prato de cultura. Além disso, a aplicação do meio Leibowitz deve ser feita de forma suave, de modo a não separar a amostra da superfície devido às "ondas" criadas pelo meio. - Coloque a placa de Petri com as seções coladas na incubadora padrão de cultura celular a 37 °C até que as medições sejam realizadas.
NOTA: Certifique-se de que as seções teciduais estão estáveis e não se desgrude medem da superfície do prato de cultura tecidual realizando cada passo lentamente.
- Cole suavemente as seções de 35 μm de espessura com cola de amostra biocompatível em pratos de cultura de tecido compatíveis com o dispositivo AFM. Para fazer isso, pegue 2-3 gotas da cola e coloque-as no prato de cultura de tecido no local onde a borda da seção vai acabar. Agora coloque a seção de cartilagem na cola e deixe-a grudar firmemente na superfície do prato de cultura de tecido.
2. Preparação cantilever (colagem das microesferas)
- Preparando o dispositivo AFM e diluindo as microesferas
- Coloque o cantilever no bloco de vidro especificado para medições de ar, fixe-o com a mola e monte o bloco de vidro na cabeça AFM.
- Diluir as microesferas em 100% etanol (100 partículas/10 μL) e ultrassonolo para 10 s, de modo que as microesferas sejam separadas e não se agrupam.
- Preparando a configuração para colagem
- Limpe um escorregador de vidro com 70% de etanol e monte-o no suporte de amostra no dispositivo AFM.
NOTA: A limpeza do slide evita que partículas de poeira que possam interferir no processo de colagem se acumulem na superfície do escorregador. - Coloque 2 μL da suspensão da microsfera no meio do escorregador e 2 μL de cola perto da suspensão da microsfera.
NOTA: É recomendável colocar a suspensão da microsfera e a cola próximas umas das outras, para permitir uma transição rápida do cantilever entre a cola e as microesferas. Se a transição entre mergulhar o cantilever na cola e fazer contato com uma microsfera for muito longa, a cola acabará por endurecer, perdendo assim suas propriedades adesivos. - Deixe o líquido de etanol na microesfera secar a ar, deixando as microesferas no lugar.
- Limpe um escorregador de vidro com 70% de etanol e monte-o no suporte de amostra no dispositivo AFM.
- Colando as microesferas na ponta cantilever
- Mergulhe o cantilever manualmente na cola com a ajuda do motor de passo sinuoso em passos de 10 μm até que a ponta esteja coberta por cola. Realize este passo rapidamente, pois a cola seca rápido.
- Retraia o cantilever novamente em 100 μm, mova-o em direção às microesferas e posicione a ponta cantilever diretamente acima de uma única microesfera.
- Execute uma medição de espectroscopia de força para mergulhar a ponta cantilever na microesfera selecionada com os parâmetros mostrados na Tabela 1.
NOTA: Ao executar esta etapa, uma medição da superfície da microesfera é usada para estabelecer contato entre a ponta do cantilever e a microesfera. O tempo de contato relativamente longo mostrado na Tabela 1 permite um amplo tempo de ligação entre a cola e a microesfera. A curva de distância de força obtida durante esta etapa é gerada como um subproduto da colagem da microesfera na ponta cantilever e não é processada para análise posterior. - Uma vez que uma microesfera é anexada ao cantilever, retraia o bloco de vidro com o cantilever montado em cima e, em seguida, remova a cabeça AFM do microscópio. Por último, desmonte o bloco de vidro e cantilever da cabeça AFM.
- Incubar o cantilever a 65 °C por 2 h e deixe secar durante a noite em RT antes de iniciar as medições.
NOTA: A incubação do cantilever melhora as propriedades adesivos da cola, tornando o complexo cantilever-microsfera mais estável.
3. Preparar o dispositivo AFM para medições
- Ajuste um bloco de vidro especificado para medir em um ambiente líquido no suporte de AFM para que a superfície superior fique reta e paralela ao suporte de AFM.
- Com a ajuda de pinças, monte cuidadosamente o cantilever selecionado na superfície do bloco de vidro, de modo que a ponta AFM com a microesfera se projete sobre o plano óptico polido.
NOTA: A ponta do cantilever precisa se projetar sobre o plano polido para poder refletir o laser da AFM no fotodetector. Tenha muito cuidado ao colocar o cantilever no AFM para não arranhar a superfície óptica polida do bloco de vidro. Arranhar o bloco de vidro pode resultar em dificuldades no ajuste do alinhamento do laser e pode interferir nas medidas subseqüentes. - Como o cantilever estará sujeito à pressão mecânica, ele precisa ser fixado no lugar. Estabilize o cantilever no bloco de vidro deslizando a mola metálica para a ranhura do bloco e prendendo a parte superior do cantilever com a mola com a ajuda de pinças.
- Coloque cuidadosamente o bloco de vidro com o cantilever na cabeça AFM e fixe-o com o mecanismo de travamento integrado. Certifique-se de que a mola está voltada para o lado esquerdo para que o cantilever seja colocado na orientação correta. Em seguida, monte a cabeça AFM com o cantilever no dispositivo AFM.
4. Carregando a amostra e a calibração do cantilever
NOTA: Aqui, a calibração do dispositivo é realizada executando uma curva de força na superfície limpa da placa de Petri cheia do meio de Leibovitz sem qualquer tecido amostral. A calibração também pode ser realizada usando um prato AFM de controle separado preenchido apenas com o meio AFM sem a amostra.
- Montagem da amostra no dispositivo AFM
- Coloque a placa de Petri preparada na etapa 1.3.3 no suporte de amostra AFM.
- Ligue o aquecedor da placa de Petri e coloque-o a 37 °C. Permita que o prato de cultura tecidual atinja a temperatura ideal (ou seja, 20 min).
- Coloque uma folha protetora na base do conjunto cantilever para evitar a condensação do meio na cabeça AFM.
- Calibração do dispositivo
- Abra o software(Tabela de Materiais),seguido pela janela de alinhamento a laser, e a janela que retrata as configurações do parâmetro de aproximação. Em seguida, ligue o motor do passo a passo, a luz laser e a câmera CCD.
- Use a câmera CCD no microscópio para visualizar e identificar o cantilever. Usando a função motora do passo, abaixe o cantilever em passos de 100 μm até que o cantilever esteja totalmente submerso no meio.
NOTA: A submersão do cantilever no líquido é visualmente identificável através da câmera CCD. Quando quebra a superfície da água, a ponta cantilever cria reflexos circulares facilmente perceptíveis na água. - Direcione o laser para cima do cantilever usando os parafusos de ajuste.
NOTA: Não supere os parafusos, pois isso danificará o mecanismo de alinhamento do laser. O cantilever é visto de baixo e o raio laser vem de cima. - Uma vez posicionado o laser sobre o cantilever, ajuste o feixe de laser com a ajuda de parafusos no dispositivo AFM para que o feixe refletido caia sobre o centro do fotodetector. Continue monitorando a posição do feixe de laser usando a função de alinhamento a laser.
NOTA: O detector capta a deflexão do raio laser refletida pelo cantilever e converte-o em um sinal elétrico. - Após o ajuste laser-cantilever, o sinal de soma deve ser de 1 V ou acima, enquanto as deflexões laterais e verticais devem estar próximas de 0. Se esses valores não forem obtidos, ajuste o fotodetector.
- Obtenção da curva de força de calibração
- Para alcançar a superfície da antena AFM para iniciar as medições, execute um scanner Abordagem com os parâmetros de aproximação dados na Tabela 2. Uma vez que a parte inferior do prato de cultura de tecido é alcançado, retraia o cantilever por 100 μm.
NOTA: Neste ponto, a sonda está exatamente 100 μm acima da parte inferior do prato de cultura de tecido. - Configure os parâmetros RUN e ajuste os parâmetros exibidos na Tabela 3. Clique no botão RUN para iniciar uma medição e obter uma curva de distância de força de calibração.
NOTA: A curva de força obtida aqui é mostrada na Figura 1. - Na curva de distância de força de calibração, selecione a região para um ajuste linear da curva retraída no software.
NOTA: O ajuste linear é feito para medir a sensibilidade do cantilever. Uma vez que o ajuste linear esteja no lugar, os valores serão salvos pelo software. A medição constante da mola ou o ruído térmico do cantilever é calculado pelo software posteriormente. - Como as medições são realizadas em média a uma temperatura de 37 °C, defina a variável de temperatura em 37 °C no software para imitar as condições fisiológicas o mais próximo possível.
NOTA: Ao final da calibração, a deflexão vertical é salva e exibida na unidade de força, o Newton (N), em vez de volts (V), que é a unidade do registro original pelo detector de fotodiodo.
- Para alcançar a superfície da antena AFM para iniciar as medições, execute um scanner Abordagem com os parâmetros de aproximação dados na Tabela 2. Uma vez que a parte inferior do prato de cultura de tecido é alcançado, retraia o cantilever por 100 μm.
5. Caracterização biomecânica do ECM e PCM por meio da realização de medidas de elasticidade via AFM
- Identificando os padrões de condrócitos na seção de cartilagem
- Observe a seção de cartilagem sob um microscópio de contraste de fase integrado no sistema AFM e identifique os padrões celulares específicos10 da cartilagem articular do joelho osteoartrértico: cordas simples (áreas de tecido saudável), cordas duplas (degeneração do tecido inicial), pequenos e grandes aglomerados (ambos degeneração tecidual avançada). Ver Figura 2A-D.
- Uma vez identificado o padrão específico desejado, meça dois locais por padrão escolhido por tipo de matriz (PCM ou ECM) e realize nove repetições de medição em cada local de medição(Figura 2E,F). Certifique-se de um tamanho de amostra grande o suficiente para explicar possíveis imprecisões.
NOTA: Para as medidas de PCM, coloque o cantilever próximo às células (como mostrado pelos círculos vermelhos na Figura 2E,F). Para realizar as medições do ECM, selecione uma região sem células (mostrada pela área azul na Figura 2E,F) e realize o recuo conforme descrito na etapa 5.2.
- Recuo do local alvo
- Realize uma abordagem seguida de uma retração para que o cantilever esteja posicionado 100 μm acima do tecido, que será a posição inicial para as medidas subsequentes.
- Concentre-se no PCM ou ECM do padrão a ser medido e corrija o mouse do computador nesse ponto.
NOTA: O mouse servirá como marcador visual para o local de recuo. Uma vez que o foco muda para a ponta cantilever, as estruturas teciduais se tornarão indistinguíveis ou borradas. - Agora foque na sonda e mova a ponta da sonda para o ponto previamente corrigido pela seta do computador. Em seguida, inicie as medições com RUN,utilizando o parâmetro de ponto de set obtido pela calibração do cantilever.
NOTA: Uma curva de força exemplar obtida a partir da medição do PCM de uma única corda é mostrada na Figura Suplementar 1.
6. Processamento de dados
NOTA: A análise ou determinação dos dados do módulo elástico é realizada utilizando-se um modelo Hertz como descrito anteriormente11,12. A forma do indenter foi esférica devido ao uso de microesferas na ponta e a razão de Poisson foi mantida em 0,5 com base na literatura anterior13,14,15.
- Abra o software de processamento de dados(Tabela de Materiais)compatível com os dados obtidos a partir do dispositivo AFM.
- Selecione o modelo Hertz no software para processar as curvas de distância de força. Defina a razão Poisson em 0,5 e selecione a forma da ponta como esférica e um raio de ponta de 12,5 μm.
- Uma vez que todos os parâmetros são ajustados, os resultados são ajustados, e o módulo do Young é calculado e exibido pelo software.
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Representative Results
Ao longo do modelo fisiopatológico de cordas a cordas duplas, para pequenos e finalmente para grandes aglomerados, tanto ecm(Figura 3A) quanto PCM(Figura 3B)moduli elástico diminuiu significativamente entre cada mudança de padrão. A única exceção foi a diferença de ECM entre cordas e cordas duplas (p = 0,072). Os resultados mostram que a razão ECM/PCM (Figura 4B) não mudou significativamente, enquanto observou-se uma diminuição acentuada das diferenças absolutas de elasticidade entre ECM e PCM (Figura 4A). Além disso, os resultados não mostram associação significativa em relação à razão ECM/PCM ou alterações espaciais celulares associadas (r = -0,099, p = 0,281).
Figura 1: Representação esquemática de uma curva de distância de força no modo de contato AFM. À medida que a sonda se aproxima da superfície, as forças são muito pequenas para dar uma deflexão mensurável da ponta no início, deixando assim a ponta em sua posição não perturbada (1). Então, quando o cantilever está muito próximo da amostra, devido às forças adesivos ativas entre a ponta e a sonda, o cantilever realmente se encaixa rapidamente em direção à amostra (2). Com a sonda se aproximando ainda mais da amostra, a deflexão repulsiva então enfrenta o movimento da direção, com uma função quase linear de altura e deflexão até que a deflexão vertical atinja o valor relativo do ponto de ajuste (3). Ao se retrair (4), além das forças de desvio de rebaixamento, as forças de adesão também estão presentes enquanto o cantilever é retraído no eixo Z da amostra. À medida que a sonda AFM é retirada do contato com a amostra, ela primeiro fica "presa" antes de ser capaz de se soltar da adesão na interface, levando até mesmo a uma pequena deflexão negativa do cantilever, antes de novamente atingir sua posição neutra sem contato com a sonda (5). A extensão da deflexão é expressa na força que trabalha no cantilever expresso em nanonewtons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização espacial representativa dos condrócitos e medidas AFM da matriz extracelular (ECM) e matriz pericelular (PCM). (A-D) Caracterização dos padrões celulares: cordas(A),cordas duplas(B),pequenos aglomerados(C)e grandes aglomerados(D). Os moduli elásticos do PCM (círculos vermelhos) eFECM (área azul)(E/F) foram avaliados para os diferentes padrões celulares na cartilagem osteoartrítica. Os locais de medição do ECM e do PCM foram selecionados pelo experimentador e são graficamente indicados por cruzes pretas. A ponta cantilever usada para as medidas é marcada por uma estrela branca. As barras de escala representam 10 μm(A-D),e 100 μm(E/F). A figura é adaptada e modificada a partir de Danalache et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação do moduli quantificado de Young da matriz extracelular (ECM) e da matriz pericelular (PCM) em função da organização dos condrócitos espaciais. Com organização progressiva de condrócito espacial patológico, observou-se uma diminuição gradual da elasticidade nos boxplots tanto para o ECM (A) quanto para o PCM (B) (*p < 0,05, ***p < 0,001). Abreviaturas: SS: single strings, DS: double strings, SC: small clusters, BC: clusters grandes. As figuras são retiradas de Danalache et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Relação do moduli jovem da matriz extracelular (ECM) e da matriz pericelular (PCM) em função da organização espacial celular. Uma organização de condrócito espacial cada vez mais patológico foi associada a uma diminuição do moduli dos Jovens tanto para ECM quanto para PCM(A). Enquanto essas mudanças espaciais ocorreram, a razão de elasticidade do ECM e do PCM manteve-se constante, não apresentando alterações significativas(B). Os dados são apresentados como um diagrama de linha com erro padrão médio (A) e boxplots(B). Abreviaturas: SS: single strings, DS: double strings, SC: small clusters, BC: clusters grandes. As figuras são retiradas de Danalache et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Curva de força representativa obtida pelo recuo da matriz pericelular (PCM) de um único padrão de corda mostrando os resultados de ajuste (seta laranja) bem como o quadrado médio da raiz residual (RMS residual; seta preta). Os resultados de ajuste incluem o ponto de contato entre a amostra e a ponta, o módulo de Young e a linha de base. O RMS residual exibido abaixo descreve a diferença entre os dados de ajuste e força, representando assim a qualidade de um ajuste de curva de força. Clique aqui para baixar este número.
| Tabela 1. Parâmetros para colar uma microesfera na sonda AFM | |
| Parâmetros | Valor |
| Setpoint | 5.0 V |
| Ajuste a linha de base | 1 |
| Comprimento de puxar | 90,0 μm |
| Movimento Z | Velocidade constante |
| Ampliar a velocidade | 5,0 μm/s |
| Estender o tempo | 18.0 s |
| Tempo de contato | 90.0 s |
| Modo de atraso | Força constante |
| Taxa de amostragem | 2000 Hz |
Tabela 1. Parâmetros para colar uma microsfera na sonda AFM.
| Tabela 2. Parâmetros de abordagem | |
| Parâmetros de abordagem | Valor |
| Abordagem IGain | 5,0 Hz |
| Ganho de abordagem | 0.0002 |
| Aproximar a altura do alvo | 10,0 μm |
| Setpoint de abordagem | 5.00 V |
| Linha de base de abordagem | 0,00 V |
Tabela 2. Parâmetros de aproximação.
| Tabela 3. Parâmetros de execução | |
| Parâmetros | Valor |
| Setpoint | 1.0 V |
| Ajuste a linha de base | 1 |
| Comprimento de puxar | 90,0 μm |
| Movimento Z | Velocidade constante |
| Ampliar a velocidade | 5,0 μm/s |
| Estender o tempo | 18.0 s |
| Tempo de contato | 0.0 s |
| Modo de atraso | Força constante |
| Taxa de amostragem | 2000 Hz |
Tabela 3. Executar parâmetros.
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Discussion
Utilizando a AFM como uma técnica nova e poderosa para medir as propriedades biomecânicas dos materiais biológicos em um nível de nanoescala, medimos as propriedades elásticas do ECM e do PCM na cartilagem articular osteoartrítica humana. As amostras de cartilagem foram selecionadas de acordo com seu padrão espacial predominante de organização de condrócitos como um biomarcador à base de imagem para degeneração tecidual local. Como esperado, observou-se forte declínio nos valores de elasticidade tanto do ECM quanto do PCM ao longo da reorganização espacial dos condrócitos. Essas observações destacam claramente que os desvios na disposição espacial dos condrócitos não foram associados apenas a alterações nas propriedades elásticas do microambiente celular (PCM), mas também em toda a cartilagem (ECM). Além disso, a relação ECM/PCM não mostrou alterações significativas, apesar das mudanças robustas no moduli elástico de PCM e ECM durante o OA. Esses achados indicam que as mudanças nas propriedades mecânicas do CmEM e do PCM ocorreram unidirecionalmente e, ao mesmo tempo, o que pode significar que a natureza da destruição progressiva é semelhante tanto para o PCM quanto para o ECM. Iniciação e progressão da OA desencadeiam, assim, significativa degradação do PCM e ECM e, em última instância, destruição. Ambas as perdas foram associadas a uma perda significativa de propriedades biomecânicas da cartilagem articular, como sua elasticidade, como mostrado no presente estudo. Isso enfatiza a relevância funcional da organização espacial dos condrócitos como marcador de propriedades biomecânicas. Por outro lado, permite usar medidas de elasticidade local para tirar conclusões sobre os padrões espaciais localmente predominantes e, assim, a degeneração do tecido local da cartilagem.
A microscopia de força atômica (AFM) surgiu como uma ferramenta de alta resolução para estudar tecidos de forma não destrutiva. Ele opera sondando fisicamente amostras com um cantilever delicado e flexível que reflete um laser em um fotodiodo. Qualquer alteração nesta reflexão é registrada e convertida em um sinal elétrico. Embora a AFM seja uma ferramenta poderosa para realizar medições em nanoescala, ela não vem sem suas limitações e armadilhas. Especialmente crítico é a preparação cantilever colando as microesferas. No contexto deste método, as microesferas são usadas para modificar a profundidade de recuo e a pressão local durante as medições. O uso de pequenas microesferas presas à ponta da sonda permite medir as propriedades biomecânicas de uma rede de fibras em vez da elasticidade de uma única fibra ao usar apenas a ponta. Também previne danos teciduais durante o processo de medição. Devido à natureza delicada dos sensores cantilever, um modo de preparação atento e cuidadoso precisa ser estabelecido para obter medições consistentes e precisas. Para evitar que as microesferas se desconectem da ponta do sensor, recomendamos cola recém-misturada não mais de uma semana. Além disso, é vital para a funcionalidade do sensor colocar a microsfera no centro da ponta, pois o desvio lateral no apego da microsfera resulta facilmente em medidas inconsistentes.
Colocar o cantilever no bloco de vidro e fixá-lo com uma mola adequada é um processo delicado e propenso a erros que precisa de atenção meticulosa e mãos firmes. Como os cantilevers são muito propensos a serem destruídos por operadores não treinados, recomendamos a realização de vários testes e prática para lidar confortavelmente com os componentes facilmente quebráveis da AFM.
Um bloco de vidro limpo é imperativo para calibrar adequadamente o dispositivo e obter medidas confiáveis. Sujeira ou poeira na superfície óptica do bloco podem impedir o alinhamento adequado do laser no fotodetector. Portanto, se forem encontrados problemas durante o alinhamento do laser, lavar o bloco de vidro com etanol uma segunda vez pode ser necessário.
A análise dos dados ou a determinação do módulo elástico podem ser realizadas utilizando-se o modelo Hertz como descrito anteriormente11,12. Em suma, os dados gerados pelo recuo são parcelas de força sobre o movimento da ponta cantilever. Durante as medições, o cantilever é movido na direção da amostra. Isso leva o cantilever a fazer contato com a amostra e, posteriormente, à sua dobra na direção oposta à que ela originalmente se movia. Simultaneamente, ocorre um recuo da amostra por uma certa quantidade. Para utilizar o modelo de ajuste de Hertz, o recuo da amostra deve ser calculado e ajustado para isolar o parâmetro de dobra cantilever. O parâmetro que descreve a amostra é a razão de Poisson, que depende do material investigado. Para amostras biológicas macias, a razão de Poisson é frequentemente definida como 0,515. Como mencionado acima, a forma do indenter usado é relevante para o cálculo do módulo de Young, pois dita as extensões que devem ser feitas à equação original de Hertz. No caso do experimento descrito, uma forma de indenter esférica é assumida devido ao uso de microesferas.
Embora a AFM possa oferecer novas e interessantes possibilidades de coleta de dados, a consistência e a confiabilidade dos dados gerados dependem fortemente da experiência do respectivo operador. Várias das etapas descritas acima são propensas a erros humanos e requerem paciência e meticulosidade para executá-los corretamente.
Devido às muitas variáveis sensíveis que podem afetar os resultados de medição, os valores de força absoluta relatados neste estudo não podem ser generalizados, mas são bastante específicos para nossa configuração experimental. Ao utilizar esta técnica para avaliar a degeneração tecidual da cartilagem, algumas medidas normalizadoras em diferentes padrões espaciais precisam primeiro ser realizadas para dimensionar os resultados para as configurações específicas de medição experimental presentes. A relação da elasticidade diferente moduli e os padrões espaciais, no entanto, não serão afetados.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Agradecemos aos nossos co-autores da publicação original pela ajuda e apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. Ramalingam, M., Ramakrishna, S. , Woodhead Publishing. Cambridge, UK. 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
